Planarian İmmobilizasyon, Kısmi Işınlama, ve Doku Nakli

Aşağıdaki deneyin genel amacı, rejenerasyon sırasında kök hücre ve döl davranışlarını in vivo olarak analiz etmek için kök hücre ablasyonlu dokuya bitişik bir sağlıklı kök hücre popülasyonunu konumlandırmaktır. Bu, daha fazla manipülasyon için ışınlanmamış veya Yapraklı ışınlanmış bir paryanın uyuşturulması ve hareketsiz hale getirilmesiyle elde edilir. Daha sonra, hareketsizleştirilmemiş ışınlanmış parian kısmen kurşunla korunur ve daha sonra x-ışını ile ışınlanır, bu da kök hücre yüklü kalan korumalı dokuya yan yana kök hücre ablasyonlu doku ile yaralanmamış bir parian üretir.

Alternatif olarak, ışınlanmamış bir donörden alınan bir doku grefti, izole edilmiş bir kök hücre popülasyonuna sahip bir parian üretmek için daha önce ışınlanmış bir konakçıya nakledilebilir. Aksi takdirde bir kök hücre içinde fally bulunur. Kök hücre işaretleyici genleri için tüm mount RNA in situ iki hibridizasyon ile kök hücre ablasyonlu dokulara bitişik izole kök hücre popülasyonlarını gösteren ablasyonlu konak sonuçları elde edilir.

Bu nedenle, burada açıklanan yöntemler, hem transplantasyon paradigmasında hem de kısmi ışınlama paradigmasında kök hücrelerin davranışını inceleyerek rejenerasyon planaryalarını daha iyi anlamayı amaçlamaktadır, bu da çevre dokuların ve bu kök hücrelerin bulunduğu yerel ortamların bu neo blastların veya kök hücrelerin davranışını etkileyip etkilemediğini test etmemizi sağlar. Rejenerasyon sürecinde, deneyden bir ila iki ay önce, kaidesi beraberindeki el yazmasına göre besleyin. Bu gösteride istenen boyutu elde etmek için, bir ila iki santimetre uzunluğunda ve iki milimetreden daha geniş kaide seçilir.

Daha sonra kullanımdan üç ila yedi gün önce aç bırakılırlar. Daha sonra, Kloro ton çözeltisini, parian suda hacim başına ağırlık% 0.1 ila 0.2 cleone çözerek hafif bir lokal anestezik hazırlayın. Daha sonra doku nakli için çözeltiyi bir bunsen brülörü ile buz üzerinde soğutun, greft dokusunu kesmek için uçtan bir ila iki santimetre açıyla 90 derecelik bir açıyla 0.75 milimetre iç çapa sahip bir kılcal boruyu bükün.

Daha sonra, grefti almak için konakçıda bir delik oluşturmak için uçtan bir ila iki santimetre açıyla 0,7 milimetre dış çapa sahip başka bir kılcal boruyu 90 derecelik bir açıyla bükün. Sonra, siyah filtre kağıdı watman'ı kesin. Üç numara, filtre kağıdı Kim mendil ve sigara sarma kağıdı, ekteki el yazmasında belirtilen boyutlara göre.

Bundan sonra, modifiye edilmiş Holt Fers çözeltisini ve Caine doymuş Holt Fretter çözeltisini hazırlayın. Her ikisini de dört santigrat dereceye kadar soğutun. Ardından katlanmış bir Kim mendilini bir Paraform karesine yapıştırın.

Diseksiyon mikroskobu altında Peltier soğutucu plakasına veya başka bir soğutma cihazına yerleştirin. Daha sonra Kim mendilini soğutulmuş Holt Fretter solüsyonu ile doyurun. Ardından Kim mendilinin üzerine iki siyah filtre kağıdı dikdörtgeni yerleştirin.

Şimdi bir Petri kabına bir parça Watman iki numaralı filtre kağıdı yerleştirin. Filtre kağıdını Holt Fretter solüsyonu ile nemlendirin. Daha sonra kısmi ışınlama için tabağı buz üzerinde soğutun.

Doku nakline benzer şekilde daha büyük bir tabağa daha büyük bir kağıt astar yerleştirin. Filtre kağıdını Holt Fretter solüsyonu ile nemlendirin. Sonra tabağı buz üzerinde soğutun.

Bu prosedürde, bir Petri kabını soğutulmuş cleone çözeltisi ile doldurun. Planaryayı nakil için tabağa pipetleyin. Bir seferde sadece bir konakçıyı ve bir donörü uyuşturun.

Kısmi ışınlama için, birçok hayvan aynı anda uyuşturulabilir. Ardından, paryanın hareketsiz hale gelene kadar beş ila 10 dakika cleone solüsyonunda ıslanmasına izin verin. Paryayı, soğutulmuş Holt Fretter solüsyonu ile doldurulmuş bir tabağa pipetleyerek durulayın.

Bundan sonra, soğutulmuş Holt fretter çözeltisi ile doyurulmuş siyah filtre kağıtlarına pipetleyerek baza alanını hareketsiz hale getirin. Sonra onları bir çift forseps ile ventral tarafı aşağı doğru yönlendirin. Şimdi, daha önce hazırlanmış soğutulmuş bir Petri kabını, üst kaynaklı bir X-ışını ışınlayıcısının içine sığacak bir buz kovasına yerleştirin.

Siyah filtre kağıtlarını hareket ettirerek uyuşturulmuş plin bölgesini bir Petri kabına yerleştirin. Daha sonra bunları üst kaynak X-ışını ışınlayıcısına aktarın, buz kovasını katot tüpünden paryaya olan mesafe en aza indirilecek şekilde yerleştirin. Böylece etkili doz oranını en üst düzeye çıkarır.

Ardından, x-ışını dozu için kurşun kalkanları paria ve katot tüpü arasına yerleştirin. Korumalı olmayan bölgelerden tam kök hücre ablasyonu isteniyorsa, 30 gri veya daha fazla verin. X-ışını emisyonundan hemen sonra, parianı soğutulmuş paryan suyuna aktarın.

Bundan sonra, paryan suyunun oda sıcaklığına ısınmasına ve hayvanların kendilerini siyah filtre kağıdından çıkarmasına izin verin. Kısmi ışınlama prosedürü şimdi tamamlanmıştır. Diseksiyon mikroskobu altında bu işleme başlamak için, anestezi uygulanmış konakçı ve donör plin alanını, peltier veya soğutucu plaka üzerinde zaten soğutulmuş olan Kim mendili üzerindeki ayrı dikdörtgen siyah filtrelere yerleştirin.

Donörden greft tıkacını kesmek için 0,75 milimetre iç çaplı bir kılcal boru kullanın. Ardından, konağın yoldan uzak bir kısmına yerleştirmek için bir çift forseps kullanın. Ardından, ana bilgisayardan bir fişi çıkarmak için 0,7 milimetre dış çaplı bir kılcal boru kullanın.

Daha sonra grefti deliğe yerleştirin. Dikdörtgen siyah filtre kağıdı üzerine nakledilen konağı daha önce hazırlanan Petri kabına aktarın. Bir parça haddeleme kağıdını Caine doymuş Holt Fretter solüsyonu ile ıslatın.

Ardından, nakledilen konağın üzerine yerleştirin. Daha sonra, doymuş Holter solüsyonunu kaplayan dört parça filtre kağıdını ıslatın ve nakledilen konak subunun daha sonra dört tomar kesiği ıslatması durumunda, doymuş Holt Fretter solüsyonunu Kim ile silin. Bunları filtre kağıtlarının üzerine yerleştirin.

Bundan sonra kapağı kapatın. Petri kabını buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra donör parianı geri kazanım ve rejenerasyon için parian suyuna aktarın.

Tüm nakiller tamamlandığında, nakledilen parianı gece boyunca 10 santigrat derecelik bir inkübatöre yerleştirin. Ertesi sabah, parian su ile doldurulmuş bir Petri kabına aktarın. Paryanın filtre kağıdından çıkmasına izin verin veya forseps ile nazikçe çıkarın ve parian suyunu daha sonra iki ila üç günde bir değiştirin.

Işınlanmış, ancak ışınlamadan üç gün sonra sabitlenmiş kontrol paryanında delik montajlı in situ hibridizasyon, vahşi tip parian'ınkinden ayırt edilemeyen bir kök hücre dağılımı gösterir. Öte yandan, sadece kısmen korunmuş olan parian için, ön ve arka kısımları açıkta bırakan kök hücreler, korumasız bölgelerden ablasyona uğramış gibi görünmektedir. Burada başarılı bir şekilde nakledilen bir paryanın dorsal ve ventral görünümleri gösterilmektedir.

Transplantasyondan üç gün sonra, greft hem dorsal hem de ventral yüzeylerde açıkça görülebilir ve greft konak arayüzünde karakteristik pigmentsiz doku ile çevrilidir. Bununla birlikte, başarısız transplantasyon, transplantasyon bölgesinde görünür greft dokusu göstermez. Tüm mount in situ hibridizasyon, kök hücrelerin yalnızca greft yerleşiminin içinde veya çevresinde varlığını ortaya çıkardı, bu da bir kez ustalaştıktan sonra transplantasyonun başarısını gösterir.

Transplantasyonlar her biri beş dakika gibi kısa bir sürede yapılabilir. % 90 ila 100'e yaklaşan başarı oranları ile kısmi ışınlama büyük ölçüde ölçeklendirilebilir. Işınlayıcınızın alan boyutunun yeterince büyük olduğunu varsayarsak.