Picoeukaryote genomik Dönüşüm Ostreococcus tauri

Bu prosedürün genel amacı, bir deniz piko ökaryotik lgal türü olan yeni model organizma Austria Occus Tori'nin kararlı trenkojenik hatlarını oluşturmak ve seçmektir. Bu, ilk olarak dönüşüm başına 50 mililitre yoğun ALG kültüründen hücre peletleri üretilerek gerçekleştirilir. İkinci adım, hücreleri doğrusallaştırılmış DNA ile karıştırmak ve daha sonra elektroporasyonu gerçekleştirmektir.

Dönüşüm hücrelerini taze, orta derecede seyrelttikten ve gece boyunca inkübe ettikten sonra,% 0.2 düşük erime noktalı aase ve seçici bir ajan ekleyin ve karışımı küçük Petri kaplarına dökün. Son adım, sürekli mavi ışıkta iki ila üç haftalık kuluçka döneminden sonra büyüyecek olan kolonileri seçmektir. Sonuç olarak, sıvı, orta ve PCR ve southern blot gibi müteakip moleküler analizler, yapının oluşturulan transgenik hatların genomuna başarılı bir şekilde entegrasyonunu göstermek için kullanılır.

Bu organizmayı Arabidopsis gibi mevcut model organizmalara göre kullanmanın temel avantajı, neredeyse hiç genetik fazlalık olmadan arka planda düzenleyici ağların incelenmesine izin veren genomik karmaşıklığı büyük ölçüde azaltmaktır. Laboratuvarımda bitki sirkadiyen saatini incelemek için osteo occus kullanmış olsak da, diğer birçok karmaşık hücresel ağı incelemek için kullanılabilir. Dolayısıyla bu tekniğin sonuçları, bitki biyolojisi alanının çok ötesine uzanır.

Bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir, çünkü bireysel adımlar oldukça basit görünse de, hücrelerin uygun şekilde ele alınması ve verimli bir iş akışı iyi bir sonuç elde etmek için gereklidir. Bu prosedürün bazı kısımları, bir laboratuvardan araştırma görevlisi olan Culin Kish tarafından gösterilecektir. Avusturya Occus hücreleri, litre başına 40 gramlık bir SW çözünmesi hazırlamak için yapay deniz suyunda veya bir SW'de toplanır.

Deiyonize sudaki deniz tuzları, ölçüldüğü gibi binde 30 parça veya PPT tuzluluğa kadar. Bir tuzluluk ölçer kullanarak zenginleştirme, orta eser metal elementler ve vitaminler ekleyin ve daha sonra sabit ışık altında bir SW'de Avusturya koks suşu O TT H 95'in 0.22 mikron filtre brüt hücreleri ile sterilize edilmiş filtre. Ay ışığı mavisi filtre ile donatılmış bir bitki büyüme inkübatöründe, ışık yoğunluğu saniyede metre kare başına 20 mikromol yakın olmalıdır ve sıcaklık 20 santigrat derecede tutulmalıdır hücreler sürekli çalkalama gerektirmez, ancak agregasyonu önlemek için her iki ila üç günde bir çalkalanır.

Bakım için, hücrelerin aseptik olarak her yedi günde bir taze bir SW'de bir ila 100 seyreltilmesinde alt kültür hücreleri. Her dönüşüm, mililitre başına 20 ila 30 kez 10 ila altı hücre hücre yoğunluğunda 50 mililitre hücre gerektirir. Bu yoğunluğa alt kültürden beş ila yedi gün sonra ulaşılmalıdır.

Yaklaşık hücre yoğunluğu ve eksen, bir hemo sitometrede en az 40 kez tahmin edilebilir. Büyütme veya tercihen akış sitometrisi ile belirlenebilir. Sağlıklı ve sağlıksız kültürlerin bir örneği burada gösterilmiştir.

Her biyo parametrik çizim, hücre başına kırmızı floresana veya x ekseninde FL üçe karşı y ekseninde yan saçılma veya SSC'yi gösterir. FL üç, klorofil kırmızı floresansını temsil eder ve SSC, nispi hücre boyutunun göstergesidir. Sağlıklı hücreler Avusturya Occus penceresine düşerken, ölen hücreler veya kirletici bakteriler bu pencerenin dışında kalır.

İdeal olarak, hücrelerin %99'undan fazlası Avusturya Occus penceresinde olmalıdır. Verimli genetik dönüşüm için, her dönüşüm, mikrolitre başına bir mikrogram konsantrasyon olarak beş mikrogram saf doğrusallaştırılmış plazmit, DNA gerektirir. Steril deiyonize suda, plazmit, kullanılan vektörün omurgasını kesen, ancak transgen veya seleksiyon geninde olmayan bir enzim tarafından doğrusallaştırılmıştır.

DNA içeren mikro santrifüj tüpünü buz üzerinde her dönüşüm için iki milimetrelik bir elektroporasyon damarı ile birlikte tutun. Her hücre hattının dönüştürülmesi için DNA'sız bir kontrol gereklidir. Her dönüşüm için, 50 mililitre hücreyi konik tabanlı bir tüpe aktarın,% 0.1 onik asit F 68 ekleyin ve 10 santigrat derecede 8.000 kez G'de 10 dakika santrifüjleyin.

Hücreleri peletlemek için hemen takviyeyi atın ve hücrelere bir mililitre Resus süspansiyon tamponu ekleyin. Resus, hücreleri yukarı ve aşağı pipetleyerek askıya alır, bir mikro çöp tüpüne aktarır ve 8.000 kez 10 dakika boyunca döndürür. 10 santigrat derecede G, hızlı bir şekilde çalışarak, ikinci sıkmadan sonra hücreleri bir kez daha yıkayın.

Her bir peleti 200 mikrolitre Resus süspansiyonunda yeniden süspanse etmek için bir P 40 ucu kesin. Yeniden süspanse edilmiş hücrelerin 40 mikrolitresinde buz üzerinde doğrusallaştırılmış DNA'nın her bir tüpüne tamponlayın. Yavaşça karıştırın ve elektroporasyon teknesine aktarın.

Vete'yi elektroporasyon makinesine koyun. Ayarları karşılıklı sensör başına altı kilovolt, 600 ohm ve 25 mikro gün olarak ayarlayın. Elektroporasyondan sonra hücreleri elektro olarak çalıştırır.

Küvetlerdeki hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Bu süre zarfında, doku kültürü şişelerini etiketleyin ve her şişeye 30 mililitre taze bir SW ekleyin. Her şişeden bir mililitre SW alın ve iki dakika boyunca karşılık gelen vete inkübatına yavaşça ekleyin.

Daha sonra, şimdi hücrelerin glo'sunu içeren bir SW'yi nazikçe çıkarın ve nazikçe ve yavaşça doğrudan a'ya doğru okşayın SW.In kültür şişesi hücreleri tipik olarak büyük bir Glo'da kalacaktır. Şu anda toplanmış hücreleri sallamamaya veya rahatsız etmemeye dikkat edin. Hücrelerin inkübatörde bir ila iki saat iyileşmesine izin verin.

Son olarak, şişeyi manuel olarak sallayarak hücreleri yeniden askıya alın. Bu noktada, hücreler serbestçe yeniden askıya alınmalı ve hiçbir küme görünmemelidir. Kültürleri, elektroporasyondan sonraki gün inkübatörde gece boyunca toparlanmaya bırakın, bir yıldız çubuk içeren bir şişede çift damıtılmış su içinde% 2.1 düşük erime noktalı haase çözeltisi otoklavlayın.

65 ila 90 santigrat derecede, ısıtma manyetik yıldızında su içeren daha büyük bir beherde erimiş halde tutun. Her dönüşüm için, her biri dokuz mililitre SW plus içeren sekiz adet 50 milimetrelik Petri kabı ve sekiz adet 50 mililitrelik tüp hazırlayın. Gerekli seçim.

Dönüşüm hücrelerini inkübatörden toplayın. Bu prosedürün en zor kısmı, dönüştürülmüş hücrelerin çok fazla ısıya maruz bırakılarak bütünlüklerini bozmadan, düşük yüzdeli agros jellere dahil edilmesidir. Bu nedenle, prosedürün sonraki birkaç adımını hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirmek önemlidir: Steril bir akış başlığında çalışmak.

Tüplerden birinin dokuz mililitresine bir mililitre kaynamaya yakın düşük erime noktası aase SW.In ekleyin, tüpü kapatın ve karıştırmak için ters çevirin. Ardından, 0,5 mililitre yeni dönüştürülmüş hücre ekleyin. Karıştırmak için tüpü hızlı bir şekilde kapatın ve ters çevirin ve ardından içeriğini Petri kabına dökün.

Bu işlemi kalan yedi tüple tekrarlayın ve ardından bir sonraki dönüşüm şişesine geçin. Bulaşıkları, arayanın sertleşmesi için bir saat akış davlumbazında açık bırakın. Daha sonra bulaşıkları örtün ve her biri dört yuvarlak tabak içeren büyük kare Petri kaplarına dikkatlice aktarın.

Bulaşıklar tamamen ayarlanmadığından, jel çok kırılgandır. Bulaşıkları tutarken jeli kırmamaya dikkat edin. Kare tabakları paraform ile kapatın ve inkübatöre yerleştirin.

Koloniler göründüğünde, kesme uçları olan 200 mikrolitrelik bir perpe kullanın. Steril bir başlıkta kolonileri toplamak için, sadece serbest kolonileri seçin ve yeşil bir koloniyi emin. Komşu kolonilerden herhangi bir hücre eklememeye dikkat edin.

Hücreleri, seçimi içeren iki mililitre sıvı ortama aktarın. 24 oyuklu bir plakada yukarı ve aşağı okşayarak karıştırın. Dönüşüm başına 24 veya 48 koloni seçtikten sonra, plakaları para film ile kapatın ve inkübatöre aktarın.

Bir hafta sonra, her birinin 100 mikrolitresini seçimle birlikte iki mililitre taze bir SW'ye aktarın. 24 oyuklu bir plakada yedi gün daha büyür. Hayatta kalan hücre hatları daha sonra beş mikrogram doğrusallaştırılmış DNA'yı dönüştürürken daha ileri çalışmalar için kullanılabilir.

Bu protokolü kullanarak. Dönüşüm plakası başına 20 ila 60 koloni iki ila üç hafta sonra ortaya çıkmalıdır. Toplanan kolonilerin yaklaşık% 80'i sıvı ortamda antibiyotik direnci ile pozitif olarak seçildi ve bu prosedürü takiben sonraki çalışmalarda kullanıldı.

Geliştirilmesinden sonra hendek geninin yerleştirme numarasını ve yerini doğrulamak için PCR veya Southern blot gibi diğer yöntemler daha sonra gerçekleştirilebilir. Bu teknik, sirkadiyen saat ve hücre döngüsü alanlarındaki araştırmacıların, bu yeni model organizma Austria Caucus'ta kendi sistemlerinin karmaşık bileşenlerini ve davranışlarını anlamalarına izin verdi. Tori, Bu videoyu izledikten sonra, transgenik Avusturya caucus hatlarının nasıl oluşturulacağını iyi anlamış olmalısınız.