Name: Picoeukaryote genomik Dönüşüm Ostreococcus tauri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Öğrenin, Ostreococcus tauri'de elektroporasyonla genetik dönüşüm yapmayı ve stabil transgenik hatlar üretmeyi. Bu yöntem, bitki biyolojisi ve hücresel ağ araştırmaları için değerli bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

BBSRC ve EPSRC ödül D019621 tarafından finanse Bütünleştirici Sistem Biyolojisi için Merkezi SynthSys. FYB için Mükemmellik &quot;Deniz Genomics&quot; hibe AB 6. ÇP Ağ genetik transformasyon yöntemlerinin geliştirilmesi finanse etmiştir.

1. Alg Malzeme Hazırlanması <ol><li> Ostreococcus hücrelerin yapay deniz suyu (ABY) kültürlenmiştir. Deniz tuzları (litre başına tipik olarak yaklaşık 40 gram) 30 bir tuz için deiyonize su içinde çözülür, ppt gibi bir tuz sayacı kullanılarak ölçüldü. 1-3 Tablolarda tarif edildiği gibi Zenginleştirme orta 11,12, eser elementler metal ve vitaminler eklenir. Ortam 0.22 um bir filtreden daha sonra filtre ile sterilize edilmiş olup. </li><li> Bakım için Ostreococcus gerginlik OTTH95 hücreleri taze ASW her 7 günde 1/100 dilusyondaki aseptik alt-kültür ve Ayışığı Mavi filtre takılmış bir bitki büyüme inkübatörde sabit ışık altında yetiştirilen. Işık yoğunluğu yaklaşık 20 mmol m -2 s -1 olmalıdır ve sıcaklık 20 ° C&#39;de muhafaza edilir Hücreler sürekli ajitasyon gerekmez, ancak her 2 ila 3 gün agregasyonunu önlemek için bir kez çalkalanır. </li><li> Her bir dönüşüm için, hücreler 50 ml de bir hücre gerekmektediralt-kültür takiben 5-7 gün elde edilmelidir 20-30 x 10 6 ml -1, bir nsity. Yaklaşık hücre yoğunluğu ve axeny x40 büyütme en az akış sitometrisi ya da bir ya haemocytometer kullanılarak belirlenebilir. </li></ol> 2. Elektroporasyon <ol><li> Dönüşümü için DNA hazırlamak. Her bir dönüşüm için, saf, linearised plazmid DNA 5 ug steril deiyonize su içinde 1 mg / ml arasında derişimde gereklidir. Diğer yöntemler işe eşit derecede iyi olabilir ama bu DNA elde etmek için, yazarlar, Qiagen midi hazırlık kiti kullanmanızı öneririz. Bir kullanılan vektörün omurgasında kesen bir enzimi, ancak transgen ya da seçim geni olan ürünün sindirilmesi. Daha da saflaştırmak ve etanol çökeltme ile sonuçta elde edilen DNA doğrusal konsantre ve yüksek kaliteli bir steril deiyonize su uygun hacimde yeniden süspanse ürünü. </li><li> Her bir dönüşüm için 5 ug DNA içeren tüpler mikrosantrifüj hazırlayın. Bir controHer bir hücre dizisi transforme edilmesi için bir DNA ile l gereklidir. Her bir dönüşüm için bir küvet 2 mm elektroporasyon ile birlikte, buz üzerinde bu tüplerin tutmak. </li><li> Dönüşüm başına tabanda tamponu 2.2 ml hazırlayın. GKD 2 O içinde 1 M çözüm Sorbitol eritilir,% 0.1 Pluronic asit F68 ve filtre-sterilize ekleyin. </li><li> Konik alt ile bir 50 ml nihai bir tüp içinde hücreleri% 0.1 &#39;lik konsantrasyonu, 10 ve at 8000X g&#39;de 10 dakika boyunca granül bunların ° C ila Pluronic F68 asit, ekleyin. Hemen yukarı veya aşağı doğru pipet ile tarafından yeniden süspanse tampon 1 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri, ve bir mikrofüj tüpe transfer. 10 ° C&#39;de 8000 xg&#39;de 10 dakika aşağı doğru döndürün ve hızlı şekilde çalışma, bir kez daha bu yıkama adımı tekrarlayın. </li><li> Bir kesim ucu ile yeniden süspanse tampon 40 ul her son pelletini. Buz üzerinde linearised DNA&#39;nın her tüpüne süspanse hücreler 40 ul ekleyin, hafifçe karıştırın ve elektroporasyon küvetine transfer. </li><li> Electrop de küvet koyunnutuk makinesi. 6 kV cm -1, 600 Ω ve 25 uF için ayarlarını değiştirin. Hücreleri Electroporate. </li><li> 10 dakika için oda sıcaklığında küvet içinde electoporated hücreleri inkübe ve doku kültür şişeleri hazırlamak için olduğu zaman kullanılır. Onları etiketlemek ve her taze ASW 30 ml ekleyin. Her balona 1 ml çıkarın ve yavaşça ilgili küvet ekleyin. 2 dakika inkübe ve yavaşça ASW kaldırmak, şimdi yavaşça hücrelerin damlası içeren ve yavaş yavaş kültür şişelerinde ASW doğrudan Pipeti. </li><li> Hücreler genellikle bir damlası kalır. Bu anda toplu hücreler sallamayın veya rahatsız dikkat edin. Hücreleri 1-2 saat inkübatörde kurtarmak için izin ver, sonra şişeleri sallayarak tekrar süspansiyon. Bu zamanda, hücre serbestçe tekrar süspansiyon olmalıdır ve hiçbir topaklar görülmelidir. Inkübatörde gecede kurtarmak için kültürleri bırakın. </li></ol> 3. Yarı-katı Ortamda Tabaklar Hücreler dahil edilmesi <ol><li&gt; Ertesi gün, bir karıştırma çubuğu içeren bir şişe içinde GKD 2 O% 2.1 düşük erime noktası agaroz çözeltisi otoklavlama. Bir ısıtma altmda manyetik bir karıştırıcı su içeren bir cam kapta daha 65-90 ° C sıcaklıkta erimiş tutmak. Her dönüşüm için 9 ASW ml artı gerekli seçimi içeren 8 Petri (55 mm çap) ve 8 x 15 ml tüpler her hazırlamak. Nourseothricin veya G418 kullanıyorsanız, 2 mg / ml kullanın. </li><li> Kuluçka gelen dönüştürülmüş hücreler toplanır. Steril bir flowhood çalışan, tüplerin birinde 9 ml kaynar LMP agaroz 1 ml ilave edilir. Tüp kapatılır ve alt üst edilerek karıştırılır. Sonra, taze transforme hücreler 0.5 ml eklemek hızlı karıştırın ve plaka içine dökün. Kalan 7 tüpleri ile bu işlemi yineleyin ve ardından sonraki dönüşüm şişesi geçin. </li><li> Agaroz ayarlamak için tabak, bir saat boyunca akış kaputu açık bırakın. Sonra tabak kapatın ve 4 plakaları her tutacak büyük kare Petri, aktarabilirsiniz. Kare plakalar zekâ Sealh parafilm. Plakalar tamamen ayarlanır unutmayın, ve sonuç olarak, jel çok hassastır. Bakım tabak tutarken jel kırmamaya dikkat edilmelidir. Inkübatör tüm kare tabak yerleştirin. </li></ol> 4. Dönüştürülmüş Kolonileri Seçimi <ol><li> Koloniler dönüşüm plakaları 10 ila 21 gün sonra, ancak davalarını dönüştürdü plakalar üzerinde görünmelidir. Koloniler kesme ipuçları ile 200 ul pipet kullanmak toparlamak için. Sadece ücretsiz koloniler seçin ve yeşil koloni berbat. Komşu kolonilerden herhangi bir hücre dahil etmemeye dikkat edin. </li><li> Bir 24 kuyu plaka, seçimi ihtiva eden sıvı bir ortam, 2 ml kadar hücreleri transfer edin. Nourseothricin kullanıldığı zaman, 1.75 mg / ml kullanabilir. Aşağı pipetleme tarafından karıştırın. Dönüşüm başına 24-50 koloniler seçin. Parafilm ve inkübatör için transfer yüzeyleri. </li><li> Bir hafta sonra, 24 kuyu plaka seçimi ile 2 ml taze ASW her iyi 100 ul aktarmak ve bir additiona için büyümekl 7 gün. Hayatta kalan hücre çizgileri başka çalışmalar için kullanılabilir. Genomu ve ekleme numarasına Kararlı entegrasyon PCR ve Southern Blot kullanılarak analiz edilmelidir. Genomik DNA bitki DNA ekstraksiyonu için herhangi bir yere ölçekli standart metot kullanılarak bu amaçlar için elde edilebilir. </li></ol> 5.. Temsilcisi Sonuçlar Hücreler 1/100 7 gün boyunca gelişen sonra, mililitrede 25 milyon hücrelik bir yoğunlukta ulaşmıştır bölünür. Ayarları uygun olan hücrelerin elektroporasyon bir zaman sabiti 10 ila 14 milisaniye ile sonuçlanmıştır. Hücrelerinin kültür şişeleri içinde orta aktarıldığında, hücrelerin bir damlası oluşturması gerekir. Hafif bir saat sonra çalkalandı zaman, hücrelerin kolaylıkla tekrar süspansiyon gerekir. % 0.2 LMP agar içine 1 ml transforme hücreler dahil edilmesi tutarlı ama sadece yarı katı jel neden. Kolonileri 10 ile 21 gün sonra görünmelidir. dönüşüm başına yukarıda protokolünü kullanarak linearised DNA 5 mikrogram dönüştüren, 50-100 kolonilerplaka genellikle negatif kontrol plakalar üzerinde hiçbir karşılık, bekleniyordu. ~ Seçilmiş kolonilerin% 80 pozitif sıvı ortam içinde antibiyotik direnci ile seçilmiştir ve müteakip çalışmalarda kullanılan edildi. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> Stok çözelti </td><td> 1 litre için Hacmi </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td> 8.83 x 10 -4 M </td><td> 75 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> NH4CI </td><td> 3.63 x 10 -5 M </td><td> 2.68 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> β-gliserofosfat </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td> 2.16 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 1.29 mg / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Tris-bazlı (pH 7.2) </td><td> 1 x 10 -3 M </td><td> 121.1 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> K eser metal çözüm </td><td></td><td> Tablo 2 </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> f / 2 vitamini çözüm </td><td></td><td> Tablo 3 </td><td> 0,5 mL </td></tr></tbody></table> Tablo 1. O. büyüme için Orta bileşenlerin tauri 11, 12. 30 ppt tuzluluk bir yapay deniz suyu 1 litre toplam hacmi Makyaj ve belirtildiği gibi stok solüsyonlar yukarıda bileşenlerini ekleyin. Bir hafta içinde orta ve kullanım Filter-sterilize edin. Vitamin çözeltisi dışında bütün bileşiklerin stokları orta her bir litre için bu çözelti 6 ml eklemek için havuzlanmış edilebilir. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> Stok çözelti </td><td> 1 litre için Tutarı </td></tr><tr><td> Na 2 </sub&gt; EDTA • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -4 M </td><td></td><td> 41.6 g </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -5 M </td><td></td><td> 3.15 g </td></tr><tr><td> Na 2 Moo 4 • 2H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 6.3 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 22.0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 10.0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 180.0 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td> 1 x 10 -8 M </td><td> 9.8 g / L dH <sub&gt; 2 O </td><td> 1 mL </td></tr></tbody></table> Tablo 2. Metal çözüm 11,12 çiziniz. Bir dH 2 O 1 litre toplam, ve çözülmekte ısı kadar olun. Depolama için tablet çözümü ve dondurma. Final konsantrasyonları son ortamı değil, eser metal çözümü için verilmiştir. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> Stok çözelti </td><td> 1 litre için Tutarı </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 </td><td> 1 x 10 -10 M </td><td> 1 g / L dH 2 O </td><td> 1 mL </td></tr><tr><td> Biotin </td><td> 1 x 10 -9 M </td><td> 0.1 g / L dH 2 O </td><td> 10 mL </td></tr><tr><td> Tiamin • HCl </td><td> 1 x 10 -7 M </td><td></td><td> 200 mg </td></tr></tbody></table> Tablo 3. f / 2Vitamin çözümü 11. dH 2 O, filtre sterilize, tablet ve dondurucuda 1 litre toplam Makyaj. Nihai konsantrasyonlar nihai orta değil, vitamin çözeltisi için verilmiştir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig1.jpg" /> Şekil 1.. Dönüşüm işlemi grafiksel bakış. Genetik elektroporasyonla Ostreococcus tauri dönüştürme işlemi şematik gösterimi. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig2.jpg" /> Şekil 2. Kültür büyüme. Hücreler taze ASW 1/100 dilüsyon her 7 günde aseptik alt-kültür ve Ayışığı Mavi filtre takılmış bir bitki büyüme inkübatörde sabit ışık altında yetiştirilen. Işık yoğunluğu yaklaşık 20 mmol m -2 s -1 ° C Hücreler sürekli ajitasyon gerekmez 20 tutulur, ama s, gerekenagregasyonunu önlemek için her 2 ila 3 günde bir Haken. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4074/4074fig3.jpg" /> Şekil 3. % 0.2 LMP agaroz koloni oluşumu. Büyük bir kare Petri Transfer 4 plaka ve parafilm (sol üst) ile mühür. Koloniler oluşturdular zaman, sadece ücretsiz (ideal konik biçimli) koloniler (sağ üstte) seçin ve bir P200 pipetle plaka onları emmek. Negatif kontrol (sağ alt) üzerinde koloniler olmamalıdır.

<ol><li>Derelle, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+analysis+of+the+smallest+free-living+eukaryote+Ostreococcus+tauri+unveils+many+unique+features%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).</li>
<li>Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-D+ultrastructure+of+O.+tauri%3A+electron+cryotomography+of+an+entire+eukaryotic+cell%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell.</a> PLoS One. 2, e749(2007).</li>
<li>O'Neill, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+rhythms+persist+without+transcription+in+a+eukaryote%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote.</a> Nature. 469, 554-558 (2011).</li>
<li>van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteasome+function+is+required+for+biological+timing+throughout+the+twenty-four+hour+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle.</a> Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).</li>
<li>Troein, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+light+inputs+to+a+simple+clock+circuit+allow+complex+biological+rhythms%5BTitle%5D)+AND+%22Plant.+J%22%5BJournal%5D)">Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms.</a> Plant. J. 66, 375-385 (2011).</li>
<li>Corellou, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clocks+in+the+green+lineage%3A+comparative+functional+analysis+of+the+circadian+architecture+of+the+picoeukaryote+ostreococcus%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus.</a> Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).</li>
<li>O'Neill, J. S., Reddy, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circadian+clocks+in+human+red+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Circadian clocks in human red blood cells.</a> Nature. 469, 498-503 (2011).</li>
<li>Monnier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orchestrated+transcription+of+biological+processes+in+the+marine+picoeukaryote+Ostreococcus+exposed+to+light%2Fdark+cycles%5BTitle%5D)+AND+%22B.M.C.+Genomics%22%5BJournal%5D)">Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles.</a> B.M.C. Genomics. 11, 192(2010).</li>
<li>Le Bihan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+proteomic+analysis+of+the+unicellular+alga+Ostreococcus+tauri%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri.</a> J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).</li>
<li>Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. , 201001174050 (2010).</li>
<li>Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+of+marine+planktonic+diatoms.+I.+Cyclotella+nana+Hustedt%2C+and+Detonula+confervacea+%28cleve%29+Gran%5BTitle%5D)+AND+%22Can.+J.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran.</a> Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).</li>
<li>Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Media+for+the+culture+of+oceanic+ultraphytoplankton%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phycol%22%5BJournal%5D)">Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton.</a> J. Phycol. 23, 633-638 (1987).</li>
<li>Djouani-Tari, elB. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+phosphate-regulated+promoter+for+fine-tuned+and+reversible+overexpression+in+Ostreococcus%3A+Application+to+circadian+clock+functional+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis.</a> PLoS One. 6, e28471(2011).</li>
<li>Moulager, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+light+signals+by+the+retinoblastoma+pathway+in+the+control+of+S+phase+entry+in+the+picophytoplanktonic+cell+Ostreococcus%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS.+Genet%22%5BJournal%5D)">Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus.</a> PLoS. Genet. 6, e1000957(2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Hücresel devlet ve kültür axeny dönüşüm prosedürü için büyük önem taşır. Hücreleri, genellikle ışık 12 saat çevrimi içinde muhafaza edilmesine rağmen, 12 saat karanlık, bu şartlar altında yetiştirilen hücrelerinde dönüşümünün verim yetersiz olduğu bulunmuştur. Tekrarlanan peletleme / tabanda adımları sırasında hücreler her zaman kolaylıkla tekrar süspansiyon gerekir. Hücreleri agrega veya mukus benzeri bir madde varsa, tekrar baştan prosedürü başlatmak için daha iyidir. Tipik olarak, ~ 50 koloniler negatif kontrol plaka üzerinde hiç karşı, her dönüşüm plaka beklenebilir. Düşük dönüşümü verim durumda, kültürleme koşulları hücreleri optimum halindedir sağlamak üzere değiştirilebilir olmalıdır. Dönüşüm verimliliği etkileyen değişkenler ortam laboratuarında sıcaklıkta (yaklaşık 20 ° C olmalı) ve işleme hızı (hücre [2,3] kurtarma [2,7] peletleme gelen Prosedürü ~ 1 saat sürer) içerir. Aynı zamanda önemli olduğu bütün solüsyonlar,yeniden her dönüşüm öncesi taze yaptı. Plakalar dahil olmak için LMP agaroz konsantrasyonu Ostreococcus hücreleri yüksek agaroz konsantrasyonlarda büyümek olmaz. Çok önemlidir ve düşük konsantrasyonlarda karışacaktır. Ostreococcus için üç dönüşüm vektörleri daha önce 6 yayınlanmış olan ve daha vektörler oluşturulan ve kısa zamanda yayınlanacaktır bekleniyor. Potox vektör 6 Ostreococcus alınan güçlü uyarılabilir 13 promotor taşıyan ise mevcut vektör Pot-Luc 6, hızlı transgenik hat seçimini artı uysal ekspresyonu sağlayan bir C-terminal ateşböceği lusiferaz etiketi ile birlikte bir seçim promotor kullanılmasına izin verir ilgi genin ekspresyonu için yüksek afinite Fosfat Taşıyıcı (HAPT) geni. Potox-Luc vektör aşırı hatları dolaylı seçimi için kullanılabilecek ek bir lusiferaz işareti taşıyan, Potox türemiştir <s14&gt; kadar. Bu vektörler başarılı seçim işaretleyicilerini Nourseothricin ve G148 vardır. Bununla birlikte, birçok Ostreococcus hücreleri antibiyotikler dayanımı ve transjenik Ostreococcus hücrelerin seçilmesi için gerekli olan bileşiklerin konsantrasyonları konvansiyonel sistemlerin modeli (2 mg / ml) daha yüksektir. Süreci verimsiz görünür rağmen, hücreler ve bu işlem için gerekli plazmid DNA sayıda anlamlı bir engel teşkil etmektedir. Daha geniş bir sınırlama seçilebilir işaretleyici dayanıklı üretilen her satırı tüm yapı DNA entegre olduğunu kontrol etmek için ayrı ayrı analiz edilmesi gerekiyor. Biz seçilebilir marker başarılı ifadesi ilgi gerçek geninin ekleme uymadı hangi örnekler gözlemledim, yani kısmi entegrasyonlar oluşabilir. Açıkça, genom içine rastgele yerleştirilmesi de bu yöntemle ekleme sitenin hiçbir kontrolü olmadığı anlamına gelir, ve yöntemleri bhomolog rekombinasyon üzerine ased halen geliştirilmektedir. Ancak, yöntem, en iyi bilgi için, burada genetiği değiştirilmiş Ostreococcus hücreleri oluşturmak için şu anda sadece karakterize yöntemi açıklanmıştır. Ostreococcus tauri ancak son zamanlarda bir deneysel model organizma olarak kullanılan olduğu gibi, bu hücrelerin çalışma yöntemleri çoğu gelişmeye ve ilgili artan araştırma topluluğu tarafından rafine edilmesi muhtemeldir. Bu protokol insanların Ostreococcus ile çalışma başlatmak yardımcı olmak için tasarlanmıştır, ama hiçbir şekilde bu mikroalgi genomik dönüşümü hakkında bilmek olduğunu tüm tanımlamak için iddia edilir. Okuyucuları, küçük kuluçka farklılıklar (ışık seviyesi ve kalitesi) ve diğer parametreler var olacaktır olarak kendi ihtiyaçlarına göre bu protokol uyum ve muhtemelen bunun için gerekli sağlıklı kültürleri elde etmek için her bireyin laboratuvarda optimize edilmiş olması mümkün olacak yazarlar güven protokolü. Mastering sonra teknikleri, burada açıklananvektörler promotörleri bir dizi kontrolü altında ışıldayan, floresan veya diğer tagged füzyon hatları oluşturmak için inşa edilebilir. Bu heyecan verici yeni deney platformu karmaşık biyokimyasal sorunlar farmakolojik yaklaşımlar oldukça kolaylaştırdı 3 edildiği azaltılmış karmaşıklığı, bir ökaryot çözülüyor, nasıl çalışmak faydalı olacaktır.

<table border="1"><tbody><tr><td colspan="4"> Orta bileşenleri </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td colspan="2" > Katalog numarası </td><td> Satıcı </td></tr><tr><td> Instant Ocean Deniz Tuz </td><td colspan="3"> gelen <a href="http://amazon.co.uk" target="_blank">amazon.co.uk</a> veya <a href="http://rocketaquatics.co.uk" target="_blank">rocketaquatics.co.uk</a> </td></tr><tr><td> NaNO 3 </td><td colspan="2"> S5506-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> NH4CI </td><td colspan="2"> A9434-500G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Gliserol 2-fosfat disodyum tuzu hidrat </td><td colspan="2"> G9422-100G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> H 2 SeO 3 </td><td colspan="2"> 84.920-250G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ultra saf tris </td><td colspan="2"> 15504-020 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Na 2 EDTA • 2H 2 O </td><td colspan="2"> BPE120-500G </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> FeCl 3 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 157740 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Na 2 Moo 4 • 2H 2 O </td><td colspan="2"> 31.439-100G-R </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ZnSO 4 • 7H 2 O </td><td colspan="2"> Z0251 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CoCl 2 • 6H 2 O </td><td colspan="2"> 31277 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> MnCl 2 • 4H 2 O </td><td colspan="2"> 203.734-5G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> CuSO 4 • 5H 2 O </td><td colspan="2"> C8027 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Vitamin B 12 (Siyanokobalamin) </td><td colspan="2"> V2876 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Biotin </td><td colspan="2"> 47868 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Tiamin • HCl </td><td colspan="2"> T4625 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Ampisilin </td><td colspan="2"> A9518-25G </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Neomisin </td><td colspan="2"> N6386 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Kanamisin </td><td colspan="2"> K4000 </td><td> Sigma </td></tr><tr><td colspan="4"> Yetiştiricilik için Sarf Malzemeleri </td></tr><tr><td colspan="2"> Madde </td><td> Katalog numarası </td><td> Satıcı </td></tr><tr><td colspan="2"> Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T25 Süspansiyon Kültürleri </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T75 Süspansiyon Kültürleri </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T175 Süspansiyon Kültürleri </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td colspan="2"> DYP Şişe üst filtreler, 1L, tam </td><td> 99950T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> DYP Şişe üst filtreler, 500ml, </td><td> 99500T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> DYP Şişe üst filtreler, 250ml, </td><td> 99250T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> DYP Şişe üst filtreler, 150ml, </td><td> 99150T </td><td> Bioscience Helena </td></tr><tr><td colspan="2"> Marine Aquarium için Tuzluluk Ölçer </td><td> DSG-10 </td><td> Daeyoon </td></tr></tbody></table><table border="1"><tbody><tr><td colspan="3" > Dönüşümü için kimyasallar </td></tr><tr><td> Kimyasal </td><td> Katalognumara </td><td> Satıcı </td></tr><tr><td> D-sorbitol </td><td> S6021-1KG </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> Pluronic F-68 çözüm </td><td> P5556-100ML </td><td> Sigma </td></tr><tr><td> ClonNat </td><td> 51000 </td><td> Werner </td></tr><tr><td> Düşük erime noktası agaroz </td><td> 16520-050 </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td colspan="3"> Dönüşüm için Sarf </td></tr><tr><td> Madde </td><td> Katalog numarası </td><td> Satıcı </td></tr><tr><td> Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T25 Süspansiyon Kültürleri </td><td> 83.1810.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T75 Süspansiyon Kültürleri </td><td> 83.1813.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Doku Kültürü Flask T175 Süspansiyon Cultures Kanal Dökme ile havalandırılmış </td><td> 83.1812.502 </td><td> Starstedt </td></tr><tr><td> Greiner santrifüj tüpü 50ml </td><td> 227261 </td><td> GBO </td></tr><tr><td> Gen Verici / MicroPulser küvetler, 0.2 cm boşluk, 50 </td><td> 165-2086 </td><td> Bio-Rad </td></tr><tr><td> Petri yuvarlak PS 3 DELIKLERI H14.2 Φ55 </td><td> 391-0895 </td><td> VWR International </td></tr><tr><td> Işınlama net 120mm tarafından steril dört havalandırmaları polistiren ile Petri kare </td><td> FB51788 </td><td> Fisher Scientific </td></tr><tr><td> Ayışığı Mavi ışık filtresi </td><td> 183 </td><td> Lee Aydınlatma </td></tr></tbody></table>

picoeukaryote genomik dönüşüm<em&gt; ostreococcus tauri</em

Genomic Transformation of the Picoeukaryote Ostreococcus tauri

Bitki Bilimleri hızlı ilerleme engelleyen ortak sorunları hücresel, doku ve tüm organizmanın karmaşıklığı ve yüksek bitkiler basit genetik etkileyen genomik fazlalık özellikle yüksek düzeyde bulunmaktadır. Yeni model organizma Ostreococcus tauri bugüne kadar bilinen en küçük serbest yaşayan ökaryot ve başına en organellerin sadece biri (mitokondri, kloroplast, golgi yığını) varlığı ile kendini gösteren büyük oranda azaltılmış genom büyüklüğü ve hücresel karmaşıklık 1,2, sahip Hücre ve sadece ~ 8.000 gen içeren bir genomu. Dahası, unicellularity ve kolay bir kültür kombinasyonu kimyasal biyolojisi yaklaşımlara müsait bir platform sağlar. Son zamanlarda, Ostreococcus başarıyla sirkadiyen Timekeeping 3-6 altında yatan temel mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Bu model organizma sonuçları memeli biyoloji 7 bitki bilimi sadece etkiledi, ama var. Bu örnek, nasıl hızlı bir deney vurgulamaktadıryeşil soydan basit ökaryot yalnızca sınırlı karmaşıklığı bu arka planda teknik olarak uygulanabilir yöntemlerle sınanabilir hipotezler üretme, daha kompleks organizmalarda araştırma hızlandırabilir. Bir genom ve genler değiştirmek olanağı Bilgi herhangi bir model türler için temel araçlardır. Genetik Ostreococcus dönüştürmek için daha önce bildirilen yöntemler 6,10 dünyada çok az laboratuar bilinmektedir ise Genomik 1, Transkriptomik 8, ve bu türler için Proteomik 9 bilgiler, özgürce kullanılabilir. Bu makale, deney yöntemleri genetik elektroporasyon yoluyla yapı ayrıntılı olarak belirtildiği gibi dönüştürülmüştür hatları seçimi, bir kaynaklanan izin verecek şekilde düşük oranda agaroz in transforme hücreler dahil edilmesi metodu olan bir aşırı ekspresyonu ile Bu yeni model organizma dönüştürmeye tek hücre dönüştürdü. Ostreoco başarılı uygulama sonrasındasirkadiyen araştırma ccus, Ostreococcus artan bir ilgi biyoteknolojik alanlarda dahil olmak üzere bitki bilimleri, içinde ve dışında çeşitli araştırma alanları beklenebilir. Korunmuş biyokimyasal yollar üzerinde çalışmak biyoloji ve tıp bilimleri, geniş bir alanda araştırmacılar büyük bir model türlerinin genomik ve organizma karmaşıklığı ücretsiz Ostreococcus içinde takip araştırma, düşünebilirsiniz.

Bu makalede, tek hücreli deniz alg genetik dönüşümü anlatılmaktadır<em&gt; Ostreococcus tauri</em&gt; Elektroporasyonla. Bu ökaryot organizma büyük ölçüde azaltılmış genomik ve hücresel karmaşıklığı haiz ve hücre kültürü ve kimyasal biyoloji hem de kolayca uysal biri, yüksek bitkiler için etkili bir model platformdur.

Picoeukaryote genomik Dönüşüm<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Bitki Bilimleri'nde hızlı ilerlemeyi engelleyen yaygın sorunlar arasında hücresel, dokusal ve tüm organizma düzeyindeki karmaşıklık ve özellikle yüksek düzeydeki genomik...

Bu prosedürün genel amacı, yeni bir model organizma olan ve denizel bir piko ökaryotik alg türü olan Austria Occus Tori'nin stabil transgenik hatlarını oluşturmak ve seçmektir. Bu işlem, öncelikle transformasyon başına 50 mililitre yoğun ALG kültüründen hücre peletleri oluşturularak gerçekleştirilir. İkinci adımda, hücreler lineerleştirilmiş DNA ile karıştırılır ve ardından elektroporasyon uygulanır.Transform edilen hücreler taze ortamda seyreltilip gece boyunca inkübe edildikten sonra, karışıma %0,2 düşük erime noktalı agar ve selektif bir ajan ekleyin ve karışımı küçük Petri kaplarına dökün. Son adım, sabit mavi ışık altında iki ila üç haftalık inkübasyonun ardından büyümüş olacak olan kolonilerin seçilmesidir. Nihayetinde, sıvı ortamda seleksiyon ve ardından PCR ile southern blot gibi moleküler analizler, konstrüktün oluşturulan transgenik hatların genomuna başarılı entegrasyonunu göstermek için kullanılır.Bu organizmanın Arabidopsis gibi mevcut model organizmalara tercih edilmesinin temel avantajı, genomik karmaşıklığı büyük ölçüde azaltarak düzenleyici ağların neredeyse hiç genetik yedeklilik olmaksızın incelenmesine olanak tanımasıdır. Laboratuvarımda bitki sirkadiyen saatini incelemek için osteo occus kullanmış olsak da, bu organizma diğer birçok karmaşık hücresel ağın çalışılmasında da kullanılabilir. Dolayısıyla, bu tekniğin etkileri bitki biyolojisi alanının çok ötesine uzanmaktadır.Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritiktir çünkü bireysel adımlar oldukça basit görünse de, hücrelerin uygun şekilde taşınması ve verimli bir iş akışı, iyi bir sonuç elde etmek için esastır. Bu prosedürün bölümleri, bir laboratuvardan araştırma asistanı olan Culin Kish tarafından gösterilecektir. Austria Occus hücreleri yapay deniz suyunda veya SW'de kültürlenir; SW hazırlamak için litre başına 40 gram çözün.Deiyonize su içindeki deniz tuzları, ölçülen tuzluluk değeri bin başına 30 parça (PPT) olacak şekilde ayarlanır. Bir tuzluluk ölçer kullanarak zenginleştirici, besiyeri eser metal elementleri ve vitaminler eklenir; ardından, sürekli ışık altında deniz suyunda (SW) bulunan Austria cocus suş O TT H 95'in kaba hücreleri 0.22 mikronluk filtre üzerinden steril edilerek süzülür. Ay ışığı mavi filtresi ile donatılmış bir bitki büyüme inkübatöründe, ışık yoğunluğu saniyede metrekare başına yaklaşık 20 mikromol olmalı ve sıcaklık 20 °C'de tutulmalıdır; hücreler sürekli ajitasyon gerektirmez, ancak agregasyonu önlemek için iki ila üç günde bir kez çalkalanırlar.Bakım için, hücreleri her yedi günde bir taze SW ortamına 1:100 seyreltme oranında aseptik olarak pasajlayın. Her transformasyon için, mililitre başına 20 ila 30 × 10⁶ hücre yoğunluğunda 50 mililitre hücre gereklidir. Bu yoğunluğa, pasajlamayı takip eden beş ila yedi gün içinde ulaşılmalıdır.Yaklaşık hücre yoğunluğu ve ekseni, bir hemositometrede minimum 40 kat büyütme ile tahmin edilebilir veya tercihen akış sitometrisi ile belirlenebilir. Sağlıklı ve sağlıksız kültürlerin bir örneği burada gösterilmiştir.Her bir biyoparametrik grafik, y ekseninde yan saçılmayı (side scatter veya SSC) ve x ekseninde hücre başına düşen kırmızı floresansı (FL three) göstermektedir. FL three, klorofil kırmızı floresansını temsil ederken; SSC, göreceli hücre boyutunun bir göstergesidir. Sağlıklı hücreler Austria Occus penceresinin içinde yer alırken, ölen hücreler veya kontamine bakteriler bu pencerenin dışında kalır.İdeal olarak, hücrelerin %99'undan fazlası Austria Occus penceresinde olmalıdır. Verimli genetik transformasyon için, her transformasyon işleminde 1 µg/µL konsantrasyonunda beş mikrogram saf lineerize plazmid DNA gereklidir. Plazmid; transgende veya seçilim geninde değil, kullanılan vektörün omurgasında kesim yapan bir enzim ile steril deiyonize su içerisinde lineerize edilmiştir.DNA içeren mikro santrifüj tüpünü, her bir transformasyon için iki milimetrelik bir elektroporasyon küveti ile birlikte buz üzerinde tutun. Transforme edilecek her bir hücre hattı için DNA içermeyen bir kontrol gereklidir. Her bir transformasyon için, 50 mililitre hücreyi konik tabanlı bir tüpe aktarın, %0,1'lik nikotik asit F 68 ekleyin ve 10 °C'de 8.000 ×g'de 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Hücreleri peletlemek için süpernatantı hemen uzaklaştırın ve hücrelere bir mililitre Resus süspansiyon tamponu ekleyin. Hücreleri pipetleme yöntemiyle resüspande edin, bir mikrosantrifüj tüpüne aktarın ve 10 °C'de 8,000 ×g hızında 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Hızlıca çalışarak, ikinci santrifüj işleminden sonra hücreleri bir kez daha yıkayın.Her bir peleti 40 µL Resus süspansiyon tamponu içinde yeniden süspandirmek için bir P 200 ucunu kesin. Buz üzerinde bulunan lineerize DNA tüplerinin her birine 40 µL yeniden süspande edilmiş hücre ekleyin. Nazikçe karıştırın ve elektroporasyon küvetine aktarın.Küveti elektroporasyon cihazına yerleştirin. Ayarları sensör başına altı kilovolt, 600 ohm ve 25 mikro saniye olarak düzenleyin. Elektroporasyondan sonra hücrelere elektro-operasyon uygulayın.Küvetlerdeki hücreleri oda sıcaklığında 10 dakika boyunca inkübe edin. Bu süre zarfında, doku kültürü flasklarını etiketleyin ve her bir flaska 30 mililitre taze a SW ekleyin. Her flasktan bir mililitre a SW alın ve bunu nazikçe ilgili küvete ekleyip iki dakika boyunca inkübe edin.Ardından, hücre kümesini içeren steril suyu nazikçe çıkarın ve yavaşça doğrudan steril suyun içine pipetleyin. Kültür balonunda hücreler genellikle büyük bir küme halinde kalacaktır. Bu aşamada agregasyon oluşturmuş hücreleri sallamamaya veya rahatsız etmemeye dikkat edin. Hücrelerin inkübatörde bir ila iki saat boyunca toparlanmasına izin verin.Son olarak, flaskı manuel olarak çalkalayarak hücreleri yeniden süspande edin. Bu noktada, hücreler serbestçe süspande olmalı ve herhangi bir kümeleme görülmemelidir. Kültürlerin toparlanması için elektroporasyonun ertesi günü inkübatörde gece boyunca bekletin; ardından, içinde manyetik karıştırma çubuğu bulunan bir şişede, çift distile su içerisinde %2.1 düşük erime noktalı agar çözeltisini otoklavlayın.Isıtmalı manyetik karıştırıcı üzerindeki su dolu daha büyük bir beher içerisinde 65 ile 90 °C arasında erimiş halde tutun. Her transformasyon için, her biri 9 mL SW plus ve gerekli seçici ortam içeren sekiz adet 50 mm'lik Petri kabı ve sekiz adet 50 mL'lik tüp hazırlayın.Transforme edilmiş hücreleri inkübatörden alın. Bu prosedürün en zor kısmı, transforme hücreleri aşırı ısıya maruz bırakarak hücre bütünlüğünü bozmadan düşük yüzdeli agros jellerine dahil etmektir. Bu nedenle, prosedürün sonraki birkaç adımını steril bir laminar akışlı kabinde hızlı ve verimli bir şekilde gerçekleştirmek önemlidir.Dokuz mililitre SW'ye, kaynama noktasına yakın sıcaklıkta bir mililitre düşük erime noktalı agar ekleyin. Tüplerden birini kapatın ve karıştırmak için ters çevirin. Ardından, 0,5 mililitre taze transforme edilmiş hücre ekleyin. Tüpü hızla kapatıp karıştırmak için ters çevirin ve ardından içeriğini Petri kabına dökün.Bu işlemi geri kalan yedi tüp için tekrarlayın ve ardından bir sonraki transformasyon balonuna geçin. Dizinin yerleşmesi için plakaları laminar akışlı kabinde bir saat boyunca açık bırakın. Ardından plakaların üzerini kapatın ve her biri dört yuvarlak plaka alan büyük kare Petri kaplarına dikkatlice aktarın.Plaklar tamamen donmadığı için jel çok kırılgandır. Plakları taşırken jeli kırmamaya dikkat edin. Kare plakları parafilm ile kapatın ve inkübatöre yerleştirin.Koloniler ortaya çıktığında, kesme uçlu (cutoff) 200 microliter pipet kullanın. Steril bir kabin içerisinde koloni seçmek için, ayrık kolonileri belirleyin ve yeşil bir koloniyi çekerek alın. Komşu kolonilerden herhangi bir hücrenin karışmamasına dikkat edin.Hücreleri, seçici madde içeren iki mililitre sıvı besiyerine aktarın. 24 kuyucuklu bir plaka içerisinde, pipetle yukarı aşağı çekerek karıştırın. Transformasyon başına 24 veya 48 koloni seçtikten sonra, plakaları parafilm ile mühürleyin ve inkübatöre aktarın.Bir hafta sonra, her kuyucuktan 100 µL'yi seleksiyon içeren 2 mL taze SW'ye aktarın. 24 kuyucuklu bir plakada yedi gün daha büyütün. Hayatta kalan hücre hatları, 5 µg lineerize DNA transformasyonu yapılarak ileri çalışmalarda kullanılabilir.Bu protokol kullanıldığında, iki ila üç hafta sonra transformasyon plakası başına 20 ila 60 koloni görülmelidir. Seçilen kolonilerin yaklaşık %80'i sıvı ortamda antibiyotik direnci ile pozitif olarak seçilmiş ve bu prosedür takip edilerek sonraki çalışmalarda kullanılmıştır.Geliştirme aşamasından sonra, trench geninin eklenme sayısı ve konumunu doğrulamak amacıyla PCR veya Southern blot gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Bu teknik, sirkadiyen saat ve hücre döngüsü alanlarındaki araştırmacıların, yeni model organizma olan Austria Caucus. Tori'deki ilgili sistemlerin karmaşık bileşenlerini ve davranışlarını anlamalarını sağlamıştır. Bu videoyu izledikten sonra, transgenik Austria caucus hatlarının nasıl oluşturulacağı konusunda kapsamlı bir anlayışa sahip olmalısınız.

genomic-transformation-of-the-picoeukaryote-ostreococcus-tauri

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Protokol Metilotropik maya kullanarak protein ekspresyonu açıklar.

Rekombinant Proteinlerin Metilotropik maya İfade Pichia pastoris</em

Sistematik, büyük ölçekli sentetik gen (bir gen ya da gen-epistasis) etkileşim ekranlar genetik ve fazlalık yolu çapraz konuşma keşfetmek için kullanılabilir. Burada, yüksek-throughput kantitatif sentetik genetik dizi tarama teknolojisi tarif eSGA biz epistatik ilişkileri durulaştırmada ve genetik etkileşim ağları keşfetmek için geliştirilen...

Bakteriyel Fonksiyonel Ağlar ve tanımında Haritalama<em&gt; Escherichia Coli</em&gt; Sentetik Genetik Diziler kullanarak

Kaynak: Stefan, A., ve diğerleri, Escherichia coli'de Protein Birlikte Ekspresyonunun Çok Yönlü Faydaları. J. Vis. Uzm. (2015)Bu video, hücre hazırlama, elektroporasyon, geri kazanım ve transformantların seçimi dahil olmak üzere Escherichia coli'yi antibiyotik direnç geni taşıyan bir plazmit ile dönüştürme prosedürünü göstermektedir.

Yüksek Voltajlı Elektroporasyon Kullanılarak Bakterilerin Hazırlanması ve Dönüşümü

Enterobacter sp. YSU glukoz az tuz ortamında büyür. Oksotroflan rastgele bir konakçı genom içine kendisini ekleyen bir transposome ile dönüştürülmesiyle oluşturulur. Mutantlar minimal orta karmaşık ortamdan replika plaka tarafından bulundu. Kesilen gen, kurtarma ve dizileme ile tespit edilir.

Üretilmesi Enterobacter Sp. YSU oksotroflan transpozon mutajenezi kullanarak,

Protein ko-ekspresyonu, protein komplekslerinin in vitro olarak yeniden yapılandırılmasına güçlü bir alternatiftir ve in vivo biyokimyasal ve genetik testlerin gerçekleştirilmesinde yardımcı olur. Burada, protein kompleksleri elde etmek ve hücrelerin mutasyon frekansını ayarlamak için Escherichia coli'de protein ko-ekspresyonunun kullanımını rapor ediyoruz.

Protein birlikte-ifade edilme yönlü Faydalar<em&gt; Escherichia coli</em

Biyolistik dönüşüm homolog yeniden bağlama aracılığıyla fırsatçı patojen Cryptococcus neoformans genomuna DNA'nın kararlı bütünleşmesinin oluşturmak için kullanılan bir yöntemdir. Biz C.neoformans içine floresan etiket mCherry kaynaşmış kodlayan gen asetat kinaz olan bir yapı, biolistik dönüşümü gösterecektir.

Fırsatçı mantar patojenlere bir Floresan etiketli geninin biyolistik transformasyonu<em&gt; Cryptococcus neoformans</em

Geliştirmek dönüşümü, yönetmek ve probiyotik maya Saccharomyces boulardii heterolog protein ifadesini test etmek için kullanılabilecek tekniklerin birleşik bir açıklama burada sunulmuştur.

Farelerde oral sonda ardından Probiyotik Maya Dönüşümü ve Gastrointestinal Bağışıklık Dokular Onların Kurtarma

Sentetik Biyoloji Mühendisliği proteinlerin kanonik olmayan amino asitlerin co-translational ekleme kullanarak benzersiz özellikleri ile sağlar. Burada, GFP türü fluorophore "altın" floresan protein (GdFP) olarak adlandırdığı roman Floresans spektroskopik özellikleri ile hayalice kırmızı kaymıştır bir türevi E. coli seçici basınç birleşme (SPI) yolu ile nasıl üretilir sundu.

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Burada, Limosilactobacillus reuteri DSM20016 ile çalışmak, büyümeyi, plazmid dönüşümünü, koloni PCR'sini, floresan muhabir protein ölçümünü ve sınırlı plazmid mini hazırlığını detaylandırmak için protokollerin yanı sıra yaygın sorunları ve sorun gidermeyi sunuyoruz. Bu protokoller, DSM20016'daki muhabir proteinlerinin ölçülmesine veya muhabir dahil değilse koloni PCR ile doğrulanmasına izin verir.

Limosilactobacillus reuteri DSM20016'da Elektroporasyon ve Transformasyon Doğrulama Yöntemleri

Bu yazıda, Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus için antibiyotik sağkalımını değerlendirmek için kapsamlı bir protokol sunuyoruz, plazmitleri P. aeruginosa ve S. aureus'a dönüştürerek raportör suşlar oluşturmak ve persistanlar gibi fenotipik varyantları hızlandırılmış epifloresan mikroskobu ile görselleştirmek için.

Pseudomonas aeruginosa ve Staphylococcus aureus Heterojen Fenotiplerinin Hızlandırılmış Epifloresan Mikroskobu Görüntülemesi

Bu protokol, Saccharomyces eubayanus'ta transkripsiyonel aktivite ölçümlerine izin vererek, glikozdan maltoza geçişi izlemek, metabolik adaptasyonların gerçek zamanlı analizini sağlamak ve çeşitli koşullar altında endüstriyel fermantasyon için gerinim optimizasyonunu desteklemek için bir biyolüminesan raportör kullanır.

In vivo (İn canlı) Mayada Biyolüminesan Raportör Kullanılarak Metabolik Geçiş Sırasında Transkripsiyonel Aktivitenin İzlenmesi

Öğrenin, Ostreococcus tauri'de elektroporasyonla genetik dönüşüm yapmayı ve stabil transgenik hatlar üretmeyi. Bu yöntem, bitki biyolojisi ve hücresel ağ araştırmaları için değerli bir model sunar.

Picoeukaryote genomik Dönüşüm

Daha fazla video keşfet