Bir Fonksiyonlu Bis-Peptid Katı Faz Sentezi Metodolojisi "Güvenlik" Catch Kullanımı

Aşağıdaki deneyin genel amacı, katı faz teknikleri kullanarak işlevselleştirilmiş bir BSP peptidini sentezlemektir. Bu, korumalı bir BIS amino asidinin hidroksietil benzoik asit reçinesi üzerine yüklenmesiyle elde edilir. Daha sonra, BIS peptidini uzatan ve istenen işlevselliği gösteren bir işlem olan işlevselleştirilmiş bis amino asitleri bağlamak için derin koruma birleştirme döngüleri tekrarlanır.

Son olarak, ilk bis amino asidi, BIS peptidini reçineden DI Keto pirazin oluşumu ile ayırmak için bir alfa amino asit ile modifiye edilir. Sıvı kromatografi kütle spektrometresi analizine dayalı olarak iyi ham saflıkta ve yaklaşık %10'luk tutarlı izole verimlerde işlevselleştirilmiş bir BSP peptidinin başarılı sentezini gösteren sonuçlar elde edilir. Bu tekniğin etkileri, bis peptitlerinin paralel ve kütüphane sentezine doğru uzanır, çünkü BIS peptitleri, çözeltideki reaksiyonlardan daha kolay manipüle edilen katı bir reçine üzerine monte edilir ve yan ürünler filtrasyon ile kolayca çıkarılır.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü adımların çoğunun öğrenilmesi zordur, çünkü tüm reaksiyonların mümkün olduğunca yakın bir şekilde tamamlanmasını sağlamak için gerekli birçok önemli ayrıntı vardır. Katı faz sentezi ile ara ürünleri saflaştırmanın bir yolu yoktur. Bu nedenle, temiz bir nihai ürün elde etmek için, her reaksiyonun mümkün olduğu kadar uzağa sürülmesi gerekir.

Adımlar doğası gereği tekrarlayıcı olduğu için karışıklığı önlemek için deneysel prosedürlerden oluşan bir kontrol listesi oluşturmanızı öneririz. Bu protokol, ilk BSP peptidinin yüklenmesi, ilk BSP peptidinin korunması ve aynı anda reçine kapağı ile başlar. Başlamak için, 114 miligram H-M-B-A-A reçinesini tartarak ilk BSP peptidini sekiz mililitrelik bir reaksiyon kabına yükleyin ve manyetik bir karıştırma çubuğu ekleyin.

Kabın üst kısmını kauçuk septum ile kapatın ve tüpü Argonne ile en az beş dakika boyunca temizleyin. Bu arada, aktive edilmiş BIS amino asit çözeltisini yazılı protokolde açıklandığı gibi hazırlayın. Bu videoya eşlik eden solüsyonu şırınga ile reaksiyon kabına aktarın ve ertesi gün gece boyunca Argonne altında karıştırın, septumu çıkarın ve reaksiyon karışımını boşaltın.

Reçineye yaklaşık iki mililitre kloro metan ekleyerek reçineyi yıkayın. 30 saniye ila bir dakika karıştırın ve ardından boşaltın. Bu işlemi DCM ile dört kez tekrarlayın ve ardından reçineyi beş kez dimetilformamid ile yıkayın.

İlk bis amino asidin ve eşzamanlı reçine kapağının derinlemesine korunmasını sağlamak için, reaksiyon kabına yavaşça asetik asit ve DCM içinde% 33 hidrojen bromür çözeltisinden iki mililitre ekleyin. Reçineyi boşalttıktan ve DCM'de beş kez yıkadıktan sonra 15 dakika karıştırmaya bırakın. D koruma sırasını bir kez daha tekrarlayın.

Daha sonra, reçineyi DCM'de beş kez ve ardından DMF'de beş kez yıkayın, DMF'de% 5 hacimli, hacimsel D-I-P-E-A çözeltisi ile iki kez yıkayarak reçineyi nötralize edin. Daha sonra DCM ile beş kez ve DMF ile beş kez daha yıkayın. Şimdi korunan fonksiyonelleştirilmiş bis amino asidin birleştirilmesi gerçekleştirilebilir.

İlk olarak, susuz DCM ile üç kez yıkayarak reçine içeren reaksiyon kabına inert bir atmosferi yeniden verin. Daha sonra bir septum ve argonne hattı tahliyesi takın ve bir ila iki mililitre susuz DCM ekleyerek ve 30 saniye karıştırarak kabı yıkayın. Ardından, argonne hattı fıskiyesi yükselmeye başlayana kadar kabı boşaltın.

Bu işlemi en az bir kez daha tekrarlayın. Daha sonra, Argonne atmosferi altında alevle kurutulmuş bir test tüpünde işlevselleştirilmiş bir bis amino asit çözeltisi hazırlayın. 47 mikrolitre DIC ekleyin ve 90 dakika karıştırın.

Daha sonra 666 mikrolitrede 35 mikrolitre D-I-P-E-A ve reçineye hidrus DMF ekleyin ve beş dakika daha karıştırın. Önceden aktive edilmiş BIS amino asit çözeltisini şırınga yoluyla kaba aktarın ve ertesi gün gece boyunca karıştırın. Reaksiyon karışımını boşaltın ve argon altındayken susuz DCM ile iki kez yıkayın.

Bu prosedürdeki kritik bir adım, biz amino asit bağlantılarıdır. Di keto piperazin halkasının kapanmasını sağlamak için, ek aktive edici maddelerle daha uzun reaksiyon süreleri kullanıyoruz. Di keto pirazinin kapanmasını teşvik etmek için, bir HOAT ekleyin ve DIC çözeltisi ekleyin, bir saat boyunca argon altında karıştırın.

Daha sonra septumu çıkarın ve reaksiyon karışımını boşaltın. Reçineyi DCM ile beş kez ve DMF ile beş kez yıkayın. Bu bölüm, işlevselleştirilmiş BIS amino asidinin derin korumasını, F moc'un derin korumasını ve ilk BIS amino asidinin asilasyonunu kapsar.

Korunan işlevselleştirilmiş bis amino asidin derinlemesine korunmasını sağlamak için, reaksiyon kabına yavaşça iki mililitre TFA ve TIPS çözeltisi ekleyin ve boşalttıktan sonra bir saat karıştırın, reçineyi DCM ile yaklaşık 30 saniye yıkayın ve ardından boşaltın, DCM yıkamasını beş kez tekrarlayın. Ardından, A-D-C-M-D-M-F yıkamayı takiben tüm derin koruma reçinesi yıkama sırasını tekrarlayın. DMF'de %5 hacimce D-I-P-E-A çözeltisi ile iki kez yıkayarak reçineyi nötralize edin.

Ardından başka bir D-C-M-D-M-F yıkama yapın. Buradan, BIS peptidi diğer işlevselleştirilmiş bis amino asitleri ile uzatılabilir veya önde gelen nitrojen karboksilik asit veya her ikisi üzerinde işlevselleştirilebilir. FM grubunu korumak için, DMF'ye iki mililitrelik %20'lik bir boru paridin çözeltisi ekleyin ve reaksiyonu 20 dakika karıştırın.

Reçineyi DMF'de beş kez boşaltın ve yıkayın. Reçinenin ek bir yıkamasını takiben bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. A: Hazırlanan amino asit çözeltisini reaksiyon kabına ekleyerek ilk bis amino asidi izole edin ve son adım olarak altı saat karıştırın.

Reçineyi DCM ile beş kez ve DMF ile beş kez yıkayın. Bu protokolün son kısmı, reçineye bağlı amino asitten Bach grubunun çıkarılmasını ve reçineden bölünmeyi içerir. İlk olarak, reaksiyon kabına iki mililitre bire bir T-F-A-D-C-M çözeltisi ekleyin ve 30 dakika karıştırın.

Reçineyi DCM'de beş kez boşaltın ve yıkayın. Ardından bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Reçineyi 30 saniye boyunca, DCM ile beş kez ve DMF ile beş kez yıkayın ve boşaltın.

Daha sonra, susuz DMF'de% 10'luk bir D-I-P-E-A çözeltisinden iki mililitre ekleyin ve 24 ila 48 saat karıştırın. Son olarak, reaksiyon karışımını önceden tartılmış yuvarlak tabanlı bir şişeye toplayın. Bu çözeltinin 30 mikrolitresini bir lc MS dosyasında 450 mikrolitre Tetra Hydro FU'ya aktarın ve analiz için gönderin.

Reçineyi ilave DMF alikotları ile yıkayın ve yuvarlak tabanlı şişeye toplayın. Sentez boyunca reçine kimyasal dönüşümlerini izlemek için aşağıdaki yöntemler kullanılabilir. Serbest hidroksil gruplarını tespit etmek için, önce tek kullanımlık pipet ile yaklaşık bir miligram kuru reçineyi çıkararak metil kırmızısı testini gerçekleştirin.

Dört mililitrelik bir reaksiyon kabına durulayın. Metinde anlatıldığı gibi hazırlanmış bir metil kırmızı çözelti ekleyin ve beş ila 10 dakika karıştırın. Reçineyi DCM ile beş kez boşaltın ve yıkayın, turuncu veya kırmızı reçine boncukları, serbest hidroksil gruplarının varlığını gösterir.

Bu test, ilk bis amino asit ve reçine kapatma adımlarının yüklenmesini değerlendirmek için kullanılabilir. İkincil araçları tespit etmek için, yaklaşık bir miligram kuru reçineyi tek kullanımlık pipet ile küçük bir şişeye aktararak klor testini gerçekleştirin. DMF çözeltisine 0.8 milimolar kloral ve DMF çözeltisine% 2 asit aldehitten üç damla ekleyin.

Ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika oturalım. Bu durumda, mavi veya mor reçine boncukları, reçineye bağlı bileşik üzerinde serbest ikincil araçların mevcut olduğunun bir göstergesidir. Aktivasyon verimliliklerini doğrulamak için, aktivasyon tuzağı testini gerçekleştirin, sentez sırasında aktive edilmiş bileşik, aktive edilmiş çözeltinin beş ila 10 mikrolitresinin elle karıştırılmış 50 mikrolitre olain içeren bir sıvı kromatografi kütle spektrometresi şişesine aktarılmasıyla değerlendirilebilir.

Birkaç saniye boyunca çözelti sarı hale gelmeli, daha sonra 450 mikrolitre tetra hidro uran ile seyreltilmeli ve lc MS analizi için gönderilmelidir. Nihai ürün ve aktive edilmiş ara ürünler, bir C 18 ters fazlı kolon ve %0.1 formik asit içeren bir su asetil nitril çözücü sistemi ile donatılmış bir LCM S sistemi kullanılarak değerlendirilebilir. Bu L-C-M-S-U-V izi, ham ürünün iyi saflığına bir örnek sağlar.

Spektrumda 21.3 dakikada bulunan ana zirvenin, beklenen ürün kütlesi ile tutarlı bir maskeye sahip olduğu bulundu. Bu, ham ürünün kütle spektrumunda, kütleye karşılık gelen ana tepe noktalarını ortaya çıkaran tepe noktasında, ayrıca sodyum iyonunun kütlesinde ve ayrıca kütle eksi IV DDE koruma grubunun kütlesinde görselleştirilebilir. Burada gösterilen, 21.3 dakikada çok saf bir ürün ortaya çıkaran saflaştırılmış spektrumların LCMS UV izi ve bu saflaştırılmış trier zirvesinin kimliğini doğrulayan kütle spektrumudur.

Bu videoyu izledikten sonra, geliştirildikten sonra işlevselleştirilmiş bis peptitlerini sentezlemek için katı yüz tekniklerinin nasıl kullanılacağını iyi anlamış olmalısınız. Bu teknik, biz peptitleri alanındaki araştırmacıların, protein-protein etkileşimleri ve kataliz alanlarındaki uygulamaları keşfetmelerinin yolunu açtı. Bu teknik, uygun şekilde gerçekleştirilirse dört ila beş gün içinde işlevselleştirilmiş bir biz peptit trimerinin sentezine yol açabilir.

Bu prosedürü denerken, bu prosedürü takiben boncukları reaksiyon ve yıkama solüsyonlarına daldırmayı unutmamak önemlidir. Stereokimyanın veya alternatif işlevlerin protein bağlanması veya katalitik aktivite üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için paralel veya kütüphane sentezi gibi diğer yöntemler gerçekleştirilebilir. Organik reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun kişisel güvenlik ekipmanı ve çeker ocak kullanımı gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.