Name: Bir Fonksiyonlu Bis-Peptid Katı Faz Sentezi Metodolojisi Güvenlik Catch Kullanımı (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-05-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Öğrenin, fonksiyonel bis-peptid trimer sentezi için katı faz yöntemlerini ve güvenlik yakalama prosedürünü. Bu teknik, peptid kütüphane sentezi ve paralel üretim için uygulama potansiyeli sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar, yararlı tartışmalar için bu katı faz sentezi tekniği ve Matthew FL Parker ilk geliştirme Dr Zachary Z. Brown ve Jennifer Alleva teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Cephalon, Inc tarafından desteklenen Savunma Tehdit Azaltma Dairesi (DOD-DTRA) (HDTRA1-09-1-0009) ve Horst Witzel Burs Ödülü tarafından desteklenmektedir

1. Kurulum <ol><li> Katı faz sentezi için reaksiyon kurulum Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi, vakum altında kapalı bir filtreleme şişesine polipropilen hortumu aracılığıyla bağlı olan bir polipropilen filtre kartuş veya cam reaktör olup. Reaksiyon, bir manyetik karıştırma çubuğu ile veya reaktör ile azot gazı ile karıştırılabilir. </li><li> Bu reaksiyon kabına inert bir atmosfer altında bulunan imkan verir ve ambalajlarında gelen reaktiflerin çıkarılmasını sağlar gibi bir kurutma tüpü ve yağ bubbler ile donatılmış bir silindir Argon bağlanmış bir gaz manifoldu ayrıca tavsiye edilir. </li><li> Tüm işlemler bir çeker ocak ve uygun kişisel koruyucu ekipman (koruyucu gözlük, laboratuvar önlüğü ve nitril eldiven) gereklidir yapılmaktadır. </li></ol> 2. Reçine üstüne Bis-Peptid İlk Yükleme <ol><li> 8 ml reaksiyon kabı içerisine HMBA-AM Reçine (0.88 mmol / g yükleme, 100 mmol) 114 mg tartılır ve manyetik karıştırıcı ekleyin. Th tepe başlıken az 5 dakika argon ile bir lastik septum ve tahliye borusu ile e gemi. </li><li> Bu arada, Şekil 3 (586,63 g / mol, 2 eşdeğer) ve 1 59.2 mg bileşik 1 ile 117,3 mg ağırlığında - (mezitilen-2-sülfonil)-3-nitro-1 ,2,4-triazol (MSNT, 296.0 Bir 15 mL atılabilir santrifüj tüpüne g / mol, 2 eşdeğer) ve 2 ml susuz diklorometan (DCM) içinde çözülür. Eritilip solüsyon ve karışımına 1-metilimidazol (NMI, 80,81 mL / mol, 3 eşdeğer) 24 uL ekleyin. </li><li> Şırınga yoluyla reaksiyon kabına aktarılması çözeltisi aktive edilmiş ve gece boyunca argon (~ 10 saat) karıştırılmasına izin verir. </li><li> Septum çıkarın ve reaksiyon karışımı süzün. DCM (5x) ve dimetilformamit (DMF) (5x) ile reçine yıkanır. Reçine yükleme derecesini değerlendirmek için bölüm 10.1 açıklanan &quot;metil kırmızısı testi&quot; yapın. Reçine metil kırmızısı testi sırasında kırmızı kalırsa daha sonra 2.2 ve 2.3 tekrarlanması gereken adımlar. Olumsuz bir metil kırmızısı testi göstergesidir sarı bir renk, tercih edilir;Ancak, kalan hidroksil grupları sonraki adım, biraz daha pozitif sonuç (açık turuncu renkli reçine) kapağı kapatılmış olacak beri kabul edilebilir. </li></ol> 3. Kapatma İlk Bis-Peptid ve Simultane Reçine deproteksiyonu <ol><li> Reaksiyon kabına DCM 1 mL sonra 30 saniye (köpürme meydana) içinde damla damla asetik asit içinde 1 mL% 33 hidrojen bromür ilave ve 15 dakika için karıştırılmaya izin verir. DCM (5x) ile reçine boşaltın ve yıkayın sonra bir kez daha işleyecek tekrarlayın. </li><li> DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır. N, bir% 5 v / v çözeltisi, DMF içinde bir N-diizopropiletilamin (DIPEA) daha sonra DCM (5x) ve tekrar DMF (5x) ile yıkama ile iki kez yıkanarak reçine nötralize. &quot;Metil kırmızısı testi&quot; ve bölüm 10.1 ve 10.2 tartışılan &quot;kloranil testi&quot; yapın. Sonuçlar kloranil test için metil testi kırmızı ve pozitif negatif olmalıdır. </li></ol> 4. Kavrama Boc / tBu-Korumalı Fonksiyonlu Bis-AmiHiçbir Asit <ol><li> Susuz DCM ile üç kez yıkanarak reçine içeren reaksiyon teknesine bir inert atmosfer reintroduce daha sonra bir septum ve argon hattı takın. Temizlemek ve susuz DCM 1-2 ml ekleyerek ve argon hattı bubbler yükselmeye başlayıncaya kadar sonra geminin boşaltılması 30 saniye boyunca heyecan vererek gemi yıkayın. En az bir kez daha yapın. </li><li> Bir alev kurutulmuş test DMF: bis-amino asit (3eq.) ve 2:1 DCM 2 mL, 1-hidroksi-7-azabenzotriazole (HOAt, 136,11 g / mol, 18eq) ile fonksiyonelleştirilmiş 245 mg 0.15 M çözeltisi hazırlayın argon atmosferi altında bir tüp. Diisopropilkarbodiimide 47 uL (DIC, 156.6 ml / mol, 3eq.) ekleyin ve 90 dakika daha çırpın. </li><li> Reçineye 666 uL susuz DMF içinde 35 uL DIPEA (174,19 mL / mol, 2 eşdeğer) ekleyin ve 5 dakika için karıştırılmıştır izin verir. </li><li> Şırınga yoluyla reaksiyon kabına pre-aktive bis-amino asit çözeltisi aktarılır ve gece boyunca karışmaya izin verir. </li><li> Reaksiyon karışımı akmasını ve susuz DCM ile iki kez yıkayıp altında iken<html> argon. </li><li> Diketopiperazine kapanması teşvik etmek için, 1:1 DCM bir 4 mL HOAt (136,11 g / mol, 10eq) ve DIC (156.6 mL / mol, 10eq) ve bir 0.25 M solüsyon ilave: DMF ve argon altında karıştırılır izin 1 saat karıştırıldı. </li><li> Septum çıkarın ve reaksiyon karışımı süzün. DCM (5x) ve DMF (5x) ile reçine yıkanır. Eğer istenirse, bölüm 10.2 tartışılan &quot;kloranil test&quot; gerçekleştirin. </li></ol> 5.. Boc / tBu-Korumalı Fonksiyonlu Bis-Amino Asit deproteksiyonu <ol><li> Reaksiyon kabına triisopropylsilane (TIPS) ve 1 saat için karıştırılmaya izin: 95:5 trifluororacetic asit (TFA) solüsyonu 2 ml ilave edilir. Suyunu süzün ve daha sonra bir kez daha işlemi yineleyin DCM (5x) ile yaklaşık 30 saniye reçine yıkayın. </li><li> DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır. Daha sonra DCM (5x) ve tekrar DMF (5x) yıkayıp DMF içinde DIPEA bir% 5 v / v çözeltisi ile iki kez yıkanarak reçine nötralize. Eğer istenirse, bölüm 10.2 tartışılan &quot;kloranil test&quot; gerçekleştirin. </li></ol>bis-peptid hedef sentezlemek için istediğiniz gibi le &quot;&gt; 6. adımları tekrarlayın 4 ve 5. 7. Bis-Peptid Prolidine End göstermeye çalışıyor <ol><li> Büyüyen bir bis-peptid prolidine ucu bir diketopiperazine aracılığıyla tek tek veya birlikte asilatlanabilir. Ayrıca, bu amaçla serbest amino asit affording, ikinci parçalanabilen edilecek olan, korunan bırakılabilir. İsterseniz, kaplin verimliliğini değerlendirmek için bölüm 10.2 tartışılan &quot;kloranil test&quot; gerçekleştirin. </li></ol> 8. Bis-Peptid Kuvaterner sonu Fmoc ve Açilleme deproteksiyonu <ol><li> 20 dakika boyunca DMF içinde% 20 piperidin bir 2mL solüsyonu ilave edilir ve reaksiyon karıştırılır. DMF (5x) ile reçine boşaltın ve yıkayın sonra bir kez daha işlemi tekrarlayın. </li><li> DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır. </li><li> 114 mg 2 ile N-metilpirrolidon 2 mL (NMP) amino asit (3eq.) bir 0.15 M solüsyon hazırlanır - (7-aza-1 H-benzotriazol-1-il) -1,1,3,3-<html> (HATU, 380.2 g / mol, 3 eşdeğer) ve 104.5 uL DIPEA (174,19 mL / mol, 6EQ) ve iyice karıştırın. Reaksiyon kabına ekleyin ve 6 saat boyunca karıştırılır izin verir. </li><li> DCM (5x) daha sonra DMF (5x) ile reçine yıkanır. </li></ol> 9. Reçine gelen Amino Asit ile Cleave Bound reçineden Boc grubu çıkarın <ol><li> Reaksiyon kabına DCM çözeltisi ve 30 dakika için karıştırılmaya izin: a 1:01 TFA 2 ml ilave edilir. DCM (5x) ile reçine boşaltın ve yıkayın sonra bir kez daha işleyecek tekrarlayın. </li><li> Sonra DCM (5x) DMF (5x) ile 30 saniye reçine yıkayın ve süzün. </li><li> Susuz DMF içinde% 10 DIPEA bir çözelti 2 mL ekleyin ve 24-48 saat için karıştırılmaya izin verir. </li><li> Önceden tartılmış yuvarlak dipli bir balona Reaksiyon karışımı Collect. LC-MS, bir şişe içinde THF içinde 450 uL Bu çözeltinin 30 uL transferi ve analiz için teslim. DMF ilave alikotları ile reçine yıkanır ve yuvarlak dipli bir balona toplamak ve sonra solvent vakumda kaldırın. </li></ol>&quot;dflinebreak&gt; 10. Bis-Peptid saflaştırılması <ol><li> HPLC flakon yerleştirmeye dimetil sülfoksit (100-250 uL) ve transfer bir asgari tutarda bis-peptid ham eritin. Yarı-prepitive HPLC sistemi (Hewlett Packard 1100 Serisi) ile otosampler&#39;li içine Yeri insert bir Xterra Hazırlık MS C18 5 mikron 7.8x150 mm sütun ve 100 uL enjeksiyon loop ile donatılmıştır. </li><li> 274 nm&#39;de izlerken 30 dakika içinde% 0.1 formik asit ile su içinde% 5-95 asetonitril gradyan programı kullanılarak örnek 50 uL birden fazla enjeksiyon gerçekleştirmek. Önceden tartılmış tek santrifüj tüpündeki ürünü pik toplayın ve bir lyophilizer kullanılarak kuru dondurma. Dikkat tipik olarak görülür analitik LCMS göre pik tutma süresi hafif bir kayma olarak ilk çalıştırma ile alınmalıdır. </li></ol> 11. Değerlendirme Yöntemleri <ol><li> METİL KIRMIZI TEST 7: Pipet ile kuru reçine ~ 1 mg çıkarın ve 4 mL reaksiyon kabı içerisine durulayın. 500 uL susuz DCM içerisinde 20 mg metil kırmızı, 50 uL N, N&#39;-diizopropilkarbodiimid (DIC), ve 5 mg 4-dimetilaminopiridin (DMAP) içindeki bir çözeltisine ilave edip 5-10 dakika için karıştırılmaya izin verir. Boşaltın ve süzüntü renksiz hale gelinceye kadar DCM ile reçine yıkayın. Pozitif göstergesi turuncu veya kırmızı kalan reçine boncuk olduğunu. </li><li> Kloranil TEST 12: Transfer ~ pipet aracılığıyla küçük bir şişeye kuru reçine 1 mg. Bir 0,8 mM DMF çözelti içinde kloranil ve DMF solüsyonu içinde% 2 asetaldehit hem 3 damla ekleme ve 5-10 dakika boyunca oda sıcaklığında bekletilir. Pozitif göstergesi mor / mavi dönüm reçine boncuk olduğunu. </li><li> AKTİVASYON TRAP TEST: sentezi sırasında aktive bileşikler, bir sıvı kromatografi-kitle spektrometresi (LC-MS) pirolidin 50 uL ihtiva eden bir şişeye aktive çözeltisi küçük bir miktarda (5-10 uL) aktararak değerlendirilebilir. Birkaç saniye için elle karıştırın (solutiüzerine tetrahidrofuran (THF) 450 uL ile sulandırmak ve LC-MS analiz için teslim sonra) sarı olmalıdır. </li><li> Analitik LC-MS: nihai ürün ve aktive edilmiş ara ürünler, bir Waters Xterra MS C18 3,5 um ile donatılmış bir HP 1200 serisi LC-MS sistemi kullanılarak değerlendirilebilir 4.6 mm x 150 mm sütun ve su içinde% 5-95 asetonitril oluşan bir gradyan sistemi 30 dakika içinde% 0.1 formik asit ile. </li></ol> 12. Temsilcisi Sonuçlar Bir hem ham örnek (Şekil 4) ve saflaştırılmış (Şekil 5) LCMS izleri sağlanmaktadır. Yaklaşık% 10 verim saflaştırılmış yukarıda açıklanan yöntemler kullanılarak tahmin edilmektedir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig1.jpg" /> Şekil 1. Katı Faz Sentezi için deneysel Set-Up diyagramı. <img alt="Şekil 2" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig2.jpg" /> Şekil 2.Bis-Amino Asitler / Bis-Peptitler ilgili isimlendirme. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig3.jpg" /> Şekil 3. Genel Sentez şeması. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4112/4112fig3large.jpg" target="_blank">büyük rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 4a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4a.jpg" /> Şekil 4a. 274 nm&#39;de Ham Ürün HPLC Trace. <img alt="Şekil 4b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig4b.jpg" /> Şekil 4b. Ham Ürün Peak MS Spektrumu. <img alt="Şekil 5a" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5a.jpg" /> Şekil 5a. 274 nm&#39;de Ürün Saflaştırılan HPLC Trace. <img alt="Şekil 5b" src="/files/ftp_upload/4112/4112fig5b.jpg" /> Saf Product Şekil 5b. MS Spektrumut Tepe.

<ol><li>Atherton, E., Sheppard, R. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAtherton%2C+E+%22Solid+Phase+Peptide+Synthesis%3A+A+Practical+Approach%22">Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (1989).</li>
<li>Brown, Z. Z., Alleva, J., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid-Phase+Synthesis+of+Functionalized+Bis-Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Biopolymers%22%5BJournal%5D)">Solid-Phase Synthesis of Functionalized Bis-Peptides.</a> Biopolymers. 96, 578-585 (2010).</li>
<li>Schafmeister, C. E., Brown, Z. Z., Gupta, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shape-Programmable+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acc.+Chem.+Res%22%5BJournal%5D)">Shape-Programmable Macromolecules.</a> Acc. Chem. Res. 41, 1387-1398 (2008).</li>
<li>Brown, Z. Z., Schafmeister, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+Hexa-+and+Pentasubstituted+Diketopiperazines+from+Sterically+Hindered+Amino+Acids%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Let%22%5BJournal%5D)">Synthesis of Hexa- and Pentasubstituted Diketopiperazines from Sterically Hindered Amino Acids.</a> Org. Let. 12, 1436-1439 (2010).</li>
<li>Nielson, J., Lyngso, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatorial+Solid-Phase+Synthesis+of+Balanol+Analogues%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">Combinatorial Solid-Phase Synthesis of Balanol Analogues.</a> Tet. Lett. 37, 8439-8442 (1996).</li>
<li>Blankemeyer-Menge, B., Nimtz, M., Frank, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Efficient+Method+for+Anchoring+Fmoc-Amino+Acids+to+Hydroxyl-Functionalized+Solid+Supports%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">An Efficient Method for Anchoring Fmoc-Amino Acids to Hydroxyl-Functionalized Solid Supports.</a> Tet. Lett. 31, 1701-1704 (1990).</li>
<li>Komba, S., Sasaki, S., Machida, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+New+Colorimetric+Test+for+Detection+of+Hydroxyl+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Tet.+Lett%22%5BJournal%5D)">A New Colorimetric Test for Detection of Hydroxyl Groups in Solid-Phase Synthesis.</a> Tet. Lett. 48, 2075-2078 (2007).</li>
<li>Demner, O., Dijkgraaf, I., Schottelius, M., Wester, H. J., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+of+Functional+Groups+into+Peptides+via+N-Alkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Org.+Lett%22%5BJournal%5D)">Introduction of Functional Groups into Peptides via N-Alkylation.</a> Org. Lett. 10, 2015-2018 (2008).</li>
<li>Plas, S. E. V. ander, Van Hoeck, E., Lynen, F., Sandra, P., Madder, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Toward+a+New+SPE+Material+for+EDCs%3A+Fully+Automated+Synthesis+of+a+Library+of+Tripodal+Receptors+Followed+by+Fast+Screening+by+Affinity+LC%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Org.+Chem%22%5BJournal%5D)">Toward a New SPE Material for EDCs: Fully Automated Synthesis of a Library of Tripodal Receptors Followed by Fast Screening by Affinity LC.</a> Eur. J. Org. Chem. 11, 1796-1805 (2009).</li>
<li>Kaiser, E., Colescot, R. L., Bossinger, C. D., Cook, P. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Color+Test+for+Detection+of+Free+Terminal+Amino+Groups+in+Solid-Phase+Synthesis+of+Peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Color Test for Detection of Free Terminal Amino Groups in Solid-Phase Synthesis of Peptides.</a> Anal. Biochem. 34, 595-598 (1970).</li>
<li>Chan, W. C., White, P. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChan%2C+WC+%22Fmoc+Solid+Phase+Peptide+Synthesis%3A+A+Practical+Approach%22">Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach</a>. , Oxford University Press. (2000).</li>
<li>Vojkovsky, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Secondary+Amines+on+Solid-Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Peptide+Research%22%5BJournal%5D)">Detection of Secondary Amines on Solid-Phase.</a> Peptide Research. 71, 236-237 (1995).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada sunulan sentetik bir yaklaşım sık katı-faz peptid sentezi yöntemleri kullanılarak bis-amino asit inşa edici bloklar fonksiyonlandırılmış bis-peptid sentezi için bir yöntem sağlar. Trans-4-hidroksiprolin 3 bu &quot;Pro4&quot; yapı taşlarından monomer sentezi yüksek ölçeklenebilir ve başarılı bir 600 mg (234 gr) ölçeği (yayımlanmamış) de hidantoin aşaması tamamlanmıştır. Monomerler yandan yerleştirildikten sonra, katı-faz tekniklerin kullanımı reaksiyon work-up ve ara saflaştırılması için ihtiyacı ortadan kaldırarak, mevcut çözelti faz yöntemleri 4 den bis-peptid sentezi daha hızlı bir yöntem sağlar. Katı faz sentezinde primer zorluğun, ara izole edilir yana çözme sentetik ilerleme ve problem teşhis edilir. Bu tanımlamak için de dahil olmak üzere pek çok kolorimetrik testlerin gelişmesine yol açmıştır halinde serbest aminlerin (Kaiser Testi 10) ya da serbest hydroxYLS (Metil Red Testi 7) reçine maruz kalmaktadır. Ne yazık ki, yaygın olarak kullanılan Kaiser Testi 10, bir kuaterner karbona bağlı sekonder aminler ya aminlerin hemen özel kullanımına bağlı olarak bizim katı-faz sentezi genel olarak uygulanabilir değildir. HMBA reçine değerlendirmesi için diğer seçenekler gibi hidrazin 11, UV / Vis 1,11 ile takip kantitatif Fmoc bölünme gibi bir nükleofil kullanarak ve yakalama ve gelen aktif bileşikler analiz testi bölünmelere içerir. Katı-faz sentezi dahilinde bir başka sorun, göz ardı operatör tarafından istenen sentetik adımlardan tekrarlanan olmasıdır. Bu zihin ile herhangi bir manuel katı-faz peptid sentezi gerçekleştirirken, yazarlar güçlü bir elektronik tablo veya kontrol listesi kullanmanızı öneririz. Ortak bir α-amino asit ile karşılaştırıldığında bir katı-faz sentezi için bis-peptidler kullanarak zor sterik hin nedeniyle daha zor kavramaları için potansiyel içerirdrance, on-reçine diketopiperazine kapatma ihtiyacı ve aynı anda deprotections (Boc / tBu; Cbz / tBu). Başka daha zor geleneksel yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu &quot;emniyet mandalı&quot; yöntemi ile reçineden sayısal yayın elde yatmaktadır. Akılda bu faktörler ile, bu yöntemin daha optimizasyonu sağlanır ve mevcut çabaları burada sunulan yöntemi geliştirmek için grubumuzda sürmektedir edilebilir olması çok mümkündür.

<table border="1"><tr><td> Isim </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> HMBA-Am Reçine </td><td> Novabiochem </td><td> 855018 </td><td></td></tr><tr><td> MSNT </td><td> Novabiochem </td><td> 851011 </td><td></td></tr><tr><td> NMI </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 336092 </td><td> Toksik, aşındırıcı </td></tr><tr><td> DCM </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> <a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/ProductDetail.do?lang=en&amp;N4=D65100%7CSIAL&amp;N5=SEARCH_CONCAT_PNO%7CBRAND_KEY&amp;F=SPEC" target="_blank">D65100</a> </td><td> Kanserojen </td></tr><tr><td> Susuz DCM </td><td> Acros </td><td> 34846 </td><td> Kanserojen </td></tr><tr><td> Asetik asit içinde% 33 hidrojen bromür </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 248630 </td><td> Toksik, Corrosive, Duman zaman açık </td></tr><tr><td> DIPEA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 387649 </td><td> Korozif, toksik, Parlayıcı </td></tr><tr><td> DMF </td><td> Fisher Scientific </td><td> AC27960 </td><td> Toksik, yanıcı </td></tr><tr><td> Susuz DMF </td><td> Acros </td><td> 34843 </td><td> Toksik, yanıcı </td></tr><tr><td> HOAt </td><td> GenScript </td><td> C01568 </td><td></td></tr><tr><td> DIC </td><td> Acros </td><td> BP590 </td><td> Korozif, toksik, Parlayıcı </td></tr><tr><td> TFA </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> T6508 </td><td> Toksik, aşındırıcı </td></tr><tr><td> İPUÇLARI </td><td> Acros </td><td> 21492 </td><td> Toksik, yanıcı </td></tr><tr><td> Piperidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 104094 </td><td> Korozif, toksik, Parlayıcı </td></tr><tr><td> HATU </td><td> GenScript </td><td> C01566 </td><td&gt; Toksik </td></tr><tr><td> NMP </td><td> Acros </td><td> 36438 </td><td> Toksik </td></tr><tr><td> DMAP </td><td> Novabiochem </td><td> 851055 </td><td> Toksik </td></tr><tr><td> Metil Red </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 250198 </td><td></td></tr><tr><td> THF </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> 401757 </td><td> Şekillendirme yanıcı, toksik, Peroksit </td></tr><tr><td> Pirolidin </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> P73803 </td><td> Korozif, toksik, Parlayıcı </td></tr><tr><td> Dimetil Sulfoxide </td><td> Balıkçı </td><td> D1281 </td><td></td></tr><tr><td> SPPS&#39;si Reaksiyon Gemileri </td><td> Zarafet </td><td> 211108 </td><td></td></tr><tr><td> LCMS </td><td> Agilent </td><td> 1200 Serisi </td><td></td></tr><tr><td> Yarı Hazırlık LC </td><td> Hewlett Packard </td><td> 1100 Serisi </td><td></td></tr><tr&gt; <td> Lyophilizer </td><td> Labconco </td><td> 7934027 </td><td></td></tr><tr><td> Rotovapor </td><td> Buchi </td><td> R-210 Serisi </td><td></td></tr><tr><td> Argon </td><td> Airgas </td><td> AR PP300CT </td><td></td></tr></table>

bir fonksiyonlu bis-peptid katı faz sentezi metodolojisi &quot;güvenlik&quot; catch kullanımı

Solid Phase Synthesis of a Functionalized Bis-Peptide Using "Safety Catch" Methodology

1962 yılında, RB Merrifield verimli bir peptid sentezi için yeni bir yol olarak katı-faz peptid sentezi ile ilk yayınlanmış prosedürü. Bu teknik, hızlı zaman ve emek hem de çözüm fazlı önceki üzerinden avantajlı olduğunu kanıtladı. Sağlam bir destek niteliği ile ilgili Gelişmeler, koruyucu gruplar istihdam ve son beş yılda istihdam kaplin yöntemleri yalnızca Merrifield orijinal sistemin yararlılığı artmaktadır. Günümüzde, bir Boc-bazlı koruyucu ve baz / nükleofil yarılabilir reçine strateji veya Fmoc-bazlı koruma ve asidik reçine yarılabilir stratejisinin kullanımı, en yaygın olarak 1 peptit sentezi için kullanılır, RC Sheppard öncülük. Merrifield en katı destek stratejisi esinlenerek, biz burada açıklanan fonksiyonlandırılmış bis-peptidler 2, montaj için bir Boc / tert-bütil katı-faz sentezi bir strateji geliştirdik. T karşılaştırıldığında, katı-faz sentezi ile kullanılmako çözelti faz yöntemleri Merrifield 1 tarafından tarif edildiği gibi zaman ve hem de çalışma avantajlı olarak, yalnızca değil ama aynı zamanda bis-peptid kütüphaneleri sentezinde daha kolay bir şekilde sağlar. Burada göstermektedir ki sentezi iki adımlı bir diketopiperazine oluşumu ile reçineden bis-peptit fonksiyonlandırılmış serbest bırakmak için mekanizması &quot;emniyet yakalamak&quot; kullanan bir son bölünme aşaması içerir. Bis-peptidler tipi ve stereokimyasal monomer birimlerinden ve her bir monomer arasındaki bağlantı ile kontrol edilen bir tahmin edilebilir ve designable şekilde, işlevselliği konumlandırmak için mümkün olan bis-amino asit, katı, spiro-merdiven oligomerler vardır. Her bir bis-amino asit, iki amino asit (bir α-amin ile bir karboksilik asit) 3,4 içeren bir stereokimyasal olarak saf, siklik iskelesi olup. Laboratuvarımız şu kataliz, protein-protein etkileşimleri ve n de dahil olmak üzere, geniş bir alan üzerinde çeşitli işlevsel bir bis-peptidlerin potansiyeli soruşturmaanomaterials.

Bir HMBA reçineden Yarılma Prosedürü: &quot;emniyet yakalamak&quot; kullanılarak, bir fonksiyonlandırılmış bis-peptit trimerininkinden verimli bir katı-faz peptid sentezi açıklanmaktadır.

Bir Fonksiyonlu Bis-Peptid Katı Faz Sentezi Metodolojisi &quot;Güvenlik&quot; Catch Kullanımı

1962 yılında R.B. Merrifield, peptidleri verimli bir şekilde sentezlemek için yeni bir yol olarak katı faz peptid sentezini kullanan ilk prosedürü yayınladı. Bu ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, katı faz tekniklerini kullanarak fonksiyonelleştirilmiş bir BSP peptit sentezlemektir. Bu işlem, korumalı bir BIS amino asidinin hidroksietil benzoik asit reçinesine yüklenmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, fonksiyonelleştirilmiş bis amino asitleri eklemek için derin koruma kenetleme döngüleri tekrarlanır; bu süreç BIS peptidini uzatır ve istenen fonksiyonelliği sağlar.Son olarak, DI Keto pirazin oluşumu yoluyla BIS peptidini reçineden ayırmak için ilk bis amino asit, bir alfa amino asit ile modifiye edilir. Sıvı kromatografisi kütle spektrometrisi analizi baz alındığında, fonksiyonelleştirilmiş bir BSP peptidinin iyi ham saflıkta ve yaklaşık %10'luk tutarlı izole verimlerle başarılı bir şekilde sentezlendiğini gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin etkileri, bis peptidlerin katı bir reçine üzerinde birleştirilmesi nedeniyle paralel ve kütüphane sentezlerine kadar uzanmaktadır; zira bu yöntem, çözeltideki reaksiyonlara göre daha kolay manipüle edilebilir ve yan ürünler filtrasyonla kolayca uzaklaştırılabilir.Birçok adımın öğrenilmesinin zor olması nedeniyle bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır; çünkü tüm reaksiyonların mümkün olduğunca tamamlanmasını sağlamak için birçok önemli detaya ihtiyaç vardır. Katı faz sentezinde ara ürünleri saflaştırmanın bir yolu yoktur. Bu nedenle, temiz bir nihai ürün elde etmek için her reaksiyon mümkün olduğunca ileri götürülmelidir.Adımlar doğası gereği tekrarlayıcı olduğundan, karışıklığı önlemek için deneysel prosedürlerin bir kontrol listesini oluşturmanızı öneririz. Bu protokol, ilk BSP peptidinin yüklenmesi, ilk BSP peptidinin korunması ve eş zamanlı reçine kaplaması ile başlar. Başlamak için, sekiz mililitrelik bir reaksiyon kabına 114 miligram H-M-B-A-A reçinesi tartarak ekleyip bir manyetik karıştırma çubuğu koyarak ilk BSP peptidini yükleyin.Kabın üstünü kauçuk septayla kapatın ve tüpü en az beş dakika boyunca argon ile süpürün. Bu sırada, yazılı protokolde açıklandığı şekilde aktive edilmiş BIS amino asit çözeltisini hazırlayın. Bu videoya eşlik eden işlemle, çözeltiyi şırınga yardımıyla reaksiyon kabına aktarın ve argon altında gece boyunca karıştırın; ertesi gün septayı çıkarın ve reaksiyon karışımını boşaltın.Reçineye yaklaşık iki mililitre klorometan ekleyerek reçineyi yıkayın. 30 saniye ile bir dakika arasında karıştırın ve ardından süzün. Bu işlemi DCM ile dört kez tekrarlayın ve ardından reçineyi beş kez dimetilformamid ile yıkayın.Birinci bis amino asidin derin korunmasını ve eş zamanlı reçine kaplamasını gerçekleştirmek için, reaksiyon kabına asetik asit ve DCM içinde %33'lük hidrojen bromür çözeltisinden iki mililitre yavaşça ekleyin. Reçineyi boşaltıp DCM ile beş kez yıkadıktan sonra 15 dakika boyunca karıştırmaya bırakın. D koruma sekansını bir kez daha tekrarlayın.Ardından, reçineyi beş kez DCM ile, ardından beş kez DMF ile yıkayın; reçineyi, DMF içinde %5 hacimce/hacimce D-I-P-E-A çözeltisi ile iki kez yıkayarak nötralize edin. Daha sonra beş kez DCM ve beş kez DMF ile bir kez daha yıkayın. Artık korumalı fonksiyonelleştirilmiş bis amino asidin kenetlenmesi gerçekleştirilebilir.Öncelikle, reçine içeren reaksiyon kabını anhidroz DCM ile üç kez yıkayarak inert atmosferi yeniden sağlayın. Ardından bir septum ve argon hattı temizleme düzeneği takın; kaba bir ila iki mililitre anhidroz DCM ekleyip 30 saniye boyunca karıştırarak kabı yıkayın. Daha sonra, argon hattı kabarcıkları yükselmeye başlayana kadar kabı boşaltın.Bu işlemi en az bir kez daha tekrarlayın. Ardından, alevle kurutulmuş bir deney tüpünde, argon atmosferi altında fonksiyonelleştirilmiş bis amino asit çözeltisi hazırlayın. 47 µL DIC ekleyin ve 90 dakika boyunca karıştırın.Ardından, reçineye 666 µL hidrus DMF içerisinde 35 µL D-I-P-E-A ekleyin ve beş dakika daha karıştırın. Önceden aktive edilmiş BIS amino asit çözeltisini şırınga yardımıyla kaba aktarın ve ertesi güne kadar gece boyunca karıştırın. Reaksiyon karışımını süzün ve argon altında anhidroz DCM ile iki kez yıkayın.Bu prosedürdeki kritik bir adım bis amino asit kenetlenmeleridir. Di keto piperazin halka kapanmalarını sağlamak için, ek aktive edici ajanlar ile daha uzun reaksiyon süreleri uyguluyoruz. Di keto pirazinin kapanmasını teşvik etmek için, bir HOAT ve DIC çözeltisi ekleyin ve argon altında bir saat boyunca karıştırın.Ardından, septumu çıkarın ve reaksiyon karışımını süzün. Reçineyi beş kez DCM ile ve beş kez DMF ile yıkayın. Bu bölüm, fonksiyonelleştirilmiş BIS amino asidin derin korumasını, Fmoc'un derin korumasını ve ilk BIS amino asidin asilasyonunu kapsamaktadır.Korunan fonksiyonelleştirilmiş bis amino asidin derin korumasını gerçekleştirmek için, TFA ve TIPS çözeltisinden iki mililitreyi reaksiyon kabına yavaşça ekleyin ve bir saat boyunca karıştırın; ardından süzün, reçineyi yaklaşık 30 saniye boyunca DCM ile yıkayın ve süzün, DCM yıkamasını beş kez tekrarlayın. Daha sonra, A-D-C-M-D-M-F yıkama sırasını takip ederek tüm derin koruma reçine yıkama dizisini tekrarlayın. Reçineyi, DMF içinde %5 hacimsel D-I-P-E-A çözeltisi ile iki kez yıkayarak nötralize edin.Ardından bir D-C-M-D-M-F yıkama işlemi daha gerçekleştirin. Bu aşamadan itibaren BIS peptidi, diğer fonksiyonelleştirilmiş bis amino asitlerle uzatılabilir veya öncü azot karboksilik asidi üzerinden fonksiyonelleştirilebilir ya da her ikisi birden yapılabilir. FM grubunun korumasını kaldırmak için, DMF içinde %20 piperidin içeren iki mililitrelik bir çözelti ekleyin ve reaksiyonu 20 dakika boyunca karıştırın.Reçineyi süzün ve DMF ile beş kez yıkayın. Bu işlemi, reçineyi ek bir kez daha yıkadıktan sonra bir kez daha tekrarlayın. Son adım olarak, hazırlanan amino asit çözeltisini reaksiyon kabına ekleyip altı saat boyunca karıştırarak ilk bis amino asidi izole edin.Reçineyi beş kez DCM ve beş kez DMF ile yıkayın. Bu protokolün son bölümü, reçineye bağlı amino asitten Bach grubunun uzaklaştırılmasını ve reçineden ayrılmayı içerir. İlk olarak, reaksiyon kabına iki mililitre bire bir T-F-A-D-C-M çözeltisi ekleyin ve 30 dakika boyunca karıştırın.Reçineyi süzün ve DCM ile beş kez yıkayın. Ardından bu işlemi bir kez daha tekrarlayın. Reçineyi 30 saniye boyunca, beş kez DCM ve beş kez DMF ile yıkayıp süzün.Ardından, susuz DMF içinde %10 D-I-P-E-A çözeltisinden iki mililitre ekleyin ve 24 ila 48 saat boyunca karıştırın. Son olarak, reaksiyon karışımını önceden tartılmış bir yuvarlak tabanlı balona toplayın. Bu çözeltiden 30 µL'yi, bir LC-MS şişesindeki 450 µL Tetra Hydro FU içine aktarın ve analiz için gönderin.Reçineyi ek DMF porsiyonlarıyla yıkayın ve yuvarlak tabanlı balona toplayın. Sentez boyunca reçine üzerindeki kimyasal dönüşümleri izlemek için aşağıdaki yöntemler kullanılabilir. Serbest hidroksil gruplarını saptamak için, önce tek kullanımlık bir pipet yardımıyla yaklaşık bir miligram kuru reçine alarak metil kırmızısı testini gerçekleştirin.Dört mililitrelik bir reaksiyon kabına aktarıp durulayın. Metinde açıklandığı şekilde hazırlanan bir metil kırmızı çözeltisi ekleyin ve beş ila 10 dakika boyunca karıştırın. Reçineyi süzün ve beş kez DCM ile yıkayın; turuncu veya kırmızı renkli reçine boncukları serbest hidroksil gruplarının varlığını gösterir.Bu test, ilk bis amino asit yükleme ve reçine kapatma basamaklarını değerlendirmek için kullanılabilir. İkincil araçları tespit etmek için, tek kullanımlık bir pipet yardımıyla yaklaşık bir miligram kuru reçineyi küçük bir şişeye aktararak kloral testini gerçekleştirin. Hem 0,8 milimolar DMF çözeltisindeki kloralden hem de DMF çözeltisindeki %2'lik asit aldehitten üçer damla ekleyin.Ve oda sıcaklığında beş ila 10 dakika bekletelim. Bu durumda, mavi veya mor reçine boncukları, reçineye bağlı bileşiğin üzerinde serbest sekonder aminlerin bulunduğunun bir göstergesidir. Aktivasyon verimliliklerini doğrulamak için aktivasyon tuzak testini gerçekleştirin; sentez sırasındaki aktive bileşik, aktive çözeltiden 5 ila 10 µL'nin, 50 µL olain içeren bir sıvı kromatografisi-kütle spektrometrisi flakonuna aktarılması ve elle karıştırılmasıyla değerlendirilebilir.Çözelti birkaç saniye boyunca sarı renge dönmeli, ardından 450 µL tetra hydro uran ile seyreltilmeli ve lc MS analizine sunulmalıdır. Nihai ürün ve aktive edilmiş ara ürünler, C 18 ters faz kolonla donatılmış bir LC MS sistemi ve 0.1% formik asit içeren su asetil nitril çözücü sistemi kullanılarak değerlendirilebilir. Bu L-C-M-S-U-V izi, ham ürünün yüksek saflığına bir örnek teşkil etmektedir.Spektrumda 21.3 dakikada tespit edilen ana pikin, beklenen ürün kütlesiyle uyumlu bir kütleye sahip olduğu görülmüştür. Bu durum, ham ürünün kütle spektrumunda; kütleye ek olarak sodyum iyonunun kütlesine ve kütleden IV DDE koruyucu grubun kütlesinin çıkarılmış haline karşılık gelen ana piklerin görülmesiyle görselleştirilebilir. Burada, 21.3 dakikada çok saf bir ürünü gösteren saflaştırılmış spektrumların LCMS UV izi ve bu saflaştırılmış trier pikinin kimliğini doğrulayan kütle spektrumu sunulmuştur.Bu videoyu izledikten sonra, geliştirilmiş katı faz tekniklerini kullanarak fonksiyonelleştirilmiş bis peptitlerin nasıl sentezleneceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Bu teknik, bir kez ustalaşıldığında, bis peptit alanındaki araştırmacıların protein-protein etkileşimleri ve kataliz uygulamalarını keşfetmelerine olanak sağlamıştır. Doğru şekilde uygulandığında, bu teknik dört ila beş gün içinde fonksiyonelleştirilmiş bir bis peptit trimerinin sentezlenmesini sağlayabilir.Bu prosedürü uygularken, boncukların reaksiyon ve yıkama çözeltileri içerisinde daldırılmış halde tutulmasının önemli olduğunu unutmayın. Stereokimyanın veya alternatif fonksiyonelliklerin protein bağlanması veya katalitik aktivite üzerindeki etkisi gibi ek soruları yanıtlamak için paralel sentez veya kütüphane sentezi gibi diğer yöntemler uygulanabilir. Organik reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken uygun kişisel koruyucu ekipman kullanımı ve çeker ocak kullanımı gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

solid-phase-synthesis-functionalized-bis-peptide-using-safety-catch

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Peptoids çoğu laboratuarlarda kolayca sentezlenebilir sağlayan temel ekipman ve piyasada bulunan reaktifler içeren basit ve genel bir manuel peptoid sentez yöntemi özetlenmiştir. Amfifilik peptoid 36mer sentezi, saflaştırma ve karakterizasyonu yanı sıra, yüksek sıralı nanosheets olarak kendi montaj olarak açıklanmıştır.

Yüksek Sıralı Nanosheets Peptoid Polimerler ve Self-Meclis Solid-faz Submonomer Sentezi

Mikrodalga ışınlaması kullanılarak siklik peptitlerin sentezi için basit ve genel bir yöntem özetlenmiştir. Bu prosedür, yan zincirleri ve farmakoforik kısımları korurken farklı konformasyonların bir koleksiyonu ile omurga siklik peptitlerinin sentezini sağlar ve bu nedenle biyoaktif konformasyonun taranmasına izin verir.

Mikrodalga Radyasyon Kullanımı Potansiyel Antiparazitik Therapeutics gibi omurga Siklik Peptit Kütüphanesi Gelişimi

Aynı dizide karışık katyonik işlevselliğe sahip peptoidleri sentezlemek için bir protokol sunulmuştur (lizin ve arginin tipi monomerler). Bu bileşiklerin, kutanöz leishmaniasis'e neden olan protozoan parazitler olan Leishmania mexicana'ya karşı daha sonraki testleri de açıklanmaktadır.

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

Polyamine tabanlı peptid amphiphiles (PPAs) sentezi gruplar bu reaktif işlevler maske korumanın akılcı kullanımı gerektiren birden çok Amin nitrogens, varlığı nedeniyle önemli bir sorundur. Bu yazıda, bu yeni sınıf kendi kendine montaj moleküllerin hazırlanması için facile yöntemi açıklanmaktadır.

Polyamine tabanlı peptid Amphiphiles (PPAs) ve ilgili Biyomalzeme kendi kendine montaj sentezi için facile iletişim kuralı

1,2-dithiolane sentezi için bir protokol peptid ve peptid kendinden montajlı kaynaklanan supramolecular yapıları karakterizasyonu değiştiren.

1,2-Dithiolane malzemelerin ve kendi kendine montaj peptidler değiştirilme tarihi

Bir protokol bilgi kodlanmış peptoid oligomers sentezi için ve dinamik kovalent reaktan çiftleri ve Lewis asidik nadir toprak olarak aminler ve aldehitler kullanarak moleküler merdivenler içine bu peptoidlerin dizi yönelimli kendini montaj için sunulmaktadır metal çok rol reaktifler olarak triflates.

Bilgi taşıyan Peptoidlerin sentezi ve Dizi yönelimli Dinamik Kovalent Öz-montaj

Bu protokol, sistein ve metiyonin arasındaki bisalkilasyon yoluyla siklik peptitlerin sentezini ve propargil sülfonyum merkezi tarafından tetiklenen fakil tiol-yne reaksiyonunu sunar.

On-Tether Sülfonyum Merkezi Kullanarak Döngüsel Peptitlerin Oluşturulması

Bu protokol, siklik hücreye nüfuz eden peptitlerin aromatik çapraz bağlarla sentezini ve biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliklerinin değerlendirilmesini açıklar.

Biyolojik Bariyerlerin Daha İyi Penetrasyonu için Siklik Hücre Nüfuz Eden Peptitlerin Yapımı

Ticari bir mikrodalga reaktöründe katı faz peptit sentezlerini gerçekleştirmek için basit, ucuz ve yeni bir aparat sunulmaktadır.

Katı faz peptit sentezi için ticari bir mikrodalga reaktörünün ucuz bir adaptasyonu

Ugi reaksiyon hızlı bileşiklerin çeşitli kütüphane oluşturmak için uygun bir yol olduğu kanıtlanmıştır. Bir amin reaksiyon, bir aldehit, bir karboksilik asit ve oda sıcaklığında genellikle bir isonitrile metanol içerir. Bu video, filtrasyon tüpleri ve bir Mettler-Toledo MiniMapper otomatik sıvı işleyici reaktifler ve solvent teslim etmek için kullanılan ile donatılmış bir 48-yuvası Mettler-Toledo MiniBlock kullanmaktadır. Konsantrasyonu, çözücü bileşimi ve bazı reaktifler fazla ilgi...

Paralel Sentezi ve Otomatik Liquid Handling kullanma Ugi Reaksiyon optimizasyonu

Öğrenin, fonksiyonel bis-peptid trimer sentezi için katı faz yöntemlerini ve güvenlik yakalama prosedürünü. Bu teknik, peptid kütüphane sentezi ve paralel üretim için uygulama potansiyeli sunar.

Bir Fonksiyonlu Bis-Peptid Katı Faz Sentezi Metodolojisi "Güvenlik" Catch Kullanımı

Daha fazla video keşfet