Mikrodalga Radyasyon Kullanımı Potansiyel Antiparazitik Therapeutics gibi omurga Siklik Peptit Kütüphanesi Gelişimi

Bu prosedürün genel amacı, yeni anti-parazitik terapötikler için mikrodalga ışınlaması kullanarak konformasyonel çeşitliliğe sahip odaklanmış bir omurga siklik peptidomimetik kütüphanesi geliştirmektir. Bu yöntem, protein-protein etkileşimlerini spesifik olarak hedeflemek için yeni araçlar geliştirmeye yardımcı olabilir. Bu işleme başlamak için, bir polipropilen kartuşa 2,5 mililitre istenen amino asit, bir mililitre aktivatör ve 0,5 mililitre aktivatör tabanı ekleyin.

Kartuşu otomatik bir mikrodalga sentezleyiciye yerleştirin ve birleştirme reaksiyonunun 300 watt ve 25 santigrat derecede 75 saniye ilerlemesine izin verin. Reaksiyon tamamlandıktan sonra, reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre N, N-dimetilformamid veya DMF ile yıkayın. Önceki adımı beş kez tekrarladıktan sonra, polipropilen kartuşa 0.1 molar 1-hidroksibenzotriazol veya HOBt ile DMF'de yedi mililitre% 20 piperidin ekleyin ve 45 watt ve 75 santigrat derecede 30 saniye inkübe edin.

Bittiğinde, reaksiyon karışımını boşaltın. Daha sonra, polipropilen kartuşa 0.1 molar HOBt ile DMF'de yedi mililitre% 20 piperidin ekleyin ve 45 watt ve 75 santigrat derecede 180 saniye inkübe edin. Reaksiyon karışımını boşalttıktan sonra, reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre DMF ile yıkayın.

Daha sonra reçineyi yedi mililitre diklorometan veya DCM ile oda sıcaklığında 120 saniye yıkayın. Anhidrit bağlantısı için, reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre 1-metil-2-pirolidinon veya NMP ile yıkayın. Bittiğinde, reaksiyon karışımını boşaltın.

Önceki adımı üç kez tekrarladıktan sonra, karşılık gelen anhidritin 10 eşdeğerini 50 mililitrelik bir polipropilen tüpte beş mililitre NMP içinde çözün. Daha sonra, çözeltiye bir eşdeğer 4-Dimetilaminopiridin veya DMAP ve 10 eşdeğer N, N-diizopropiletilamin veya DIEA ekleyin. Bu karışımı reçineye ekleyin ve 25 watt ve 75 santigrat derecede 300 saniye inkübe edin.

Reçineyi NMP ile yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre DMF ile yıkayın. Bu noktada, reçineyi bir kapak tapası ve musluk ile donatılmış bir polipropilen kartuşa aktarın. Reçine DCM ile yıkandıktan sonra, 1 gram reçine başına polipropilen kartuşa 15 ila 25 mililitre %1 trifloroasetik asit, %5 triizopropilsilan ve %94 DCM karışımı ekleyin.

Polipropilen kartuşu bir çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika çalkalayın. Bunu takiben, bir vakum uygulayarak çözeltiyi polipropilen kartuştan boşaltın. Önceki adımları üç kez tekrarladıktan sonra, reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre DCM ile yıkayın.

Bu adımlar son derece önemlidir, çünkü birkaç reçinedeki tritil koruyucu grupların DCM-trifloroasetik asit çözeltilerinde kısmen parçalanmış olduğu bulunmuştur. Metiltrityl gruplarının çıkarılması, birden fazla yıkama gerektiren yavaş bir işlemdir. 50 mililitrelik bir polipropilen tüpte, beş mililitre dibromometan içinde beş eşdeğer Benzotriazol-1-ly-oxy-tris-pyrolidinofosphonium heksaflorfosfat çözün.

Ardından, çözeltiye 10 eşdeğer DIEA ekleyin. Karışımı DCM ile durulanmış reçineye ekleyin ve 25 watt ve 75 santigrat derecede 300 saniye inkübe edin. Bunu takiben, reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre DCM ile yıkayın.

DCM ile iki yıkamadan sonra, reçineyi bir polipropilen kartuşa aktarın ve iki kez dietil eter ile yıkayın. Reçineyi oda sıcaklığında bir vakumlu desikatörde potasyum hidroksit üzerinde en az üç saat kurutun. Daha sonra, her bir gram reçineye 10 mililitre önceden soğutulmuş trifloroasetik asit bölünme kokteyli ekleyin.

Polipropilen kartuşu bir çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 3 saat çalkalayın. Bunu takiben, reçineyi 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe süzerek bölünme çözeltisini toplayın. Tüpe 35 mililitre soğuk dietil eter ekleyin.

Dört santigrat derecede 1, 207 kez g'de beş dakika santrifüjleyin. Ardından, eter tabakasını boşaltın. Kaiser testi için, 16.5 miligram potasyum siyanürü 25 mililitre damıtılmış suda çözerek Çözelti A'yı hazırlayın.

Çözeltinin bir mililitresini 49 mililitre peridin ile seyreltin. Daha sonra, bir gram ninhidrini 20 mililitre etanol içinde çözerek Çözelti B'yi hazırlayın. 40 gram fenolü 20 mililitre etanol içinde çözerek Çözelti C'yi hazırlayın.

Çözeltiler hazırlandıktan sonra, reçineden birkaç boncuğu bir test tüpüne aktarın. Tüpe her çözeltiden üç damla ekleyin ve karıştırın. Son olarak, test tüpünü bir ısıtma bloğu üzerinde 110 santigrat derecede beş dakika ısıtın.

Omurga siklik peptitlerinin sentezi, FMOC, t-butil protokolünü takiben katı destek üzerinde otomatik bir mikrodalga sentezleyici kullanılarak gerçekleştirildi. Ürün kütle spektrometresi ile analiz edildi ve saflık derecesi HPLC kullanılarak belirlendi. Biyolojik tarama, peptit pL1'in, insanlarda en şiddetli leishmaniasis olan visseral leishmaniasis'e neden olan bir parazit olan Leishmania donovani'ye karşı aktif olduğunu gösterdi.

Peptit pL1, kontrol tedavisine kıyasla parazit canlılığını %75 oranında azalttı. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa üç ila beş gün içinde yapılabilir. Geliştirildikten sonra, bu teknik, çok çeşitli alanlardaki araştırmacıların, temel araştırma ve terapötiklerde farmakolojik düzenleyiciler olarak peptitleri keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, özellikle protein-protein etkileşimlerini hedeflemek için konformasyonel çeşitliliğe sahip odaklanmış bir peptidomimetikler kütüphanesinin nasıl geliştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Trifloroasetik asit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman iyi havalandırılan bir başlıkta çalışırken göz koruması, laboratuvar önlüğü ve eldiven giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.