Name: Mikrodalga Radyasyon Kullanımı Potansiyel Antiparazitik Therapeutics gibi omurga Siklik Peptit Kütüphanesi Gelişimi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-01-26T20:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Öğrenin, mikrodalga radyasyon kullanarak omurga siklik peptit kütüphanesi geliştirme yöntemini. Bu teknik, antiparazitik tedaviler için protein-protein etkileşimlerini hedeflemeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz yararlı tartışmalar için Lauren Van Wassenhove, Sunhee Hwang ve Daria Mochly-Rosen teşekkür ederiz. Fon çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayınlama kararı, ya da yazının hazırlanmasında hiçbir rolü vardı NQ için çalışma Sağlık Hibe NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA (SPARK) Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklenmiştir.

1. Ekipman ve Reaktifler Hazırlık <ol><li> Hazırlama ekipmanları <ol><li> Uygun kişisel koruyucu ekipman kullanarak bir davlumbaz içindeki tüm adımları uygulayın. </li><li> Kimyasal olarak (a cam bir sır ile 30 ml), bir Teflon bir reaksiyon kabı içinde, mikrodalga güç iletimi kontrol etmek için bir fiber optik ısı algılayıcı ile teçhiz Discover bir ek modül ile bir mikrodalga Peptid Sentezleyicisi kullanılarak katı destek üzerinde veya tek polipropilen peptidleri sentezler Kartuş (kaba frit ile 12 mi). </li><li> Uygun karıştırma için, reaksiyon kabına, azot kaynağı bağlamak, ya da seçenek olarak polipropilen kartuşun her iki ucu mühürlenir, döner bir karıştırıcı üzerinde yer. </li><li> Reaksiyon karışımları veya yıkar boşaltmak için, atık tuzağı ev tipi vakum bağlanın. </li><li> Reaksiyon kabı içine fiber optik prob yerleştirin. </li></ol></li><li> Reaktif hazırlanması <ol><li> Rink Amide reçinesi AM 100-200 meş tartılarak reçine hazırlayın (0,204 mg)Doğru şişmesi için 2-4 saat boyunca çalkalanır, aşağı reçine yıkama ve boşaltmak için reaksiyon kabı / polipropilen kartuşa N 1 karışımı, N-dimetilformamid (DMF) / diklorometan (DCM): 1, 5 ml ekleyin. </li><li> DMF içinde karşılık gelen Fmoc-amino asit çözülmesiyle asit solüsyonlarının amino 0.2 M 9-florenilmetoksikarbonil (Fmoc) hazırlayın ve amino asitler (Tablo 1) eriyene kadar karışım vorteks. </li><li> (Benzotriazol-1-il) - - N, N, N &#39;, N&#39;-tetrametiluronyum heksaflorofosfat (HBTU), 100 ml DMF içinde ve katı kadar karışımı vorteks çözündürülür (Tablo 18.96 g O eritilmesi ile 0.45 M aktivatör çözeltisi karışımı hazırlayın 1). </li><li> 65,2 ml 1-metil-2-pirolidinon (NMP) (Tablo 1) 34.8 mi N, N-diizopropiletilamin (DIEA) birleştirilerek 2 M aktivatör baz çözeltisi karışımı hazırlayın. </li><li> 3,37 g 1-hidroksibenzotriazol hidrat eritilmesi ile 0.1 M çözelti, koruma kaldırma karışım hazırlayın (HOBt)% 20 h / h DMF içinde piperidin solüsyonu ve katı kadar karışımı vorteks 250 ml (Tablo 1) içinde çözülür. </li></ol></li></ol> 2. Amino Asit Kavrama Fmoc korumalı <ol><li> Amino asit bağlama <ol><li> Reaksiyon kabı / polipropilen kartuş amino asit (2.5 mi) / aktivatör (1 ml) / aktivatör bazı (0.5 mi) ilave edilir ve reaksiyon, 300 sn (25 W, 75 ° C, Tablo 2) devam edelim. Çözüm boşaltın. </li><li> DMF ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, RT) DMF ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Beş kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> Fmoc korumasının kaldırılması <ol><li> 0.1 M HOBt reaksiyon kabı / polipropilen kartuş DMF içinde% 20 lik piperidin 7 ml ilave edilir ve 30 sn (45 W, 75 ° C, Tablo 2) inkübe edilir. </li><li> Reaksiyon karışımını boşaltın. </li><li> Reaksiyon kabı / polipropilen kartuş 0.1 M HOBt, DMF içinde% 20 lik piperidin 7 ml ilave edilir ve 180 saniye süreyle kuluçkalayın (45 B, 75 ° C, Tablo 2). </li><li> Reaksiyon karışımını boşaltın. </li><li> DMF ile reçine yıkanır. 120 sn (7 ml 0 W, oda sıcaklığı) için reçine DMF ekleyin ve çözüm boşaltın. Beş kez tekrarlayın. Not: İsteğe bağlı olarak, burada prosedürü duraklatmak ve daha sonraki bir tarihte yeniden. </li></ol></li><li> Amino asit birleştirme aşamasından sonra, (- 20 ° C &#39;de daha uzun bir süre deposu için reçine), 4 ° C&#39;de en az birkaç gün, DCM ve mağaza ile reçine yıkayın. <ol><li> Bir polipropilen kartuşuna reaksiyon kabından reçine taşıyın. </li><li> DCM ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın. </li><li> Bir üst kapak ve vana ile sıkıca polipropilen kartuşunu kapatılmalıdır. </li><li> Yeni bir sentez başlamadan önce, DMF içinde 3-4 saat (7 mi), reçineyi kabartmak. </li></ol></li><li> Sentezini İzleme <ol><li> Hızla ilerlemesini belirlemek için Kaiser (ninhidrin) testi veya Kloranil testini kullanınsentez. İsteğe bağlı olarak, sentezlenen peptidin saflığı ve kütle belirlemek için küçük çaplı bir parçalanma reaksiyonunu gerçekleştirmek. Bölüm 9&#39;a bakın. Not: Daha fazla sorun giderme için Tablo 3&#39;e bakınız. </li></ol></li><li> Hedeflenen peptit sentezleme istediğiniz gibi tekrarlayın 2.1 ve 2.2 adımları: Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf). </li></ol> 3. anhidrit / asit Kaplin <ol><li> Anhidrit birleştirme <ol><li> NMP ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) NMP ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın. </li><li> NMP (5 mi) içinde karşılık gelen anhidrit 10 eşdeğer çözülür 1 eşdeğer 4-dimetilaminopiridin (DMAP) ve solüsyona 10 eşdeğer DIEA (Tablo 1) ekleyin. </li><li> (25 / DIEA reçinesine anhidrit / DMAP 10 karışımını 300 saniye boyunca inkübe: 1: 10 eklemeW, 75 ° C, Tablo 2). Çözüm boşaltın. </li><li> NMP ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) NMP ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> Asit bağlama <ol><li> DMF ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) DMF ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın. </li><li> DMF içinde karşılık gelen dikarboksilik asit 10 eşdeğer (5 mi) içinde çözülür. 1 eşdeğer DMAP ve 10 eşdeğer N, çözeltiye N &#39;diizopropilkarbodiimid (DIC) (Tablo 1) ekleyin. </li><li> 30 dakika boyunca karıştırılmasıyla karışımın önceden aktive eder. </li><li> Reçinesine eklenir ve 300 sn (25 W, 75 ° C, Tablo 2) boyunca inkübe ve solüsyonu boşaltın. </li><li> DMF ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve drenaj çözeltisi DMF ekleyin. Adımı tekrarlayın üç kez. </li></ol></li></ol> 4. N-metiltritil (Mtt) Grup DEPROTECT Korumaiyon Not: lisin yan zinciri, N-metiltritil (Mtt) 81, asit labil koşullar 82,83 altında seçici koruması bozulabilir bir koruma grubu ile korundu. Korumanızı Mtt mikrodalga enerjisi olmadan bir çalkalayıcı üzerinde elle koruma grubu. <ol><li> Kapak fiş ve vana ile donatılmış bir polipropilen kartuşuna reçineyi aktarın. </li><li> DCM ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın. </li><li> Reçinenin bir gramı başına polipropilen kartuş% 1 trifloroasetik asit (TFA),% 5 triizopropilsilan (TIS) ve% 94 DCM karışımı 15-25 ml ekleyin. Not: TFA kuvvetli asit ve aşındırıcı cilt, göz ve akciğer dokusuna son derece rahatsız edici. <ol><li> Her zaman başlığı içinde TFA konsantre solüsyonlar tutun. </li><li> Iyi havalandırılan bir başlık uygun kişisel koruyucu donanım (göz koruması, bir laboratuvar önlüğü ve eldiven) ve çalışmayı kullanın. Derhal eldivenleri değiştirinOnlar TFA ve derhal temiz-up herhangi bir dökülme ile temas halinde. Deri veya gözler asit ile temas ederse, su ile hemen etkilenen alanı yıkayın ve ek 15 dakika yıkayın. </li></ol></li><li> Bir çalkalayıcı üzerinde polipropilen kartuşunu ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca çalkalanır. </li><li> Vakum uygulanarak polipropilen kartuş çözüm boşaltın. </li><li> Tekrarlayın 4,3-4,5, üç kez yineleyin. </li><li> DCM ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Beş kez tekrarlayın. </li></ol> Doğrusal Peptid 5. Siklizasyon <ol><li> DCM ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Beş kez tekrarlayın. </li><li> 50 ml&#39;lik bir polipropilen tüpüne, 5 eşdeğer Benzotriazol-1-ly-oksi-tris-pirrolidino-heksafluorfosfat dibromometan GİRİŞ (PyBOP) (DBM, 5 mi) ve solüsyona 10 eşdeğer DIEA ilave (Tablo 1) çözülür. </li><li&gt; reçinesine eklenir ve 300 sn (25 W, 75 ° C, Tablo 2) inkübe edilir. Çözüm boşaltın. </li><li> DCM ile reçine yıkanır. 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. Üç kez tekrarlayın. </li></ol> Yan zincir Gruplarının 6. yarma ve korumanın kaldırılması <ol><li> DCM ve dietil eter ile reçine yıkanır. <ol><li> 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı) ve DCM ilave edin ve solüsyonu boşaltın. İki kez tekrarlayın. </li><li> 120 saniye reçineye (7 ml, 0 W, oda sıcaklığı), dietil eter ekleyin ve bir çözüm boşaltın. İki kez tekrarlayın. </li></ol></li><li> Potasyum hidroksit (KOH, 1-10 g) üzerinde, en az 3 saat boyunca oda sıcaklığında vakum eksikatörü içinde reçine kurutun. </li><li> Kurutulmuş reçine tartılır ve bir polipropilen kartuş aktarın. </li><li> Önceden soğutulmuş trifloroasetik asit (TFA) yarılma kokteyli, 10 ml ekleme (örneğin,% 90 TFA,% 2.5 su,% 2.5 ve% 5 TIS fenol) reçine, her bir gram için. </li><li> 3 saat çalkalayınızoda sıcaklığında karıştırıldı. </li><li> 50 ml&#39;lik bir polipropilen tüpü içine reçine filtre edilerek TFA bölünmesi çözeltisi toplayın. Filtrasyon için, 12 ml polipropilen kartuşunun içinde frit kullanın. </li><li> Tüp soğuk dietil eter (35 mi) ilave edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 1207 x g&#39;de 5 dakika boyunca santrifüje. </li><li> Eter tabakası boşaltacaktır. </li><li> Adımı tekrarlayın 6,7-6,9, beş kez. </li></ol> 7. omurga Siklik Peptit Kurutma <ol><li> Aynı tüp içerisinde çöken peptidi tutmak ve 30 dakika için bir başlık kurutun. </li><li> Su ve asetonitril (ACN) 1: 1 karışımı peptid çözülür. </li><li> Sıvı azot içinde nihai ürün çözeltisi dondurun. </li><li> Nihai ürün liyofilize edin. </li></ol> 8. Omurga Siklik Peptit karakterize <ol><li> Su (400 ul) içindeki ürünün küçük bir örnek (1 mg) çözündürülür. </li><li> Bir ters fazlı yüksek performanslı sıvı kromatografisi yolu çözdürülmüştür peptid (10-200 ul) enjektehy (RP-HPLC) sistemi peptit saflığı 34 test etmek. </li><li> Kütle spektrometrisi matris destekli lazer desorpsiyon iyonizasyon (MS-MALDI) 84 kullanılarak, peptidin kütlesini kontrol edin. <ol><li> Asetonitril 1 (v / v) karışımı kullanılarak bir 1: 1 ul (100 uM) peptidi karıştırın su matris 1 ul (5 mg / ml, α-siyano-4-hidroksisinamik asit) ile, 1: 1 (v asetonitril / hac) karışımı: TFA (% 0.1) su. </li><li> Nokta MS-MALDI plaka üzerinde 1 ul. </li><li> Örnek kurutun ve kütle spektrometresi içine yerleştirin. </li></ol></li><li> Peptid tartılır ve yüzde verim hesaplar. </li><li> -20 ° C&#39;de saklayın. </li></ol> 9. Sentezi İzleme <ol><li> Kaiser (Ninhidrin) testi 85 <ol><li> Reaktif çözümleri hazırlayın. <ol><li> Damıtılmış su, 25 ml potasyum siyanit (KCN) 16.5 mg çözülmesiyle çözelti bir hazırlayın. Piridin 49 ml Yukarıdaki çözeltinin 1 ml seyreltilir. </li><li> Çözelti B Hazırlama20 ml etanol içinde 1 g ninhidrin çözülmesiyle. </li><li> 20 ml etanol içinde 40 g fenol çözülmesiyle Çözelti C hazırlayın. </li></ol></li><li> Amino asit kaplin tamamlamayı veya koruyucu grubun korumasının kaldırılması kontrol etmek için Kaiser testi kullanın. <ol><li> Bir test tüpüne reçine birkaç boncuk aktarın. </li><li> Üç damla her çözeltinin (~ 100 ul) (A, B ve C) ekleyin ve karıştırın. </li><li> 5 dakika boyunca 110 ° C&#39;de bir ısıtma bloğu üzerinde test tüpünü ısıtın. Not: Mavi renkli taneler (pozitif sonuç) tam olmayan birleştirme tepkimesi ya da Fmoc koruma grubunun deproteksiyonu göstermektedir. </li></ol></li></ol></li><li> Kloranil testi 86 <ol><li> Her bir test için, taze aşağıdaki reaktifler hazırlayın. <ol><li> DMF içerisinde% 2 kloranil bir çözelti hazırlayın, çözelti A </li><li> DMF içerisinde% 2 olan bir asetaldehid çözeltisi hazırlandı, çözelti B </li></ol></li><li> Amino asit bağlama veya t tamamlandığının kontrol edilmesinin kloranil testi gerçekleştirmekO koruma grubunun korumasının bozulması. <ol><li> 1.5 ml bir tüp içinde çözelti B, 100 ul çözelti A 100 ul karıştırın. </li><li> Boncuklar bırakın ve yavaşça 5 dakika sallayın. Not: koyu kahve renkli taneler (pozitif sonuç) Fmoc koruma grubu veya bir Komple olmayan bir akuplaj reaksiyonunun korumasının kaldırılmasını işaret etmektedir. </li></ol></li></ol></li><li> Küçük ölçekli bölünme reaksiyonu <ol><li> Kap tapası ve vana ile teçhiz edilmiş 3 mi polipropilen kartuş reçinenin küçük bir miktar çıkarın. </li><li> % 95, 2 mL TFA karışımı,% 2.5 su ve% 2.5 TBS ile tedavi. </li><li> Oda sıcaklığında 30 dakika boyunca Karışım çalkalanır. </li><li> Polipropilen kartuş cam hamuru kullanılarak süzme ile reçineyi çıkarın ve bir azot akımı ile çözücü buharlaşır. </li><li> Su içinde eritin ve tortu HPLC ve / veya MS kullanılarak ürünün analizinin yapılması. </li></ol></li></ol> Kültür Tahlili 10. Layişmanya donovani promastigot canlılığı <ol> &lt;li&gt; Leishmania donovani (L. donovani) büyüme ve tedavi koşulları <ol><li> Kültür L. 26 ° C &#39;de 4,5 g / L glikoz, L-glutamin ve sodyum piruvat ile Eagle Medium (DMEM) ve Dulbecco Modifikasyonunda donovani promastigotları. </li><li> L. davranın donovani 26 ° C &#39;de 24 saat süre ile, siklik peptitler (100 uM) ile promastigotlar. </li></ol></li><li> Layişmanya donovani (L. donovani) canlılık testi <ol><li> Üreticinin protokolüne uygun olarak AlamarBIue 20 ul parazit uygunluğunun değerlendirilmesi. </li><li> (570 nm&#39;de uyarma ve 590 nm&#39;de emisyonla) floresans ölçümü ile AlamarBIue azalma belirlenir. Daha yüksek flüoresans değerleri daha yüksek metabolik aktivitesi ve artan parazit yaşayabilirliğini göstermektedir. </li></ol></li></ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

Tam otomatik bir sentezleyici kullanılarak mikrodalga Layişmanya parazitin LACK proteini elde edilen omurgası, siklik peptitlerin odaklanmış bir kütüphane sentezi tarif edilmektedir. Siklik peptidlerin bir odaklanmış kütüphanesi korunmuş pharmacophores ve çeşitli bağlayıcılar ile geliştirilmiştir. Örneğin glutarik anhidrit, süksinik anhidrit, adipik asit, pimelik asit, lizin, ornitin, ve diğer yapı blokları gibi çeşitli bağlayıcıların eklenmesi siklik peptidlerin konformasyonal alan çeşitliliğini artırmak için ...

Protein-protein etkileşimleri (PPIs), hücre içi sinyal iletimine hücre ölümüne 1, en ​​çok biyolojik süreçlerde önemli bir rol oynamaktadır. Bu nedenle, PPIs hedefleyen temel araştırma ve tedavi uygulamaları temel bir öneme sahiptir. PPI&#39;lar özel ve stabil antikor ile düzenlenir, ancak antikorlar üretmek ve zayıf biyoyararlanıma sahip pahalı ve zordur edilebilir. Alternatif olarak, PPIs küçük moleküller ile hedeflenebilir. Küçük moleküller, antikorlar ile karşılaştırıldığında sentezlenmesi daha kolay ve ucuzdur; ancak, görece daha az esnek ve geniş protein-protein arayüzleri 2,3 daha küçük boşluklara daha iyi uyum. Çeşitli çalışmalar, basit ve ucuz bir antikor daha küçük moleküllere göre daha esnek olan peptidler, protein arabirimleri bağlanan ve PPIs 4,5 düzenleyebildiğini göstermiştir. Küresel tedavi peptid pazarı 2013 yılında 15000000000 dolar civarında değer ve% 10,5 annua büyüyorLly 6. Ayrıca, 50&#39;den fazla pazarlanan peptidler, klinik test farklı aşamalarında yaklaşık 270 peptidler ve gelişmiş klinik öncesi safhalarında 7 yaklaşık 400 peptidler vardır. Çok sayıda peptidler ilaç olarak kullanılmaktadır rağmen, peptidler hala zayıf biyoyararlanım ve istikrar, geçiş hücre zarlarında verimsizlik ve yapısal esneklik 8,9 dahil olmak üzere yaygın bir uygulama sınırlayan birçok zorluklar oluşturmaktadır. Bu dezavantajların üstesinden gelmek için bir seçenek, örneğin, yerel (D-amino asit ve N-alkilasyon) ve küresel (siklizasyon) sınırlamaların 8,10-12 gibi farklı modifikasyonlar uygulamaktır. Bu modifikasyonlar, aynı zamanda doğal olarak meydana gelir. Örneğin, siklosporin A, bir bağışıklık bastırıcı doğal siklik peptit, tek bir D-amino asit içerir ve N-alkilasyon modifikasyonlar 13,14 geçer. Doğal amino asitlerin değiştirilmesi, genellikle peptid etkiler, örneğin D- ve N-alkilasyon gibi lokal kısıtlamaları indükleme9&#39;un s biyolojik etkinliği. Bununla birlikte, ilgi konusu sekans aynı kalır hangi siklizasyon, biyolojik aktiviteyi korumak için daha olasıdır. Siklizasyon farklı konformasyonları arasındaki dengeyi azaltarak peptid yapısal alanı kısıtlamak için son derece cazip bir yoldur. Genellikle tek bir işlevine aracı olan aktif yapının peptidi kısıtlayarak, biyolojik aktivite ve seçicilik arttırır. Siklizasyon ayrıca daha az bozucu enzimler tarafından tanınan bir konformasyonda peptid tutarak, peptid stabilitesini artırır. Gerçekten de, siklik peptitler, linear karşıt parçalarına göre 15-17 metabolik dayanıklılık, biyoyararlanımını ve seçicilik geliştirilmiş gösterildi. Ancak, siklizasyon bazı durumlarda kısıtlama biyoaktif bir yapıyı elde peptidler engelleyebilir çünkü iki ucu keskin kılıç olabilir. Bu engel aşmak için, odaklanmış bir kütüphane olduğu tüm peptidler aynı birincil sequenc vare ve sonuç olarak sabit bir farmakoforlar sentezlenebilir. Kütüphanede peptidler için, daha sonra biyolojik olarak aktif en konformasyon 9,18 taranması için, ki böyle halka boyutu ve konumu olarak yapısını etkileyen parametrelerin, farklıdır. Peptitler çözelti içinde ve şimdi daha yaygın peptid sentez yaklaşımı ve daha ayrıntılı olarak ele alınacaktır, bir katı-faz peptid sentezi (SPPS) yaklaşımı, her iki sentezlenebilir. SPPS kimyasal transformasyonlar sentetik bileşikler 19 geniş bir yelpazede hazırlamak için bir bağlayıcı yoluyla katı bir destek üzerinde gerçekleştirildiği bir işlemdir. SPPS N-terminine bir katı desteğe bağlı olan C-terminaline, bir aşamalı bir şekilde amino asitlerin birbirini takip eden eşleştirme işlemi ile montaj peptidler sağlar. N-α-amino asit yan zincirler st için bir amino asidin ilave edilmesini sağlamak için peptid uzama sırasında kullanılan reaksiyon koşullarında kararlı olan koruyucu gruplar ile maskelenmiş olması gerekirep. Son aşamada, peptid reçineden serbest bırakılır ve koruyucu gruplar yan zincir eş zamanlı olarak giderilir. Peptid sentez edilirken, her karbodiimit süzme ile peptid-katı destek matrisinden çıkarıldı ve her bir bağlantı adımının sonunda yıkanmasını edilebilir. Bu tür bir sistem ile, yüksek bir konsantrasyonda reaktifler, büyük miktarda tamamlanması için birleştirme reaksiyonları tahrik ve tüm sentez aşamalar, malzemenin 20 arasında transfer olmadan aynı kap içinde gerçekleştirilebilir. SPPS bu reaksiyon 21 izleme tamamlanmamış reaksiyonlar, yan reaksiyonların ürünleri, saf olmayan reaktifler yanı sıra zorluklar üretimi gibi bazı sınırlamalar vardır, ancak, SPPS avantajları peptid sentezi için &quot;altın standart&quot; hale getirmiştir. Bu avantajlar elde doğal olmayan amino asitler, otomasyon, kolay saflaştırmaya birleştirmek için bir seçenek, en aza fiziksel kayıp, ve fazla reaktifler kullanılmasını içeriryüksek verim. SPPS zor sekuenzler 21,22, floresan modifikasyonlar 23 ve peptid kütüphanelerinin 24,25 sentezinde, son derece faydalı olduğu gösterilmiştir. SPPS ayrıca oligonükleotidler 26,27, 28,29 oligosakaritlerin ve peptid nükleik asitler 30,31 gibi diğer poli zincirli montajlar için çok yararlıdır. İlginç bir şekilde, bazı durumlarda, SPPS geleneksel çözelti 32,33 yapılır küçük moleküllerin sentezi için avantajlı olduğu gösterilmiştir. SPPS sektöründe 36-38 araştırma ve öğretim 34,35 için küçük ölçekli hem de büyük ölçekte hem de kullanılır. Esas olarak Peptidlerin sentezi için SPSS metodoloji kullanılır iki sentez stratejileri bütiloksikarbonil (Boc) ve 9-fluorenilmetoksikarbonil (Fmoc) &#39;dir. SPPS&#39;si için kişiye ilk strateji r peptidin grupları Yan-zincir koruma kaldırma ve parçalamak için güçlü asit koşulları gerektirir Boc olduğuEsin. Fmoc-temelli peptit sentez, ancak, orta dereceli bir baz koşulları kullanır ve asit-labil Boc protokolü 39 daha yumuşak bir alternatiftir. Fmoc stratejisi asit koşulları altında, peptidin reçineden ayrılması sırasında sentezin son aşamasında uzaklaştırılır ortogonal t-butil (tBu) yan zincir koruma kullanmaktadır. Katı bir destek üzerinde peptit sentezi için genel çalışma prensibi Şekil 1 &#39;de sunulmuştur. N-α-terminalinde bir geçici koruyucu grup ile maskelenen başlangıç ​​amino asidi, C-terminali reçineye yüklenir. (Şekil 1, Aşama 1) gerektiğinde yan zinciri maskelemek için bir yarı kalıcı koruyucu grup, aynı zamanda kullanılır. Hedef peptidin sentezi N-α-geçici koruyucu grubun korumasının kaldırılması, tekrarlı devreler aşağıdaki korumalı amino asit (Şekil 1, Aşama 2) ve bağlantı (Şekil 1 ile N-terminine C-termininden monte edilir </str<html> Ong&gt;, Aşama 3). Son amino asit (Şekil 1, Aşama 4) yüklendikten sonra, peptit reçine desteğinden ayrılmaktadır ve yarı kalıcı koruyucu-gruplar (Şekil 1, Aşama 5) çıkarılır. <img alt="figür 1" src="/files/ftp_upload/53589/53589fig1.jpg" /> Katı fazlı peptid sentezi Şekil 1. genel şema. N-α-korumalı amino asit reçinesi (Aşama 1) bir bağlayıcı vasıtasıyla bir karboksil grubuna kullanılması ile tespit edilir. Istenen peptit N-a (Aşama 2) ve amino asit bağlama (Aşama 3) geçici koruma grubu (TPG) korumasının kaldırılması, tekrarlı devreler ile N-terminine C-terminaline kadar olan bir doğrusal tarzda monte edilir. Sentezi (Aşama 4) tamamladıktan sonra, yarı-kalıcı koruyucu-gruplar (SPG) peptidi yarılması (Aşama 5) boyunca kaldırılır.= &quot;_ blank&quot; olsun&gt; bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Bu siklizasyon (Şekil 2A) için tek seçenek, (B) halkalanmaya sağlar çünkü bu uygun bir yoldur, ancak sınırlı - (A) baş-kuyruk siklizasyonuyla: Tüm peptit zincirinin toplanması ardından, siklizasyon çeşitli alternatifler elde edilebilir Biyolojik olarak aktif fonksiyonel gruplar ihtiva ilgi sekansından amino asitleri - ancak bu amino asitlerin kullanımı bozmadan amino asit (ya da diğer yapı taşları) ile biyolojik aktivitesi (Şekil 2B) ve (C) siklizasyonunu etkileyebilir Biyolojik olarak aktif dizisi. Bu ilgi duyulan dizilimi (Şekil 2C) değiştirmeden odaklı kütüphanelerin üretilmesine imkan verir olarak bu molekülleri tanıtılması yaygındır. <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/53589/53589fig2.jpg" /> FŞEKIL 2. Alternatif peptit siklizasyon stratejilerinin C-terminal ve N-terminal arasında bir peptid bağı vasıtasıyla kuyruk siklizasyon (A) kafası.; Fonksiyonel gruplar arasında, (B) siklizasyon örneğin / glutamik asit (2) ya da yan zincir N- ya da C-ucu (3 aspartik sistein artığı (1), ya da lizin yan zincirleri arasında bir amid bağı arasında bir disülfid bağı olarak -4); (R0) öncesi ve (R7) biyoaktif dizisi sonra, örneğin ekstra amino asitler ya da amino asit türevleri ya da küçük moleküller ekleyerek (C) siklizasyon. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53589/53589fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> Mikrodalga destekli böylece organik kimyasal hızlandırıcı, sentez reaksiyonlarını ısıtmak için mikrodalga ışıması kullanan 40,41 dönüşümler. Mikrodalga kimyası absorbe çözücü reaktif yeteneği / dayanmaktadırmikrodalga enerjisi ve dönüştürmek 42 ısıtmak için. Teknoloji yaygınlaşmadan önce, önemli dezavantajları kontrol edilebilirlik ve sentez protokolleri tekrarlanabilirlik ve yeterli sıcaklık ve basınç kontrolleri 43,44 mevcut sistemlerin eksikliği de dahil olmak üzere, aşılması gerekiyordu. Mikrodalga destekli peptid sentezi ilk rapor birleştirme verimlilik ve saflıkta 45 arasında önemli bir gelişme ile birkaç kısa peptidlerin sentezlenmesi için bir mutfak mikrodalga (7-10 amino asit) kullanılarak yapıldı. Ayrıca, mikrodalga enerjisi, zincir agregasyonunu azaltmak yan tepkimeleri azaltmak rasemizasyon sınırlandırılması ve tüm zor ve uzun sekanslar 46-53 için kritik olan birleştirme oranlarını geliştirdiği gösterilmiştir. Şu anda, bir katı destek üzerinde peptitler veya ilgili bileşiklerin sentezi için mikrodalga ışınlama kullanılması, bir organik çözücü 54 yerine su içinde (A) sentezi de dahil olmak üzere, geniş; (B) peptitlerin sentezi ileBu tür sentez, sterik olarak engellenmiş bir amino asit türevlerinin, düşük bağlanma verimliliği tipik olarak zordur glikopeptidler 55-58 veya 59-61 phosphopeptides, ortak post-translasyonel modifikasyonlar; (C) olan bir yan zincir ile bağlı olan bir azot atomu 62 veya peptoidler, bir amino asit kalıntısının C (α) değiştirilmesi ile oluşturulabilir örneğin azapeptides olarak omurgasındaki modifikasyon ile peptidler, sentezi yerine Ca&#39;sına atomu 63,64 daha amid nitrojen; (D) siklik peptit 65-71 sentezi; birleşimsel kütüphanelerin 51,72 ve (E) sentezi. Birçok durumda, yazarlar daha yüksek verim rapor geleneksel protokole göre, mikrodalga ışıma altında sentez süresini düşürmüştür. Rasyonel tasarımı 73-75 kullanarak, fo skafold L eishmania en reseptörden elde edildi, anti-parazitik peptidleri gelişmişr C-kinaz (EKSİKLİĞİ) aktif. LACK Layişmanya enfeksiyonu 76 erken fazında önemli bir rol oynar. LACK düşük seviyelerde ifade Parazitler EKSİKLİĞİ temel parazit sinyal süreçleri ve protein sentezinde 78 katılır bile immün tehlikeye farelere 77 parasitize başarısız. Bu nedenle, EKSİKLİĞİ önemli bir iskele protein 79 ve değerli bir ilaç hedefidir. Ancak ev sahibi memeli benzerinin RACK olarak, parazitler korunan LACK diziler üzerinde yoğunlaşırken, biz 8 amino asit peptid kültüründe Leishmania sp. Canlılığını azalma (RNGQCQRK) belirledi. Burada, yukarıda tarif edilen LACK proteini dizisi elde omurgası siklik peptit sentezi için bir protokol açıklar. Peptidler, Fmoc / tBu protokolü ile SPSS metodolojisine göre mikro dalga ısıtma kullanılarak katı bir destek üzerinde sentezlendi. Peptidler, bir amid bağı olarak aracılığıyla bir TAT 47-57 (YGRKKRRQRRR) taşıyıcı peptide konjuge edildiSPPS&#39;si parçası. Hücre içine yüklerin çeşitli TAT merkezli ulaşım 15 yılı aşkın bir süredir kullanılmaktadır ve hücre içi organellere içine kargo teslim 80 teyit edilmiştir. Dört farklı bağlayıcılar, süksinik ve glutarik anhidrid gibi adipik ve pimelik asit, iki ila beş karbonlu karboksilik asit bağlayıcılar oluşturmak için siklizasyonu gerçekleştirmek için kullanıldı. Siklizasyon mikrodalga enerjisi kullanılarak yapıldı ve son ayırma ve yan zincir koruma giderme adımları, mikrodalga enerjisi manuel olarak yapıldı. Otomatik bir mikro dalga sentezleyicisi kullanımı, ürün saflığı geliştirilmiş ürün verimini ve sentez süresini kısalttığını göstermiştir. Bu genel bir protokol, in vitro ve in vivo önemli moleküler mekanizmasının anlaşılması ve daha fazla insan hastalıklar için potansiyel ilaçların geliştirilmesi peptidleri kullanan diğer çalışmalar için uygulanabilir.

<table><tbody><tr><td>< güçlü > REAKTİFLER< / güçlü ></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Katı destek, Rink Amid reçine ML</td><td>CBL</td><td>BR-1330</td><td>yükleme: 0.49 mmol / g</td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FA2100</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg (Pbf) -OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FR2136</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-ASN (Trt) -OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FN2152</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-ASP (OBut) -OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FD2192</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys (Trt) -OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FC2214</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln (Trt) -OH</td><td>İleri Chemtech</td><td>FQ2251</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu (OtBu) -OH</td><td>İleri Chemtech</td><td>FE2237</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gly-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FG2275</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Trt)-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FH2316</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FI2326</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Leu-OH</td><td>İleri Chemtech</td><td>FL2350</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>İleri Chemtech</td><td>FK2390</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FM2400</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Phe-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FF2425</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FP2450</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser-(tBu)-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FS2476</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FT2518</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Trp(Boc)-OH</td><td>İleri Chemtech</td><td>FW2527</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(Ama)-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FY2563</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>FV2575</td><td></td></tr><tr><td>1-Metil-2-pirolidinon (NMP)</td> <td>Sigma</td><td>328634</td><td><güçlü>Dikkat< / güçlü> Toksik / Son derece yanıcı / Tahriş edici.</td></tr><tr><td>N, N-Dimetilformamid (DMF)</td> <td>Alfa Aesar</td><td>43465</td> <td>< güçlü > Dikkat< / güçlü> Toksik. 
DMF ayrışmasından kaynaklanan dimetilamin izlerinin bir sonucu olarak Fmoc çıkarılması gibi yan reaksiyonları ortadan kaldırmak için yüksek kaliteli DMF kullanın.</td></tr><tr><td>Diklorometan (DCM)</td> <td>Sigma</td><td>D65100</td> <td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Zararlı</td></tr><tr><td>Dibromometan (DBM)</td> <td>Sigma</td><td>D41868</td> <td><güçlü > Dikkat< / güçlü > Zararlı</td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit (TFA)</td> <td>Sigma</td><td>T62200</td> <td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Aşındırıcı / Toksik</td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit, HPLC sınıfı (TFA)</td> <td>Sigma</td><td>91707</td><td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Aşındırıcı / Toksik</td></tr><tr><td>Dietileter</td><td>Sigma</td><td>31690</td><td><güçlü>Dikkat< / güçlü> Son derece yanıcı / Zararlı</td></tr><tr><td>Triizopropilsilan (TIS)</td> <td>Sigma</td><td>233781</td><td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Tahriş Edici / Yanıcı</td></tr><tr><td>Su, HPLC sınıfı</td><td>Sigma</td><td>270733</td><td></td></tr><tr><td>Asetonitroil, HPLC sınıfı (ACN)</td> <td>Fisher Bilimsel</td><td>A998-4</td> <td>< güçlü > Dikkat< / güçlü> Yanıcı / Tahriş Edici / Zararlı</td></tr><tr><td>< >N, N-Diizopropetilamin (DIEA)</td> <td>Sigma</td><td>3440</td> <td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Aşındırıcı / Yüksek yanıcı</td></tr><tr><td>Piperidin</td><td>Sigma</td><td>W290807</td><td><güçlü>Dikkat< / güçlü> Toksik / Yüksek derecede yanıcı</td></tr><tr><td>Piridin</td><td>Sigma</td><td>270970</td><td><güçlü>Dikkat< / güçlü> Son derece yanıcı / Zararlı</td></tr><tr><td>Etanol (EtOH)</td> <td>Sigma</td><td>459844</td><td><güçlü>Dikkat< / güçlü> Son derece yanıcı / Tahriş edici</td></tr><tr><td>1-Hidroksibenzotriazol hidrat (HOBt)</td> <td>Sigma</td><td>157260</td> <td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Son derece yanıcı / Tahriş edici / Zararlı</td></tr><tr><td>O-(Benzotriazol-1-il)-N,N,N&prime;,N&prime; - tetrametiluronyum hekzaflorofosfat (HBTU)</td><td>Sigma</td><td>12804</td><td><güçlü>Dikkat</güçlü> Tahriş Edici/Zararlı</td></tr><tr><td>Benzotriazol-1-ly-oksi-tris-pirolidinfosfonyum hekzaflorfosfat (PyBOP)</td><td>Gelişmiş Chemtech</td><td>RC8602</td><td><güçlü>Dikkat</güçlü> Tahriş Edici</td></tr><tr><td>Ninhidrin</td><td>Sigma</td><td>454044</td><td><güçlü>Dikkat</güçlü> Zararlı</td></tr><tr><td>Fenol</td><td>Sigma</td><td>P3653</td><td><güçlü>Dikkat< / güçlü> Aşındırıcı / Toksik</td></tr><tr><td>Potasyum siyanür (KCN)</td> <td>Sigma</td><td>11813</td> <td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Çok Toksik</td></tr><tr><td>Potasyum hidroksit (KOH)</td> <td>Sigma</td><td>221473</td><td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Toksik</td></tr><tr><td>N, N' -Diizopropilkarbodiimid (DIC)</td> <td>Sigma</td><td>38370</td> <td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Yanıcı / Toksik</td></tr><tr><td>4-Dimetilaminopiridin (DMAP)</td> <td>Sigma</td><td>522805</td><td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Toksik / Tahriş</td></tr><tr><td>Edici Glutarik anhidrit</td><td>Sigma</td><td>G3806</td> <td><güçlü > Dikkat< / güçlü> Yanıcı / Tahriş Edici / Zararlı</td></tr><tr><td>Süksinik anhidrit</td><td>Sigma</td><td>239690</td><td><güçlü>Dikkat</güçlü> Tahriş edici/Zararlı</td></tr><tr><td>Adipik asit</td><td>Sigma</td><td>A26357</td><td><güçlü>Dikkat</güçlü> Toksik / Tahriş edici</td></tr><tr><td>Pimelic asit</td><td>Sigma</td><td>P45001</td><td><güçlü>Dikkat</güçlü> Toksik / Tahriş Edici</td></tr><tr><td>Kloranil</td><td>Sigma</td><td>23290</td><td><güçlü>Dikkat< / güçlü> Toksik / Tahriş Edici</td></tr><tr><td>Asetaldehit</td><td>Sigma</td><td>402788</td><td><güçlü>Dikkat< / güçlü> Yanıcı / Toksik</td></tr><tr><td><güçlü>EKİPMANLAR< / güçlü></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>Beckman Coulter</td><td>Allegra 6R santrifüj</td><td></td></tr><tr><td>Liyofilizatör</td><td>Labconco</td><td>serbest bölge 4.5</td><td></td></tr><tr><td>Vakum pompası</td><td>Franklin Electric</td><td>model 1101101416, 3/4 HP</td><td>Alcatel ile Franklin Motorlu pompa&nbsp;</td></tr><tr><td>Polipropilen kartuş 12 ml</td><td>Uygulamalı Ayırma</td><td>2419</td><td></td></tr><tr><td>12 ml polipropilen kartuş için kapak tapası</td><td>Uygulamalı Ayırma</td><td>8157</td><td></td></tr><tr><td>Polipropilen kartuş 3 ml</td><td>Uygulamalı Ayırma</td><td>2413</td><td></td></tr><tr><td>3 ml polipropilen kartuş için kapak tapası</td><td>Uygulamalı Ayırma</td><td>8054</td><td></td></tr><tr><td>Durdurma muslukları PTFE</td><td>Uygulamalı Ayırma</td><td>2406</td><td></td></tr><tr><td>Düz tüpler, 50 ml</td><td>VWR</td><td>21008-240</td><td></td></tr><tr><td>Ekstraksiyon manifoldu, 20 kutup, 16 x 100 mm tüpler</td><td>Sular</td><td>WAT200609</td><td></td></tr><tr><td>Çalkalayıcı, BD adams nutator karıştırıcı</td>, <td>Fisher scientific</td><td>22363152</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene HDPE dar ağızlı IP2 şişeler, 125&nbsp; ml</td><td>Fisher scientific</td><td>03-312-8</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyer şişesi</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-501, 500 ml</td><td></td></tr><tr><td>Isıtma bloğu</td><td>Thermolyne</td><td>1760 dri banyosu</td><td></td></tr><tr><td>Düz uçlu tek kullanımlık borosilikat cam tüpler</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-961-25</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipetler ve uçlar Finnpipette</td><td>Thermo</td><td>20&ndash; 200 ve 100&ndash; 1.000 &mu; l</td><td></td></tr><tr><td>HPLC şişeleri - mikro vl pp 400 ve mikro; l PK100&nbsp; &nbsp;</td><td>VWR</td><td>69400-124</td><td></td></tr><tr><td>HPLC şişesi- Mavi Geçmeli Kapak</td><td>VWR</td><td>66030-600</td><td></td></tr><tr><td>Analitik HPLC sütunu</td><td>Peeke Scientific</td><td>U1-5C18Q-JJ</td><td>ultro 120 5 & m C18Q, 4,6 mm İç Çap 150 mm</td></tr><tr><td>Hazırlık HPLC kolonu, XBridge&nbsp;</td><td>Sular</td><td>OBD C18 5 & mikro; m sütun</td><td>19 mm ve zamanlar; 150 mm</td></tr><tr><td>Kütle spektrometresi</td><td>Uygulamalı Biyosistemler</td><td>Voyager DE-RP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Azot silindiri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kurutucu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analitik RP-HPLC sistemi Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td><td>aşağıdakilerle donatılmıştır: CBM-20A sistem kontrolörü, SPD-20A dedektörü, CTO-20A kolonlu fırın, 2 x LC-20AD solvent dağıtım ünitesi, SIL-20AC otomatik numune alma cihazı, DGU-20A5 gaz giderici (Shimadzu, MD, ABD).</td></tr><tr><td>Hazırlayıcı RP-HPLC sistemi Shimadzu LC-20</td><td></td><td></td>, <td>aşağıdakilerle donatılmıştır: CBM-20A sistem denetleyicisi, SPD-20A dedektörü, CTO-20A kolon fırını, 2 x LC-6AD solvent dağıtım ünitesi ve FRC-10A fraksiyon toplayıcı (Shimadzu, MD, ABD).</td></tr></tbody></table>

mikrodalga radyasyon kullanımı potansiyel antiparazitik therapeutics gibi omurga siklik peptit kütüphanesi gelişimi

Development of a Backbone Cyclic Peptide Library as Potential Antiparasitic Therapeutics Using Microwave Irradiation

Protein-protein etkileşimleri (PPIs) hemen hemen tüm biyolojik süreçlerin neden olduklarına ve birçok insan hastalıkları ile bağlantılıdır. Bu nedenle, temel araştırma ve ilaç sektöründe PPIs hedef büyük bir çaba var. Protein-protein arayüzleri düz, genellikle büyük ve genellikle bu tür siteleri hedeflemek küçük moleküllerin keşfi zorlaştıran, cepler yoksundur. Antikorlar kullanılarak alternatif hedefleme yaklaşımları kötü oral biyoyararlanım, düşük hücre geçirgenliği ve üretim verimsizliği nedeniyle sınırlamaları vardır. PPI arayüzleri hedef peptidleri kullanma birçok avantajı vardır. Peptitler daha şekilsel esnekliğe, artan seçiciliğe sahip ve genellikle daha ucuzdur. Ancak, peptidler yoksul istikrar ve verimsizlik geçen hücre zarları da dahil olmak üzere, kendi sınırlamaları vardır. Bu tür kısıtlamaların üstesinden gelebilmek için, peptit siklizasyon yapılabilir. Siklizasyon peptid seçimliliği arttırmak için ortaya konmuşturMetabolik stabilitesi ve biyo. Bununla birlikte, bir siklik peptid konformasyonunu biyoaktif tahmin önemsiz değildir. Bu sorunun üstesinden gelebilmek için, bir çekici bir yaklaşım tüm omurga siklik peptitler aynı birincil sekansına sahiptir, ancak bu tür bir halka boyutu ve konumu olarak yapısını etkileyen parametrelerin, farklı olan ekrana odaklanmış bir kütüphanenin taranması için. Spesifik parazit PPIs hedefleme omurgası siklik peptidlerin bir kütüphane sentezi için detaylı bir protokol açıklar. Rasyonel bir tasarım yaklaşımı kullanarak, aktive C-kinaz (EKSİKLİĞİ) için iskele protein L eishmania reseptörü türetilen peptidler geliştirdi. Biz ancak memeli konak homolog olarak, parazitler korunan LACK diziler, parazitlerin canlılığı açısından kritik olan proteinler için etkileşim siteleri temsil edebilir varsaydık. Halkalı peptidler reaksiyon sürelerini azaltmak ve artırmak için mikrodalga ışıması kullanılarak sentezlendiverimlilik. Farklı halka boyutları ile omurgası halkalı peptidler bir kütüphane geliştirilmesi en Biyolojik aktif konformasyon için sistematik bir ekran kolaylaştırır. Bu yöntem, döngüsel peptitler sentezlemek için bir genel, hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Burada özellikle Leishmania parazitinin hayati PPIs hedef ve (antiparaziter ajanlar 87 olarak PPIs hedef peptidler hakkında inceleme için) antiparaziter ajanlar gibi hareket omurga halkalı peptidler odaklanmış küçük bir kütüphane gelişimini açıklar. Yeni bir omurga siklik peptit sentezi yoluyla farmakoforlar, uzatılabilir büyüklükte bir iskele halinde muhafaza edilmektedir. Burada önerilen odaklanmış kütüphanenin gücü siklizasyonu yoluyla yapısal serbestlik kısıtlı bir derecede izin verirken peptid i...

Mikrodalga ışınlaması kullanılarak siklik peptitlerin sentezi için basit ve genel bir yöntem özetlenmiştir. Bu prosedür, yan zincirleri ve farmakoforik kısımları korurken farklı konformasyonların bir koleksiyonu ile omurga siklik peptitlerinin sentezini sağlar ve bu nedenle biyoaktif konformasyonun taranmasına izin verir.

Mikrodalga Radyasyon Kullanımı Potansiyel Antiparazitik Therapeutics gibi omurga Siklik Peptit Kütüphanesi Gelişimi

Protein-protein interactions (PPIs) are intimately involved in almost all biological processes and are linked to many human diseases. Therefore, there is ...

Bu prosedürün genel amacı, yeni antiparaziter terapötikler için mikrodalga ışınımı kullanarak konformasyonel çeşitliliğe sahip odaklanmış bir ana zincir siklik peptidomimetik kütüphanesi geliştirmektir. Bu yöntem, protein-protein etkileşimlerini spesifik olarak hedefleyen yeni araçların geliştirilmesine yardımcı olabilir. Bu prosedüre başlamak için, polipropilen bir kartuşa 2.5 milliliters istenen amino asit, bir milliliter aktivatör ve 0.5 milliliters aktivatör bazı ekleyin.Kartuşu otomatik bir mikrodalga sentezleyiciye yerleştirin ve kenetlenme reaksiyonunun 25 watt ve 75 °C'de 300 saniye boyunca gerçekleşmesini sağlayın. Reaksiyon tamamlandığında, reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre N, N-dimetilformamid veya DMF ile yıkayın. Önceki adımı beş kez tekrarladıktan sonra, polipropilen kartuşa 0.1 molar 1-hidroksibenzotriazol veya HOBt içeren DMF içinde %20 piperidin'den yedi mililitre ekleyin ve 45 watt ile 75 °C'de 30 saniye boyunca inkübe edin.İşlem tamamlandığında, reaksiyon karışımını süzün. Ardından, polipropilen kartuşa 0.1 molar HOBt içeren DMF içinde %20 piperidin'den yedi mililitre ekleyin ve 45 watt ve 75 °C'de 180 saniye boyunca inkübe edin. Reaksiyon karışımını süzdükten sonra, reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre DMF ile yıkayın.Ardından, reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre diklorometan (DCM) ile yıkayın. Anhidrit kenetlenmesi için reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre 1-metil-2-pirolidinon (NMP) ile yıkayın. İşlem tamamlandığında, reaksiyon karışımını süzün.Önceki adım üç kez tekrarlandıktan sonra, karşılık gelen anhidritin 10 eşdeğerini 50 mililitrelik bir polipropilen tüp içinde beş mililitre NMP içerisinde çözün. Ardından, çözeltiye bir eşdeğer 4-Dimetilaminopiridin (DMAP) ve 10 eşdeğer N, N-diizopropiletilamin (DIEA) ekleyin. Bu karışımı reçineye ekleyin ve 25 watt ve 75 °C'de 300 saniye boyunca inkübe edin.Reçineyi NMP ile yıkadıktan sonra, oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre DMF ile yıkayın. Bu aşamada reçineyi, kapak tıpası ve musluk ile donatılmış bir polipropilen kartuşa aktarın. Reçine DCM ile yıkandıktan sonra, her 1 gram reçine başına %1 trifluoroacetic acid, %5 triisopropylsilane ve %94 DCM karışımından 15 ila 25 mililitre polipropilen kartuşa ekleyin.Polipropilen kartuşu bir sarsıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında beş dakika boyunca sallayın. Bunun ardından, vakum uygulayarak çözeltiyi polipropilen kartuştan süzün. Önceki adımları üç kez tekrarladıktan sonra, reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre DCM ile yıkayın.Birçok reçinedeki trityl koruyucu grupların DCM-trifloroasetik asit çözeltilerinde kısmen ayrıştığı tespit edildiğinden, bu adımlar oldukça önemlidir. Metiltrityl gruplarının uzaklaştırılması, birden fazla yıkama gerektiren yavaş bir işlemdir. 50 mililitrelik bir polipropilen tüp içinde, beş eşdeğer Benzotriazole-1-ly-oxy-tris-pyrrolidinophosphonium hexafluorphosphate'ı beş mililitre dibromometan içinde çözün.Ardından, çözeltiye 10 eşdeğer DIEA ekleyin. Karışımı DCM ile durulanmış reçineye ekleyin ve 25 watt ve 75 °C'de 300 saniye boyunca inkübe edin. Bunun ardından, reçineyi oda sıcaklığında 120 saniye boyunca yedi mililitre DCM ile yıkayın.DCM ile iki kez yıkadıktan sonra reçineyi polipropilen bir kartuşa aktarın ve dietil eter ile iki kez yıkayın. Reçineyi, oda sıcaklığında bir vakum desikatöründe potasyum hidroksit üzerinde en az üç saat boyunca kurutun. Ardından, her bir gram reçineye 10 mililitre önceden soğutulmuş trifloroasetik asit cleavage kokteyli ekleyin.Polipropilen kartuşu bir çalkalayıcıya yerleştirin ve oda sıcaklığında 3 saat boyunca çalkalayın. Bunun ardından, reçineyi 50 mililitrelik bir polipropilen tüpe filtreleyerek kesme solüsyonunu toplayın. Tüpe 35 mililitre soğuk dietil eter ekleyin.4 °C'de 1.207 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından, eter tabakasını boşaltın. Kaiser testi için 16,5 mg potasyum siyanürü 25 mL distile suda çözerek Çözelti A'yı hazırlayın.Çözeltinin bir mililitresini 49 mililitre peridin ile seyreltin. Ardından, bir gram ninhidrini 20 mililitre etanolde çözerek Çözelti B'yi hazırlayın. 40 gram fenolü 20 mililitre etanolde çözerek Çözelti C'yi hazırlayın.Çözeltiler hazırlandıktan sonra, reçineden birkaç boncuğu bir deney tüpüne aktarın. Tüpe her bir çözeltiden üç damla ekleyin ve karıştırın. Son olarak, deney tüpünü bir ısıtma bloğunda 110 degrees Celsius sıcaklıkta beş dakika boyunca ısıtın.İskelet döngüsel peptidlerin sentezi, katı destek üzerinde FMOC, t-bütil protokolü izlenerek otomatik bir mikrodalga sentezleyici kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ürün kütle spektrometrisi ile analiz edilmiş ve saflık derecesi HPLC kullanılarak belirlenmiştir. Biyolojik tarama, pL1 peptidinin, insanlardaki en şiddetli leishmaniasis türü olan visseral leishmaniasis'e neden olan bir parazit olan Leishmania donovani'ye karşı aktif olduğunu göstermiştir.Peptit pL1, kontrol tedavisine kıyasla parazit canlılığını %75 oranında azaltmıştır. Uzmanlaşıldığında, bu teknik düzgün bir şekilde uygulandığında üç ila beş günde tamamlanabilir. Geliştirilmesinin ardından bu teknik, geniş bir yelpazedeki alanlarda çalışan araştırmacıların, temel araştırmalarda ve terapötiklerde farmakolojik regülatörler olarak peptitleri keşfetmelerinin önünü açmıştır.Bu videoyu izledikten sonra, protein-protein etkileşimlerini spesifik olarak hedeflemek amacıyla konformasyonel çeşitliliğe sahip odaklanmış bir peptidomimetik kütüphanesinin nasıl geliştirileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Trifloroasetik asit ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken göz koruması, laboratuvar önlüğü ve eldiven takmak ve iyi havalandırılan bir çeker ocak içerisinde çalışmak gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

development-backbone-cyclic-peptide-library-as-potential

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Aşağıdaki protokol tiyol-ene fotoğrafı tıklama reaksiyonlar oluşturduğu adım büyüme PEG-peptid Hidrojellerde pankreatik β-hücreleri encapsulating için teknikler sağlar. Bu malzeme platformu hücre kapsülleme için cytocompatible mikroçevrede sunuyor, ama aynı zamanda hidrojellerin bünyesinde oluşturulan hücre yapılarının kullanıcı kontrollü hızlı iyileşme sağlar sadece.

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Bu video zincir polimerizasyonların gizlenmemesi ve hidrojel sentezini sağlayan, poli (etilen glikol), metakrilat, hızlı, verimli bir yöntem gösterecektir. Bu benzer, fonksiyonlandırmalar verimliliğini değerlendirmek giderme ve gelişmiş değişiklikler için öneriler sunmak ve tipik hidrojel karakterizasyon teknikleri göstermek için peptidler, detay ortak analitik yöntemler içine metakrilamit işlevlerini tanıtmak için nasıl gösterecektir.

Mikrodalga destekli Poli işlevselleştirilmesi (etilen glikol) ve zincir polimerizasyonu ve Hidrojel formasyonunda kullanılan On-reçine Peptides

Peptid üçüncül amidler (PTAs) gibi peptitler, peptoidler ve N-metillenmiş peptidlere sınırlı değildir peptidomimetik bir süper ailesidir. Burada PTA bir tek tane tek bileşik kütüphanesi sentezlenmesi için iki-ve-havuz ve alt monomer stratejileri hem de birleştiren bir sentetik yöntem açıklanmaktadır.

Split-ve-havuz Sentezi ve Peptit Tersiyer Amid Kütüphanesi Karakterizasyonu

Aynı dizide karışık katyonik işlevselliğe sahip peptoidleri sentezlemek için bir protokol sunulmuştur (lizin ve arginin tipi monomerler). Bu bileşiklerin, kutanöz leishmaniasis'e neden olan protozoan parazitler olan Leishmania mexicana'ya karşı daha sonraki testleri de açıklanmaktadır.

Bunların Anti layişmanya Faaliyet karışık Lizin tipi / Arjinin-monomerleri ve Değerlendirilmesi peptoidler Sentezi için etkili bir yöntem

Protokol Escherichia colisunar-lactococcal antimikrobiyal peptid nisin içine seçici basınç birleşme kanonik olmayan amino asit (ncAAs) dayalı. Özelliklerini rekombinant ifade ile ikame ile tanımlanmış büyüme medya istenen ncAAs sırasında değiştirilebilir. Bioactivity ortaya çıkan değişimler büyüme inhibisyon deneyleri ve floresan mikroskopi tarafından eşleştirilir.

Antimikrobiyal peptidler kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından üretilen

Bu protokol, sistein ve metiyonin arasındaki bisalkilasyon yoluyla siklik peptitlerin sentezini ve propargil sülfonyum merkezi tarafından tetiklenen fakil tiol-yne reaksiyonunu sunar.

On-Tether Sülfonyum Merkezi Kullanarak Döngüsel Peptitlerin Oluşturulması

Bu protokol, siklik hücreye nüfuz eden peptitlerin aromatik çapraz bağlarla sentezini ve biyolojik bariyerler boyunca geçirgenliklerinin değerlendirilmesini açıklar.

Biyolojik Bariyerlerin Daha İyi Penetrasyonu için Siklik Hücre Nüfuz Eden Peptitlerin Yapımı

Fisyon mayası burada, polimerizasyonlarını görselleştirmek için GFP ile translasyonel füzyon proteinleri olarak FtsZ ve MreB gibi bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini eksprese etmek için heterolog bir konakçı olarak kullanılır. Ayrıca, polimerizasyonu etkileyen bileşikler, bir floresan mikroskobu kullanılarak görüntüleme ile tanımlanır.

Bakteriyel hücre iskeleti proteinlerini hedef alan antibakteriyel ilaç taramaları için bir platform olarak fisyon mayası

Ticari bir mikrodalga reaktöründe katı faz peptit sentezlerini gerçekleştirmek için basit, ucuz ve yeni bir aparat sunulmaktadır.

Katı faz peptit sentezi için ticari bir mikrodalga reaktörünün ucuz bir adaptasyonu

Bu protokol, katyonik peptid Mel4 ile RK758 peptit taklidi olan antimikrobiyal aktivite ve sitotoksisitenin üretilmesi ve değerlendirilmesi için bir yöntem tanımlar. Kimyasal sentez, rekombinant ifade ve standartlaştırılmış fonksiyonel testleri entegre ederek, peptit ve küçük molekül taklitlerinin üretimi ve testi için daha verimli bir iş akışı sağlar.

Antimikrobiyal Peptitler ve Taklitlerinin Üretimi ve Testi

Öğrenin, mikrodalga radyasyon kullanarak omurga siklik peptit kütüphanesi geliştirme yöntemini. Bu teknik, antiparazitik tedaviler için protein-protein etkileşimlerini hedeflemeye yardımcı olur.

Mikrodalga Radyasyon Kullanımı Potansiyel Antiparazitik Therapeutics gibi omurga Siklik Peptit Kütüphanesi Gelişimi

Daha fazla video keşfet