Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme In-situ Perfüzyon LacZ-Tagged Tümör Hücreleri

Bu prosedürün genel amacı, şişirilmiş akciğer mimarisini korurken fare akciğerindeki mikro metastazların ex vivo tespitini iyileştirmektir. Bu, ilk olarak, o dokudaki ana renk arka plan kaynağı olan kanı çıkarmak için akciğerin PBS ile yerinde perfüze edilmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, PFA enjeksiyonu ile akciğeri şişirmek, ardından akciğer dokusunu şişirme altında sabitlemek için çimdiklemektir.

Daha sonra, akciğer çıkarılır ve PFA'ya daha fazla sabitlenir veya kriyoseksiyon için tek akciğer lobları gömülür. Son adımlar, dokuların Xal solüsyonunda boyanması ve LA zag tümör hücrelerinin görüntülenmesidir, sonuçta tüm akciğer loblarında metastaz yapar veya akciğer dokusu kesitlerinde binoküler mikroskop veya ışık mikroskobu ile tek hücre seviyesine kadar tespit edilebilir. Bu tekniğin gökyüzünün kendi başına durması gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, kanla ilgili arka planın çıkarılması nedeniyle mikro metastazların saptanabilirliğinin önemli ölçüde iyileştirilmesidir.

Yaklaşık 150 mikrolitre PBS'de intraperitoneal ketamin, ksilazin ve ace promazin enjeksiyonu ile bir fareyi uyuşturarak protokole başlayın. Farenin ağrı refleksleri artık gözlenmediğinde, ameliyat masasına sabitleyin. Geri dönün ve saçı %70 etanol ile kayganlaştırın.

Cildi karından boyuna kadar açın. Cildi yanlara doğru çekin veya çıkarın. Venina juguler gibi büyük damarların yırtılmasını önlemek için göğüs kafesindeki peritonu dikkatlice açın.

Bu, perfüzyonun verimliliğini artıracaktır. Şimdi 21 ila 24 gauge iğne ile 20 mililitrelik bir şırınga kullanarak karaciğerin altındaki vena cava cardis'i kesin. Akciğer tamamen beyaz olana ve kalp atmayı durdurana kadar atan kalbin sağ ventrikülüne yavaşça 10 ila 15 mililitre PBS enjekte edin.

Daha sonra karaciğerin ve diyaframın üzerindeki kan damarlarını vasküler bir kelepçe ile sıkıştırın. % 3 paraform aldehit içeren 10 mililitrelik bir şırınga yükleyin ve 21 ila 24 gauge iğne ile sağ ventriküle enjekte edin. Yaklaşık iki mililitre.

Göğüs kafesinin dışındaki trakeayı ortaya çıkarın ve göğüs kafesinin dışından yaklaşık üç mililitre aldehit trakea içine bir enjeksiyonla akciğeri şişirin. Daha sonra iğneyi çıkardıktan hemen sonra, delinmeye yapışan trakeayı vasküler bir kelepçe ile sıkıştırın ve fiksasyona izin vermek için 10 dakika bekleyin. Daha sonra, kan damarlarını vasküler kelepçenin üzerine geçirin.

Ardından kelepçeyi çıkarın ve fazla güç formaldehitini çıkarmak için sağ ventriküle yaklaşık iki mililitre PBS enjekte edin. Tüm akciğer loblarının alt kısımlarını bir iğne ile delin ve trakeadaki vasküler kelepçeyi çıkarın. Şimdi, diğer enjeksiyona bağlı trakeaya üç ila beş mililitre seyreltilmiş gömme çözeltisi enjekte edin.

Akciğer loblarındaki paraform derisi çözelti ile değiştirildiğinde enjeksiyonu durdurun. Kalbi bir forseps ile çekerek ve bağ dokusu bağlarını, kan damarlarını ve trakeayı keserek akciğeri dikkatlice çıkarın. Kalbi akciğerlere bağlı tuttuğunuzdan emin olun.

Kriyo bölümleri için bir lob ayırın ve kalan akciğer dokusunu tüm uzun boyama için kullanın. Akciğeri sıkıca kapanan bir kapağı olan plastik bir kaba koyun ve% 2 formaldehit ve PBS ile sabitleyin. Solüsyonda tutmak için akciğerin üzerine bir parça gazlı bez koyun ve 30 dakika oda sıcaklığında bekletin.

Yarım saat sonra, fiksasyon solüsyonunu çıkarın ve dokuyu PB S3 ile iyice yıkayın, bir mililitre Xal stok solüsyonunu, bir ila 40 temel boyama solüsyonunda seyrelterek kullanıma hazır xal solüsyonunu taze olarak hazırlayın ve en az 10 mililitre ekleyin bardağa. Akciğeri bir parça gazlı bezle batırın. Hava değişimine izin vermek için kapağı gevşek bir şekilde sabitleyin ve ışıktan koruyarak üç ila beş saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin.

İnkübasyondan sonra, xal çözeltisini çıkarın. Artık xal solüsyonunu çıkarmak için akciğerleri PBS ile bir kez durulayın ve PBS'ye en az 10 mililitre% 4 paraform aldehit ekleyin. Doku artık histoloji için hazırdır ve dört santigrat derecede% 4 PFA'da uzun süre saklanabilir.

Bir gömme kalıbının üçte birini seyreltilmemiş poliforze gömme ortamı ile doldurarak başlayın. Daha sonra akciğer lobunu kalıba yükleyin ve lob tamamen kaplanana kadar orta madde eklemeye devam edin. Hava kabarcıkları yapmaktan dikkatlice kaçının, şimdi gömülü lobu 20 dakika boyunca dört santigrat derecede inkübe edin.

Daha sonra, gömülü akciğerleri kuru buz ve isop pentan karışımı içinde yavaşça dondurarak bölümlere ayırmaya hazırlayın. Gerekirse, artık lobun yedi ila 10 mikron kriyo bölümleri arasında kesilmiş bir kriyostat üzerinde saklanmak üzere eksi 80 santigrat derece dondurucuya aktarılabilirler Bölümleri piyasada bulunan kriyo bölümüne monte edin Hazır slaytlar Monte edildikten sonra, bölümleri hemen nemlendirilmiş bir odada 24 saat boyunca 37 santigrat derecede xal boyama solüsyonunda inkübe edin. Ertesi gün, slaytları durulama başına beş dakika boyunca PBS'de iki kez durulayın.

Bunu damıtılmış suda kısa bir durulama ile takip edin. Şimdi, xal'ı daha baskın hale getiren zayıf bir karşı leke elde etmek için slaytları 10 saniye boyunca nükleer hızlı kırmızı ile boyayın ve karşı lekeyi hemen damıtılmış suyla durulayın. Daha koyu bir karşı leke için süreyi 30 saniye veya daha fazla uzatın.

Slaytları immüno montajı ile monte edin. Yapılan LM sekiz fare işletim sistemi modelinde metastaz oluşumu yeniden araştırıldı. Burada tarif edilenlerin temsili görüntüleri kullanılarak, kontrollü bitti hücreleri enjekte edilen farelerde aynı anda gevşek transdüksiyonlu ve nont transdüksiyonlu kontrollü done ve LM sekiz hücresi enjekte edilen farelerin temsili görüntüleri kullanılarak.

Makroskopik ve mikroskobik metastazlar, perfüze olmayan ve perfüze edilmiş akciğerlerde tespit edilemeden kalmıştır. Ancak ilginç bir şekilde, dun LA Z hücreleri enjekte edilen farelerde, xgl boyama, yerinde perfüze edilmemiş akciğerlerin yüzeyinde tek hücrelerin veya küçük hücre kümelerinin mavi mikrometastatik odaklarını ortaya çıkardı in situ perfüzyon ve akciğerlerin fiksasyonu, dun la z mikro metastazlarının saptanabilirliğini daha da iyileştirdi, ancak, yarı saydam kontrol LM sekiz hücre enjekte edilen farelerde makroskopik odaklarda büyüme gözlenmedi, Çapı 0.1 milimetreden daha büyük, zar zor tespit edilebilen makro metastatik odaklar, perfüze olmayan akciğerlerde tanındı. Akciğerin perfüzyonu odakların tespitini iyileştirmedi.

Bununla birlikte, LAC Z hücreleri enjekte edilen farelerde, perfüze olmayan organların yüzeyinde çoklu X gal boyası mavi makro metastazı tespit edildi. Perfüze olmayan organların yüzeyinde de mikro metastazlar tespit edildi. Ayrıca, akciğerlerin perfüzyonu, makro ve mikro metastazların saptanabilirliğini daha da geliştirdi.

Sonuç olarak, mikro ve makro metastazlar, esas olarak organ yüzeyinin altındaki odakların da görünür hale geldiği perfüze dokunun yarı saydamlığına bağlı olarak daha yüksek bir yoğunlukta ve daha büyük bir sayıda görünür hale geldi. Akciğer dokusunun kriyo kesitleri kullanılarak yapılan ek bir histolojik analiz, Dun LAX Z hücrelerinden türetilen primer tümörleri olan farelerde LAX Z transdüksiyonlu done ve LM sekiz hücresi enjekte edilen farelerde akciğer metastazlarının gelişmiş saptanabilirliğini doğruladı. Akciğer kesitlerinde mikro metastazlar ve hatta tek hücreli odaklar tanındı.

Bu, ilgili kontrol hücrelerinin primer tümörleri olan farelerde gözlenmedi. Ayrıca, makro metastazlar, LM sekiz LA C hücresi enjekte edilen farelerde, kontrol LM sekiz hücresi olan hayvanlara göre daha net bir şekilde görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, ZI iki'de akciğer perfüzyonu ve fiksasyonunun nasıl gerçekleştirileceğini ve ardından eksize edilen akciğerlerdeki metastazın eksi boyamasını iyi anlamış olmalısınız.

Bu teknik, her türlü kanser çalışmasında akciğerdeki metastaz dağılımı için okunan oldukça hassas bir son noktadır ve ayrıca metastatik lezyonların erken tespiti için kullanılan mikro, ct, PET ve MRI gibi mevcut in vivo görüntüleme tekniklerinin iyileştirilmesi için bir ölçüt görevi görebilir.