Name: Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme In-situ Perfüzyon LacZ-Tagged Tümör Hücreleri (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-08-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: Keşfedin, farelerde tek hücre çözünürlüğünde akciğer metastazlarını in situ perfüzyon ve X-Gal boyama ile görselleştirme yöntemini. Bu protokol, kan kaynaklı arka planı ortadan kaldırarak mikrometastazların saptanabilirliğini önemli ölçüde artırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yazarlar akciğer perfüzyon tekniği onun tavsiye için Dr Lubor Borsig (Fizyoloji Enstitüsü, Zürih Üniversitesi) teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma Kanton Zürih Krebsliga, Walter L. ve Johanna Kurt Vakfı, Zürih, Lydia Hochstrasser Vakfı, Zürih, İsviçre Ulusal Bilim Vakfı, SNF, İsviçre, Schweizerischer Verein Balgrist ve Üniversitesi bağışları ile desteklenmiştir Zürih.

1. In-situ Akciğer Perfüzyon ve Fiksasyon <ol><li> ~ 150 ul fosfat IP enjeksiyonu ile farelerin anestetize salin (PBS) ile 112.5 mg / kg (vücut ağırlığı) ketamin, 16.5 mg / kg ksilazin, ve 15 mg / kg &#39;ye asepromazin (veya uygun bir ağrı kesici içeren başka bir anestezi ile). Içeren tamponlu </li><li> Fare refleksleri artık gözlenen olduğunda, geri aşağı ameliyat masasında düzeltmek ve aşağı kaygan kıllar% 70 Etanol ile kürk ıslak. </li><li> Boynuna karın cilt kadar açın ve yanlara çekin veya kaldırın. </li><li> Geniş bir boyuta periton ve toraks açın. Sonraki perfüzyon azalmış etkinlik kaçınmak için büyük gemilerin rüptürü (örn. vena jugularis) önleyin. </li><li> Karaciğer altında vena kava caudalis kesin. </li><li> Akciğer tamamen beyaz ve kadar dayak kalbin sağ ventrikül içine yavaşça 10-15 ml PBS enjekte 24G iğne - 21G ile donatılmış 20 ml şırınga kullanınkalp (asistoli) yenerek durur. </li><li> Vasküler klemp ile karaciğer ve diyafram yukarısında kan damarlarından sıkıştırın. </li><li> Sağ ventrikül içine PBS içinde% 3 paraformaldehid ~ 2 ml (PFA) enjekte 24G iğne - 21G ile donatılmış 10 ml şırınga kullanın. </li><li> Toraks dışında trakea ortaya çıkarın. Akciğer şişirilmiş kadar trakea içine PBS kranyal (toraks dışında) 3% PFA ~ 3 ml enjekte aynı şırınga kullanın. Hemen iğne çıkarıldıktan sonra, vasküler klemp ile ponksiyon trakea kaudal çimdiklemek ve fiksasyonu sağlamak için 10 dakika bekleyin. </li><li> Vasküler klemp üzerinde kan damarları transeksiyonu, kelepçe kaldırmak ve aşırı PFA kaldırmak için sağ ventriküle ~ 2 ml PBS enjekte. </li><li> Delinme bir iğne ile tüm akciğer lobu alt kısımları, trakea vasküler klemp kaldırmak ve de PFA kadar ilk ponksiyon trakea kaudal içine orta / PBS 01:01 gömme PolyFreeze bir çözüm 3-5 ml enjekte akciğerloblar çözümü ile değiştirilir. </li><li> Bir forseps ile kalp çekerek ve bağ dokusu bağ, kan damarları ve trakea transecting tarafından dikkatle akciğer çıkarın. Akciğere bağlı kalp tutun. </li><li> Akciğer doku analizi ile devam etmek nasıl bağlı bölümlerde 2 veya 3&#39;te protokolleri ile devam edin. Her iki analiz yapmak istiyorsanız, bir akciğer lobunun kaldırmak ve 3 altında açıklandığı gibi devam edin. 2 altında tarif edildiği gibi kalp bağlı kalan loblar işlemden geçirin. </li></ol> 2. Tüm Akciğer lobları içinde lacZ etiketli Metastatik Tümör Hücrelerinin Görselleştirme <ol><li> Sıkı bir kapatma kapağının ile plastik bir kap içinde akciğer yerleştirin ve 30-60 dakika için oda sıcaklığında PBS içinde% 2 formaldehit ile sabitleyin. </li><li> Fiksasyon çözüm çıkarın ve PBS ile iyice 3 kez yıkayın. </li><li> Taze 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid (X-Gal) boyama çözeltisi (X-Gal stok çözeltisi [40 mg / ml &#39;de hazırlanmış en az 10 mLDimetilformamid] 01:40 Temel Boyama Çözüm seyreltilerek, pH 7.1 (Tablo 1); ışıktan korumak). </li><li> Çözelti içinde tamamen tutmak ve hava değişimini sağlamak için kap üzerinde sadece gevşek kapak yerleştirmek için yüzme akciğer üstünde bir gazlı bezi koyun. </li><li> Işıktan korunmuş 3-5 saat süreyle 37 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> X-Gal çözüm çıkarın, rezidüel X-Gal çözümü (isteğe bağlı) çıkarın ve% 4 PFA eklemek için bir kez PBS ile yıkayın. </li></ol> 3. Akciğer Cryosections yılında lacZ etiketli Metastatik Tümör Hücrelerinin Görselleştirme <ol><li> Seyreltilmemiş PolyFreeze gömme orta 1/3 önceden doldur etiketli gömme kalıp. Üst lobun koyun ve lob tamamen kaplıdır kadar orta gömme ile doldurmak. Kabarcıkları önlemek için deneyin. </li><li> 20 dk için 4 ° C sıcaklıkta gömülü akciğer inkübe edin. </li><li> Daha sonra -80 ° C de yavaş yavaş kuru buz ve izopentan ve depo karışımı içinde gömülü akciğer donma </li><li> 7-10 mikron kriyo CutKriyostaz bölümleri ve SuperFrostPlus mikroskop slaytlar takar. </li><li> Nemlendirilmiş bir oda içinde 24 saat için 37 ° C de X-Gal boyama solüsyonu ile hemen bölümleri inkübe edin. </li><li> Distile su içinde kısa bir süre sonra 5 dk PBS 2 kez slaytları durulayın. </li><li> , 10-30 sn nükleer hızlı kırmızı ile Counter-leke distile su ile durulayın ve İmmünoreaktif-Dağı ile slaytlar monte. </li></ol> 4. Temsilcisi Sonuçlar Asai ark. Yüksek metastatik LM8 alt hücre hattı elde edilenler farklı ebeveyn Dunn hücrelerinden türetildiği sc primer tümörleri, kendiliğinden saptanabilir akciğer metastazları kurmazlar ki Dunn-türetilmiş LM8 OS fare modeli üzerinde özgün makale bildirilmiştir singenik C3H farelerin 14. Burada bildirilen teknikleri ile, Dunn/LM8 fare OS modellerinde metastaz oluşumu yeniden incelenmiştir. Biz istikrarlı lacZ-transduced Dunn ve LM8 hücre yararlandıs ve farelerde in-situ akciğer perfüzyon ve fiksasyon için bir protokol. Deri altından enjekte edilmiş farelerin perfüze ve non-perfüze akciğer Örnek görüntüleri lacZ-transdük ve kontrol Dunn ve LM8 hücre Şekil 1 &#39;de gösterilmiştir olmayan transdük. Kontrolü Dunn hücreleri enjekte farelerde, makroskopik ve mikroskopik metastaz olmayan perfüze ve perfüze akciğer (Şekil 1A, i-iv) algılanamayan kalmıştır. Ancak ilginç bir şekilde, Dunn-lacZ hücreleri ile enjekte edilen farelerde, X-gal boyaması olmayan akciğer perfüze (Şekil 1A, vi) yüzeyi üzerinde tek bir hücre ya da hücre kümeleri küçük (&lt;0.1 mm) mavi mikrometastazların odak görüldü. Içinde, Akciğerlerin situ perfüzyon ve fiksasyon daha Dunn-lacZ mikrometastaz (Şekil 1A, viii) ve görülebilirliği artırıldı. Ancak, makroskopik odakları için akıbet (Şekil 1A, v, vii) gözlenmemiştir. &lt;/ P&gt; Saydam kumanda LM8 hücreleri, zor tespit macrometastatic odakları ile enjekte farelerde çapı 0.1 mm&#39;den büyük olmayan perfüze akciğer (Şekil 1B, i) kabul edildi. Akciğer Perfüzyon (Şekil 1B, iii) odaklarının tespiti düzelmedi. Bununla birlikte, farelerde çoklu LM8-lacZ hücreleri ile enjekte X-Gal mavi lekeli makro-(Şekil 1B, D) ve mikrometastazların (Şekil 1B, vi) non-perfüze organ yüzeyine tespit edilmiştir. Ayrıca, akciğer perfüzyon daha tanımlanabilirliğini makro ve mikro metastaz (- viii Şekil 1B, vii) düzeldi. Sonuç olarak, mikro-macrometastases ve esas olarak, organ yüzeyin altında odaklar görünür hale geldiği perfüze doku geçirgenliği için, daha yüksek yoğunluk ve daha büyük bir sayıda görünür hale gelmiştir. İlave bir saatAkciğer dokusunda cryosections kullanarak istological analizi lacZ-transduced Dunn ve LM8 hücreler enjekte edilmiş farelere akciğer metastazı gelişmiş tanımlanabilirliğini doğruladı. Dunn-lacZ veya LM8-lacZ hücrelerinden türetildiği primer tümörlü farelerde, ilgili kontrol hücreleri, mikrometastaz hatta tek hücre odakları primer tümörleri olan farelerin aksine akciğer bölümler (Şekil 2) kabul edildi. Ayrıca, macrometastases da kontrol LM8 hücreleri (Şekil 2C ve D) ile enjekte edilen hayvanlarda daha LM8-lacZ hücreleri ile enjekte edilen farelerde daha açık bir şekilde görünür olmuştur. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/4162/4162fig1.jpg" /> Şekil 1., Spontan metastazlarının tespiti olmayan, transdüksiyon, (i-iv) ve lacZ-transdüksiyon ile (V-VIII) Dunn (A) ve LM8 (B) non-perfüze (I, II, V, VI) ile perfüze hücreleri C3H farelerde (iii, iv, vii, viii) akciğerler. Temsili X-Gal-sta Metastazlariined bütün akciğerler (v, A ve B vii) ve ilgili yakın çekimler (vi, viii A ve B) mavi görünür. Etiketli olmayan LM8 hücreleri (B i-iv) ile enjekte edilen farelerin organlarında Macrometastatic odak (&gt; 0,1 mm) yıldız işareti ile gösterilir. Yakın çekimler gösterildiği Alanları genelinde akciğerler için temsilidir. Ölçek çubukları tüm akciğer görüntüleri 1 mm ve yakın-up 0,1 mm göstermektedir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/4162/4162fig1large.jpg" target="_blank">büyük bir rakam görmek için buraya tıklayın</a> . <img alt="Şekil 2," src="/files/ftp_upload/4162/4162fig2.jpg" /> Şekil 2. Dunn ve akciğer cryosections içinde LM8 mikrometastaz saptanması. Ekim gömülü akciğer doku kesitlerinde nemlendirilmiş bir oda içinde 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de X-gal boyaması çözelti içinde inkübe edildi ve daha sonra nükleer hızlı kırmızı ile zıt edildi. Oklar Dunn-lacZ (B) veya LM8-lacZ hücreleri (D) ile enjekte farelerin akciğer bölümlerinde tanınan mikrometastatik odakları işaret. Micrometastases olmayan transdük Dunn (A) ya da LM8 hücreleri (C) ile enjekte edilen farelerde akciğer bölümlerinde saptanamaz kalmıştır. Ölçek çubukları 0.1 mm göstermektedir.

<ol><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mouse+cancer+models%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Maximizing mouse cancer models.</a> Nature. 7, 645-658 (2007).</li>
<li>Coussens, L. M., Fingleton, B., Matrisian, L. M. Matrix metalloproteinase inhibitors and cancer: trials and tribulations. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoussens%2C+LM+%22Science+%28New+York%2C+N.Y.%29%22">Science (New York, N.Y.)</a>. 295, 2387-2392 (2002).</li>
<li>Fass, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+and+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Imaging and cancer: a review.</a> Mol Oncol. 2, 115-152 (2008).</li>
<li>Puaux, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+imaging+techniques+to+monitor+tumor+growth+and+cancer+progression+in+living+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">A comparison of imaging techniques to monitor tumor growth and cancer progression in living animals.</a> Int. J. Mol. Imaging. 2011, 321538(2011).</li>
<li>Malek, A., Catapano, C. V., Czubayko, F., Aigner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+polymerase+chain+reaction-based+method+for+detection+and+quantification+of+metastasis+in+human+xenograft+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">A sensitive polymerase chain reaction-based method for detection and quantification of metastasis in human xenograft mouse models.</a> Clinical & experimental metastasis. 27, 261-271 (2010).</li>
<li>Schmidt, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+spontaneous+metastasis+in+an+aggressive+breast+carcinoma+model+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+%26+experimental+metastasis%22%5BJournal%5D)">Characterization of spontaneous metastasis in an aggressive breast carcinoma model using flow cytometry.</a> Clinical & experimental metastasis. 17, 537-544 (1999).</li>
<li>Horwitz, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrates+for+Cytochemical+Demonstration+of+Enzyme+Activity.+I.+Some+Substituted+3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">Substrates for Cytochemical Demonstration of Enzyme Activity. I. Some Substituted 3-Indolyl-Beta-D-Glycopyranosides.</a> J. Med. Chem. 7, 574-575 (1964).</li>
<li>Kruger, A., Schirrmacher, V., Khokha, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+lacZ+gene%3A+an+important+tool+for+metastasis+research+and+evaluation+of+new+cancer+therapies%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+metastasis+reviews%22%5BJournal%5D)">The bacterial lacZ gene: an important tool for metastasis research and evaluation of new cancer therapies.</a> Cancer metastasis reviews. 17, 285-294 (1998).</li>
<li>Arlt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+gelatinase-specificity+of+matrix+metalloproteinase+inhibitors+correlates+with+antimetastatic+efficacy+in+a+T-cell+lymphoma+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Increase in gelatinase-specificity of matrix metalloproteinase inhibitors correlates with antimetastatic efficacy in a T-cell lymphoma model.</a> Cancer research. 62, 5543-5550 (2002).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+inhibition+of+intra-peritoneal+tumor+growth+and+dissemination+of+human+ovarian+carcinoma+cells+in+nude+mice+by+anti-L1-cell+adhesion+molecule+monoclonal+antibody+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Efficient inhibition of intra-peritoneal tumor growth and dissemination of human ovarian carcinoma cells in nude mice by anti-L1-cell adhesion molecule monoclonal antibody treatment.</a> Cancer research. 66, 936-943 (2006).</li>
<li>Banke, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+inhibition+of+experimental+metastasis+and+prolongation+of+survival+in+mice+by+a+potent+factor+Xa-specific+synthetic+serine+protease+inhibitor+with+weak+anticoagulant+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Thrombosis+and+haemostasis%22%5BJournal%5D)">Effective inhibition of experimental metastasis and prolongation of survival in mice by a potent factor Xa-specific synthetic serine protease inhibitor with weak anticoagulant activity.</a> Thrombosis and haemostasis. 94, 1084-1093 (2005).</li>
<li>Borsig, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heparin+and+cancer+revisited%3A+mechanistic+connections+involving+platelets%2C+P-selectin%2C+carcinoma+mucins%2C+and+tumor+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Heparin and cancer revisited: mechanistic connections involving platelets, P-selectin, carcinoma mucins, and tumor metastasis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 3352-3357 (2001).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LacZ+transgene+expression+in+the+subcutaneous+Dunn%2FLM8+osteosarcoma+mouse+model+allows+for+the+identification+of+micrometastasis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Orthop.+Res%22%5BJournal%5D)">LacZ transgene expression in the subcutaneous Dunn/LM8 osteosarcoma mouse model allows for the identification of micrometastasis.</a> J. Orthop. Res. 29, 938-946 (2011).</li>
<li>Asai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+murine+osteosarcoma+cell+line+%28LM8%29+with+high+metastatic+potential+to+the+lung%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a murine osteosarcoma cell line (LM8) with high metastatic potential to the lung.</a> International journal of cancer. 76, 418-422 (1998).</li>
<li>Arlt, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+antineoplastic+antibiotic+taurolidine+promotes+lung+and+liver+metastasis+in+two+syngeneic+osteosarcoma+mouse+models+and+exhibits+severe+liver+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+cancer%22%5BJournal%5D)">The antineoplastic antibiotic taurolidine promotes lung and liver metastasis in two syngeneic osteosarcoma mouse models and exhibits severe liver toxicity.</a> International journal of cancer. , (2011).</li>
<li>Steinmann, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antimetastatic+activity+of+honokiol+in+osteosarcoma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Antimetastatic activity of honokiol in osteosarcoma.</a> Cancer. , (2011).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Dunn/LM8 fare modelinde OS burada sunulan sonuçlar, in-situ perfüzyon / akciğer dokusunda tespit lacZ ile etiketlenmiş tümör hücreleri X-gal boyaması birleştiren yeni kurulan yöntem gücünü göstermektedir. İki tekniğin bu kombinasyonu tek bir hücre düzeyinde mikrometastazların lezyonların yüksek duyarlılık tespit aşağı izin verir ve aynı zamanda akciğer yüzey (Şekil 1) hem de akciğer bölümler halinde (Şekil 2) üzerindeki macrometastases bir görüntüleme artırır. X-Gal boyama da çünkü doğal kan ve doku ile ilgili renk diğer organları, in-situ perfüzyon / fiksasyonu (mikro) metastaz tespiti sadece biraz akciğer dışındaki dokularda metastatik odaklar tanımlanabilirliğini geliştirir sağlarken Bu organların 13. Başka bir organ perfüzyon yönlendirilir bile, karaciğer, örneğin, kan kaldırılması sadece kısmen kontrast bahsi artıracakween X-Gal boyama ve organ doğal rengi. Bununla birlikte, yöntem lacZ-etiketli tümör hücrelerinin her türü için geçerli olduğu, önemli ölçüde hareketsiz tek hücreli mikrometastazların seviyesine akciğer metastazı tanımlanabilirliğini arttırmak aşağı ve makro ve mikrometastazların bir miktarı kolay ve güvenilir bir miktar sağlar olacaktır. Bu yöntem ve lusiferaz ve floresan proteinleri içeren muhabiri genleri, dayalı tüm diğer tekniklerin bir sınırlama transgen ifade istikrardır. Şekil 2B&#39;de gösterildiği gibi, macrometastatic odakları içindeki tüm tümör hücreleri beta-galaktosidaz aktivitesi eksikliği gösteren mavi lekeli. Bu nekroz ile ilgili olabilir, ama daha büyük olasılıkla transgen ekspresyonu kaybı nedeniyle. Biz Dunn ve LM8 hücreleri ifade için bile sürekli seçilim altında lacZ ve diğer transgenlerin down-regülasyonu çok etkili olduğu görülmektedir. Bu nedenle fare K12 için son yıllarda yapılan çalışmalarda açıkve K7M2 ve bütün in vitro hem de yukarı saat boyunca% 100 in vivo kararlı lacZ ekspresyonu yapılmaktadır HOS insan, 143b ve Saos-2 osteosarkoma hücre hattı. LacZ ifade kez kararlı garantilidir, bu tekniğin mekanistik doku kolonizasyonu 13 gibi metastatik lezyonlar 15 eradikasyonu hedefleyen yeni tedavilerin geliştirilmesi ve test sürecini araştırmak için örneğin gen-manipüle tümör hücreleri ile çalışmalarda uygulanabilir , 16. Ayrıca, metastatik lezyonların erken tanısında kullanılan PET, (mikro) BT ve MRG gibi güncel radyolojik görüntüleme teknikleri, iyileştirilmesi için bir kriter olarak hizmet verebilir. Farklı izleyiciler ile yeni PET çalışmasında (yayımlanmamış) biz in vivo tespit akciğer açıklanan protokol ile sonradan ex vivo metastazları doğrulanmadı. Yeni bir küçük hayvan mikro-BT ile devam eden bir çalışmada (SkyScan) biz bugüne kadar ab vardırle 0,5 mm ve ex vivo aşağı 0,3 mm bir boyuta in vivo akciğer metastazları aşağı algılamak için, ama biz 0.1 mm çözünürlükte hedefliyoruz. İlginçtir, bu biz in-situ perfüzyon ve X-Gal boyama kombine yöntemi ile mikrometastaz makro-ayırt etmek ayarladığınız boyut sınırıdır. Bu da yine bu kolay ve maliyet-etkili bir tekniğin duyarlılık ve kullanışlılığı altını çiziyor.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Narketan10 (ketamin) </td><td> Vetoquinol AG </td><td></td><td> 100 mg / ml solüsyon </td></tr><tr><td> Xylazin (xylazine) </td><td> Streuli Pharma AG </td><td></td><td> 20 mg / ml çözelti </td></tr><tr><td> Prequilan (Acepromazine) </td><td> Fatro SpA </td><td></td><td> 10 mg / ml çözelti </td></tr><tr><td> Bulldog Tipi vasküler klemp Serrefine </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 18051-35 </td><td> kavisli, 35 mm </td></tr><tr><td> Kapaklı plastik bardak </td><td> Semadeni </td><td> 2988 </td><td> Kapaklı 25 ml bardak </td></tr><tr><td> 5-Bromo-4-kloro-3-indolil-β-D-galaktozid (X-Gal); toz </td><td> Axxora </td><td> ALX-582-002-G005 </td><td> depo, N-Di-methylformamide 40 mg / ml &#39;ye, N-korumalı çözülür ışık -20 ° C&#39; de </td></tr><tr><td> Maksimum ışık-korumalı 4 ° C&#39;de saklanır pH 7.1 &#39;e kadar dengelenmiş temel boyama çözeltisi,,. 1 ay </td><td> kendi kendini yetiştirmiş </td><td></td><td> 100 ml / L 10xPBS, 1.64 g / L K3Fe (CN) 6, 2.1 g / L K4Fe (CN) 6, 2 mL / L 1 M MgCl2, 2 ml / L, 10% NP40, 1 ml / L, 10% sodyum-deoksikolatın </td></tr><tr><td> PolyFreeze Katıştırma Orta </td><td> Polysciences; swiss distribütörü: Brunschwig </td><td> 19636-1 </td><td></td></tr><tr><td> Kalıp Katıştırma </td><td> Polysciences </td><td> 18646A-1 </td><td></td></tr><tr><td> Leica CM1850 kriyostat </td><td> Leica Microsystems </td><td></td><td></td></tr><tr><td> SuperFrost slaytlar </td><td> Menzel </td><td> J1800AMNZ </td><td></td></tr><tr><td> Nükleer-Hızlı Kırmızı - Alüminyum sülfat çözeltisi </td><td> Lig Chroma Waldeck GmbH &amp; Co KG distributor: Medite </td><td> 84-0241-00 </td><td></td></tr><tr><td> İmmünoreaktif Montaj </td><td> Thermo Electron, swiss distribütörü: Histocom </td><td> 9990412 </td><td></td></tr></tbody></table> Tablo 1. Reaktifler ve Ekipmanları.

kombine tarafından farelerde tek hücre çözünürlükte akciğer metastaz geliştirilmiş görselleştirme<em&gt; in-situ</emakciğer doku ve x-gal boyanma&gt; perfüzyon<em&gt; lacz</em&gt;-tagged tümör hücreleri

Improved Visualization of Lung Metastases at Single Cell Resolution in Mice by Combined In-situ Perfusion of Lung Tissue and X-Gal Staining of lacZ-Tagged Tumor Cells

Metastaz kanser türlerinin çoğunda başlıca ölüm nedeni ve kanser araştırma, dolayısıyla bir ana odak noktasıdır. Ancak, radyolojik görüntüleme ve tedavi eradikasyon başarısı ile mikrometastaz tespit sınırlı kalır. Hayvan modellerinde kanser araştırma 1 için çok değerli araçlar olduğu kanıtlanmış olsa da, izleme / mikrometastazlar görselleştirme preklinik çalışmalarda bir meydan okuma ve metastatik yayılım eksik değerlendirilmesi potansiyel klinik çalışmalarda 2 hayal kırıklığı yaratan sonuçlar yol açar kalır. Sonuç olarak, nihayet normal dokuda tek hücre düzeyinde metastaz tekrarlanabilir ve güvenilir algılama sağlamak için metodlarla rafine büyük ilgi var. Ana odak nedenle mikro-bilgisayarlı tomografi (mikro-BT), pozitron emisyon tomografisi (PET), biyolüminesans veya floresan görüntüleme gibi in vivo tümör hücrelerinin algılanmasına izin teknikleri üzerinde &lt;&gt; 3,4 sup. Biz şu anda farklı osteosarkom modelleri primer tümör büyümesi ve metastaz vivo izlenmesi için bu teknikleri optimize edilmiştir. Bu tekniklerin bazıları qPCR 5, 6 ya da FACS histolojik boyama farklı türleri gibi klasik yöntemlerin yanında metastaz ex vivo analiz için de kullanılabilir. Bir kriter olarak, kararlı transfeksiyon veya lacZ geni ile tümör hücrelerinin transdüksiyonu bakteriyel bir enzim kromojenik substrat 5-bromo-4-kloro-3-indolil-beta-D metabolize β-galaktosidaz kodlayan bu çalışmada kurduk çözülmeyen bir indigo mavisi 7 ve burada gösterildiği gibi tek hücre düzeyinde fare doku ex vivo olarak tümör hücrelerinin son derece hassas ve seçici histokimyasal mavisi boyama aşağı izin verir-galactopyranoside (X-Gal). Bu çalışmalarda metastaz 8 hassas doğrulama bir yeni değerlendirmede olanak sağlayan düşük maliyetli ve ekipman yoğun değil araçtırticancer tedaviler 9-11. X-gal boyası bir sınırlayıcı faktör de vaskülarize dokuların kan ile ilgili kırmızı boyama, örneğin düşük kontrast olduğunu. Akciğer dokusunda bu sorunu yerinde akciğer perfüzyon, son zamanlarda Borsig ark. 12. Kan bunları temizlemek için ve altında in-situ bunları düzeltmek ve gömmek için anestezi altında farelerin akciğerlerinde perfüze tarafından kurulmuş bir teknik ile çözülebilir trakea yoluyla enflasyon. Bu yöntem aynı zamanda akciğer çökmesi önler ve böylece histolojik analiz için doku kalitesini geliştirmektedir fonksiyonel akciğer alveol, morfolojisini muhafaza eder. Bu çalışmada, biz lacZ eksprese tümör hücrelerinin X-gal boyası bir arada yararlanır ve in-situ perfüzyon ve akciğer doku fiksasyonu., Yeni bir protokol, tarif Bu rafine protokol akciğerde tek metastatik hücrelerinin yüksek hassasiyet algılama sağlar ve d yeni bir çalışmada bize etkinBaşlangıçta 14 sigara metastatik olduğu açıklanan bir fare modeli 13 yılında &quot;atıl&quot; akciğer mikrometastazlar etect.

Bu çalışmada bildirilen yeni protokol kombine farelerde tek hücreli çözünürlükte metastaz seçici algılama sağlar<em&gt; In-situ</em&gt; Akciğer perfüzyon ve fiksasyon ve X-Gal boyama<em&gt; LacZ</emTümör hücreleri&gt; etiketli.

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme<em&gt; In-situ</emAkciğer Doku ve X-Gal Boyanma&gt; Perfüzyon<em&gt; LacZ</em&gt;-Tagged Tümör Hücreleri

Metastaz, kanser türlerinin çoğunda ölümlerin temel nedenidir ve dolayısıyla kanser araştırmalarının ana odak noktasıdır. Ancak, ...'nın tespiti

Bu prosedürün genel amacı, şişirilmiş akciğer mimarisini korurken fare akciğerindeki mikro metastazların ex vivo tespitini iyileştirmektir. Bu, öncelikle dokudaki temel renk arka planı kaynağı olan kanı uzaklaştırmak için akciğerin in situ olarak PBS ile perfüze edilmesiyle gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, PFA enjeksiyonu ile akciğerin şişirilmesi ve ardından akciğer dokusunu şişmiş halde sabitlemek için uç kısmın sıkıştırılmasıdır.Ardından, akciğer çıkarılır ve PFA ile daha fazla fikse edilir veya tekil akciğer lobları kriyoseksiyon için gömülür. Son adımlar, dokuların Xal solüsyonunda boyanması ve LA zag tümör hücrelerinin görselleştirilmesidir; sonuç olarak, tüm akciğer loblarında veya akciğer doku kesitlerindeki metastazlar, binoküler mikroskop veya ışık mikroskobu ile tek hücre seviyesine kadar tespit edilebilir. Bu tekniğin, kendi başına ayakta duran gökyüzü gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, kanla ilişkili arka planın giderilmesi sayesinde mikro metastazların tespit edilebilirliğinin önemli ölçüde artmış olmasıdır.Protokole, bir fareye yaklaşık 150 µL PBS içinde ketamin, ksilazin ve asepromazin içeren intraperitonal bir enjeksiyon yaparak anestezi uygulayarak başlayın. Farede ağrı refleksleri gözlemlenmediğinde, fareyi ameliyat masasına sabitleyin. Sırt bölgesini aşağı doğru tarayın ve tüyleri %70 etanol ile düzeltin.Karnın alt kısmından boyuna kadar deriyi açın. Deriyi yanlara doğru çekin veya tamamen çıkarın. Vena jugularis gibi büyük damarların yırtılmasını önlemek için torakstaki peritonyumu dikkatlice açın.Bu, perfüzyonun verimliliğini artıracaktır. Şimdi, 21 ila 24 gauge iğneye sahip 20 mililitrelik bir şırınga kullanarak karaciğerin altındaki vena cava cardis'i kesin. Akciğer tamamen beyazlaşana ve kalp atışları durana kadar atan kalbin sağ ventrikülüne yavaşça 10 ila 15 mililitre PBS enjekte edin.Ardından, karaciğerin üzerindeki kan damarlarını ve diyaframı vasküler bir klemple sıkıştırın. 10 mililitrelik bir şırıngayı %3 paraformaldehit ile doldurun ve 21 ila 24 gauge bir iğne ile sağ ventriküle enjekte edin. Yaklaşık iki mililitre.Toraksın dışındaki trakeayı açığa çıkarın ve toraks dışından trakeaya yaklaşık üç mililitre aldehit enjekte ederek akciğeri şişirin. Ardından, iğneyi çıkardıktan hemen sonra trakeayı ponksiyon bölgesinden vasküler bir klemple sıkıştırın ve fiksasyonun gerçekleşmesi için 10 dakika bekleyin. Son olarak, vasküler klempin üstündeki kan damarlarını kesin.Ardından klempi çıkarın ve fazla formaldehiti uzaklaştırmak için sağ ventriküle yaklaşık iki mililitre PBS enjekte edin. Tüm akciğer loblarının alt kısımlarını bir iğne ile delin ve trakeadaki vasküler klempi kaldırın. Şimdi, diğer enjeksiyona paralel olarak trakeaya üç ila beş mililitre seyreltilmiş gömme solüsyonu enjekte edin.Paraformal ehid akciğer loblarında solüsyonla yer değiştirdiğinde enjeksiyonu durdurun. Kalbi bir pensle çekerek ve bağ dokusu ligamentlerini, kan damarlarını ve trakeayı keserek akciğeri dikkatlice çıkarın. Kalbin akciğerlere bağlı kaldığından emin olun.Bir lobu kriyoseksiyonlar için ayırın ve geri kalan akciğer dokusunu tüm akciğer boyaması için kullanın. Akciğeri sıkı kapanan kapaklı plastik bir kaba yerleştirin ve %2 formaldehyde ve PBS ile fikse edin. Akciğeri solüsyonun içinde tutmak için üzerine bir parça gazlı bez koyun ve oda sıcaklığında 30 dakika bekletin.Yarım saat sonra fiksasyon solüsyonunu uzaklaştırın ve dokuyu PBS ile 3 kez iyice yıkayın; bir mililitre Xal stok solüsyonunu temel boyama solüsyonu ile 1:40 oranında seyrelterek kullanıma hazır Xal solüsyonunu taze olarak hazırlayın ve kaptaki örneğe bundan en az 10 mL ekleyin. Akciğeri bir gazlı bez parçasıyla daldırın. Hava değişimine izin vermek için kapağı gevşekçe kapatın ve ışıktan koruyarak 37 °C'de üç ila beş saat inkübe edin.İnkübasyonun ardından xal çözeltisini uzaklaştırın. Kalan xal çözeltisini temizlemek için akciğerleri bir kez PBS ile yıkayın ve PBS içinde %4 paraformaldehitten en az 10 mililitre ekleyin. Doku artık histoloji için hazırdır ve dört santigrat derecede %4 PFA içerisinde uzun süre saklanabilir.Bir gömme kalıbının üçte birini seyreltilmemiş poly forze gömme ortamı ile doldurarak başlayın. Ardından akciğer lobunu kalıba yerleştirin ve lob tamamen kapanana kadar ortam eklemeye devam edin. Hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edin, ardından gömülmüş lobu 4 °C'de 20 dakika boyunca inkübe edin.Ardından, gömülmüş akciğerleri kuru buz ve izopentan karışımında yavaşça dondurarak kesime hazırlayın. Gerekirse, örnekler saklanmak üzere -80 °C dondurucuya aktarılabilir; bir kriyostat kullanarak lobdan 7 ila 10 µm kalınlığında kriyokesitler kesin ve kesitleri ticari olarak temin edilebilen kriyokesit hazır lamlarına monte edin. Montaj işleminin ardından, kesitleri nemlendirilmiş bir bölmede 37 °C'de 24 saat boyunca XAL boyama çözeltisinde inkübe edin. Ertesi gün, lamları PBS ile her seferinde beş dakika olacak şekilde iki kez durulayın.Bunu, distile su ile kısa bir durulama ile takip edin. Şimdi, xal'i daha baskın hale getiren hafif bir karşıt boyama elde etmek için lamları 10 saniye boyunca nükleer hızlı kırmızı (nuclear fast red) ile karşıt boyayın ve karşıt boyayı hemen distile su ile durulayın. Daha koyu bir karşıt boyama için süreyi 30 saniyeye veya daha fazlasına çıkarın.Slaytları immüno mount ile kapatın. Done LM eight fare OS modellerinde metastaz oluşumu yeniden incelendi. Burada açıklanan, aynı anda laxy transduce edilmiş ve transduce edilmemiş kontrol done ve LM eight hücrelerinin enjekte edildiği farelerin perfüze ve perfüze edilmemiş akciğerlerinin temsilci görüntüleri ile kontrol done hücreleri enjekte edilen farelerin görüntüleri kullanılmıştır.Perfüze edilmemiş ve perfüze edilmiş akciğerlerde makroskobik ve mikroskobik metastazlar saptanamadı. Ancak ilginç bir şekilde, dun LA Z hücreleri enjekte edilen farelerde, xgl boyaması perfüze edilmemiş akciğerlerin yüzeyinde tek hücrelerden veya küçük hücre kümelerinden oluşan mavi mikrometastatik odakları ortaya çıkardı; akciğerlerin in situ perfüzyonu ve fiksasyonu, dun la z mikrometastazlarının tespit edilebilirliğini daha da artırdı, ancak kontrol LM sekiz hücreleri enjekte edilen farelerde makroskobik odaklara doğru bir büyüme gözlenmedi. Perfüze edilmemiş akciğerlerde, çapı 0,1 milimetreden büyük, yarı saydam ve zar zor tespit edilebilen makrometastatik odaklar belirlendi. Akciğerin perfüzyonu, odakların tespitini iyileştirmedi.Buna karşın, LAC Z hücreleri enjekte edilen farelerde, perfüzyon uygulanmamış organların yüzeyinde X gal ile maviye boyanmış çok sayıda makro metastaz tespit edilmiştir. Perfüzyon uygulanmamış organların yüzeyinde mikro metastazlar da saptanmıştır. Ayrıca, akciğerlerin perfüzyonu, makro ve mikro metastazların tespit edilebilirliğini daha da artırmıştır.Sonuç olarak, temel olarak perfüze dokunun şeffaflığı sayesinde mikro ve makro metastazlar daha yüksek bir yoğunlukta ve daha fazla sayıda görünür hale gelmiş, böylece organ yüzeyinin altındaki odakların görünürlüğü de artmıştır. Akciğer dokusunun kriyoseksiyonları kullanılarak yapılan ek bir histolojik analiz, LAX Z transduksiyonlu don ve LM sekiz hücreleri enjekte edilen farelerde ve Dun LAX Z hücrelerinden türetilen primer tümörleri olan farelerde akciğer metastazlarının tespit edilebilirliğinin arttığını doğrulamıştır. Akciğer kesitlerinde mikro metastazlar, hatta tek hücreli odaklar tespit edilmiştir.Bu durum, ilgili kontrol hücrelerinin primer tümörlerine sahip farelerde gözlemlenmemiştir. Dahası, makro metastazlar, LM eight LA C hücreleri enjekte edilen farelerde, kontrol LM eight hücrelerine sahip hayvanlara kıyasla daha belirgin şekilde görülmüştür. Bu videoyu izledikten sonra, ZI iki'de akciğer perfüzyonu ve fiksasyonunun nasıl gerçekleştirileceği ve ardından çıkarılan akciğerlerdeki metastazların exci boyamasının nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu teknik, her türlü kanser çalışmasında akciğerdeki metastaz dağılımı için oldukça hassas bir son nokta ölçümüdür ve ayrıca metastatik lezyonların erken teşhisinde kullanılan mikro BT, PET ve MRI gibi mevcut in vivo görüntüleme tekniklerinin geliştirilmesi için bir referans noktası olarak hizmet edebilir.

improved-visualization-lung-metastases-at-single-cell-resolution-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu anti-kanser tedavisi için, görüntüleme yanıt için bir yöntem...

Meme Kanseri Fare Modelleri Tümör Mikroçevre İlaç Yanıtlarının Görüntüleme Canlı

Farelerde floresan haberci kullanılarak, akciğer metastazı olan tümör hücre stromanın etkileşimleri ex vivo canlı görüntüleme için nispeten basit bir yöntem tarif eder. iplik disk konfokal mikroskopi kullanılarak, bu teknik, en az 4 saat boyunca canlı hücre görüntülenmesini sağlayarak ve diğer enflamatuar akciğer koşulları incelemek için adapte edilebilir.

Ex Akciğer Metastaz ve Bunların mikroçevresinin Canlı Görüntüleme vivo

Bu protokol, tek bir hücre çözünürlükte in vivo olarak, gerçek zamanlı olarak çok-etkileşimlerin uzatılmış zaman atlamalı görüntüleme gerçekleştirmek için multiphoton mikroskobu kullanımını tarif eder.

Tümör mikroçevresinde Gerçek zamanlı Multisellüler Dynamics Genişletilmiş Time-lapse intravital Görüntüleme

Bu protokol, vakumla stabilize edilmiş bir görüntüleme penceresi kullanarak sağlam akciğerin gerçek zamanlı olarak uzun süreli yüksek çözünürlüklü, tek hücreli görüntülemesini gerçekleştirmek için çoklu foton mikroskobunun kullanımını açıklar.

Bir Vakum Stabilize Görüntüleme Penceresi ile Akciğer uzun vadeli Yüksek Çözünürlüklü Intravital Mikroskopi

Bir hayvan modeli tümör hücreleri (CTCs) kanseri metastaz sırasında akciğer kolonizasyon teşvik dolaşan rolü deşifre için gereklidir. Burada kurduk ve başarıyla gerçekleştirilen bir vivo içinde tahlil özel olarak test etmek için gereksinimin akciğer kolonizasyon için CTCs polimer fibronektin (polyFN) Meclisi.

Tümör hücre görselleştirme akciğer dokusu içinde dolaşan bir akciğer kolonizasyon tahlil kurulması

Açıklanan yaklaşım, akciğerlerdeki metastaz sayısı ve boyutunun ölçülmesine ek olarak meme kanseri metastazı oluşumunun ve büyümesinin gerçek zamanlı olarak izlenmesine olanak sağlamak için deneysel kuyruk ven metastazı tahlillerini in vivo canlı hayvan görüntülemeile birleştirir.

Kuyruk Ven Metastaz Tahlilleri ve Gerçek Zamanlı Vivo Görüntüleme Kombine Kullanımı Meme Kanseri Metastatik Kolonizasyon ve Yük Akciğerlerde Quantify için

Kanser hücrelerinin intravenöz enjeksiyonu genellikle metastaz araştırmalarında kullanılır, ancak metastatik tümör yükünü analiz etmek zor olabilir. Burada, metastazın kuyruk damarı enjeksiyon modelini gösteriyoruz ve ortaya çıkan metastatik akciğer tümörü yükünü analiz etmek için yeni bir yaklaşım içeriyoruz.

Tümör Hücrelerinin Lateral Kuyruk-Damar Enjeksiyonu Sonrasında Akciğer Metastazının Patolojik Analizi

Endojen olarak HER2 ile amplifiye edilmiş inflamatuar meme kanseri hücre hattının kuyruk damarı enjeksiyonu yoluyla üretilen meme kanseri beyin metastazının bir ksenogreft fare modelini tanımladık.

İnflamatuar Meme Kanseri Hücrelerinin Kuyruk-Ven Enjeksiyonu ile Beyin Metastazının Modellenmesi

Burada, akciğerin yüksek çözünürlüklü, intravital görüntülemesini sağlayan murine toraks için kalıcı olarak indwelling optik pencerenin cerrahi implantasyonu için bir protokol sunuyoruz. Pencerenin kalıcılığı, akciğerdeki dinamik hücresel süreçlerin, özellikle de yayılan tümör hücrelerinin metastatik ilerlemesi gibi yavaş gelişen süreçlerin incelenmesine çok uygun hale getirir.

Akciğere Kanser Metastazını Araştırmak İçin Kalıcı Bir Pencere

El yazması, ortotopik olarak enjekte edilen meme tümörlerinden spontan akciğer metastazının kurulması ve uzunlamasına büyüme izlemesi için metastatik kaskadının tüm aşamalarında müdahaleye uygun bir metodolojiyi açıklamaktadır.

In vivo (İn canlı) Ortotopik Olarak Enjekte Edilen Meme Tümörü Hücrelerinin Spontan Akciğer Metastazını Ölçmek için Görüntüleme

Akciğer kanseri için yeni tedaviler geliştirmenin en büyük zorluğu, bölgesel hastalık metastatik hastalığa ilerlerken tümör mikro çevresinin modellenmesini içerir. Burada, zaman içinde hastalığın in vivo olarak izlenmesine izin veren ortotopik bir sinjeneik akciğer kanseri modeli oluşturmanın basit bir yöntemini açıklıyoruz.

Akciğer Kanserinin Sinjeneik Ortotopik Fare Modelini Oluşturmak için Minimal İnvaziv Bir Yöntem

Keşfedin, farelerde tek hücre çözünürlüğünde akciğer metastazlarını in situ perfüzyon ve X-Gal boyama ile görselleştirme yöntemini. Bu protokol, kan kaynaklı arka planı ortadan kaldırarak mikrometastazların saptanabilirliğini önemli ölçüde artırır.

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme In-situ Perfüzyon LacZ-Tagged Tümör Hücreleri (Video) | JoVE Journal

Kombine tarafından Farelerde Tek Hücre çözünürlükte Akciğer Metastaz Geliştirilmiş Görselleştirme

Daha fazla video keşfet