Name: Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-04T12:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 30 s
Description: Öğrenin, hücre göçünü altın nanoparçacık kaplı kapak camları kullanarak nicel olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, hücre hareketini görselleştirmek ve çeşitli koşullarda hücre davranışını anlamak için güvenilir bir araç sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri (AI050677, HD-051998 ve GM103433), bir Malcolm Feist kardiyovasküler araştırma bursu ve bir Amerikan Kalp Derneği predoctoral bursu (10PRE4200007) hibe tarafından desteklenmiştir.

1. Jelatin-kaplanmış lameller hazırlanması <ol><li> Bir steril plastik 100 mm çanak (es) yerleştirin asitle yıkanmış cam lameller (çapı 15 mm). Tabak başına 8-9 lamelleri yerleştirin ve birbirlerine dokunmadan veya yemeğin tarafında değil emin olun .. </li></ol> Not: lameller, iğneler ve cımbız muhtemel kirletici mikroorganizmaların, hem de hareketliliği de dahil olmak üzere hücresel fonksiyonlar, endotoksinler etkiler ortadan kaldırmak için steril olması gerekmektedir. <ol start="2"><li> Jelatin toz tartılır ve 0.5 g/300 ml &#39;lik nihai bir konsantrasyon ile bir jelatin solüsyonu yapmak için deiyonize su içinde tekrar süspansiyon toz. Daha sonra, jelatin solüsyonu otoklava gerekmektedir. </li><li> Pipet 2-3 her bir lamel üzerine jelatin (~ 100-150 ml) damla. </li></ol> Not: Jelatin çanak dokunmak veya çanak lamelleri kaldırmak mümkün olmayacaktır izin vermemek için dikkatli olun. <ol start="4"&gt; <li> 10 dk için 90 ° C sıcaklıkta bir fırında 100 mm tabak jelatin kaplı lamelleri pişirilir. </li><li> Nazik pipetleme tarafından aşırı jelatin çıkarın. </li><li> 45 dk için 70 fırın içinde 100 mm tabak ° C lamelleri kurutun. </li><li> Kuruduktan sonra, steril, endotoksin ücretsiz iğne ve cımbız (iğne hafifçe kaldırmak için yavaşça cımbız için erişilebilir yapmak için lamel kadar dürtmek için kullanılan) kullanarak 100 mm çanak lamelleri çıkarın. </li><li> 24-iyi çanak ayrı kuyulara bireysel jelatin kaplı lamelleri yerleştirin. </li></ol> 2. Kolloidal Altın kaplı lameller hazırlanması <ol><li> Chloroauric asit (tetrakloro asit trihidrat; HAuCl 4 · 3H 2 O) uygun bir miktarı tartılır ve sonra bir nihai 14.5 mM solüsyonu (zehirli) maddesinin hazırlanması için steril deiyonize su içinde tekrar süspansiyon haline getirin. 8-9 lamelleri başına çözelti 1.5 ml hazırlayın. </li></ol> Uyarı: Chloroauric asit hkucak dolusu yutulduğunda, Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur ve alerjik cilt reaksiyonuna neden olabilir. Yutulması halinde toksiktir. <ol start="2"><li> Sodyum sitrat, uygun bir miktarda tartılır (trisodyum dihidrojen 2-hydroxypropane-1 ,2,3-tricarboxylate, Na 3 C 6 H 5 O 7) ve daha sonra son bir% 0.5 çözelti yapmak üzere deiyonize su içinde tekrar süspansiyon toz. 8-9 lamelleri başına 1 ml çözelti hazırlayın. </li></ol> Uyarı: Sodyum sitrat göz ve cilt tahrişine neden olabilir. Ayrıca solunum ve sindirim yollarında tahrişe neden olabilir. <ol start="3"><li> Steril, endotoksin ücretsiz beher içinde steril 14.5 mM HAuCl 4 solüsyon ve steril deiyonize su 13.5 ml 1.5 ml birleştirmek sonucu soluk sarı bir çözelti elde edilmelidir. Adı geçen hacimleri için 8-9 koloidal altın lamelleri için izin verir. </li><li> Sürekli karıştırarak ederken bu b başlayana kadar, bir sıcak plaka üzerinde çözüm ısıtmakyağ. </li></ol> Uyarı: buharları toksik / zararlı olabilir gibi çözüm ısıtma, davlumbaz yapılmalıdır. Buharlar mukoza ve üst solunum yolu dokusu için yıkıcı vardır. <ol start="5"><li> Sıcak plaka gelen beher çıkarın. </li><li> Karıştırma sırasında,% 0.5 sodyum sitrat solüsyonu 0,7 ml eklenir. Söz konusu hacim yapılacak 8-9 koloidal altın lamelleri için izin verir. </li><li> Yaklaşık 2 dakika için bu birleşik çözüm karıştırarak tutun (Not: çözüm rengi yavaş yavaş nihayet bir kırmızı şarap ulaşmadan önce, derin mor, mor, gri, açık veya, tercihen, pas rengi, soluk sarı değişecektir) . Bu ürün kolloidal altın çözümdür. </li><li> 1-2 dk (koloidal altın çözeltisi eklendiğinde, erime lamel jelatin tabaka tutmak için) için 10 ml lik bir pipet, koloidal altın çözelti soğutulur ve daha sonra colloida bir 1.0-2.0 mLbakınız - önceden bir 24-kuyu çanak (ler) (bu, jelatin kaplı lamelleri eklediği koloidal altın çözelti miktarı altın parçacıkları çözelti içinde çökeltilmiştir ne kadar iyi bağlıdır yerleştirilmiş her bir jelatin kaplı lamel üzerine l altın çözelti aşağıdaki yorum). </li></ol> Not: altın partikül Yağış verimliliğinde farklılıklar olabilir Çünkü, ilk jelatin kaplı lamelleri için koloidal altın çözeltisi 0.5-1 ml ekleyin ve sonra 0.5 saat boyunca inkübatörde 24-iyi çanak koymak için tavsiye edilir . Bu inkübasyon süresinden sonra, lamelleri lameller üzerine altın parçacıkları uygun yoğunluk için hafif mikroskop altında kontrol edilmelidir. Altın parçacıkları çok düşük ve çok yüksek bir konsantrasyon örnekleri 20x mikroskobu görüntüleri için Şekil 1&#39;e bakınız. Altın parçacıkları (en azından monositler ile kullanmak için) ideal bir konsantrasyon 40x mikroskopi görüntü elde etmek için Şekil 2&#39;ye bakınız. Optfarklı hücrelerin özellikleri lamelleri üzerine hareketin kendi gücünü dikte edecek gibi slayt üzerinde altın nanopartiküller olmuş bölgeler yoğunluğu deneysel, kullanılan her bir hücre tipi için tespit edilmelidir. Altın partiküllerinin konsantrasyonu yetersiz ise, jelatin kaplı lamelleri ile koloidal altın çözeltisi ilave 0.5-1 ml eklenir. Hücre boyutuna bağlı olarak, altın partiküllerinin uygun konsantrasyonu değişebilir ve bu, bunun bir sonucu olarak hareketlilik açısından incelenmiştir hücre boyutuna bağlı olacaktır. Örneğin, küçük ölçekli hücreleri (~ 10-20 mikron 28) insan monosit ile, altın parçacıkları daha yüksek bir konsantrasyon analizlerimiz gerek duyuldu. Nanoparçacıkların uygun dağılımını kolayca ve verimli bir hücresel parçaların kenarları ayırt edebilme becerisi ile araştırmacı sağlar. Çok yüksek altın parçacıkları bir konsantrasyon doğru bir şekilde ölçmek için dolayısıyla hareket etmek için ve hücrelerin yeteneğini engellemektedirhareketliliğini iken motilite doğru bir parça çizmek için çok düşük limitler olanları yeteneğidir altın parçacıkları bir konsantrasyon. Önemli Not: nanoparçacıkların sentez soruna neden olan, sentez nanoparçacıkların 5 nm ile 400 nm boyutlarda ticari olarak temin edilebilir. Buna ek olarak, floresan mikroküreler hücre hareketi 29 çalışmalarda aynı zamanda kullanılmıştır. Ancak, bu mikrosferler kullanımı hücre göçü ve analizi için bir floresan mikroskobu gerektirir. <ol start="9"><li> 37 küvözde kolloidal altın kaplı lamelleri ile 24 sıra tabak koyun 1 saat gecede ° C ve inkübe. </li><li> Inkübasyondan sonra, durulama / (PBS, pH 7.4) tamponlu salin steril fosfat içine lamelleri (3x) batırarak ilişkisiz altın kaldırın. </li><li> PBS içeren temiz 12-iyi çanak (es) bu kolloidal altın kaplı lamelleri yerleştirin. </li><li> 4 ° C &#39;ye kadar olan bu lamelleri depolamak için hazır(parafilm buzdolabında yerleştirmeden önce plaka) kullanın. </li></ol> Önemli Not: Her zaman altın parçacıkları lamelleri gelen soyulmaz kurumasına izin verirseniz olabildiğince sıvı / medya bazı tür kolloidal altın kaplı lamelleri tutmak. Kolloidal altın lamelleri yapıldığı tarihten itibaren 2-3 ay içinde kullanılmalıdır. Kalite Kontrol: tek bir parça phagokinetic motilite tahlil olarak, altın parçacıkları benzer bir konsantrasyon ile karakterize edilir lamelleri kullanmak için çok önemlidir. Bu basit nokta muamele ile değil, koloidal altın kaplı lamelleri fiziksel özelliklerinin doğası sadece bağlı olduğu örnekleri arasında hücre hareketliliği de kantitatif farklılıklar için izin verir. Bu nanoparçacıkların yoğunluk sürece eşit olduğunu göstermiştir olmakla beraber, ayrı deneyler, aynı anda yapılan tek lamelleri kullanarak lehine, lamelleri kullanımıFarklı hazırlıkları uygundur. 3. Hücresel Motilite Analiz <ol><li> İlgi hücreleri için uygun bir hücresel ortamda, koloidal altın kaplama lamelleri yerleştirin. </li><li> 24-iyi çanak (es) yerleştirilir kolloidal altın kaplı lamelleri üzerine uygun şekilde tedavi hücreleri aktarın </li></ol> Not: tek bir iyi transfer hücrelerin sayısı, her bir hücre tipinde çalışma için tespit edilmesi gerekmektedir. İdeal olarak, hücrelerin eşit sırayla tek bir hücre tarafından oluşturulan tek parça istatistiksel analiz için izin verecektir kolloidal altın kaplı lamel üzerinde dağıtılması gerekir. Hücrelerinde çok yüksek bir konsantrasyonda kaplama durumunda, birden fazla hücre çakışan rota görülecektir ki son derece olası hale gelir. Örtüşen parça doğru nicelendirildi edilemez ve dolayısıyla bunlar, test edilen hücre hareketi, sonuç olarak dikkate alınması mümkün değildir. Bir sonucu olarak parça Örtüşenbirden fazla hücre tutulum genellikle kolayca gözlenir; iki ya da daha fazla hücrenin aynı bitişik temizlenmiş bir alana görülebilir olan parça (analizi alanında) birleştirilmiş ya da çapraz olarak. <ol start="3"><li> 37 inkübe ° 24 hr C /% 5 CO 2 (veya herhangi uygun bir zaman, biz 6 saat ve 12 saattir tedavi sonrası 24 saat sonrası tedavi ve endotel hücreleri arasında monosit motilitesini analiz ettiler örneğin). Hücre tipi çalıştı ve böylece deneysel her bir hücre türü (- 12 saat sonrası tedavi iyi bir başlangıç ​​noktası, ancak, 6, olduğu) için tespit edilir ile hücre hareketliliği belirlenmesi ve ölçülmesi için optimum süre çerçevesi değişecektir. </li></ol> Not: Deneysel kolloidal altın kaplı lamelleri daha sonraki bir zamanda depolanan ve / veya analiz edilmesi gerekiyorsa, hücreleri ve altın nanopartiküller lamelleri üzerine sabit olması gerekir. Bu tespitin adımı gerçekleştirmek için; aşağıdaki Adım 3.3, ilk yıkamada 1x ile dikkatlice 2 kez lamelleriPBS (lamelleri altın nanopartiküller bir kaldırma kaçınılmalıdır gibi lamelleri daldırma, tercih edilir), daha sonra bu oda sıcaklığında 3% paraformaldehit ile inkübasyon gibi standart bir cep fiksasyon yöntemi kullanın. 15 dakikalık bir inkübasyondan sonra,% 3 paraformaldehid çıkarılmalı ve lamelleri 1 x PBS ile dikkatle 3 kez yıkandı. Lamelleri sabit bir buzdolabında saklanır. <ol start="4"><li> Bir ışık mikroskobu kullanarak, tek bir hareketli hücre (: Kesinlikle soruşturma altında hücre türüne bağlı olarak değişir hücresel parçalarının fotoğraflarını çekmek için kullanılan büyütme Not) tarafından oluşturulan parça görüntüleri yakalayabilir. Koloidal altın kaplanmış lameller üzerine olmayan hareketsiz ve hareketli hücreler tarafından oluşturulan hücre parçaları örnek olarak Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir. </li></ol> Not: phagokinetic parça motilite ölçüm içinde kullanılabilir boyutu nanoparçacıkların hücre 30 için tamamen toksik olduğu tespit edilmiştir. Gerekirse, Incelenen hücre canlılığı tripan mavisi ile boyanarak değerlendirildi veya hücresel canlılığı diğer belirteçleri için incelenebilir. Bir bu adımı taahhüt gerekiyorsa, dikkate sabitleme vb fiksasyonu, türü için ihtiyaç almak zorunda kalacak. <ol start="5"><li> Böyle ImageJ yazılımı (olarak serbestçe kullanılabilir yazılım kullanma <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/</a> ) veya NIH Image ( <a href="http://rsb.info.nih.gov/nih-image/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/nih-image/</a> geliştirilen), hem Ulusal Sağlık Enstitüleri, veya ImageTool ( <a href="http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html" target="_blank">http://ddsdx.uthscsa.edu/dig/itdesc.html</a> ) San Antonio, Texas Sağlık Bilimleri Merkezi tarafından temizlenmiş, kolloidal altın ortalama alanı (keyfi birimler olarak) Üniversitesi&#39;nde geliştirilen 10-20 veya daha fazla hücre (örnek başına) çekilen görüntülerin her deneysel kol için belirlenir. İstatistikler ardından t yapılabilirO sonuçlar toplanır. Örneğin, sonuçlar gelir olarak çizilebilir ± örnekler arasında istatistiksel anlamlılık ölçütü olarak kullanılan Student t yapılan testler ve bir P değeri &lt;0.05 olan (SEM) ve standart hataları. Şekil 3 ve 4 gösteri adımları hücre tarafından temizlenir koloidal altın alan analizi. </li></ol>

<ol><li>Armstrong, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+control+of+cell+motility+during+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Rev%22%5BJournal%5D)">The control of cell motility during embryogenesis.</a> Cancer Metastasis Rev. 4, 59-79 (1985).</li>
<li>Dustin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+traffic+to+tune+T+cell+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Stop and go traffic to tune T cell responses.</a> Immunity. 21, 305-314 (2004).</li>
<li>Mutsaers, S. E., Bishop, J. E., McGrouther, G., Laurent, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+tissue+repair%3A+from+wound+healing+to+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Biochem.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of tissue repair: from wound healing to fibrosis.</a> Int. J. Biochem. Cell Biol. 29, 5-17 (1997).</li>
<li>Etienne-Manneville, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polarity+proteins+in+migration+and+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Polarity proteins in migration and invasion.</a> Oncogene. 27, 6970-6980 (2008).</li>
<li>Parsons, J. T., Horwitz, A. R., Schwartz, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion%3A+integrating+cytoskeletal+dynamics+and+cellular+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion: integrating cytoskeletal dynamics and cellular tension.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 11, 633-643 (2010).</li>
<li>Mitchison, T. J., Cramer, L. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actin-based+cell+motility+and+cell+locomotion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Actin-based cell motility and cell locomotion.</a> Cell. 84, 371-379 (1996).</li>
<li>Pollard, T. D., Borisy, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+motility+driven+by+assembly+and+disassembly+of+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cellular motility driven by assembly and disassembly of actin filaments.</a> Cell. 112, 453-465 (2003).</li>
<li>Bretscher, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Getting+membrane+flow+and+the+cytoskeleton+to+cooperate+in+moving+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Getting membrane flow and the cytoskeleton to cooperate in moving cells.</a> Cell. 87, 601-606 (1996).</li>
<li>Albrecht-Buehler, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phagokinetic+tracks+of+3T3+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The phagokinetic tracks of 3T3 cells.</a> Cell. 11, 395-404 (1977).</li>
<li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Alexander, J. S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+cytomegalovirus+induces+monocyte+differentiation+and+migration+as+a+strategy+for+dissemination+and+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Human cytomegalovirus induces monocyte differentiation and migration as a strategy for dissemination and persistence.</a> J. Virol. 78, 4444-4453 (2004).</li>
<li>Palmisano, R., Itoh, Y. Matrix Metalloproteinase Protocols. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPalmisano%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. 622, Humana Press. 379-392 (2010).</li>
<li>Ohta, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HOXD3-Overexpression+Increases+Integrin+Alpha+V+Beta+3+Expression+and+Deprives+E-Cadherin+while+It+Enhances+Cell+Motility+in+A549+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+and+Experimental+Metastasis%22%5BJournal%5D)">HOXD3-Overexpression Increases Integrin Alpha V Beta 3 Expression and Deprives E-Cadherin while It Enhances Cell Motility in A549 Cells.</a> Clinical and Experimental Metastasis. 7-8, 381-390 (2006).</li>
<li>Kawa, S., Kimura, S., Hakomori, S., Igarashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+chemotactic+motility+and+trans-endothelial+migration+of+human+neutrophils+by+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Inhibition of chemotactic motility and trans-endothelial migration of human neutrophils by sphingosine 1-phosphate.</a> FEBS Lett. 420, 196-200 (1997).</li>
<li>Kawamura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-WASP+and+WAVE2+acting+downstream+of+phosphatidylinositol+3-kinase+are+required+for+myogenic+cell+migration+induced+by+hepatocyte+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">N-WASP and WAVE2 acting downstream of phosphatidylinositol 3-kinase are required for myogenic cell migration induced by hepatocyte growth factor.</a> J. Biol. Chem. 279, 54862-54871 (2004).</li>
<li>Ando, Y., Jensen, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidermal+growth+factor+and+insulin-like+growth+factor+I+enhance+keratinocyte+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Epidermal growth factor and insulin-like growth factor I enhance keratinocyte migration.</a> J. Invest. Dermatol. 100, 633-639 (1993).</li>
<li>Todt, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+tumor+necrosis+factor-alpha+on+human+trophoblast+cell+adhesion+and+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Reprod.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Effects of tumor necrosis factor-alpha on human trophoblast cell adhesion and motility.</a> Am. J. Reprod. Immunol. 36, 65-71 (1996).</li>
<li>McAuslan, B. R., Reilly, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+phagokinesis+in+response+to+specific+metal+ions%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Cell.+Res%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell phagokinesis in response to specific metal ions.</a> Exp. Cell. Res. 130, 147-157 (1980).</li>
<li>Smith, M. S., Bentz, G. L., Smith, P. M., Bivins, E. R., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCMV+activates+PI%283%29K+in+monocytes+and+promotes+monocyte+motility+and+transendothelial+migration+in+a+PI%283%29K-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">HCMV activates PI(3)K in monocytes and promotes monocyte motility and transendothelial migration in a PI(3)K-dependent manner.</a> J. Leukoc. Biol. 76 (3), 65-76 (2004).</li>
<li>Smith, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+phosphatidylinositol+3-kinase+and+NF-kappaB+in+human+cytomegalovirus-mediated+monocyte+diapedesis+and+adhesion%3A+strategy+for+viral+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Roles of phosphatidylinositol 3-kinase and NF-kappaB in human cytomegalovirus-mediated monocyte diapedesis and adhesion: strategy for viral persistence.</a> J. Virol. 81, 7683-7694 (2007).</li>
<li>Bentz, G. L., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+CMV+infection+of+endothelial+cells+induces+an+angiogenic+response+through+viral+binding+to+EGF+receptor+and+beta1+and+beta3+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Human CMV infection of endothelial cells induces an angiogenic response through viral binding to EGF receptor and beta1 and beta3 integrins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 5531-5536 (2008).</li>
<li>Chan, G., Nogalski, M. T., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+EGFR+on+monocytes+is+required+for+human+cytomegalovirus+entry+and+mediates+cellular+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Activation of EGFR on monocytes is required for human cytomegalovirus entry and mediates cellular motility.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22369-22374 (2009).</li>
<li>Nogalski, M. T., Chan, G., Stevenson, E. V., Gray, S., Yurochko, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HCMV-Regulated+Paxillin+in+Monocytes+Links+Cellular+Pathogenic+Motility+to+the+Process+of+Viral+Entry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">HCMV-Regulated Paxillin in Monocytes Links Cellular Pathogenic Motility to the Process of Viral Entry.</a> J. Virol. 85, 1360-1369 (2011).</li>
<li>Turkevich, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+study+of+the+nucleation+and+growth+processes+in+the+synthesis+of+colloidal+gold%5BTitle%5D)+AND+%22Discuss.+Faraday.+Soc%22%5BJournal%5D)">A study of the nucleation and growth processes in the synthesis of colloidal gold.</a> Discuss. Faraday. Soc. 11, 55-75 (1951).</li>
<li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Particle+size+and+sol+stability+in+mental+colloids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloid+%26+Polymer+Science%22%5BJournal%5D)">Particle size and sol stability in mental colloids.</a> Colloid & Polymer Science. 250, 736-741 (1972).</li>
<li>Frens, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlled+nucleation+for+the+regulation+of+the+particle+size+in+monodisperse+gold+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Sci%22%5BJournal%5D)">Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions.</a> Phys. Sci. 241, 20-22 (1973).</li>
<li>Zetter, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+of+capillary+endothelial+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Assay of capillary endothelial cell migration.</a> Methods Enzymol. 147, 135-144 (1987).</li>
<li>Scott, W. N., McCool, K., Nelson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+method+for+the+production+of+gold+colloid+monolayers+for+use+in+the+phagokinetic+track+assay+for+cell+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Improved method for the production of gold colloid monolayers for use in the phagokinetic track assay for cell motility.</a> Anal. Biochem. 287, 343-344 (2000).</li>
<li>Wang, S. Y., Mak, K. L., Chen, L. Y., Chou, M. P., Ho, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+human+blood+monocyte%3A+two+subpopulations+with+different+sizes%2C+phenotypes+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunology%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of human blood monocyte: two subpopulations with different sizes, phenotypes and functions.</a> Immunology. 77, 298-303 (1992).</li>
<li>Windler-Hart, S. L., Chen, K. Y., Chenn, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+behavior+screen%3A+identification%2C+sorting%2C+and+enrichment+of+cells+based+on+motility%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A cell behavior screen: identification, sorting, and enrichment of cells based on motility.</a> BMC Cell Biol. 6, 14(2005).</li>
<li>Pan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size-dependent+cytotoxicity+of+gold+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Size-dependent cytotoxicity of gold nanoparticles.</a> Small. 3, 1941-1949 (2007).</li>
<li>Rodriguez, L. G., Wu, X., Guan, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wound-healing+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Wound-healing assay.</a> Methods Mol. Biol. 294, 23-29 (2005).</li>
<li>Boyden, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chemotactic+effect+of+mixtures+of+antibody+and+antigen+on+polymorphonuclear+leucocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes.</a> J. Exp. Med. 115, 453-466 (1962).</li>
<li>Brooks, D. M., Brooks, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Invasion+Assay+Using+Matrigel%28R%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Med%22%5BJournal%5D)">In Vitro Invasion Assay Using Matrigel(R).</a> Methods Mol. Med. 58, 61-70 (2001).</li>
<li>Kuo, J. C., Wang, W. J., Yao, C. C., Wu, P. R., Chen, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tumor+suppressor+DAPK+inhibits+cell+motility+by+blocking+the+integrin-mediated+polarity+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The tumor suppressor DAPK inhibits cell motility by blocking the integrin-mediated polarity pathway.</a> J. Cell Biol. 172, 619-631 (2006).</li>
<li>Benazeraf, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+random+cell+motility+gradient+downstream+of+FGF+controls+elongation+of+an+amniote+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A random cell motility gradient downstream of FGF controls elongation of an amniote embryo.</a> Nature. 466, 248-252 (2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Bu makalede sunulan phagokinetic parça motilite tayini hücre göçü kantitatif analiz için basit ve son derece etkili bir yöntemdir. Birden fazla hücre tipleri 9-17 analiz edilebilir, çünkü bu yöntem farklı disiplinlerde potansiyeline geniş bir kullanıma sahiptir. Koloidal altın kaplı cam lameller kullanımı, bir hareket eden bir hücre ile temizlenmiş bir izi alanı ölçümü sağlar. Test hücresi motilitesi üzerine (ECM ligandlar, virüsler, bakteriler saflaştırılmış yani büyüme faktörleri,) farklı uyaranlar...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog numarası </td><td> Yorumlar </td></tr><tr><td> Cam lameller (15 mm) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 12-545-83 </td><td></td></tr><tr><td> Jelatin 300 Bloom </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> G-1890 </td><td></td></tr><tr><td> Tetrakloro Asit Trihidrat </td><td> Fisher Kimyasal </td><td> G54-1 </td><td> 14.5 mM (nihai bir çalışma çözeltisi) </td></tr><tr><td> Sodyum Sitrat </td><td> Fisher Scientific </td><td> BP327-500 </td><td> % 0.5 (bir son çalışma çözeltisi) </td></tr><tr><td> Paraformaldehyde </td><td> Fisher Scientific </td><td> O4042 </td><td> % 3 (nihai çalışma çözeltisi) </td></tr><tr><td> 100 mm Doku Kültürü Bulaşık </td><td> Sarstedt </td><td> 83.1802 </td><td></td></tr><tr><td> 12-Peki Tabaklar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 08-772-29 </td><td></td></tr><tr><td> 24-Peki Tabaklar </td><td> Fisher Scientific </td><td> 07-200-84 </td><td></td></tr><tr><td> Techne Fırın Hybridiser HB-1D </td><td> LabPlanet </td><td> 2040500 </td><td> Standart laboratuvar fırın yeterli olacaktır </td></tr><tr><td> 10 ml Serolojik Pipetler </td><td> Sarstedt </td><td> 86.1254.001 </td><td></td></tr><tr><td> Pipet-Aid Dolgu / Dispenser </td><td> Drummond </td><td> 13-681-15 </td><td></td></tr><tr><td> P200 Tek Kanal Manuel Pipet </td><td> Rainin </td><td> PR-200 </td><td></td></tr><tr><td> 200 ml Bariyer ipuçları </td><td> CLP </td><td> BT200 </td><td></td></tr><tr><td> ImageJ yazılım </td><td> <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">htt</a>p :/ / rsb.info.nih.gov / ij / </td><td></td><td> Lisans: Public Domain </td></tr><tr><td> Bir photometrics CoolSNAPfx Nikon Eclipse TE300 12-bit CCD kamera monokrom </td><td> Nikon </td><td></td><td> Durduruldu; en karşılaştırılabilir şartname Nikon Eclipse Ti sahiptir, ancak alt uç Nikon 80i de uygun olacaktır. Diğer markalar da karşılaştırılabilir mikroskoplar sağlamak. </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Not: Aşağıda listelenen reaktifler ve ekipman bizim çeşitli çalışmalarda bize tarafından kullanılmıştır. Diğer malzemeleri, tedarikçi, reaktifler ve ekipman sürece onlar benzer özelliklere sahip olarak, kullanılabilir. </td></tr></tbody></table>

phagokinetic parça motilite testi sayesinde hücre göç kantitatif değerlendirilmesi

A Quantitative Evaluation of Cell Migration by the Phagokinetic Track Motility Assay

Hücresel motilite tek hücreli ve çok hücreli canlılar için önemli bir biyolojik süreçtir. Bu besinlerin veya uzak uygun koşulların yanı sıra doku gelişimi, bağışıklık gözetim ve yara iyileşmesi için çok hücreli organizmalarda olduğu gibi, sadece birkaç rolleri 1,2,3 söz kaynağı doğru tek hücreli organizmaların hareketi için gereklidir. Bu işlemin önemli Deregülasyon, nörolojik kardiyovasküler ve immünolojik hastalıkların yanı sıra, şiddetlenir tümör oluşumuna yol açan ve 4,5 yayılabilir. Moleküler, aktin polimerizasyonu ve reseptör geri dönüşüm hücre 6,7,8 öne hareketini götürmek hücresel uzantıları (lamellipodia), yaratmada önemli rolleri olduğu gösterilmiştir. Ancak, hücre göçü ile ilgili birçok biyolojik sorular yanıtsız kalıyor. Insan sağlığı ve hastalık hücresel hareketlilik açısından merkezi bir rol özgü mec anlamanın önemini vurgularhanisms bu süreç içinde yer alan ve özellikle önemli hücre hareketi değerlendirilmesi için doğru yöntem sağlar. Mikroskop genellikle hücre hareketi görselleştirmek için kullanılır. Ancak, hücre hareketli hücrelerin nicel zaman lapsed filmleri oluşturmak için pahalı kameralar ve yazılım gerektiren bir kaynak-alıcı bir süreç hücre göçü kantitatif ölçümü yapmak, oldukça yavaş hareket ettirin. Bu nedenle, maliyet-etkin olmayan zahmetli ve bu ortak laboratuvar ekipmanı kullanan bir hücre göçü bir kantitatif ölçümü gerçekleştirmek için yeteneği birçok araştırmacı için büyük bir ihtiyaçtır. Phagokinetic parça motilite tayini kolloidal altın kaplamalı cam lamel 9,10 ölçülebilir bir parça oluşturmak için onun yolundan altın parçacıkları temizlemek için hareketli bir hücre yeteneğini kullanır. Serbestçe kullanılabilir yazılım kullanımı ile, birden fazla parçayı istatistiksel gereksinimleri gerçekleştirmek için her tedavi için değerlendirilebilir. Tahlil değerlendirmek için kullanılabilecekBu tür kanser hücrelerinin 11,12, fibroblastlar 9, nötrofiller 13, iskelet kas hücreleri 14, keratinositler 15, trofoblastlar 16, endotel hücreleri 17 ve monositler 10,18-22 gibi birçok hücre tipleri, motilitesi. Protokol sodyum sitrat ile chloroauric asit (Au 3 +) bir azalma ile oluşturulan nanoparçacıkların (Au °) ile kaplanmış slaytlara oluşturulmasını içerir. Bu yöntem, 1951, 23. Turkevich ve arkadaşları tarafından geliştirilen ve sonra Frens ve diğerleri tarafından 1970 de geliştirilmiştir. 24,25. Bu kimyasal indirgeme aşamasının bir sonucu olarak, altın parçacıkları (çap: 10-20 nm), tepkime karışımından, çökelti ve hücre göçü analiz 9,26,27 kullanıma hazır sonra cam lameller üzerine tatbik edilebilir. Genel olarak, phagokinetic parça motilite hücresel tahlil motilite hızlı, basit ve kantitatif ölçüsüdür. Buna ek olarak,Zaman lapsed görüntüleme, hem de, araştırmacının ihtiyaçlarına bağlı olarak başka kullanım için müsait olmayan hücre tipleri ile birlikte kullanım için, basit bir yüksek hacimli tahlil olarak kullanılabilir. Birlikte, kantitatif pahalı mikroskoplar ve yazılıma gerek olmadan birden fazla hücre tipleri hücresel motilite ölçme yeteneği, ortak laboratuvar ekipman ve kimyasalların kullanımı ile birlikte, hücresel anlamada phagokinetic parça motilite tayini ile ilgilenen bilim adamları için sağlam bir seçim yapmak motilite.

Gösterilen tek bir hücre (bizim deneyler bir monosit Şekil 2 &#39;de gösterilmiştir) tarafından temizlenir bir izi alanı gösteren bir ışık mikroskobu altında alınan resimlerin bir örnektir. Non-motil hücrelerin karakteristik küçük, oval veya bu uyarılmamış hücreleri (Şekil 2A ve 2B) için hareket düşük bazal seviyesini gösteren kendi etrafında daire şeklinde yolları oluşturmak. Bunun aksine, yüksek derecede hareketli hücreler [Sistemimizde, insan sitomegalovirüs (HCMV) i...

Phagokinetic motilite parça tahlil hücre hareketi değerlendirmek için kullanılan bir yöntemdir. Özellikle, tahlil, bir nicel bir şekilde, zaman içinde chemokinesis (rastgele hücre hareketliliğinin) ölçer. Tahlil, koloidal altın kaplama lameller üzerine onların hareket ölçülebilir bir parça oluşturmak için hücrelerinin yeteneği yararlanır.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Hücresel mobilite, hem tek hücreli hem de çok hücreli organizmalar için önemli bir biyolojik süreçtir. Tek hücreli organizmaların hareketi için temel teşkil eder...

Bu prosedürün genel amacı, altın nanopartikül tabanlı bir hücre hareketliliği testi kullanarak hücresel hareketliliği zaman içinde nicel olarak ölçebilmektir. Bu işlem, öncelikle cam lamellerin altın nanopartikül kaplaması için hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Spesifik olarak, endotoksin içermeyen lameller jelatin ile kaplanır ve ardından fırınlanır.İkinci adım, altın nanopartikülleri oluşturacak olan kloroaurik asidin indirgenmesi ve jelatin kaplı lamellerin çözelti ile eşit şekilde kaplanmasıdır. Ardından, hücreler deney için istenen süre boyunca altın nanopartikül kaplı lamellerin üzerine yerleştirilir. Devamında, jelatin altın nanopartikülleri yerinden oynatarak izler oluşturacaktır.Son adım, hareket eden hücrelerin oluşturduğu izleri görüntülemek için mikroskopi kullanarak hücre hareketliliğinin izlenmesi ve miktar tayininin yapılmasıdır. Nihayetinde, izlerin alan ölçümleri ücretsiz olarak sunulan yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilir. Bu tekniğin, zaman aşımı görüntüleme (time lapse imaging) gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajlarından biri, bu deneyin yalnızca standart bir ışık mikroskobu ve standart bir kamera gerektirmesi ve ücretsiz görüntüleme yazılımları kullanmasıdır.Ayrıca, bu analiz yöntemi, yüksek kapasiteli tarama yapabilen bir metodoloji kullanarak çok sayıda örneğin kolayca analiz edilmesine ve karşılaştırılmasına olanak tanır. Bu yöntem, farklı fizyolojik faktörlerin ve hücre hareketinin etkileri hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, patojenlerin enfekte hücrelerin motilitesi üzerindeki etkilerine yönelik çalışmalar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanan kişiler, protokolde belirtilen hacimlerin ve sıcaklıkların kesinlikle takip edilmesini gerektirmesi nedeniyle zorluk yaşayabilirler.Bu protokolde, başarının sağlanması için çöktürülmüş altın nanoparçacıkların nihai çözeltisinin renginin değerlendirilmesine vurgu yapılmıştır. Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşır; çünkü FGO kinetik iz hareketliliği analizi adımlarının öğrenilmesi zordur.Bunlar, hücresel ve moleküler biyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılmayan birkaç prosedür içermektedir. Jelatin kaplı lamel hazırlamak için, öncelikle çözeltinin final konsantrasyonu 300 mililitrede 0,5 gram olacak şekilde jelatin ve deiyonize suyu yeniden süspande edin, ardından karışımı 15 ila 30 dakika boyunca otoklavlayın. Bu işlemin, jelatin eklendikten sonraki iki saat içinde bir doku kültürü kabininde yapılması önemlidir.Öncelikle sekiz veya dokuz adet asitle yıkanmış lamelin 100 milimetrelik plastik bir kaba aktarılmasıyla kaplama için lameller hazırlanır. Lamellerin birbirine veya kabın kenarlarına temas etmediğinden emin olun. Plaka üzerine taşmamasına dikkat ederek, her bir lamelin üzerine pipetle dikkatlice iki ila üç damla jelatin damlatın.Ardından, jelatin kaplı lamelleri içeren kabı bir fırına yerleştirin ve 90 °C'de 10 dakika boyunca bekletin. 10 dakika sonra, kabı fırından çıkarın ve tekrar doku kültürü kabinine geri yerleştirin.Fazla jelatini pipetle nazikçe çekin. Kabı fırına geri yerleştirin ve lamel camları 70 °C'de 45 dakika boyunca kurutun. Lamel camlar kuruduktan sonra, kabı fırından çıkarın ve doku kültürü kabinine geri koyun.Steril bir iğneyi nazikçe kullanarak lamelin bir kenarını kaldırın. Ardından, jelatin kaplı lamelleri kaptan çıkarmak için steril cımbız kullanın ve bunları 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Bir sonraki adım, kolloidal altın kaplı lamelleri hazırlamaktır.Doku kültürü kabininde çalışarak, steril ve endotoksin içermeyen bir erlenmeyer flask içerisinde 1,5 mililitre 14,5 millimolar kloro ORIC asit çözeltisi ve 13,5 mililitre otoklavlanmış deiyonize suyu birleştirip 10 mililitre %0,5 sodyum sitrat çözeltisi hazırlayarak başlayın. Her sekiz ila dokuz lamel için sonuç, soluk sarı bir çözelti olmalıdır. Kloro ORIC asit toksiktir ve dikkatle taşınmalıdır. Ayrıca ışığa duyarlıdır, bu nedenle kaynatma adımı düşük ışıklı bir ortamda gerçekleştirilmelidir.Çözelti kaynama noktasına ulaştığında, balonu ısıtıcı plakadan alın ve bir manyetik karıştırıcıya aktarın. Çözelti içinde kolloidal altın partikülleri oluşturmak için, karıştırma işlemi sırasında her 15 mililitre kloro AURIC asit çözeltisi başına 0,7 mililitre %0,5 sodyum sitrat çözeltisi ekleyin ve yaklaşık iki dakika boyunca karıştırmaya devam edin. Bu süre zarfında çözelti, soluk sarıdan şeffafa, ardından griye, mora ve derin mora dönüşecektir.Çözelti nihayet kırmızı şarap veya tercihen pas rengine ulaşmadan önce, kolloidal altın çözeltisini 10 mililitrelik bir pipete çekin ve çözeltinin oda sıcaklığına gelmesi için pipet içerisinde bir ila iki dakika soğumasını bekleyin. Ardından, 24 kuyucuklu plaktaki jelatin kaplı lamel üzerine 0.5 ile bir mililitre arası ekleyin. Kolloidal altın kaplı lamelleri içeren 24 kuyucuklu plağı 37 degrees Celsius sıcaklıktaki bir inkübatöre yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin. Partiküllerin jelatin kaplı lameller üzerine çökelmesi için yeterli süre geçtikten sonra, yoğunluklarını bir ışık mikroskobu altında kontrol edin.Altın nanoparçacıklarının uygun dağılımı, güneş kamyonlarının kenarlarının kolayca ve verimli bir şekilde ayırt edilmesine yardımcı olur. Optimal yoğunluk, hücre boyutuna göre değişiklik gösterir. Altın parçacıklarının çok yüksek bir konsantrasyonu hücrelerin hareket kabiliyetini engellerken, altın parçacıklarının çok düşük bir konsantrasyonu ise doğru bir mobilite izi belirleme yeteneğini sınırlar.Bu nedenle, münferit deneylerde yalnızca aynı partide üretilmiş veya aynı yoğunluğa sahip olduğu doğrulanmış lameller birlikte kullanılmalıdır. Altın partikül konsantrasyonu yetersizse, jelatin kaplı lamellere 0,5 ile bir mililitre arasında ek kolloidal altın çözeltisi ekleyin. Ancak, burada gösterildiği durumdaki gibi altın partikül konsantrasyonu çok yüksekse, tek etkili seçenek kolloidal altın çözeltisini yeniden hazırlamak ve yeni lamelleri kaplamaktır.Partikül yoğunluğu uygunsa, plakayı 37 °C'deki inkübatöre geri yerleştirin ve bağlanmamış altın partikülleri uzaklaştırmak için lamelleri steril fosfat tamponlu saline üç kez daldırarak bir saatten gece boyunca sürecek şekilde inkübe edin. Ardından, koloidal altın kaplı lamelleri, kullanılmaya hazır olana kadar temiz bir 12 kuyucuklu plakanın PBS dolu kuyucuklarında 4 °C'de saklayın. Lamellerin kurumasına izin verilmemeli ve hazırlandıkları tarihten itibaren iki ila üç ay içinde kullanılmalıdır.Bir sonraki adım, hücre kültürü için kolloidal altın kaplı lamel hazırlığıdır. İşleme, lamelleri eklemeden önce yaklaşık 0,3 mililitre kültür ortamı eklenmiş olan 24 kuyucuklu bir plakanın her bir kuyucuğuna yerleştirerek başlayın. Her bir kolloidal altın kaplı lamel üzerine yaklaşık 5.000 ila 50.000 hücre aktarın. Hücre sayısı hücre tipine göre değişiklik gösterecektir, ancak hücre yoğunluğu, aynı alandaki birden fazla hücreden kaynaklanan hücre izlerinin üst üste binmesini önleyecek kadar düşük olmalıdır.Plakayı kapatın ve 37 °C sıcaklıkta, %5 karbondioksit içeren bir inkübatöre altı ila 24 saat boyunca yerleştirin. Hücre tipinin motilitesine bağlı olarak, optimal zaman aralığı her hücre tipi için deneyle belirlenmelidir. İnkübasyonun ardından, hemen analiz edilmeyecek olan lamelleri önce iki kez PBS'ye daldırarak, ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %3 paraformaldehid içinde inkübe ederek sabitleyin. Sabitlenmemiş veya sabitlenmiş lameller üzerinde, tek bir hareketli hücre tarafından oluşturulan izlerin görüntülerini bir ışık mikroskobu kullanarak yakalayın. Hücresel izlerin fotoğraflarını çekmek için kullanılan büyütme, hücre tipine göre değişiklik gösterir. Ancak, sonuçları karşılaştırabilmek için her çalışmada aynı büyütme kullanılmalıdır.Monositler için, ImageJ, JNIH image veya image tool gibi ücretsiz olarak erişilebilen yazılımlar kullanılarak 40x büyütme iyi sonuç verir; her örnek için yakalanan görüntülerden 10 ila 20 veya daha fazla hücrenin temizlediği kolloidal altın ortalama alanını belirleyin. Burada gösterilen, 40x objektif ile çekilmiş, tek bir uyarılmamış monosit tarafından temizlenen kolloidal altın partikül yolu örneğidir. Hareketli olmayan hücreler, çevrelerinde düşük seviyeli bir hareketliliğe işaret eden karakteristik küçük oval veya daire şeklinde izler oluştururlar. Buna karşılık, yüksek hareketliliğe sahip hücreler, düzensiz şekilleri nedeniyle uzamış izler ve daha geniş toplam alanlar şeklinde yönlü bir hareketle karakterize edilirler.Hücre izleri, hacimlerini belirlemek için Image J yazılımındaki serbest çizim (freehand) aracı kullanılarak en iyi şekilde analiz edilir. Ardından, Image J'nin analiz menüsündeki ölçüm aracı kullanılarak kantitatif alan ölçümleri gerçekleştirilebilir. Bu prosedürü uygularken, sapmalar nihai sonuçları güçlü bir şekilde etkileyebileceği için protokolde belirtilen hacimlere ve sıcaklıklara kesinlikle uyulması gerektiğini hatırlamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, jelatin kaplı lamel camların nasıl hazırlanacağı, altın nanopartiküllerin ve altın nanopartikül kaplı lamel camların nasıl hazırlanacağı ile ışık mikroskobu kullanılarak hücre hareketinin nasıl izleneceği ve kantitatif olarak değerlendirileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Sıcak tabla üzerinde kaynayan solüsyonlarla çalışmanın, özellikle de florür, AIC asidi ve sodyum sitratın kaynayan solüsyonlarından çıkan buharların tehlikeli olabileceğini unutmayın; bu prosedür gerçekleştirilirken çeker ocakta çalışmak ve sağduyulu davranmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.

a-quantitative-evaluation-cell-migration-phagokinetic-track-motility

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Biz aydınlık intravital mikroskopi, in vivo olarak nötrofil kemoatraktan kaynak yanıt nötrofil göçünü sırasında dinamik nötrofil-endotel hücre etkileşimleri ölçmek için bir protokol tanımlamaktadır. Nötrofil intraluminal tarama, fare Cremaster'ın kas dokusu transendoteliyal göç ve kemotaksis zaman lapsed video ImageJ ile fotoğraf ve takip ile görüntülendi.

Takip Nötrofil Lumen Crawling, intravital video Mikroskopi Doku transendoteliyal Göç ve Kemotaksis

Bu yöntem gerçek zamanlı ve bu hız, yer değiştirme ve hız gibi farklı hücre göçü parametrelerinin nicel ölçümleri hücrelerin izlenmesine olanak sağlar. Geleneksel yöntemlerin aksine, bu gerçek zamanlı bir yaklaşım uç kantitatif göç ölçümlere dayalı değildir, bunun yerine izlenmesi ve sürekli farklı parametreler hesaplanarak sağlar.

Time-lapse video Mikroskop ile Hücrelerinin Rastgele Göç Kantitatif Analiz

Çeşitli büyüme faktörlerinin varlığında enterik nöral tepe hücre göçü potansiyelinin hassas miktar tayinine izin veren bir ex vivo hücre göçü deneyi mevcut.

Kemirgen Enterik Sinir progenitörlerin için Kantitatif Hücre Göç Tahlili

Yaygın olarak kullanılan, in vitro olarak hücre göçü ve işgali incelenmesi için oldukça erişilebilir yöntemler tarif edilmiştir. Birinci yöntem, hücre motilitesini büyüklüğüne hücre yara kapatma deneyidir. İkinci yöntem kemotaktik ve hücrelerin invaziv kapasitesini değerlendirir transwell göç ve istila testtir.

Vitro Hücre Göç ve Invasion Tahliller

Tek boyutlu bir kapalı mikro hücrelerin spontan göç incelemek için nicel bir yöntem tarif edilmektedir. Bu yöntem, mikrofabrike kanalları yararlanır ve tek bir deneyde, farklı koşullar altında hücrelerin büyük sayıda göçünü incelemek için kullanılabilir.

Microfabricated Kanallar Hücre Göç Çalışması

Hücre göçü, bir kanser gibi yara iyileşmesi ve bağışıklık tepkilerinin ve patofizyolojik süreçler gibi, fizyolojik bir bolluk dahil bir biyolojik bir olgudur. 3D-kollajen matris göç deneyi 3D fizyolojik gibi bir ortamda içinde farklı hücre tipleri göç özelliklerini analiz etmek için çok yönlü bir araçtır.

Bir Üç boyutlu Kollajen Matrix içindeki Hücre Göç Analizi

Birçok yukarı regüle edilmiş gen, tümör hücresi göçünü ve invazyonunu uyararak kötü prognoza yol açar. Hangi genlerin tümör hücresi göçünü ve invazyonunu düzenlediğini belirlemek çok önemlidir. Bu protokol, bir genin artan ekspresyonunun tümör hücrelerinin göçü ve invazyonu üzerindeki etkilerini gerçek zamanlı olarak araştırmak için bir yöntem sunar.

Sentetik mRNA Transfeksiyonunu Takiben Tümör Hücresi Migrasyonu ve İnvazyonunun Gerçek Zamanlı Kantitatif Ölçümü

Bu prosedür, Acanthamoeba spp.'  nin nasıl görselleştirileceğini, izleneceğini ve ölçüleceğini açıklar.Motilite.

Acanthamoeba spp.'nin miktar tayini Motilite

Bu protokol, kantitatif analiz ile belirli çevresel koşullar altında primer murin T hücresi izolasyonu ve T hücresi göçünün hızlandırılmış mikroskobu için bir yöntem sağlar.

Primer Murin CD8 + T Hücreleri için Gerçek Zamanlı İn Vitro Migrasyon Testi

Flow sitometri yaralı / patolojik MSS hücresel inflamasyon Niceleme azalan hassasiyet / doğruluk, benzer boyutta ve granülasyon hücreleri olabilir lipid / miyelin enkaz karmaşıktır. Biz miyelin enkaz kaldırmak ve yaralanan omurilikte akım sitometri ile hücre algılama geliştirmek için bir hücre hazırlama yöntemi gelişmiş var.

Akış Sitometri Yaralı Omurilik Doku Bağışıklık Hücreleri Kantitatif Değerlendirilmesi: Hücre Arıtma Yöntemi Roman kullanın

Öğrenin, hücre göçünü altın nanoparçacık kaplı kapak camları kullanarak nicel olarak ölçme yöntemini. Bu teknik, hücre hareketini görselleştirmek ve çeşitli koşullarda hücre davranışını anlamak için güvenilir bir araç sunar.

Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Daha fazla video keşfet