Phagokinetic Parça Motilite Testi sayesinde Hücre Göç Kantitatif Değerlendirilmesi

Bu prosedürün genel amacı, altın nanopartikül bazlı bir hücre motilite testi kullanarak zaman içinde hücresel motiliteyi kantitatif olarak ölçebilmektir. Bu, önce altın nanopartiküllerin kaplanması için cam kapak fişlerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. Spesifik olarak, endotoksin içermeyen örtü astarları jelatin ile kaplanır ve daha sonra fırınlanır.

İkinci adım, altın nanopartiküller oluşturacak olan kloroorik asidi azaltmak ve jelatin kaplı örtü kaymalarını çözelti ile eşit şekilde kaplamaktır. Daha sonra, hücreler, deney hücrelerinin istenen zaman dilimi için altın nanopartikül kaplama kapak kızaklarına yerleştirilir. Devam edersek, jelatin, izler oluşturan altın nanopartiküllerin yerini alacaktır.

Son adım, hareketli hücreler tarafından oluşturulan izleri görüntülemek için mikroskopi kullanılarak hücre hareketliliğinin izlenmesi ve niceliğinin belirlenmesidir. Sonuç olarak, izlerin alan ölçümleri ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımlar kullanılarak gerçekleştirilir. Bu tekniğin zaman atlamalı görüntüleme gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajlarından biri, bu testin yalnızca standart bir ışık mikroskobu, standart kamera gerektirmesi ve ücretsiz olarak kullanılabilen görüntüleme yazılımını kullanmasıdır.

Ek olarak, tahlil, yüksek verimli tarama yapabilen bir Metodist kullanılarak birden fazla numunenin analizine ve karşılaştırılmasına da kolayca izin verir. Bu yöntem, farklı fizyolojik faktörlerin ve hücre hareketinin etkisi hakkında fikir verebilse de, patojenlerin enfekte hücrelerin motilitesi üzerindeki etkileri üzerine yapılan çalışmalar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, yöntemlerin protokolde belirtilen hacimleri ve sıcaklıkları sıkı bir şekilde takip etmesini gerektirdiğinden mücadele edebilir.

Bu protokolde, başarıyı sağlamak için çökeltilmiş altın nanopartiküllerin nihai çözeltisinin renginin değerlendirilmesine vurgu yapılmaktadır. Bu yöntemin görsel gösterimi çok önemlidir. FGO kinetik iz motilite testi adımlarının öğrenilmesi zordur.

Hücresel ve moleküler biyoloji laboratuvarlarında yaygın olarak kullanılmayan çeşitli prosedürler içerirler. Jelatin kaplı örtü fişleri hazırlamak için, Resus önce jelatini ve deiyonize suyu askıya alarak çözeltiyi 300 mililitrede 0,5 gramlık bir nihai konsantrasyonla elde edin, ardından karışımı 15 ila 30 dakika otoklavlayın. Bunu, jelatinin bir doku kültürü başlığına eklenmesinden sonraki iki saat içinde yapmak önemlidir.

Önce sekiz ila dokuz asitle yıkanmış kapak fişini 100 milimetrelik plastik bir kaba aktararak lamele fişlerini kaplama için hazırlayın. Kapak fişlerinin birbirine veya tabağın kenarlarına temas etmediğinden emin olun. Plakaya taşmayı önleyerek her bir kapak fişine dikkatlice iki ila üç damla jelatin pipetleyin.

Daha sonra jelatin kaplı kapak fişlerini içeren tabağı bir fırına koyun ve 90 derecede 10 dakika pişirin. 10 dakika sonra, tabağı fırından çıkarın ve dokuya geri koyun. Kültür başlığı.

Fazla jelatini nazikçe pipetleyin. Çanağı tekrar fırına verin ve kapak fişlerini 70 derecede 45 dakika kurutun. Kapak kızakları kuruduktan sonra, tabağı fırından çıkarın ve kağıt mendil Kültür davlumbazına geri koyun.

Steril bir iğneyi hassas bir şekilde kullanarak, kapak kaymasının bir tarafını yukarı kaldırın. Daha sonra steril cımbız kullanarak jelatin kaplı örtü fişlerini tabaktan çıkarın ve bunları 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin. Bir sonraki adım, kolloidal altın kaplamalı lamel sliplerin hazırlanmasıdır.

10 mililitre% 0.5 sodyum sitrat çözeltisi hazırlayarak başlayın, bir doku kültürü davlumbazında 1.5 mililitre 14.5 milimolar kloro ORIC asit çözeltisi ve 13.5 mililitre otoklav deiyonize su steril bir endotoksin içermeyen erlenmeyer şişesinde birleştirildi Her sekiz ila dokuz kapak fişi için sonuç soluk sarı bir çözelti vermelidir. Kloro ORIC asit toksiktir ve dikkatli bir şekilde kullanılmalıdır. Aynı zamanda ışığa duyarlıdır, bu nedenle kaynatma adımı düşük ışık ayarında gerçekleştirilmelidir.

Çözelti kaynama noktasına ulaştığında, şişeyi sıcak plakadan çıkarın ve bir karıştırma plakasına aktarın. Çözelti içinde kolloidal altın parçacıklarını oluşturmak için, karıştırırken 15 mililitre kloro ORIC asit çözeltisine 0.7 mililitre% 0.5 sodyum sitrat çözeltisi ekleyin, yaklaşık iki dakika karıştırmaya devam edin. Bu süre zarfında, çözelti soluk sarıdan berraklığa, griye, mordan koyu mora değişecektir.

Sonunda kırmızı bir şaraba veya tercihen pas rengine ulaşmadan önce, kolloidal altın çözeltisini 10 mililitrelik bir pipete çekin ve çözeltinin oda sıcaklığına ulaşana kadar pipette bir ila iki dakika soğumasına izin verin. Daha sonra 24 oyuklu plakadaki jelatin kaplı örtü fişlerinin üzerine 0,5 ila bir mililitre ekleyin: Kolloidal altın kaplı örtü fişlerini içeren 24 oyuklu plakayı 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin ve 30 dakika inkübe edin. Parçacıkların jelatin kaplı örtü kızaklarına yerleşmesi için zaman bulduktan sonra, yoğunluklarını bir ışık mikroskobu altında kontrol edin.

Altın nanopartiküllerin uygun dağılımı, güneş kamyonlarının kenarlarını kolay ve verimli bir şekilde ayırt etmeye yardımcı olur. Optimal yoğunluk hücre boyutuna göre değişir. Çok yüksek bir altın parçacığı konsantrasyonu, hücrelerin hareket etme yeteneğini engellerken, çok düşük bir altın parçacığı konsantrasyonu, doğru bir hareketlilik izini tanımlama yeteneğini sınırlar.

Bu nedenle, bireysel deneylerde sadece aynı partide yapılan veya aynı yoğunluğa sahip olacak şekilde boyutlandırılan lameller birlikte kullanılmalıdır. Altın parçacıklarının konsantrasyonu yetersizse, jelatin kaplı örtü fişlerine 0,5 ila bir mililitre daha kolloidal altın çözeltisi ekleyin. Bununla birlikte, burada gösterilen durumda olduğu gibi altın parçacıklarının konsantrasyonu çok yüksekse, tek etkili seçenek kolloidal altın çözeltisini yeniden yapmak ve yeni kapak fişlerini kaplamaktır.

Parçacık yoğunluğu doğruysa, plakayı 37 santigrat derecede inkübatöre geri koyun ve kapak fişlerini steril fosfat tamponlu tuzlu suya üç kez daldırarak bağlanmamış altın parçacıklarını gece boyunca durulamak için bir saat inkübe edin. Daha sonra, kolloidal altın kaplı kapak fişlerini, kullanıma hazır olana kadar dört santigrat derecede temiz bir 12 oyuklu plakanın PBS dolu kuyularında saklayın. Lamel bezlerin kurumasına izin verilmemeli ve yapıldıkları tarihten itibaren iki ila üç ay içinde kullanılmalıdır.

Bir sonraki adım, kolloidal altın kaplı lamellerin hücre kültürü için hazırlanmasıdır. Bunları, kapağın eklenmesinden önce yaklaşık 0.3 mililitre kültür ortamı eklenmiş olan 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirerek başlayın, Fişler, her bir kolloidal altın kaplı kapak fişine yaklaşık 5.000 ila 50.000 hücre aktarır. Hücre sayısı hücre tipine göre değişir, ancak hücre yoğunluğu, aynı alandaki birden çok hücreden gelen hücre izlerinin üst üste binmesini önleyecek kadar düşük olmalıdır.

Plakayı örtün ve altı ila 24 saat boyunca% 5 karbondioksit ile 37 santigrat derecede bir inkübatöre yerleştirin Hücre tipinin motilitesine bağlı olarak, inkübasyonu takiben her hücre tipi için en uygun zaman çerçevesi deneysel olarak belirlenmelidir, hemen analiz edilmeyecek herhangi bir örtü fişini önce PBS'ye iki kez batırarak ve ardından oda sıcaklığında 15 dakika boyunca %3 para formaldehit içinde inkübe ederek düzeltin. Işık, sabitlenmemiş veya sabit kapak fişleri üzerinde tek bir hareketli hücre tarafından oluşturulan izlerin görüntülerini yakalar. Hücresel izlerin resimlerini çekmek için kullanılan büyütme, hücre tipine bağlı olarak değişir. Ancak, sonuçları karşılaştırabilmek için her çalışma için aynı büyütme kullanılmalıdır.

Monositler için, 40 x büyütme, görüntü, JNIH görüntüsü veya görüntü aracı gibi ücretsiz olarak kullanılabilen yazılımları kullanarak iyi çalışır, yakalanan görüntülerden her bir örnek için 10 ila 20 veya daha fazla hücre tarafından temizlenen kolloidal altının ortalama alanını belirler, burada gösterilen kolloidal altın parçacıklarının 40 x objektifle alınan tek bir uyarılmamış monosit tarafından temizlenen yoludur. Hareketsiz hücreler, kendi etraflarında karakteristik küçük oval veya daire şeklinde izler oluşturur, bu da düşük bir vassal hareket seviyesini gösterir. Buna karşılık, oldukça hareketli hücreler, düzensiz şekilleri nedeniyle uzun yollar ve daha geniş genel alanlar olarak yönlü bir hareket ile karakterize edilir.

Hücre izleri en iyi şekilde, hacimlerini ana hatlarıyla belirtmek için Image J yazılımındaki serbest el aracı kullanılarak analiz edilir. Kantitatif alan ölçümleri daha sonra Resim J'nin analiz menüsündeki ölçüm aracı kullanılarak gerçekleştirilebilir.Bu prosedürü denerken, sapmalar nihai sonuçları güçlü bir şekilde etkileyebileceğinden, protokolde belirtilen hacimleri ve sıcaklıkları sıkı bir şekilde takip etmeyi unutmamak önemlidir. Bu videoyu izledikten sonra, jelatin kaplı lamellerin nasıl oluşturulacağını, altın nanopartiküllerin ve altın nanopartiküller kaplı lamellerin nasıl hazırlanacağını ve bir ışık mikroskobu kullanılarak hücre hareketinin nasıl izleneceğini ve kantitatif olarak nasıl değerlendirileceğini iyi anlamış olmalısınız.

Kaynar çözeltilerle sıcak bir plaka üzerinde çalışmanın, özellikle kaynayan flor, AIC asidi ve sodyum sitrat çözeltisinden çıkan buharların, davlumbazda çalışmak gibi tehlikeli önlemler olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman sağduyulu davranılması gerektiğini unutmayın.