Tek molekül Görüntüleme için kompakt Kuantum Noktaları

Bu prosedürün genel amacı, tek moleküllü görüntülemede kullanım için optimize edilmiş parlaklık ve stabilitenin yanı sıra en aza indirilmiş boyut ve spesifik olmayan bağlanma ile floresan kuantum noktaları hazırlamaktır. Bu, önce küçük kadmiyum selenit kuantum nokta çekirdeklerinin hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, floresanlarını kırmızı spektruma kaydırmak ve parlaklıklarını artırmak için bu çekirdekleri cıva ile alaşımlamaktır.

Daha sonra, floresan emisyonlarını stabilize etmek için nano kristaller üzerinde ince bir alaşımlı kabuk büyütülür. Son adım, biyolojik olarak inert polietilen glikol ile modifiye edilebilen çok dişli bir polimer kullanarak bu parçacıkları organik çözücülerden sulu tamponlara aktarmaktır. Sonuç olarak, floresan spektrometresi, jel kromatografisi ve jel elektroforezi, bu parçacıkların parlak floresan, kompakt bir hidrodinamik boyut ve biyolojide tek moleküllü floresan görüntüleme için çok uygun nötr bir elektrostatik yük özelliklerine sahip olduğunu göstermek için kullanılır.

Bu kuantum noktalarının mevcut ticari malzemelere göre temel avantajı, bu nanoparçacıkların önemli ölçüde azaltılmış bir hidrodinamik boyuta sahip olmasıdır. Daha küçük kuantum noktaları, azalan floresan yoğunluğu, azalan floresan stabilitesi ve yalnızca mavi spektrumdaki floresan nedeniyle olumsuz etkilense de, bu etkileri bir cıva katyonu değişim işlemi kullanarak dengeledik. Bu nano Kristaller, kalabalık biyolojik ortamlarda tek biyomoleküllerin dinamik olarak görüntülenmesini sağlayarak biyofizik ve hücresel sinyallemedeki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Başlamak için, 50 mililitreye selenyum ekleyerek üstüne 0.4 molar bir selenyum çözeltisi hazırlayın. Üç boyunlu şişe, şişeyi yüksek vakum altında boşaltır ve havasız koşullar altında bir sch şaft hattı kullanarak argon ile doldurur. Berrak renksiz bir çözelti elde etmek için 10 mililitre üst ekleyin ve bir saat karıştırarak 100 santigrat dereceye ısıtın.

Çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun ve şişeyi bir kenara koyun. Ayrıca, yazılı protokolde listelenen miktarları kullanarak 250 mililitrelik üç boyunlu bir şişede bir kadmiyum oksit TDPA ve ODE çözeltisi hazırlayın. Bu videoya eşlik ederken, karıştırırken bir şaft hattı kullanarak çözeltiyi boşaltın.

Sıcaklığı 100 santigrat dereceye yükseltin ve 15 dakika daha boşaltın. Argon gazı altındaki düşük kaynama noktalı safsızlıkları gidermek için, kadmiyum oksidi tamamen çözmek için karışımı bir saat boyunca 300 santigrat dereceye ısıtın. Çözelti kırmızımsı bir renkten berrak ve renksiz hale dönecek, çözeltiyi oda sıcaklığına soğutacaktır.

Daha sonra, kadmiyum çözeltisine HDA ekleyin, 70 santigrat dereceye ısıtın ve boşaltın. Sabit bir basınç elde edildiğinde, sıcaklığı artırın ve çözeltiyi 30 dakika boyunca geri akıtın. Schlink hat vanasını inert gaza çevirin ve termokupl doğrudan çözeltiye yerleştirin.

Havasız koşullar altında, kadmiyum çözeltisine DPP ekleyin ve sıcaklığı 310 santigrat dereceye yükseltin. Şimdi 0,4 molar üst selenyum çözeltisinin 7,5 mililitresini çıkarmak için 16 gauge iğneye bağlı tek kullanımlık bir plastik şırınga kullanın. Sıcaklık 310 santigrat dereceye dengelendiğinde, sıcaklık kontrol cihazını sıfır santigrat dereceye ayarlayın ve üst selenyum çözeltisini hızla doğrudan kadmiyum çözeltisine enjekte edin.

Çözelti renksizden sarıya, turuncuya değişecek ve sıcaklık hızla düşecek ve tekrar yaklaşık 280 santigrat dereceye yükselecektir. Bu prosedürdeki en zor adım, şırınganın tüm hacmini kadmiyum çözeltisine mümkün olduğunca çabuk enjekte etmektir. Bu, partiküllerin homojen bir şekilde çekirdeklenmesini sağlar.

Bir dakikalık reaksiyondan sonra, şişeyi ısıtma mantosundan çıkarın ve sıcaklık 200 santigrat derecenin altına düşene kadar bir hava akımı ile hızla soğutun. Sıcaklık yaklaşık 40 santigrat dereceye ulaştığında, 30 mililitre heksan ile seyreltin, kalan kadmiyum öncüsünün çoğu çözeltiden çökelecektir. Bu çökeltiyi santrifüjleme ile çıkarın.

Altı adet 50 mililitrelik polipropilen konik santrifüj tüpünün her birinde, elde edilen ham nano Krystal çözeltisinin 12 mililitresini seyreltin. Aynı parametrelerle santrifüjlemeyi takiben 40 mililitre aseton ile süpernatanı dikkatlice boşaltın ve atın. Ardından, nano krysttal peletlerini heksan içinde çözün.

Çözeltiyi, üst fazı koruyarak eşit hacimde metanol ile ekstrakte edin. Üçüncü ekstraksiyon için bu ekstraksiyonu iki kez daha tekrarlayın. Metanol hacmi, kabaca 200 mikromolarda saf kadmiyum selenit kuantum noktalarından oluşan konsantre bir heksan çözeltisi elde etmek için yaklaşık 15 mililitreye ayarlanabilir.

Bu reaksiyonun tipik verimi, iki üç nanometre çapında üç mikromolar kadmiyum selenit kristalidir, yazılı prosedürde açıklandığı gibi ultraviyole görünür absorpsiyon spektrumunu ölçerek nano Krystal çapını ve konsantrasyonunu belirler, nano kristaller kısmen cıva ile kırmızıya kayma, absorpsiyon ve floresan emisyonu ile değiştirilebilir. Bunu yapmak için, karıştırma çubuğu ile 20 mililitrelik bir cam şişede heksan ve kloroformu karıştırın, daha sonra kadmiyum, selenit, kuantum nokta çözeltisi, OLA ve cıva oktan ihlali ekleyin. Nano kristalleri saflaştırdıktan ve yazılı prosedürde açıklandığı gibi konsantrasyonlarını belirledikten sonra, kabuk büyümesi için nano kristallerin oda sıcaklığında en az 24 saat yaşlanmasına izin verin.

50 mililitrede 0.1 molar kabuk öncü çözeltileri hazırlayın, kadmiyum öncüsü, çinko öncüsü ve kükürt öncüsünün vakumlu ısı çözeltileri altında üç boyunlu şişeler, berrak çözeltiler elde etmek için bir saat boyunca geri akışa hazırlayın, ardından argon ile üç boyunlu bir şişeye doldurun. Topo ODE'yi ekleyin ve hazırlanmış cıva, kadmiyum, selenit, kuantum noktaları. Yan çizgiyi kullanarak heksini oda sıcaklığında boşaltın.

Sıcaklığı 100 santigrat dereceye yükseltin ve 15 dakika boyunca geri çekin. Hat vanasını Argon gazına değiştirin ve termokupl'u nano Krystal çözeltisine yerleştirin. Sıcaklığı 120 santigrat dereceye çıkardıktan sonra, 0.5 tek tabaka veya 140 mikrolitre kükürt öncü çözeltisi ekleyin ve reaksiyonun 15 dakika devam etmesine izin verin.

Sıcaklığı 140 santigrat dereceye yükseltin. 0.5 tek tabaka veya 140 mikrolitre kadmiyum öncü çözeltisi ekleyin ve reaksiyonun 15 dakika devam etmesine izin verin. Daha sonra reaksiyon çözeltisine 500 mikrolitre susuz OLA ekleyin.

160 santigrat derece ekleyin, 0.5 tek tabaka veya 220 mikrolitre kükürt öncü çözeltisi ekleyin, ardından her ekleme arasında 15 dakika olacak şekilde 170 santigrat derecede eşit miktarda çinko öncü çözeltisi ekleyin. Daha sonra 180 santigrat derecede, 15 dakikalık aralıklarla 0.25 tek tabaka veya 150 mikrolitre kükürt öncü çözeltisi ve çinko öncü çözeltisi ekleyin. Serin. Oda sıcaklığına çözüm ve bu parçacıklar için yeni bir yok olma katsayısı.

Bir UV vis spektrumu kullanarak, nano kristallerin sayısının değişmediğini varsayarsak, reaksiyon çözeltisini bir dondurucuda ham bir karışım olarak saklayın. Bu aşamada, nano kristaller elektron mikroskobu, UV vis absorpsiyon spektroskopisi ve floresan spektroskopisi kullanılarak karakterize edilebilir. 50 mililitrelik üç boyunlu bir şişeye saflaştırılmış çekirdek kabuk kuantum noktaları ekleyin ve heksini yüksek bir vakum altında çıkarın.

Kuru bir film elde etmek için şişeyi argon ile doldurun. Nanopartikül filme susuz pürin ekleyin ve bulamacı bir ila iki saat boyunca 80 santigrat dereceye ısıtın. Nanopartiküller tamamen çözülecektir.

Çözeltiye bir mililitre FIO gliserol ekleyin ve iki saat boyunca 80 santigrat derecede karıştırın. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, tiyo gliserolü protonlamak için 0.5 mililitre trietilamin ekleyin ve 30 dakika karıştırın. Bu çözücü karışımındaki polar nano kristallerin zayıf çözünürlüğü nedeniyle trietilamin ilavesinden sonra çözelti bulanıklaşabilir.

Kuantum nokta çözeltisini, 20 mililitre heksan ve 20 mililitre aseton karışımı içeren 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve iyice karıştırın. Çökeltilmiş nano kristalleri santrifüjleme yoluyla izole edin, ardından aseton ile pelet yıkama yapın, kuantum nokta peletini banyo sonikasyonu ile beş mililitre DMSO'da çözün ve santrifüjleme ile takip edin. Olası agregaları çıkarmak için, bir UV V absorpsiyon spektrumundan nanopartikül konsantrasyonunu belirleyin.

Saf kuantum noktalarının çözeltisi üç saat içinde kullanılmalıdır, çünkü yüzey havadaki ortam koşulları altında yavaşça oksitlenebilir. Kuantum nokta çözeltisini DMSO ile 10 mikromolar veya daha az seyreltin ve 50 mililitrelik bir şişeye aktarın. DMSO'da mililitre dilate poliakrilik asit çözeltisi başına hazırlanmış beş miligram ekleyin, karıştırırken kuantum nokta çözeltisine damla damla ekleyin ve çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca gazdan arındırın.

Kuantum nokta polimer çözeltisini Argonne ile temizleyin ve 90 dakika boyunca 80 santigrat dereceye ısıtın. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, eşit hacimde 50 milimolar sodyum ekleyin pH at sekizinci damla ve 10 dakika karıştırın. Kuantum noktalarını yazılı prosedürde tarif edildiği gibi saflaştırın ve karıştırma çubuklu dört mililitrelik bir cam şişede bir UV vis absorpsiyon spektrumundan konsantrasyonu belirleyin, borat tamponunda bir mol kuantum noktasını 40.000 kez molar fazla 750 Dalton mono amino polietilen glikol ile karıştırın.

Nano kristallere belirli kimyasal işlevlerin nasıl ekleneceğine ilişkin talimatlar, yazılı prosedürde bulunabilir. Kuantum nokta çözeltisine 25.000 kez molar fazla miktarda aktive edici ajan çözeltisi ekleyin ve 30 dakika boyunca oda sıcaklığında karıştırın. Nano krysttal yüzeyini PEG ile doyurmak için bu adımı dört kez daha tekrarlayın.

Son olarak, nano kristalleri saflaştırmadan önce reaksiyonu söndürmek için 200 mikrolitre bir molar tris tamponu ekleyin Diyaliz santrifüj filtreleri veya ultrasantrifüjleme kullanılarak, elde edilen nano krizal, sıvı kromatografisi, jel elektroforezi ve floresan mikroskobu kullanılarak mono dağılım hidrodinamik boyutu ve yüzey yükü için analiz edilebilir. Burada kadmiyum selenit nano kristalleri, cıva, kadmiyum, selenit, kadion değişiminden sonra nano kristaller ve kabuk büyümesinden sonra bir çekirdek cıva kadmiyum selenit, kabuk kadmiyum, çinko sülfür nano kristalleri için temsili bir absorpsiyon ve floresan spektrumları gösterilmiştir. Çekirdek kadmiyum selenit nano kristalleri, %15'e yakın bir kuantum floresan verimine sahiptirBununla birlikte, bu verimlilik, muhtemelen yüzey atomunun bozulması yoluyla ortaya çıkan yük taşıyıcı tuzakları nedeniyle, cıva değişiminden sonra %1'in altına düşer.

İnce bir kadmiyum çinko sülfür kabuğunun büyümesi, bu verimliliği %70'in üzerine çıkarır ve bu, suya aktarıldıktan sonra büyük ölçüde korunur. Buna karşılık, cıva içermeyen çekirdek kadmiyum selenit, kabuk kadmiyum, çinko sülfür nano kristalleri, kalın bir kabuk büyütülmedikçe sudaki kuantum verimlerinin önemli bir kısmını kaybeder. Kadmiyum çinko sülfür ile kapatmanın, elektronik yük taşıyıcılarının kabuk malzemesine sızması nedeniyle spektrumları kırmızıya kaydırdığına dikkat etmek önemlidir.

Bu kayma, çekirdek kadmiyum çekirdekleri için 20 ila 30 nanometre civarındadır ve çekirdekteki cıva içeriğinin artmasıyla artar. Böylece, cıvayı çekirdek nano kristale dahil ederek, nano Krystal'ın küçük boyutu parlaklıktan ödün vermeden korunabilir. Küçük boyut, bu iletim elektron mikrografında ve çekirdek cıva, kadmiyum, selenit, kabuk kadmiyum, çinko sülfür nano kristallerinin parçacık boyutu dağılımında ortalama 3.2 artı veya eksi 0.6 nanometre çap göstererek gösterilmiştir.

Suya iki aşamalı bir faz transferinin kullanılması, kümeleri çıkarmak ve boyut dışlamasını toplamak için daha fazla boyut sıralaması gerektirmeyen homojen bir nano kristal popülasyonu elde etmek için kritik öneme sahiptir. Burada gösterilen kromatogram, boyutun con albumininkine benzer olduğunu doğrular. 75 kilodaltonda ve 750 Dalton amino PEG ile modifikasyondan sonra, boyut bir IgG antikorununkine benzer şekilde sadece 12 nanometreye çıkarılır.

PEG modifikasyonu, burada gösterilen aros jel elektroforez deneyinde onaylandığı gibi yüzey yükünü nötralize eder, kuyu bir okla işaretlenir ve elektrot polariteleri sağda gösterilir, bu da konjugasyondan önce nano kristallerin onik parçacıklar olarak göç ettiğini ve pegile nano kristallerin elektrostatik olarak nötr olduğunu gösterir. Burada, bir cam kapak kaymasında biriktirilen ve 545 nanometre görünür ışıkla uyarılan bu nano kristallerin bir epi floresan mikrografı gösterilmektedir. Bu nano kristaller, elektron çarpan bir CCD kamera ile saniyede 30 kare hızında tek molekül seviyesinde kolayca gözlemlenir.

Bu grafik, her karede gözlemlenen floresan parçacıklarının sayısının, sürekli uyarma ile zaman içinde dalgalandığını göstermektedir. Bu, yanıp sönme ve fotoğraf bozulmasının bir kombinasyonundan kaynaklanmaktadır. Oksidatif foto bozulma yavaş yavaş belirginleşmeden önce ilk yedi dakika boyunca göz kırpma hakimdir.

Bu videoyu izledikten sonra, kuantum noktalarının kimyasal olarak nasıl sentezleneceğini, sulu tamponlara nasıl aktarılacağını ve biyogörüntüleme uygulamaları için nasıl değiştirileceğini iyi anlamış olmalısınız. Kadyum ve cıva içeren reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve kişisel maruziyeti önlemek için ekstra önlemler alınması gerektiğini unutmayın.