Tek molekül Görüntüleme için kompakt Kuantum Noktaları

Bu prosedürün genel amacı, tek molekül görüntülemede kullanılmak üzere optimize edilmiş parlaklık ve stabiliteye sahip, aynı zamanda boyutu ve spesifik olmayan bağlanması minimize edilmiş floresan kuantum noktaları hazırlamaktır. Bu işlem, öncelikle küçük kadmiyum selenür kuantum nokta çekirdekleri hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, floresansı kırmızı spektruma kaydırmak ve parlaklığı artırmak için bu çekirdeklerin cıva ile alaşımlanmasıdır.

Ardından, floresan emisyonlarını stabilize etmek için nanokristaller üzerinde ince bir alaşım kabuğu büyütülür. Son adım, bu partiküllerin, biyolojik olarak inert polietilen glikol ile modifiye edilebilen çok dişli bir polimer kullanılarak organik çözücülerden sulu tamponlara aktarılmasıdır. Son olarak, bu partiküllerin biyolojide tek molekül floresan görüntüleme için oldukça uygun olan parlak floresan, kompakt bir hidrodinamik boyut ve nötr elektrostatik yük özelliklerine sahip olduğunu göstermek için floresan spektrometrisi, jel kromatografisi ve jel elektroforezi kullanılır.

Bu kuantum noktalarının mevcut ticari materyallere göre temel avantajı, bu nanopartiküllerin hidrodinamik boyutlarının önemli ölçüde azalmış olmasıdır. Daha küçük kuantum noktaları; azalmış floresan yoğunluğu, azalmış floresan stabilitesi ve sadece mavi spektrumda floresan verme gibi olumsuz etkilenmelere rağmen, biz bu etkileri bir cıva katyon değişim süreci kullanarak dengeledik. Bu nanokristaller, kalabalık biyolojik ortamlarda tekil biyomoleküllerin dinamik görüntülenmesine olanak sağlayarak biyofizik ve hücresel sinyalizasyon alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Başlangıç için, 50 mililitrelik üç boyunlu bir balona selenyum ekleyerek, balonun içini yüksek vakum altında boşaltıp hava içermeyen koşullarda bir sch shank hattı kullanarak argonla doldurup, top içerisinde 0,4 molar selenyum çözeltisi hazırlayın. 10 mililitre top ekleyin ve berrak, renksiz bir çözelti elde etmek için bir saat boyunca karıştırarak 100 °C'ye ısıtın.

Çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun ve balonu kenara alın. Ayrıca, yazılı protokolde belirtilen miktarları kullanarak 250 mililitrelik üç boyunlu bir balonda kadmiyum oksit, TDPA ve ODE çözeltisi hazırlayın. Bu videoya eşlik eden işlemde, karıştırırken çözeltiyi bir vakum hattı kullanarak boşaltın.

Sıcaklığı 100 °C'ye yükseltin ve 15 dakika boyunca vakum yapmaya devam edin. Argon gazı altında düşük kaynama noktalı safsızlıkları gidermek için, kadmiyum oksidi tamamen çözmek amacıyla karışımı bir saat boyunca 300 °C'ye kadar ısıtın. Çözelti kırmızımsı bir renkten berrak ve renksiz bir hale gelecektir; ardından çözeltiyi oda sıcaklığına kadar soğutun.

Ardından, kadmiyum çözeltisine HDA ekleyin, 70 °C'ye ısıtın ve havasını boşaltın. Sabit bir basınca ulaşıldığında, sıcaklığı artırın ve çözeltiyi 30 dakika boyunca reflükse tabi tutun. Schlenk hattı valfini inert gaza getirin ve termokuplu doğrudan çözeltinin içine yerleştirin.

Havasız koşullar altında, kadmiyum çözeltisine DPP ekleyin ve sıcaklığı 310 °C'ye yükseltin. Ardından, 16 gauge bir iğneye bağlı tek kullanımlık plastik şırınga kullanarak 0,4 molar üst selenyum çözeltisinden 7,5 mL alın. Sıcaklık 310 °C'de dengeye ulaştığında, sıcaklık kontrol cihazını 0 °C'ye ayarlayın ve üst selenyum çözeltisini hızla doğrudan kadmiyum çözeltisine enjekte edin.

Çözelti renksizden sarıya ve turuncuya dönecek, sıcaklık hızla düşecek ve ardından tekrar yaklaşık 280 °C'ye çıkacaktır. Bu prosedürdeki en zor adım, şırıngadaki hacmin tamamını kadmiyum çözeltisine mümkün olduğunca hızlı bir şekilde enjekte etmektir. Bu işlem, partiküllerin homojen şekilde çekirdeklenmesini sağlar.

Bir dakikalık reaksiyonun ardından, balonu ısıtıcı mantodan çıkarın ve sıcaklık 200 °C'nin altına düşene kadar bir hava akımıyla hızla soğutun. Sıcaklık yaklaşık 40 °C'ye ulaştığında, 30 mL heksan ile seyreltin; geri kalan kadmiyum öncül maddesinin çoğu çözeltiden çökecektir. Bu çökeleği santrifüjleme yoluyla uzaklaştırın.

Altı adet 50 mililitrelik polipropilen konik santrifüj tüpünün her birine, elde edilen ham nano Krystal çözeltisinden 12 mililitre ekleyerek seyreltin. Aynı parametrelerle santrifüjleme işleminin ardından, 40 mililitre aseton ile süpernatantı dikkatlice döküp atın. Ardından, nano krystal peletlerini heksan içinde çözün.

Çözeltiyi, üst fazı alacak şekilde eşit hacimde metanol ile ekstrakte edin. Bu ekstraksiyon işlemini üçüncü ekstraksiyon için iki kez daha tekrarlayın. Yaklaşık 200 micromolar konsantrasyonda saf kadmiyum selenid kuantum noktalarının konsantre bir heksan çözeltisini elde etmek için metanol hacmi yaklaşık 15 mililitreye ayarlanabilir.

Bu reaksiyonun tipik verimi, çapı 2-3 nanometre olan üç mikromolar kadmiyum selenid kristalidir; nano kristal çapını ve konsantrasyonunu, yazılı prosedürde açıklandığı şekilde ultraviyole-görünür absorpsiyon spektrumunu ölçerek belirleyin. Nano kristaller, absorpsiyonu ve floresan emisyonunu kırmızıya kaydırmak için kısmen cıva ile değiştirilebilir. Bunun için, içinde manyetik karıştırıcı olan 20 mililitrelik bir cam şişede heksan ve kloroformu karıştırın, ardından kadmiyum selenid kuantum nokta çözeltisi OLA ve cıva oktanoat ekleyin. Nano kristaller saflaştırıldıktan ve konsantrasyonları yazılı prosedürde açıklandığı şekilde belirlendikten sonra, kabuk büyümesi için nano kristallerin oda sıcaklığında en az 24 saat boyunca olgunlaşmasına izin verin.

50 mililitrelik üç boyunlu balonlarda 0,1 molar kabuk öncül çözeltileri hazırlayın; kadmiyum öncülü, çinko öncülü ve kükürt öncülü çözeltilerini vakum altında bir saat boyunca geri soğutma (refluks) yaparak berrak çözeltiler elde edin, ardından üç boyunlu bir balona argon doldurun. TOPO ODE ve hazırlanan cıva kadmiyum selenür kuantum noktalarını ekleyin. Hattı kullanarak heksini oda sıcaklığında vakumla uzaklaştırın.

Sıcaklığı 100 °C'ye yükseltin ve 15 dakika boyunca geri soğutun. Hat valfini argon gazına çevirin ve termokuplu nano kristal çözeltisine yerleştirin. Sıcaklığı 120 °C'ye çıkardıktan sonra, 0,5 tek katman veya 140 µL kükürt öncül çözeltisi ekleyin ve reaksiyonun 15 dakika boyunca devam etmesini sağlayın.

Sıcaklığı 140 °C'ye çıkarın. 0.5 monotabaka veya 140 µL kadmiyum öncül çözeltisi ekleyin ve reaksiyonun 15 dakika boyunca sürmesine izin verin. Ardından reaksiyon çözeltisine 500 µL susuz OLA ekleyin.

160 °C'de 0,5 monolayer veya 220 µL kükürt öncül çözeltisi ekleyin, ardından 170 °C'de her ekleme arasında 15 dakika bekleyerek eşit miktarda çinko öncül çözeltisi ekleyin. Daha sonra 180 °C'de 15 dakikalık aralıklarla 0,25 monolayer veya 150 µL kükürt öncül çözeltisi ve çinko öncül çözeltisi ekleyin. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğutun ve bu partiküller için yeni bir sönümleme katsayısı belirleyin.

UV-vis spektrumu kullanarak, nano kristallerin sayısının değişmediği varsayımıyla, reaksiyon çözeltisini ham bir karışım olarak dondurucuda saklayın. Bu aşamada nano kristaller; elektron mikroskopisi, UV-vis absorbsiyon spektroskopisi ve floresan spektroskopisi kullanılarak karakterize edilebilir. Purify edilmiş çekirdek-kabuk kuantum noktalarını 50 mililitrelik üç boyunlu bir balona ekleyin ve yüksek vakum altında heksanı uzaklaştırın.

Kuru bir film elde etmek için balonu argon ile doldurun. Nanopartikül filmine susuz purin ekleyin ve bulamacı bir ila iki saat içinde 80 °C'ye kadar ısıtın. Nanopartiküller tamamen çözünecektir.

Çözeltiye bir mililitre 1 M gliserol ekleyin ve 80 °C'de iki saat boyunca karıştırın. Çözelti oda sıcaklığına soğuduktan sonra, tiyogliserolü deprotonize etmek için 0,5 mililitre trietilamin ekleyin ve 30 dakika boyunca karıştırın. Polar nanokristallerin bu çözücü karışımındaki düşük çözünürlüğü nedeniyle, trietilamin eklemesinden sonra çözelti bulanıklaşabilir.

Kuantum nokta çözeltisini, 20 mililitre heksan ve 20 mililitre aseton karışımı içeren 50 mililitrelik konik santrifüj tüpüne aktarın ve iyice karıştırın. Çökelen nanokristalleri santrifüjleme yoluyla izole edin, ardından pellet'i aseton ile yıkayın, kuantum nokta pellet'ini banyo sonikasyonu ile beş mililitre DMSO içinde çözün ve santrifüjleme ile işlemi tamamlayın. Olası agregatları gidermek için ardından UV-Vis absorbsiyon spektrumundan nanopartikül konsantrasyonunu belirleyin.

Saf kuantum nokta çözeltisi, yüzeyin hava ortamında yavaşça oksitlenebilmesi nedeniyle üç saat içinde kullanılmalıdır. Kuantum nokta çözeltisini DMSO ile 10 µM veya daha düşük konsantrasyona seyrelterek 50 mL'lik bir flaska aktarın. Karıştırırken, DMSO içinde hazırlanmış 5 mg/mL'lik seyreltik poliakrilik asit çözeltisini damla damla kuantum nokta çözeltisine ekleyin ve çözeltiyi oda sıcaklığında beş dakika boyunca gazdan arındırın.

Kuantum nokta polimer çözeltisini argon ile temizleyin ve 90 dakika boyunca 80 °C'ye ısıtın. Çözeltiyi oda sıcaklığına soğuttuktan sonra, pH 8'de 50 mM sodyum borat ekleyin (damla damla) ve 10 dakika boyunca karıştırın. Kuantum noktalarını yazılı prosedürde açıklandığı şekilde saflaştırın ve konsantrasyonu UV-vis absorpsiyon spektrumundan belirleyin; karıştırma çubuğu içeren 4 mL'lik bir cam şişede, 1 mol kuantum noktayı borat tamponu içerisinde 40.000 kat molar fazla 750 Dalton mono amino polietilen glikol ile karıştırın.

Nanokristallere belirli kimyasal fonksiyonların nasıl ekleneceğine dair talimatlar yazılı prosedürde yer almaktadır. Taze hazırlanmış aktivasyon maddesi çözeltisinden 25.000 kat molar fazlayı kuantum nokta çözeltisine hızla ekleyin ve oda sıcaklığında 30 dakika boyunca karıştırın. Nanokristal yüzeyini PEG ile doyurmak için bu adımı dört kez daha tekrarlayın.

Son olarak, nano kristalleri diyaliz santrifüj filtreleri veya ultrasantrifüj ile saflaştırmadan önce reaksiyonu durdurmak için 200 µL 1 M tris tamponu ekleyin. Elde edilen nano kristallerin monodispersite, hidrodinamik boyut ve yüzey yükü analizleri sıvı kromatografisi, jel elektroforezi ve floresan mikroskobu kullanılarak yapılabilir. Burada kadmiyum selenür nano kristalleri, cıva, kadmiyum, selenür, katyon değişimi sonrası nano kristaller ve kabuk büyümesi sonrası çekirdeği cıva kadmiyum selenür, kabuğu kadmiyum, çinko sülfür olan nano kristaller için temsili absorbsiyon ve floresan spektrumları gösterilmektedir. Çekirdek kadmiyum selenür nano kristalleri yaklaşık %15'lik bir floresan kuantum verimine sahiptir. Ancak, bu verimlilik, muhtemelen yüzey atomu bozulması yoluyla oluşan yük taşıyıcı tuzakları nedeniyle, cıva değişiminden sonra %1'in altına düşmektedir.

İnce bir kadmiyum çinko sülfür kabuğun büyütülmesi, bu verimliliği %70'in üzerine çıkarır ve bu değer suya aktarıldıktan sonra da büyük ölçüde korunur. Buna karşılık, cıva içermeyen çekirdek kadmiyum selenür, kabuk kadmiyum çinko sülfür nanokristaller, kalın bir kabuk büyütülmediği sürece sudaki kuantum verimlerinin önemli bir kısmını kaybederler. Kadmiyum çinko sülfür ile kaplamanın, elektronik yük taşıyıcılarının kabuk malzemesine sızması nedeniyle spektrumu kırmızıya kaydırdığını belirtmek önemlidir.

Bu kayma, kadmiyum çekirdekler için yaklaşık 20 ila 30 nanometredir ve çekirdekteki cıva içeriği arttıkça artar. Böylece, çekirdek nanokristale cıva dahil edilerek, parlaklıktan ödün vermeksizin nanokristalin küçük boyutu korunabilir. Küçük boyut, ortalama 3.2 ± 0.6 nanometre çap gösteren çekirdek cıva, kadmiyum, selenür, kabuk kadmiyum, çinko sülfür nanokristallerinin bu transmisyon elektron mikrografında ve partikül boyut dağılımında gösterilmektedir.

Kümeleri ve agregatları boyut dışlama yoluyla uzaklaştırmak için ek bir boyut sıralamasına ihtiyaç duymayan homojen bir nanokristal popülasyonu elde etmek için suya iki aşamalı faz transferi kullanımı kritiktir. Burada gösterilen boyut dışlama kromatogramı, boyutun konalbümininkiyle benzer olduğunu doğrulamaktadır. 75 kilodalton düzeyinde ve 750 Dalton amino PEG ile modifikasyon sonrası boyut, bir IgG antikoluna benzer şekilde sadece 12 nanometreye yükselmiştir.

Burada gösterilen agaroz jel elektroforez deneyinde doğrulandığı üzere, PEG modifikasyonu yüzey yükünü nötralize eder; kuyucuk bir okla işaretlenmiş olup elektrot polariteleri sağda belirtilmiştir; bu durum, konjugasyondan önce nanokristallerin yüklü partiküller olarak göç ettiğini ve pegillenmiş nanokristallerin elektrostatik olarak nötr olduğunu göstermektedir. Burada, bir lam üzerine yerleştirilen ve 545 nanometre görünür ışıkla uyarılan bu nanokristallerin epi-floresan mikrografı görülmektedir. Bu nanokristaller, elektron çarpanlı bir CCD kamera ile saniyede 30 kare hızında tek molekül düzeyinde kolaylıkla gözlemlenebilmektedir.

Bu grafik, sürekli uyarılma altında her karede gözlemlenen floresan partikül sayısının zamanla dalgalandığını göstermektedir. Bu durum, yanıp sönme (blinking) ve fotodegrasyonun birleşiminden kaynaklanmaktadır. Oksidatif fotodegrasyon yavaşça belirginleşmeden önceki ilk yedi dakika boyunca yanıp sönme baskındır.

Bu videoyu izledikten sonra, kuantum noktalarının kimyasal olarak nasıl sentezleneceği, bunların sulu tamponlara nasıl aktarılacağı ve biyogörüntüleme uygulamaları için nasıl modifiye edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Kadmiyum ve cıva içeren reaktiflerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve kişisel maruziyeti önlemek için ekstra önlemler alınması gerektiğini unutmayın.