Floresan Mikroskobu kullanılarak Nematodlar Bakteriler görselleştirme

Bu prosedürün genel amacı, nematod konakçıları içinde floresan olarak etiketlenmiş bakteriyel simbiyansı gözlemlemektir. Bu, bakterilerin önce konjugasyon yoluyla bir floresan proteini ile etiketlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, yumurtaları hasat ederek AIC nematodlarını izole etmektir.

Daha sonra, AIC nematodları, nematod konakçısı içindeki bakteriyel simbiantın doğal ilişkisine izin vermek için floresan olarak etiketlenmiş bakteriyel simbiantları ile kombinasyon halinde büyütülür. Ve nematod popülasyonu içindeki bu ilişkinin sıklığı floresan mikroskobu ile belirlenebilir. Bu yöntem, bakterilerin konakçıları içinde nerede lokalize olduğu ve bir konakçı popülasyonu boyunca bakteri taşıyıcılığının dağılımı gibi simbiyoz alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Bakteri suşlarının, alt kültürün, donör alıcısının ve yardımcı suşların, bir ila 100 kültür / ortam oranında antibiyotik içermeyen besin açısından zengin büyüme ortamına gece boyunca büyümesinden sonra, kültürleri orta log aşaması büyümesine ulaşana kadar her bir suş için uygun sıcaklıkta büyütün. Daha sonra, suşları tek bir mikro santrifüj tüpünde birleştirin ve karışık kültürleri iki dakika boyunca 17.900 G'de santrifüjleyin, süpernatanı boşaltın ve peleti 30 mikrolitre taze ortamda döndürün. Daha sonra süspansiyonu herhangi bir antibiyotik olmadan besin açısından zengin bir ortam plakasına yerleştirin ve süspansiyon kuruduğunda lekenin kurumasını bekleyin.

Plakayı, alıcı bakteri için en uygun ve varsa donör ve yardımcı için izin verilen bir sıcaklıkta gece boyunca ters çevrilmiş olarak inkübe edin. Şimdi, saf bir bakteri çizgisi kültürü, izolasyon için tek bir koloni elde etmek için seçici bir antibiyotik plakası üzerinde tek koloniler için lekeyi ve çizgiyi kazıyın. Son olarak, ortaya çıkan kolonilerin donör suşu değil, alıcı simbiant olduğundan emin olun.

Alıcıya özgü fenotiplerin varlığını tarayarak. Örneğin, cino abdi bakterileri, floresan plazmit proteinine karşılık gelen dalga boyu altında floresansı doğrulayarak plazmitin varlığı için taranan bir katalizör testi gerçekleştirilerek e coli'den ayırt edilebilir. Büyüdükten sonra, doğal bakteriyel simbiant gece boyunca 600 mikrolitre bakteri kültürünü sekiz ila 10, 10 milimetre lipit havalandırır ve daha sonra plakaları karanlıkta 25 santigrat derecede nem olmadan inkübe edin.

İki gün sonra, bakteri çimlerine 500 mikrolitre ortamda 5.000 enfektif juvenil nematod ekleyin. Plakaları üç gün daha 25 santigrat derecede inkübe ettikten sonra, 20 mikrolitre suyu bir mikroskop lamı üzerine yerleştirin. Ardından, bakteri çimlerinden az miktarda nematod kazımak için steril bir çubuk kullanın.

Nematodların yüzerek gitmesine izin vermek için çubuğu suya yerleştirin. Düşük büyütme altında bu slayta bakın. Yumurtalar ve dişiler görünüyorsa, dişiler yumurta içerdiğinde devam edin, plakaların yüzeyine birkaç mililitre su koyun, plakaları hafifçe döndürün ve ardından suyu 50 mililitrelik konik bir tüpe dökün.

Nematodlar plakalardan çıkmalı ve artık plaka yüzeyinde görünmemelidir. Nematodların tüpün dibine çökmesine izin verin, ardından tüpün üst kısmından fazla suyu sıkın ve tüpü temiz suyla doldurun. Yetişkin nematodların çökmesine izin verdikten ve fazla suyu bir kez daha pipetledikten sonra, konik tüpleri yumurta çözeltisi ile doldurun.

Daha sonra tüpleri oda sıcaklığında tam olarak 10 dakika boyunca hafifçe ters çevirerek karıştırın. Çalkaladıktan hemen sonra konik tüpleri 1.250 Gs ve oda sıcaklığında tam olarak 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı hızlı bir şekilde boşaltın, peleti pipetleyerek yumurta çözeltisi ile yeniden süspanse edin ve konik tüpü taze yumurta çözeltisi ile doldurun.

Tüpü üç ila beş kez ters çevirerek ve ardından yumurtaları hemen peletledikten ve süpernatanı az önce gösterildiği gibi boşalttıktan sonra yumurta süspansiyonunu iyice karıştırın. Peletleri pipetleme ile kadın düşmanlığı, et suyu veya LB'de yeniden süspanse edin ve ardından yumurta süspansiyonunu 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Şimdi 15 mililitrelik tüpü lb ile doldurun, az önce gösterildiği gibi aynı hızlı adım tekniğini kullanarak yumurtaları et suyunda üç kez yıkayın ve ardından yeniden süspanse edilmiş P nematod yumurtalarını mikrolitre başına en az 10 yumurtaya seyreltin.

Yumurtaları, beş mililitre LB ve kolonize bakterilere karşı antibiyotik içeren altı santimetrelik bir Petri kabına aktarın. Plaka, gece boyunca büyüme ve floresan bakteri seçiminden sonra dört güne kadar perfil içinde sarılmış olarak saklanabilir. 600 mikrolitre bakteri kültürünü 10 milimetre lipid havalandırıcıya yaymak ve kültürü 25 santigrat derecede inkübe etmek için steril bir çubuk kullanın.

İki gün sonra, her bir lipit plakasına 500 ila 5.000 nematod yumurtası dağıtın. Plaka saklanmışsa, yumurtaları önceden hazırlanmış bakteri çimlerine aşılamadan önce en az bir kez gösterildiği gibi 15 mililitre LB içinde yıkayın. Daha sonra, nematod bakteri co kültürlerini karanlıkta, 25 santigrat derecede nemsiz olarak, enfektif yavrular plakanın kenarında bulanık beyaz bir halka olarak görünene kadar inkübe edin.

Enfektif gençler gözlendiğinde. Lipid agar plakasının kapağını çıkarın ve plakanın altını 100 milimetreye 20 milimetrelik boş bir Petri kabının dibine yerleştirin. Daha sonra Petri kabını, daha küçük plakanın yüksekliğinin yaklaşık yarısına kadar gelecek kadar su ile doldurun ve döl enfektif yavrular suya çıkana kadar su tutucuyu kuluçkaya

Nematodları sudan veya istenen yaşam evresinde uygun bakteri çiminden topladıktan sonra, birkaç tane ole tanesini 30 mikrolitre suda ve her 50 mikrolitre nematod numunesi için bu felç edici ajanın bir ila iki mikrolitresinde çözün. Daha sonra felçli nematod numunesinin yaklaşık 20 ila 30 mikrolitresini bir mikroskop lamına aktarın ve numunenin üzerine bir kapak fişi yerleştirin. Nematodların görüş alanında olduğundan emin olmak için ışık mikroskobu kullanarak nematodları görüntüleyin.

Bakteri lokalizasyonunu tanımlamak. Işık mikroskobu ayarına ek olarak nematodları floresan mikroskobu altında fotoğraflayın ve ardından görüntüleri üst üste bindirin. Bakterileri bulmak için nematodun birkaç büyütmesini ve görünümünü denemek gerekebilir.

İki ortamdan gelen nematodların bir popülasyonu sayıldı ve bakteriyel simbiant tarafından kolonizasyon için puanlandı. Sağlam istatistikler için, tabloda görüldüğü gibi her kategoriye en az 30 tane olmak üzere numune başına en az 100 nematod saymak en iyisidir. Bu nematodlar, lipid agar üzerinde büyütüldüğünde yaklaşık %14.6 ve karaciğer, böbrek agar üzerinde büyütüldüğünde %68.6 düzeyinde kolonize olur.

Diğer nematod ve bakteri türlerinin farklı kolonizasyon seviyelerine sahip olduğu gösterilmiştir. Bu şema, Steiner NEMA dişilerinin genel görünümünü göstermektedir. İç kısım, 20 x büyütmede bir S fot grafik dişisinin diferansiyel girişim kontrast görüntüsünü gösterir.

İç kısımdaki siyah ok vulvayı, beyaz oklar ise görünür yumurtaları gösterir. Bu görüntü, 40 x büyütmede gelişmiş ancak yumurtadan çıkmamış bir volt nematod yumurtasını göstermektedir ve s Volta nematodlarından izole edilen bu yumurtalar 10 x büyütme altında görüntülenmiştir. Burada, Xeno aptus bakterileri ile ilişkili Steiner Nima nematodlarının temsili mikroskop görüntüleri bu ilk görüntüde gösterilmektedir.

Alvin'in nematodları, bu kompozit görüntüyü oluşturmak için GFP'yi ifade eden bakteriyel simbiant expoları ile ilişkilendirildi. Bir faz kontrast görüntüsü, bir floresan görüntü ile kaplandı. Ok, enfektif juvenil nematod içinde bulunan bakterileri gösterir.

Bu görüntü, X nla eksprese eden GFP'ye sahip bir S carpa capsi juvenil nematodunu göstermektedir. Görüntü, önceki görüntüye benzer şekilde oluşturulmuştur ve nematod bağırsak lümeni boyunca lokalize yeşil çubuklar olarak görselleştirilen yeşil floresan proteini etiketli bakterilerle genç nematodu tasvir etmektedir. Tarif edilen prosedüre ek olarak, nematod konakçı ile ilişkilendirilmeden önce bakteriyel simbiantın genetik manipülasyonu gibi diğer yöntemler, konakçı mikrop ilişkisi için gerekli moleküler mekanizmaların neler olduğu gibi ek soruları yanıtlamak için dahil edilebilir.