Antijen Özgül Düzenleme için Trans-vivo Gecikmeli Tip Aşırı Duyarlılık Testi

Bu prosedürün genel amacı, insan deneklerde hem pro hem de anti-inflamatuar antijene özgü yanıtları izlemek için trans vivo DTH testini kullanmaktır. İlk olarak, periferik kan mononükleer hücrelerini insan deneğin periferik kanından izole edin. Ardından PBMC hazırlığını PBS ile karıştırın.

Antijeni geri çağırın, antijeni test edin ve antijeni test edin, artı antijeni geri çağırın. Footpad prem ölçümlerine devam edin ve hazırlanan karışımları kızak farelerine enjekte edin. Ayak pedleri ölçümleri 24 saat sonra tekrarlar. Üç.

DTH yanıtlarının kesin kalıpları mümkündür, düzenleyici, düzenleyici olmayan ve hassastır. Trans vivo gecikmeli tip aşırı duyarlılık testi, antijen kaynağının nakil donörünün hücreleri olduğu allo reaksiyon yanıtları gibi klinik parametreleri belirlemek için uygulanabilir. Bu tekniğin mevcut in vitro yöntemlere göre temel avantajı, tek bir test sistemi kullanılarak allo antijenlerine, oto antijenlere veya tümör antijenlerine karşı hem pro-inflamatuar hem de düzenleyici yanıtların kolayca tespit edilebilmesidir.

Laboratuvarımda bir araştırmacı olan Egon şimdi prosedürü gösterecek Trombosit aktivasyonunu önlemek için asit sitrat dekstroz tüplerinde toplanan taze insan periferik kanını kullanarak. Standart yöntemlere göre lenfosit ayırma ortamı kullanarak PBMC'yi izole edin. Kirletici trombositleri çıkarmak için PBMC preparatını PBS ile yıkayın.

Gözle görülür bir kırmızı kan hücresi kontaminasyonu varsa, bir CK lizis tamponu kullanarak kırmızı hücrelerin parçalanmasını gerçekleştirin. Ardından PBS Resus ile iki yıkama daha yapın. Allo antijeni için PBMC'yi PBS'de mililitre başına 10 milyon PBMC konsantrasyonunda askıya alın.

Daha önce gösterilen prosedürü kullanarak donör periferik kanından izole edilen P BMC'leri ile başlayın. Sonra diriltmek. PBS'deki donör hücreleri mililitre başına 120 milyon hücre konsantrasyonunda askıya alın ve protein bozulmasını önlemek için bir mikromolar PMSF ekleyin.

Şimdi iki milimetrelik bir prob sonica ile yedi adet bir saniyelik darbe kullanarak hücre süspansiyonunu sonikleştirin. Hemo sitometre kullanarak. Hücrelerin %90'ından fazlasının bozulduğunu doğrulayın.

Daha sonra, karışımı 14.000 RPM'de dört santigrat derecede 20 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice iki güvenli kilit tüpüne aktarın ve her enjeksiyon için standart yöntemlerle protein konsantrasyonunu belirleyin. Aliquot yedi kez 10 ila altıncı P BMC'leri iki mililitreye.

Güvenli kilit tüpleri, hücreleri santrifüjleme ile peletler. İlk olarak, PBMC'nin negatif kontrol süspansiyonunu 35 mikrolitre PBS'de hazırlayın. Daha sonra pozitif kontrol için 25 mikrolitre geri çağırma antijeni, tetanoz, toksoid, dipteri, toksoid ekleyin ve enjeksiyon hacmini PBS ile 35 mikrolitreye ayarlayın.

Donöre özgü yanıtı değerlendirmek için deneysel tasarıma göre, hücre peletini toplam 35 mikrolitre hacim için 10 mikrolitre donör antijen artı 25 mikrolitre PBS içinde yeniden süspanse edin. Deneysel donör antijen spesifik düzenlemesini değerlendirmek için, resus, 10 mikrolitre donör antijen ve 25 mikrolitre geri çağırma TT DT antijeni ekleyerek hücre peletini 35 mikrolitrede askıya alır. Uyuşturmadan sonra, florlu kızak faresi, bir kenarı ayağın son yürüme pedine değecek şekilde bir ayak tabanının ortasına yaylı bir kumpas yerleştirir ve gösterge okuması stabilize olduğunda ölçüm bölgesini tutarlı tutmak için bir kıyaslama sağlar.

Ayak pedi enjeksiyonu için temel ayak pedi kalınlığını kaydedin. Şırıngayı, iğne ayak parmaklarına bakacak ve eğim yukarı bakacak şekilde yerleştirin. Şimdi, fare için arka ayak pedlerine her hücre süspansiyonunun deri altı enjeksiyonlarına başlayın.

Birincisi, sağ ayak pedini negatif kontrol hazırlığı ile yavaşça enjekte edin. Ardından, sol ayak pedini PBMC artı TT dt'nin pozitif kontrolü ile enjekte edin. Şimdi fareyi fare için kafesine geri koyun.

İkincisi, sağ ayak tabanına PBMC artı allo antijen ve sol ayak tabanına PBMC artı allo antijen artı TT dt enjekte edin. Enjeksiyondan yaklaşık 18 ila 24 saat sonra sızıntı olmadığından emin olun. Her fareyi flor ile uyuşturun ve ayak tabanı şişmesinin ölçümünü tekrarlayın.

Ayak pedi şişme değerini elde etmek için enjeksiyondan önce her bir ayak pedinin kalınlığını enjeksiyon sonrası değerden çıkarın. Daha sonra tedavilerden elde edilen ayak pedi şişme değerlerinden kontrol ayak pedi şişme değerini çıkararak antijene özgü net şişmeyi hesaplayın. Antijen TT DT'yi 25 çarpı 10 ila eksi dördüncü inç üzerinde veya buna eşit veya daha büyük geri çağırmak için pozitif bir kontrol yanıtı okuyan pozitif kontrolü doğrulayın.

Testin geçerli sayılması için PBS'ye arka plan yanıtı gereklidir. Daha sonra, donör antijenlerinin varlığında hatırlama tepkilerinin inhibisyonunu belirleyin. Bu deney, böbrek nakli alıcılarını donör antijen spesifik yanıtı ve regülasyon açısından değerlendirir.

Transplant alıcılarında düzenleyici, düzenleyici olmayan ve duyarlı olmak üzere üç ana gecikmiş tip aşırı duyarlılık paterni vardır. Tüm hastalar, hatırlama antijeni tt'nin pozitif kontrolüne güçlü bir şekilde yanıt verdi. 62 numaralı hasta, donör antijenine zayıf bir yanıt ve donör antijen varlığında antijen yanıtını hatırlamak için belirgin bir bağlantılı baskılanma ile karakterize edilen düzenleyici paterni göstermektedir.

Bu, organ allogreft toleransı ile ilişkili olduğu bulunan paterndir. 48 numaralı hasta, donöre zayıf bir yanıt özelliğine sahip, ancak bağlantılı bir baskılama olmayan, düzenleyici olmayan bir model sergilemektedir. Bu patern, immünosupresif ilaçlar alan hastalarda sıklıkla gözlenmiştir.

Sekiz numaralı hasta, donör antijenine yüksek yanıt ile karakterize edilen ve bağlantılı baskılanma olmayan donör duyarlı paterni sergiler. Bu yanıt greft reddi ile ilişkilidir. Klinik vaka çalışmalarında, gözlemsel bir çalışmaya kayıtlı deneklerden alınan P BMC'ler, klinik toleransta donöre özgü düzenlemenin rolünü değerlendirmek için donöre özgü dolaylı yol, T efektörü ve T düzenleyici yanıtları için test edildi.

Donör antijenlerine dolaylı tektor yanıtları, kayıt grupları arasında belirgin bir spektrum ortaya koymaktadır. Hastanın klinik durumu toleranslı olanlardan kronik olarak reddedenlere doğru hareket ettikçe ayak tabanı şişmesi artar. Burada, bağlantılı baskılama testi, T düzenleyici yanıtının anti donör dolaylı yolunu ölçer.

Bu veriler, en toleranslı hastalardan orta ila en az toleranslı kronik olarak reddeden hastalara kadar değişen düzenleyici yanıtlarda bir azalma olduğunu göstermektedir. Birlikte ele alındığında. Trans vivo DTH testi ile ölçülen immün regülasyon, renal allogreft kabulü için önemli bir mekanizma gibi görünmektedir.

Umut verici bir alan, otoimmünitenin izlenmesinde TDTH testinin uygulanmasıdır. Bronşiolit OBL sendromunun patolojik sürecinde kollajen tip beşin rolü üzerine yaptığımız çalışma, BOS gelişiminin en yüksek rölatif riskinin kollajen ile pozitif yanıt veren hastalarda gözlendiğini ortaya koymuştur. Akciğer nakli alıcılarından beş pbmc, ancak sağlıklı kontrollerden veya kollajenden değil.

Dört reaktif iyi mera sendromu: Böbrek nakli sonrası hastalar sıklıkla kollajen beş reaktifti. TDTH testi, kanser hastalarından tümör spesifik antijenlere pbmc'nin reaktivitesini test etmek için de kullanılabilir. Örneğin, prostat kanseri hastalarında PAP'a özgü T düzenleyici hücrelerin varlığı, PAP antijeni ile aşılamaya yanıtı sınırlayabilir.

TRANSVAAL DTH testi, transplant kanseri ve otoimmün hastalarda hücre aracılı immün yanıtların değerlendirilmesinde klinik uygulaması olan yeni bir tanı testidir. Değerlidir, çünkü sadece t efektör geri çağırma yanıtlarının izlenmesinde yararlı olmakla kalmaz, aynı zamanda T düzenleyici yanıtları tespit etmek için de kullanılabilir, çünkü etki veya düzenleyici T hücrelerini tespit etmek için belirli bir sitokin ölçümüne dayanmaz. Çok esnektir ve geniş çapta uygulanabilir.