Name: Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Keşfedin, Danio rerio embriyolarında Kupffer kesesi gen fonksiyonunu modüle etme ve floresan boncuklarla asimetrik akışkan dinamiğini analiz etme yöntemini. Bu teknik sol-sağ desenlemeyi anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz mükemmel laboratuvar desteği ve zebrafish bakımı için Fiona Foley ederim. Bu eser bir GW AHA predoctoral dostluk (11PRE5730027) ve HJY (R01HL66292) ve JDA (R01HL095690) için NHLBI hibe desteklenmiştir.

Sahne Özgü Zebra balığı embriyo Enjeksiyonlar genel bakış Bir hedef mRNA bağlamak ve bu transkript protein ekspresyonu bozmak antisens oligonükleotidler morfolino (MO), yaygın çalışmalar zebrafish 13,14 içinde (-kaybı fonksiyonu) gen devirme kullanılmaktadır. Gene Araçlar, LLC floresan mikroskopi kullanılarak enjekte edilen embriyolar MO tespit carboxyfluorescein (yeşil floresans yayar) veya lissamine (kırmızı floresans yayar) biriyle etiketlenmiş MOs sunmaktadır. Zebrafish farklı gelişim aşamalarında sarısı hücre içine MO enjekte ederek, bunun embriyo belirli bölümlerinde (Şekil 1A-F) MO sunmak mümkündür. MO 1-4 hücreli aşamasında (0-1 hpf) 32-hücreli aşamada 15 küresel knockdown kolaylaştırmak kadar devam sarısı ile bağlantıları aracılığıyla tüm embriyonik hücreler (Şekil 1A, D, D &#39;) girer arasındaki sarısı içine enjekte. MO midblast sırasında sarısı içine enjekteula aşamaları (2.5-3 hpf) özellikle DFC / KV hücre soyu 12, diğer çoğu embriyonik hücre soylarının girmeden sitoplazmik köprüler 8 ve demonte gen işlevi aracılığıyla olasılıkla DFCS (Şekil 1B, D, E &#39;) atalarıdır girebilirsiniz . Gen fonksiyonu DFC / KV ya da yumurta sarısı 12,16 de gerekli olup olmadığını test etmek için önemli bir kontrol olarak, kubbe sonra% 30 epiboly aşamaları (~ 4.5 HPF) arasına enjekte edilerek yumurta sarısı hücreye MO kısıtlamak için de mümkündür Tüm sitoplazmik köprüler (Şekil 1C, F, F &#39;) kapattık. Bu enjeksiyonlar DFC / KV hücreleri 17-24 gen fonksiyonunu analiz etmek için birlikte kullanılmıştır. KV akışkan akışı değerlendirmek için, floresan mikroboncukları 6-10 somite aşamaları (12-14 hpf) ve hemen ardından videomicroscopy (Şekil 1G-J) kullanılarak görüntülendi. Arasındaki KV lümen içine enjekte edilir Microbeads kırmızı veya yeşil floresan (veya her ikisi) yayarlar mevcuttur, bu yüzden farklı kullanmak mümkündürgörüntü floresan mikroboncukları ve MO için kanalları. 1. Morpholinos evresi özel Enjeksiyon (MO) Zebrafish embriyolar içine MO enjeksiyon daha önce 25,26 kanıtlanmıştır. Burada, kısaca sahne özgü MO enjeksiyonları açıklar. Tüm enjeksiyonlar sonrasında embriyolar bir Petri kabı aktarılır ve 28.5 de inkübe ° C <ol><li> Küresel MO enjeksiyonu: hemen döllenmeden sonra embriyolar toplayın ve bir enjeksiyon plaka içine yerleştirin. Bir kılcal iğne içine floresan MO yükleyin ve (örneğin, Harvard Apparatus PLI-90 Pico-enjektör) bir mikroenjektör üzerine iğne monte. Iğne ucu kırın ve 25,26 açıklandığı gibi 1 nl bir hacme sahip bir enjeksiyon damla oluşturmak için enjeksiyon ayarları (basınç ve / veya zaman) ayarlamak. Diseksiyon stereomikroskopta kullanarak, (Şekil 1A) sarısı içine MO 1 nl enjekte Deneme başına ≥ 50 embriyo. 4 hücreli erkeklere göre enjeksiyonları tamamlamak için hızlı çalışıne. </li><li> DFC-hedefli MO enjeksiyon: 28.5 hemen döllenmeden sonra embriyolar toplayın ve inkübe ° C Embriyoların 256 hücreli evre (~ 2.5 hpf) ulaştığımda hızlı bir enjeksiyon plaka içine yerleştirin ve ardından (Şekil 256-hücre ve 1.000-hücre aşamaları arasındaki ≥ 100 embriyo sarısı içine floresan MO 1 nl enjekte 1B). </li><li> Yolk hedefli MO enjeksiyon: 28.5 hemen döllenme ve inkübe sonra embriyolar toplayın ° C. Kubbe evre (~ 4 hpf) At, bir enjeksiyon plaka embriyolar yüklemek ve ardından kubbe ve% 30 epiboly aşamaları (Şekil 1C) arasındaki ≥ 100 embriyo sarısı floresan MO 1 nl enjekte. </li></ol> 2. Analiz için Injected Embriyolar seçme <ol><li> MO embriyolar (8 hpf)% 75-epiboly aşamaya enjekte zaman, floresan MO dağıtımı için bir floresan mikroskop altında döllenmemiş ve ölü embriyolar kaldırmak ve sonra ekran canlı embriyolarının. Sonra allow embriyolar 28.5 geliştirmek için seçilen ° C. <ol><li> Küresel MO enjeksiyonları için, eşit, embriyonik hücreler (; Şekil 2A Şekil 1D) boyunca floresans dağıttık embriyolar seçin. </li><li> DFC-hedefli MO enjeksiyonları için, floresan MO sarısı boyunca yayılır ve dorsal blastoderm marjı (DFCS) (; Şekil 2B Şekil 1E) konsantre görünürse hangi embriyolar seçin. Bu aşamada, bu temel sarısında parlak floresan dolayı floresan DFCS görselleştirmek için zor olabilir. Floresan MO DFCS dışında embriyonik hücreler dahil ya kalır enjeksiyon yerinde (Şekil 2B) de araya getirdi hangi embriyoların dışlamak için dikkatli olun. </li><li> Sarısı hedefli MO enjeksiyonları için, MO floresans eşit sarısı dağılmış ve herhangi bir embriyonik hücreler (; Şekil 2C Şekil 1F) görülmez olduğu embriyolar seçin. Yine, floresan MO kalır hangi embriyolar kaldırmakenjeksiyon yerinde toplanır. </li></ol></li><li> 2-4-somite aşamaları (~ 11 hpf) arasında, ekran embriyoların yüksek büyütme kullanarak bir floresan mikroskop altında ikinci kez. Ardından seçilen embriyolar 28.5 geliştirmek için izin ° C <ol><li> Küresel MO enjeksiyonları için seçilen embriyolar MO floresans eşit KV ve tüm embriyonik hücreler (; Şekil 2E Şekil 1D &#39;) dağıtılır olmasını sağlamak. </li><li> DFC-hedefli MO enjeksiyonları için, dikkatlice MO sadece KV hücrelerinde floresans ve yumurta sarısı (Şekil 1E &#39;) sahip embriyolar seçin. 27, MO başarıyla KV hücreleri (Şekil 2F) teslim edildiği embriyoların belirlenmesinde yardımcı olabilir: örneğin Tg gibi KV hücrelerde ifade GFP (d2EGFP Dusp6) olduğunu Transgenik embriyolar. KV hücreler diğer embriyonik hücreler, MO floresan ile embriyolar atın. </li><li> Sarısı hedefli MO enjeksiyonlar için, sarısı (Şekil 1F &#39;münhasıran MO floresans sahip embriyolar seçin: Şekil2G). </li></ol></li></ol> 3. KV Akışkan Akışı Analiz için Montaj embriyolar <ol><li> Küresel MO KV asimetrik akış analiz etmek, MO veya sarısı hedefli MO enjekte edilen embriyolar DFC-hedefli, dikkatle dechorionate ~ keskin forseps ile 4-6 somite aşamaları (~ 11-12 hpf) arasında 20 embriyo. </li><li> 42 kuru bir banyo içinde bir sıvı olarak muhafaza edilmesi 5 ml tüpler içine ° C&#39;de% 1 düşük erime noktalı agaroz ve kısım 50 ml hazırlanması </li><li> Bir cam depresyon slayt (Birleşik Bilimsel Malzemeleri A.Ş.) bir embriyo transferi ve mümkün olduğunca fazla su çıkarmak. Sadece (çok agaroz sonraki görüntüleme ile karışabilir) embriyo örtecek kadar ılık% 1 düşük erime noktası agaroz ekleyerek embriyo hareketsiz. Agaroz katılaşır gibi, bu embriyo konumlandırmak için forseps kullanın KV (Şekil 1H) (dorsal görünümü) kadar karşı karşıya. Slayt başına bir embriyo ile 10 embriyolar monte edin. Sonraki adımda tüm enjeksiyonlar compl sağlamak için hızlı bir şekilde çalışın10 somite aşaması (14 hpf) tarafından eted. </li></ol> 4. KV içine Floresan mikroboncuk Enjeksiyon <ol><li> 1.5 ml Eppendorf tüp içinde steril su içinde 1:50 Multifuorescent 0.5 mikron çaplı Mikroküreler (Polysciences, Inc) Fluoresbrite seyreltin. </li><li> Tüp dokunarak iyice mikroboncuk 1:50 seyreltme karıştırın ve kılcal iğne içine 3 ul yükleyin. MO enjeksiyonları (örn. Harvard Apparatus PLI-90 Pico-enjektör) için kullanılan aynı mikroenjektör kullanarak, forseps ile iğne ucu kırmak ve olası en küçük (&lt;0.5 nl) enjeksiyonu damla oluşturmak için enjeksiyon ayarlarını. </li><li> Diseksiyon mikroskobu altında, ilk monte embriyonun KV lümenli iğne hizalayın. Lümenine iğne takın ve boncuklar küçük hacimli (&lt;0.5 nl) (Şekil 1G) enjekte. Küçük bir iğne ucu ve küçük bir enjeksiyon hacmi zarar KV önlemek için kritik öneme sahiptir. </li><li> Tüm monte embriyolar enjekte edilir. Bir embriyo injecte olmuştur kezd, steril bir su damlası kurumasını önlemek için agaroz üzerine ilave edilebilir. Enjeksiyonlar sırasında, boncuklar sık ​​iğne açılış engel olacaktır. Bu iğne ucu yeniden kırma ve mikroenjeksiyon aparatı modüle basınç ya da zaman ayarı ile enjeksiyon hacmi ayarlanması gerekir. Bu enjeksiyon sırasında önemli ölçüde zarar için yeterli künt hale gelirse iğneyi değiştirin. </li><li> Ekranı dik floresan bileşik mikroskop (örneğin Zeiss AxioImager M1) altında boncuk başarılı teslimat için enjekte edilen embriyolar bir 20X objektif kullanılarak. İlk olarak, KV yapı aydınlık alan aydınlatma (Şekil 1J) kullanılarak bozulmamış olup olmadığını belirlemek ve daha sonra boncuklar gözlemlemek için floresan kullanır. Boncuk bugünü ve KV lümeni içinde hareket olduğu embriyolar seçin. KV hasar veya KV hiçbir yüzen boncuklar ile embriyolar atın. Bu KV özledim ve yakınlardaki doku veya altta yatan sarısı boncuk teslim etmek kolaydır. Montaj ano, başarısız olursa10 embriyolar ther ve enjeksiyon işlemi tekrarlayın. </li></ol> 5. KV Akışkanın Görselleştirme ve Analiz <ol><li> KV içinde boncuklar ile seçilen her embriyo için agaroz kapağı ve sonra 63X su daldırma objektif (Şekil 1I) kullanarak dik floresan bileşik mikroskop altında KV gözlemlemek için steril bir damla su ekleyin. Alternatif olarak, bir lamel olmayan su daldırma hedef ve / veya ters mikroskop ile birlikte kullanım için de uygulanabilir. </li><li> 10 sn film kaydetmek için (örn. Zeiss AxioCamHSm) mikroskop üzerine monte edilmiş yüksek hızlı kamera kullanın. Bir aydınlık veya diferansiyel girişim kontrast (DIC) kanalı kullanılarak floresan kanal (yaklaşık 70 kare / sn) ve KV lümen kullanarak boncuklar hem kaydedin. </li><li> Zamanla tüm boncuk hareketleri görselleştirmek için, ImageJ yazılım (ücretsiz indir içine floresan boncuk film almak <a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/" target="_blank">http://rsb.info.nih.gov/ij/</a> ) birnd filmde tüm floresan sinyallerin maksimum projeksiyon oluşturun. ImageJ yılında maksimum projeksiyon gerçekleştirmek için, tıklayın &quot;Görüntü → Yığınları → Z projesi.&quot; &quot;Z projesi&quot; penceresinde, &quot;Max yoğunluğu&quot; projeksiyon tipi ile tüm dilimleri proje. Bu görüntü boncukları (Şekil 3A-B) görüntülü edildiği KV bir DIC görüntü üzerine yerleştirilebilir. </li><li> Bireysel boncuk hareketleri ImageJ kullanılarak izlenebilir. Bir eklenti (&quot;Manuel İzleme&quot;) indirilebilir <a href="http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html" target="_blank">http://rsbweb.nih.gov/ij/plugins/track/track.html</a> . ImageJ yılında floresan boncuk film açın ve Manuel İzleme işlevini çalıştırın. Manuel Takibi penceresinde, &quot;zaman aralıkları&quot; ve &quot;x / y kalibrasyon&quot; için &quot;show parametreleri&quot; ve giriş parametrelerini kontrol edin. Elle ≥ 50 kare için filmin odak düzlemi kalır boncuk seçin ve ardından embriyo başına ≥ 5 boncuk izleyebilirsiniz. Her boncuk yolu ve hızı inci tarafından oluşturulane yazılımı (Şekil 3 CD). </li></ol>

<ol><li>Sutherland, M. J., Ware, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disorders+of+left-right+asymmetry%3A+heterotaxy+and+situsinversus%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+C+Semin.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Disorders of left-right asymmetry: heterotaxy and situsinversus.</a> Am. J. Med. Genet. C Semin. Med. Genet. 151C (4), 307-317 (2009).</li>
<li>Essner, J. J., Amack, J. D., Nyholm, M. K., Harris, E. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kupffer%27s+vesicle+is+a+ciliated+organ+of+asymmetry+in+the+zebrafish+embryo+that+initiates+left-right+development+of+the+brain%2C+heart+and+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kupffer's vesicle is a ciliated organ of asymmetry in the zebrafish embryo that initiates left-right development of the brain, heart and gut.</a> Development. 132 (6), 1247-1260 (2005).</li>
<li>Nonaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Randomization+of+left-right+asymmetry+due+to+loss+of+nodal+cilia+generating+leftward+flow+of+extraembryonic+fluid+in+mice+lacking+KIF3B+motor+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Randomization of left-right asymmetry due to loss of nodal cilia generating leftward flow of extraembryonic fluid in mice lacking KIF3B motor protein.</a> Cell. 95 (6), 829-837 (1998).</li>
<li>Essner, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conserved+function+for+embryonic+nodal+cilia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Conserved function for embryonic nodal cilia.</a> Nature. 418 (6893), 37-38 (2002).</li>
<li>Kramer-Zucker, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+fluid+flow+in+the+zebrafish+pronephros%2C+brain+and+Kupffer%27s+vesicle+is+required+for+normal+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven fluid flow in the zebrafish pronephros, brain and Kupffer's vesicle is required for normal organogenesis.</a> Development. 132 (8), 1907-1921 (2005).</li>
<li>Schweickert, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-driven+leftward+flow+determines+laterality+in+Xenopus%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cilia-driven leftward flow determines laterality in Xenopus.</a> Curr. Biol. 17 (1), 60-66 (2007).</li>
<li>Tabin, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+key+to+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The key to left-right asymmetry.</a> Cell. 127 (1), 27-32 (2006).</li>
<li>Cooper, M. S., D'Amico, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cluster+of+noninvolutingendocytic+cells+at+the+margin+of+the+zebrafish+blastoderm+marks+the+site+of+embryonic+shield+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">A cluster of noninvolutingendocytic cells at the margin of the zebrafish blastoderm marks the site of embryonic shield formation.</a> Dev. Biol. 180 (1), 184-198 (1996).</li>
<li>Melby, A. E., Warga, R. M., Kimmel, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+cell+fates+at+the+dorsal+margin+of+the+zebrafish+gastrula%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of cell fates at the dorsal margin of the zebrafish gastrula.</a> Development. 122 (7), 2225-2237 (1996).</li>
<li>Amack, J. D., Wang, X., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+T-box+genes+play+independent+and+cooperative+roles+to+regulate+morphogenesis+of+ciliated+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Two T-box genes play independent and cooperative roles to regulate morphogenesis of ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Dev. Biol. 310 (2), 196-210 (2007).</li>
<li>Oteiza, P., Koppen, M., Concha, M. L., Heisenberg, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+shaping+of+the+laterality+organ+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Origin and shaping of the laterality organ in zebrafish.</a> Development. 135 (16), 2807-2813 (2008).</li>
<li>Amack, J. D., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+T+box+transcription+factor+no+tail+in+ciliated+cells+controls+zebrafish+left-right+asymmetry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">The T box transcription factor no tail in ciliated cells controls zebrafish left-right asymmetry.</a> Curr. Biol. 14 (8), 685-690 (2004).</li>
<li>Nasevicius, A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effective+targeted+gene+%27knockdown%27+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Effective targeted gene 'knockdown' in zebrafish.</a> Nat. Genet. 26 (2), 216-220 (2000).</li>
<li>Bill, B. R., Petzold, A. M., Clark, K. J., Schimmenti, L. A., Ekker, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+for+morpholino+use+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">A primer for morpholino use in zebrafish.</a> Zebrafish. 6 (1), 69-77 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Law, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lineage+of+zebrafish+blastomeres.+I.+Cleavage+pattern+and+cytoplasmic+bridges+between+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Cell lineage of zebrafish blastomeres. I. Cleavage pattern and cytoplasmic bridges between cells.</a> Dev. Biol. 108 (1), 78-85 (1985).</li>
<li>Arrington, C. B., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extra-embryonic+syndecan+2+regulates+organ+primordia+migration+and+fibrillogenesis+throughout+the+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Extra-embryonic syndecan 2 regulates organ primordia migration and fibrillogenesis throughout the zebrafish embryo.</a> Development. 136 (18), 3143-3152 (2009).</li>
<li>Caron, A., Xu, X., Lin, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2Fbeta-catenin+signaling+directly+regulates+Foxj1+expression+and+ciliogenesis+in+zebrafish+Kupffer%27s+vesicle%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Wnt/beta-catenin signaling directly regulates Foxj1 expression and ciliogenesis in zebrafish Kupffer's vesicle.</a> Development. 139 (3), 514-524 (2012).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rho+kinase+Rock2b+establishes+anteroposterior+asymmetry+of+the+ciliated+Kupffer%27s+vesicle+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Rho kinase Rock2b establishes anteroposterior asymmetry of the ciliated Kupffer's vesicle in zebrafish.</a> Development. 138 (1), 45-54 (2011).</li>
<li>Aamar, E., Dawid, I. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sox17+and+chordin+are+required+for+formation+of+Kupffer%27s+vesicle+and+left-right+asymmetry+determination+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Sox17 and chordin are required for formation of Kupffer's vesicle and left-right asymmetry determination in zebrafish.</a> Dev. Dyn. 239 (11), 2980-2988 (2010).</li>
<li>Neugebauer, J. M., Amack, J. D., Peterson, A. G., Bisgrove, B. W., Yost, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF+signalling+during+embryo+development+regulates+cilia+length+in+diverse+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FGF signalling during embryo development regulates cilia length in diverse epithelia.</a> Nature. 458 (7238), 651-654 (2009).</li>
<li>Schneider, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+Nkd1+promotes+Dvl+degradation+and+is+required+for+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish Nkd1 promotes Dvl degradation and is required for left-right patterning.</a> Dev. Biol. 348 (1), 22-33 (2010).</li>
<li>Matsui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canopy1%2C+a+positive+feedback+regulator+of+FGF+signaling%2C+controls+progenitor+cell+clustering+during+Kupffer%27s+vesicle+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Canopy1, a positive feedback regulator of FGF signaling, controls progenitor cell clustering during Kupffer's vesicle organogenesis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (24), 9881-9886 (2011).</li>
<li>Shu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Na%2CK-ATPase+alpha2+and+Ncx4a+regulate+zebrafish+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Na,K-ATPase alpha2 and Ncx4a regulate zebrafish left-right patterning.</a> Development. 134 (10), 1921-1930 (2007).</li>
<li>Esguerra, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ttrap+is+an+essential+modulator+of+Smad3-dependent+Nodal+signaling+during+zebrafish+gastrulation+and+left-right+axis+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Ttrap is an essential modulator of Smad3-dependent Nodal signaling during zebrafish gastrulation and left-right axis determination.</a> Development. 134 (24), 4381-4393 (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+Zebrafish+Embryos+to+Analyze+Gene+Function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of Zebrafish Embryos to Analyze Gene Function.</a> J. Vis. Exp. (25), e1115(2009).</li>
<li>Yuan, S., Sun, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+mRNA+and+Morpholino+Antisense+Oligonucleotides+in+Zebrafish+Embryos%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of mRNA and Morpholino Antisense Oligonucleotides in Zebrafish Embryos.</a> J. Vis. Exp. (27), e1113(2009).</li>
<li>Molina, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+chemical+screening+reveals+an+inhibitor+of+Dusp6+that+expands+cardiac+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish chemical screening reveals an inhibitor of Dusp6 that expands cardiac cell lineages.</a> Nat. Chem. Biol. 5 (9), 680-687 (2009).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Dyn%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev. Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Schneider, I., Houston, D. W., Rebagliati, M. R., Slusarski, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+fluxes+in+dorsal+forerunner+cells+antagonize+beta-catenin+and+alter+left-right+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Calcium fluxes in dorsal forerunner cells antagonize beta-catenin and alter left-right patterning.</a> Development. 135 (1), 75-84 (2008).</li>
<li>Clement, A., Solnica-Krezel, L., Gould, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cdc14B+phosphatase+contributes+to+ciliogenesis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Cdc14B phosphatase contributes to ciliogenesis in zebrafish.</a> Development. 138 (2), 291-302 (2011).</li>
<li>Matsui, T., Bessho, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Left-right+asymmetry+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Left-right asymmetry in zebrafish.</a> Cell Mol. Life Sci. , (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

DFC / KV hücre soyu için MO hedeflemek için sahne özel enjeksiyonlar kullanarak gen fonksiyonu hücre özerklik incelemek ve küresel gen demonte neden pleiotropik fenotipleri önlemek için faydalı bir yaklaşımdır. Ancak, bu enjeksiyonları teknik olarak zor olabilir. 256 hücreli ve 1000-hücre aşamaları arasında MO enjeksiyon üç olası sonuçlara neden olabilir: 1) MO sarısı boyunca MO yayılır) enjeksiyon yerinde, 2 toplanır kalır ve DFC / KV hücreleri veya 3) MO girer sarısı boyunca yayılır ve DFC / KV hücreleri ve diğer embr...

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif / Malzeme Adı </td><td> Şirket </td><td> Katalog Numarası </td></tr><tr><td> Standart Kontrol tagged oligo-Lissamine </td><td> Gene Araçları, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Özel Rock2b morfolino oligo </td><td> Gene Araçları, LLC </td><td></td></tr><tr><td> Fluoresbrite Multifluorescent 0.5 mikron Mikroküreler </td><td> Polysciences, Inc </td><td> 24054 </td></tr></tbody></table>

kupffer en veziküllü gen fonksiyonu ve cilia oluşturulan akışkanın görselleştirme analizi

Analysis of Gene Function and Visualization of Cilia-Generated Fluid Flow in Kupffer's Vesicle

Örneğin kalp, beyin ve bağırsak gibi iç organların normal işlevleri 1 için kritik olan sol-sağ (LR) asimetriler gelişebilir. Hareketli kirpikler fare, kurbağa, ve zebrafish 2-6 gibi omurgalı embriyolarının, LR asimetrisi kurma katılmaktadırlar. Bu &#39;LR kirpikler&#39; organları 7 geliştirmek için LR desenlendirme bilgi sağlamak için düşünülmektedir sol lateral plaka mezoderm olarak kaskad sinyalizasyon korunmuş bir asimetrik Nodal (TGF-β süperailesi), tetiklemek için gerekli olan asimetrik akış oluşturur. Böylece, LR desenlendirme yatan mekanizmaları anlamak için, LR kirpikli hücrelerin organizasyonu, LR kirpikler ve sağlam asimetrik akış oluşturmak için yeteneklerini motilite ve uzunluğu düzenleyen genleri tanımlamak için gereklidir. Zebrafish embriyo olarak, LR kirpikler 2,4,5 Kupffer en vesikül (KV) yer almaktadır. KV monociliated epitel hücreleri, tek bir tabaka oluşurBir sıvı dolu lümen içine aldığınız. Fate eşleme KV epiboly aşamaları sırasında 8,9 dorsal blastoderm kenar az göç dorsal haberci hücreleri (DFCS) olarak bilinen ~ 20-30 bir grup hücre elde edilir olduğunu göstermiştir. Erken somite aşamalarında, DFCS küme ve kirpikli epitel hücreleri içine ayırt embriyonun 10,11 tailbud KV oluşturur. Belirlemek ve izlemek için yeteneği DFCS-kombinasyon optik şeffaflık ve zebrafish KV LR kirpikli hücreleri incelemek için mükemmel bir model sistem embriyo-make zebrafish hızla gelişmesi ile. İlginçtir, DFC / KV hücre soyunun ataları 4 saat sonrası fertilizasyon (HPF) ile sarısı hücresi arasındaki sitoplazmik köprüler kadar korumak, 2 hpf 8 sonrası yakın sarısı hücre ve diğer embriyonik hücreler arasında sitoplazmik köprüler oysa. Bu sitoplazmik köprü yararlanan biz morfolino oligonucle sunmak için bir sahne özgü enjeksiyon stratejisi geliştirdiDFCS ve devirme bu hücreler 12 bir hedef genin işlevi sadece otides (MO). Bu teknik, gen fonksiyonunun bir vahşi-tip embriyo bağlamında gelişen DFC / KV soy nakavt edildiği kimerik embriyolar oluşturur. KV asimetrik akış analiz etmek, biz KV lümeni ve videomicroscopy 2 kullanarak kayıt boncuk hareketin içine floresan mikroboncukları enjekte. Akışkan akışı kolaylıkla görülebilmektedir ve zamanla boncuk yerinden izleme ile belirlenebilir. Burada sahne özgü DFC hedefli gen Knockdown tekniği ve akış görselleştirmek için KV içine floresan mikroboncuk enjeksiyon kullanılarak, biz KV gelişimi ve işlevi sırasında belirli bir genin rolü karakterize için etkili bir yaklaşım sağlayan bir protokol mevcut.

Sahne özgü MO enjeksiyonlar embriyonun belirli bölümlerinde gen fonksiyonlarını analiz için kullanışlı bir yaklaşım sağlar. Şekil 1 akış görselleştirmek için floresan boncuk tanıtmak DFC / KV hücrelerinde ve nasıl gen işlevi sınamak için kullanılan enjeksiyon stratejilerinin bir akış şeması sunuyor KV. Başarılı bir aşama özgü enjekte edilen embriyolar floresan MO dağılımı Şekil 1B-F ve Şekil 2 &#39;de canlı embriyolar şematik olarak gösterilmektedir. Ba...

Kupffer en veziküllü içinde Cilia üretilen sıvı akışı (KV) zebrafish embriyo sol-sağ desenlendirme denetler. Burada, KV hücrelerde özellikle gen fonksiyonu modüle bir teknik tarif. Ayrıca, sıvı akışını görselleştirmek için KV içine floresan boncuk sunmak için nasıl gösterir.

Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi

Internal organs such as the  heart, brain, and gut develop left-right (LR) asymmetries that are critical for  their normal functions1. Motile cilia are ...

Bu prosedürün amacı, sol sağ desenlemeden sorumlu olan zebra balığı embriyosunda Kavas vezikülündeki veya KV'deki fonksiyon genlerini modüle etmek ve kv'ye floresan boncuklar vererek motil clia tarafından üretilen asimetrik sıvı akışını analiz etmektir. Bu, ilk olarak, orta kirpik Dilla evresi embriyosunun yumurta sarısı hücresinde ilgilenilen belirli bir genin ekspresyonunu baskılayan floresan morf oligonükleotidlerin enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir, böylece kv'ye yol açan dorsal öncü hücrelere yüklenirler. Daha sonra, sadece yumurta sarısı hücresinde ve kv'de floresan morfosa sahip enjekte edilen embriyolar daha fazla analiz için seçilir.Daha sonra embriyolar depresyon slaytlarına monte edilir ve kv'nin sıvı dolu vezikül lümenine floresan boncuklar enjekte edilir. Son olarak, kv içinde akan boncukları kaydetmek için video mikroskobu kullanılır. Sonuç olarak, KV'deki bir aday genin dokuya özgü tükenmesinin, boncuk hareketlerinin kantitatif analizi yoluyla asimetrik sıvı akışını değiştirip değiştirmediğini belirleyen sonuçlar elde edilebilir.Bu dönemin viral gösterimi kritiktir, çünkü aşamaya özgü molino enjeksiyonları ve floresan boncuk enjeksiyonlarının öğrenilmesi zordur, ç

analysis-gene-function-visualization-cilia-generated-fluid-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Havayolu kirpikler hareketliliği ve kirpikler oluşturulan akış fare trakea kullanarak görselleştirme ve ölçülmesi için kolay ve güvenilir bir tekniktir açıklanmıştır. Bu teknik faktörler çok çeşitli farmakolojik ajanlar, genetik faktörler, çevresel maruziyet, ve / veya mukus yük gibi mekanik faktörler de dahil olmak üzere, kirpikler hareketliliği nasıl etkilediğini belirlemek için değiştirilebilir.

Kemirgen Havayolu Epiteli içinde Cilia Motilite Yüksek Çözünürlüklü Görüntüleme için ex vivo Yöntemi

Dev siliyer Stentor coeruleus, tek hücrelerde rejenerasyon ve yara iyileşmesini incelemek için klasik bir sistemdir. Stentor hücrelerini aynı anda düşük ve yüksek büyütmede görüntüleyerek, yaralama öncesinde, sırasında ve sonrasında sitoplazmik akışları ölçmek mümkündür.

Tek hücreli Yara Şifa sırasında Sitoplazmik Akışı görselleştirme Stentor coeruleus

Koku alma duyusal nöronlarının kirpikleri, sinyal iletim kaskadının proteinlerini içerir, ancak kriyoseksiyonlarda dağılımlarının ayrıntılı bir uzamsal analizi zordur. Burada, siliyer proteinlerin tüm montaj etiketlemesi ve yüz görselleştirmesi için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklıyoruz.

Fareler Ana Koku Sistemde Cilia Whole Dağı Etiketleme

Bu çalışmada, ayrıntılı bir ışık mikroskobik tekniği, ultrastrüktürel analiz için bir elektron mikroskobik yöntemle birlikte CPEC kirpiklerin ex vivo hareketinin gerçek zamanlı gözlemi ve analizi için optimize edilmiştir.

Koroid Pleksus Epitel Hücreleri Silier Hareketi Gözlem<em&gt; Ex Vivo</em

Burada C. elegans'ta gelişimsel süreçlerin nasıl izleneceği ve nicelleştirileceği gösterilmektedir. Sunulan yöntemler, kolayca uygulanabilen açık kaynaklı araçlara dayanmaktadır. 3B hücre şekli modellerinin nasıl yeniden yapılandırılacağı, hücre altı yapıların manuel olarak nasıl izleneceği ve kortikal kasılma akışının nasıl analiz edileceği gösterilmiştir.

Gelişim Süreçleri İzleme ve nicel<em&gt; C. elegans</em&gt; Açık kaynak Araçlarını Kullanma

Son zamanlarda ulaşım yolları çeşitli proteinlerin canlı hücrelerdeki birincil kirpikler içinde translocating için üç boyutlu (3D) kayma yerlerini eşleştirilmiş. Burada deneysel kurulum, biyolojik örneklerin işlem ve veri analizleri yaklaşım yeni görüntüleme 3D süper çözünürlük floresan için uygulanan bu kağıt ayrıntıları birincil kirpikler yaşıyorum.

Yüksek hızlı süper çözünürlük hızı mikroskobu canlı birincil Cilium içinde uygulanması

Çok hücreli sistemlerin doku karmaşıklığı hücre dışı ipuçları ve bireysel hücresel davranışlar arasındaki nedensel ilişkinin belirlenmesini şaşırtmak. Burada, C. elegans embriyo blastomerleri ve yapışkan polistiren boncuklar kullanarak temasa bağlı ipuçları ve bölünme eksenleri arasındaki doğrudan bağlantıyı incelemek için bir yöntem sunuyoruz.

İzole Caenorhabditis elegans Embriyo Blastomerler ve Yapıştırıcı Polistiren Boncuklar ile Mekansal Hücre Temas Desenleri In Vitro Reconstitution

Görüntüleri analiz etmek için yapay zekanın (Ai) kullanımı, yaygın olarak kullanılan yöntemlere kıyasla güçlü, daha az önyargılı ve hızlı bir yaklaşım olarak ortaya çıkıyor. Burada Ai'yi hücresel bir organel, birincil cilia'yı tanıması ve uzunluk ve lekelenme yoğunluğu gibi özellikleri titiz ve tekrarlanabilir bir şekilde analiz etmesi için eğitdik.

Birincil Cilia'yı Değerlendirmede Yapay Zeka Yaklaşımları

Erken Drosophila embriyosunda, birçok organel hareketlidir. Prensip olarak, belirli floresan problar aracılığıyla canlı olarak görüntülenebilirler, ancak yumurta kabuğu embriyoya doğrudan uygulamayı önler. Bu protokol, bu tür probların mikroenjeksiyon yoluyla nasıl tanıtılacağını ve daha sonra parçacık  görüntü velosimetrisi yoluyla toplu organel hareketinin nasıl analiz edileceğini açıklar.

Drosophila Embriyolarında Lipid İçeren Organellerin Sitoiskelete Bağımlı Ticaretinin Görselleştirilmesi

Bu yöntem, bir ARL13B-CENTRIN-2 transgenik fare modelindeki endojen sinyalin, doku toplamadan kirpik organizasyonunun analizine kadar, mineralize dokunun geniş alanlarında üç boyutlu olarak primer kirpikleri yerinde görüntülemek için kullanılmasını tanımlar. Bu protokol diğer doku tiplerine de uygulanabilir.

Kas-İskelet Dokusundaki Primer Kirpiklerin ARL13B-CENTRIN-2 Fare Modeli Kullanılarak Hacimsel Görüntülenmesi ve Analizi

Keşfedin, Danio rerio embriyolarında Kupffer kesesi gen fonksiyonunu modüle etme ve floresan boncuklarla asimetrik akışkan dinamiğini analiz etme yöntemini. Bu teknik sol-sağ desenlemeyi anlamaya yardımcı olur.

Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi

Daha fazla video keşfet