Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi

Bu prosedürün amacı, sol sağ desenlemeden sorumlu olan zebra balığı embriyosunda Kavas vezikülündeki veya KV'deki fonksiyon genlerini modüle etmek ve kv'ye floresan boncuklar vererek motil clia tarafından üretilen asimetrik sıvı akışını analiz etmektir. Bu, ilk olarak, orta kirpik Dilla evresi embriyosunun yumurta sarısı hücresinde ilgilenilen belirli bir genin ekspresyonunu baskılayan floresan morf oligonükleotidlerin enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir, böylece kv'ye yol açan dorsal öncü hücrelere yüklenirler. Daha sonra, sadece yumurta sarısı hücresinde ve kv'de floresan morfosa sahip enjekte edilen embriyolar daha fazla analiz için seçilir.

Daha sonra embriyolar depresyon slaytlarına monte edilir ve kv'nin sıvı dolu vezikül lümenine floresan boncuklar enjekte edilir. Son olarak, kv içinde akan boncukları kaydetmek için video mikroskobu kullanılır. Sonuç olarak, KV'deki bir aday genin dokuya özgü tükenmesinin, boncuk hareketlerinin kantitatif analizi yoluyla asimetrik sıvı akışını değiştirip değiştirmediğini belirleyen sonuçlar elde edilebilir.

Bu dönemin viral gösterimi kritiktir, çünkü aşamaya özgü molino enjeksiyonları ve floresan boncuk enjeksiyonlarının öğrenilmesi zordur, çünkü her ikisi de embriyonun önerilmesine ve deneyin gelişimsel zamanlamasına bağlıdır. Global morf veya MO enjeksiyonları yapmak için, döllenmeden hemen sonra embriyoları toplayın ve bunları bir enjeksiyon plakasına yükleyin. Embriyoları hareketsiz hale getirmek için embriyoları enjeksiyon plakasına yerleştirmek için pipetimizin yanından geçen bir ateş kullanın.

Bir enjeksiyon iğnesinin ucunu kırın ve bir nanolitre hacme sahip bir enjeksiyon damlası oluşturmak için enjeksiyon ayarlarını yapın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, bir ila dört hücre aşaması arasında en az 50 embriyonun boyunduruğuna bir nanolitre MO enjekte edin. DFC hedefli M mo enjeksiyonu için, döllenmeden hemen sonra embriyoları toplayın ve 28.5 santigrat derecede inkübe edin.

Embriyolar 256 hücre aşamasına ulaştığında, bunları hızlı bir şekilde bir enjeksiyon plakasına yükleyin ve yumurta sarısına bir nanolitre floresan MO enjekte edin. Sarısı hedefli enjeksiyonu gerçekleştirmek için 256 ila 1000 hücre aşaması arasında en az 100 embriyo enjekte edin. Döllenmiş yumurtaları kubbe aşamasına kadar kuluçkaya yatırdıktan sonra, kubbe ve% 30'u kat aşamaları arasında en az 100 embriyonun boyunduruğuna bir nanolitre floresan MO enjekte edin.

M mo enjekte edildiğinde embriyolar %75 kat aşamasına ulaşır. Global MO enjeksiyonları için döllenmemiş ve ölü embriyoları diseksiyon mikroskobu altında çıkarın. Tüm hücrelere eşit olarak dağılmış floresan için canlı embriyoları seçin.

DFC hedefli M mo enjeksiyonları için, yumurta sarısı boyunca yayılan ve dorsal püskürtülmüş derm kenarında konsantre edilen floresan ile embriyoları seçin. Yumurta sarısı hedefli MO enjeksiyonları için. Floresansın yumurta sarısı boyunca eşit olarak dağıldığı ve iki ila dört arasındaki herhangi bir embriyonik hücrede gözlenmeyen embriyoları seçin.

Yani akar aşamaları. Sadece KV hücrelerinde ve yumurta sarısında floresan sergileyen DFC hedefli embriyoları seçin ve geri kalanını yumurta sarısı hedefli enjeksiyonlar için atın. MO enjekte edilen embriyoların KV'sindeki asimetrik akışı analiz etmek için sadece yumurta sarısında floresan bulunan embriyoları seçin, dört ila altı embriyo arasında yaklaşık 20 embriyoyu dikkatlice kaplamak için keskin forseps kullanarak başlayın.

Bu nedenle, aşamalar bir embriyoyu bir cam çöküntü slaytına aktarabilir ve mümkün olduğunca fazla suyu çıkarabilir. Aero katılaştıkça üzerini örtecek kadar sıcak% 1 düşük erime noktalı aero ekleyerek embriyoyu hareketsiz hale getirin. KV yukarı bakacak şekilde konumlandırmak için forseps kullanın, tüm enjeksiyonların 10 tarafından tamamlandığından emin olmak için hızlı bir şekilde çalışarak 10 embriyoyu monte edin.

Yani akar aşaması. 0,5 mikron çapındaki floresan mikro boncuklar steril suda bir ila 50 dereceye kadar seyreltildikten sonra. Boncukları iyice karıştırın ve MO enjeksiyonları için kullanılan aynı mikro enjektörü kullanarak bir kılcal iğneye üç mikrolitre yükleyin.

İğne ucunu kırmak için forseps kullanın ve mümkün olan en küçük enjeksiyonu oluşturmak için enjeksiyon ayarlarını yapın. Damla. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, iğneyi ilk monte edilen embriyonun KV lümeni ile hizalayın. Ardından iğneyi lümene yerleştirin ve 0,5 nanolitreden daha az boncuk enjekte edin.

Embriyonun dik bir floresan mikroskop altında kurumasını önlemek için arosun üzerine bir damla steril su ekleyin. 20 x objektif kullanarak, enjekte edilen embriyoları, aroları kaplamak için bir damla steril su ile KV içinde boncuklarla seçilen her embriyo için boncukların başarılı bir şekilde verilmesi için tarayın. Ardından, 63 x su daldırma objektifine sahip bir floresan bileşik mikroskobu kullanarak gözlemleyin.

Mikroskoba monte edilmiş yüksek hızlı bir kamera kullanarak on saniyelik bir film kaydedin. Boncukları saniyede yaklaşık 70 kare hızında kaydetmek için floresan kanalını ve KV lümenini kaydetmek için parlak alan veya diferansiyel girişim kontrastını kullanın. Filmleri Görüntüye Aktarın J. Maksimum projeksiyonlar oluşturun ve tek tek boncukların hareketlerini izlemek için yazılımı kullanın.

Bu şekil, başarılı aşamaya özgü canlı enjekte edilen embriyolarda floresan MO'nun dağılımını göstermektedir. Çözeltinin yumurta sarısı hücresinde toplanmış halde kaldığı başarısız bir MO enjeksiyonu burada gösterilmiştir. Başarılı bir şekilde enjekte edilen embriyolardaki sıvı akışı, normal akış boncukları olan bir kontrol embriyosunda kalitatif veya kantitatif olarak ölçülebilir.

Zaman içinde floresan boncuk konumlarının maksimum projeksiyonunu yaparak veya zaman içinde tek tek boncukları izleyerek görselleştirilebilen saat yönünün tersine yolları izleyin. Koordineli akış kaybını göstermek için, akışı bozan sıra kinaz iki B veya kaya iki B'yi parçalamak için embriyolara MO enjekte edildi ve sonuç olarak, boncuklar kv'de rastgele hareket eder, kontrolden beş boncuğun ortalama hızı ve kaya iki B mo embriyosu Geliştirildikten sonra burada gösterilmiştir. Bu teknik, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların, zebra balıklarında sol sağ vücut erişiminin sağlanmasında genleri ve mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı.