Kupffer en veziküllü Gen Fonksiyonu ve Cilia Oluşturulan Akışkanın Görselleştirme Analizi
31 Mart 2013
Kupffer en veziküllü içinde Cilia üretilen sıvı akışı (KV) zebrafish embriyo sol-sağ desenlendirme denetler. Burada, KV hücrelerde özellikle gen fonksiyonu modüle bir teknik tarif. Ayrıca, sıvı akışını görselleştirmek için KV içine floresan boncuk sunmak için nasıl gösterir.
Bu prosedürün amacı, sol sağ desenlemeden sorumlu olan zebra balığı embriyosunda Kavas vezikülündeki veya KV'deki fonksiyon genlerini modüle etmek ve kv'ye floresan boncuklar vererek motil clia tarafından üretilen asimetrik sıvı akışını analiz etmektir. Bu, ilk olarak, orta kirpik Dilla evresi embriyosunun yumurta sarısı hücresinde ilgilenilen belirli bir genin ekspresyonunu baskılayan floresan morf oligonükleotidlerin enjekte edilmesiyle gerçekleştirilir, böylece kv'ye yol açan dorsal öncü hücrelere yüklenirler. Daha sonra, sadece yumurta sarısı hücresinde ve kv'de floresan morfosa sahip enjekte edilen embriyolar daha fazla analiz için seçilir.
Daha sonra embriyolar depresyon slaytlarına monte edilir ve kv'nin sıvı dolu vezikül lümenine floresan boncuklar enjekte edilir. Son olarak, kv içinde akan boncukları kaydetmek için video mikroskobu kullanılır. Sonuç olarak, KV'deki bir aday genin dokuya özgü tükenmesinin, boncuk hareketlerinin kantitatif analizi yoluyla asimetrik sıvı akışını değiştirip değiştirmediğini belirleyen sonuçlar elde edilebilir.
Bu dönemin viral gösterimi kritiktir, çünkü aşamaya özgü molino enjeksiyonları ve floresan boncuk enjeksiyonlarının öğrenilmesi zordur, çünkü her ikisi de embriyonun önerilmesine ve deneyin gelişimsel zamanlamasına bağlıdır. Global morf veya MO enjeksiyonları yapmak için, döllenmeden hemen sonra embriyoları toplayın ve bunları bir enjeksiyon plakasına yükleyin. Embriyoları hareketsiz hale getirmek için embriyoları enjeksiyon plakasına yerleştirmek için pipetimizin yanından geçen bir ateş kullanın.
Bir enjeksiyon iğnesinin ucunu kırın ve bir nanolitre hacme sahip bir enjeksiyon damlası oluşturmak için enjeksiyon ayarlarını yapın. Bir diseksiyon mikroskobu kullanarak, bir ila dört hücre aşaması arasında en az 50 embriyonun boyunduruğuna bir nanolitre MO enjekte edin. DFC hedefli M mo enjeksiyonu için, döllenmeden hemen sonra embriyoları toplayın ve 28.5 santigrat derecede inkübe edin.
Embriyolar 256 hücre aşamasına ulaştığında, bunları hızlı bir şekilde bir enjeksiyon plakasına yükleyin ve yumurta sarısına bir nanolitre floresan MO enjekte edin. Sarısı hedefli enjeksiyonu gerçekleştirmek için 256 ila 1000 hücre aşaması arasında en az 100 embriyo enjekte edin. Döllenmiş yumurtaları kubbe aşamasına kadar kuluçkaya yatırdıktan sonra, kubbe ve% 30'u kat aşamaları arasında en az 100 embriyonun boyunduruğuna bir nanolitre floresan MO enjekte edin.
M mo enjekte edildiğinde embriyolar %75 kat aşamasına ulaşır. Global MO enjeksiyonları için döllenmemiş ve ölü embriyoları diseksiyon mikroskobu altında çıkarın. Tüm hücrelere eşit olarak dağılmış floresan için canlı embriyoları seçin.
DFC hedefli M mo enjeksiyonları için, yumurta sarısı boyunca yayılan ve dorsal püskürtülmüş derm kenarında konsantre edilen floresan ile embriyoları seçin. Yumurta sarısı hedefli MO enjeksiyonları için. Floresansın yumurta sarısı boyunca eşit olarak dağıldığı ve iki ila dört arasındaki herhangi bir embriyonik hücrede gözlenmeyen embriyoları seçin.
Yani akar aşamaları. Sadece KV hücrelerinde ve yumurta sarısında floresan sergileyen DFC hedefli embriyoları seçin ve geri kalanını yumurta sarısı hedefli enjeksiyonlar için atın. MO enjekte edilen embriyoların KV'sindeki asimetrik akışı analiz etmek için sadece yumurta sarısında floresan bulunan embriyoları seçin, dört ila altı embriyo arasında yaklaşık 20 embriyoyu dikkatlice kaplamak için keskin forseps kullanarak başlayın.
Bu nedenle, aşamalar bir embriyoyu bir cam çöküntü slaytına aktarabilir ve mümkün olduğunca fazla suyu çıkarabilir. Aero katılaştıkça üzerini örtecek kadar sıcak% 1 düşük erime noktalı aero ekleyerek embriyoyu hareketsiz hale getirin. KV yukarı bakacak şekilde konumlandırmak için forseps kullanın, tüm enjeksiyonların 10 tarafından tamamlandığından emin olmak için hızlı bir şekilde çalışarak 10 embriyoyu monte edin.
Yani akar aşaması. 0,5 mikron çapındaki floresan mikro boncuklar steril suda bir ila 50 dereceye kadar seyreltildikten sonra. Boncukları iyice karıştırın ve MO enjeksiyonları için kullanılan aynı mikro enjektörü kullanarak bir kılcal iğneye üç mikrolitre yükleyin.
İğne ucunu kırmak için forseps kullanın ve mümkün olan en küçük enjeksiyonu oluşturmak için enjeksiyon ayarlarını yapın. Damla. Daha sonra, bir diseksiyon mikroskobu altında, iğneyi ilk monte edilen embriyonun KV lümeni ile hizalayın. Ardından iğneyi lümene yerleştirin ve 0,5 nanolitreden daha az boncuk enjekte edin.
Embriyonun dik bir floresan mikroskop altında kurumasını önlemek için arosun üzerine bir damla steril su ekleyin. 20 x objektif kullanarak, enjekte edilen embriyoları, aroları kaplamak için bir damla steril su ile KV içinde boncuklarla seçilen her embriyo için boncukların başarılı bir şekilde verilmesi için tarayın. Ardından, 63 x su daldırma objektifine sahip bir floresan bileşik mikroskobu kullanarak gözlemleyin.
Mikroskoba monte edilmiş yüksek hızlı bir kamera kullanarak on saniyelik bir film kaydedin. Boncukları saniyede yaklaşık 70 kare hızında kaydetmek için floresan kanalını ve KV lümenini kaydetmek için parlak alan veya diferansiyel girişim kontrastını kullanın. Filmleri Görüntüye Aktarın J. Maksimum projeksiyonlar oluşturun ve tek tek boncukların hareketlerini izlemek için yazılımı kullanın.
Bu şekil, başarılı aşamaya özgü canlı enjekte edilen embriyolarda floresan MO'nun dağılımını göstermektedir. Çözeltinin yumurta sarısı hücresinde toplanmış halde kaldığı başarısız bir MO enjeksiyonu burada gösterilmiştir. Başarılı bir şekilde enjekte edilen embriyolardaki sıvı akışı, normal akış boncukları olan bir kontrol embriyosunda kalitatif veya kantitatif olarak ölçülebilir.
Zaman içinde floresan boncuk konumlarının maksimum projeksiyonunu yaparak veya zaman içinde tek tek boncukları izleyerek görselleştirilebilen saat yönünün tersine yolları izleyin. Koordineli akış kaybını göstermek için, akışı bozan sıra kinaz iki B veya kaya iki B'yi parçalamak için embriyolara MO enjekte edildi ve sonuç olarak, boncuklar kv'de rastgele hareket eder, kontrolden beş boncuğun ortalama hızı ve kaya iki B mo embriyosu Geliştirildikten sonra burada gösterilmiştir. Bu teknik, gelişim biyolojisi alanındaki araştırmacıların, zebra balıklarında sol sağ vücut erişiminin sağlanmasında genleri ve mekanizmaları keşfetmelerinin yolunu açtı.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, sol-sağ desen oluşturmada kritik öneme sahip olan zebra balığı embriyolarının Kupffer Kesesinde (KV) gen işlevinin modülasyonuna odaklanmaktadır. Yazarlar, KV'deki sıvı akışını görselleştirmek için floresan boncuklar kullanarak bir yöntem tanımlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Nörobilim
- Gelişimsel Biyoloji
- Embriyoloji
Arka Plan
- Kupffer'in Kesesi, zebra balığında sol-sağ asimetrisinin kurulmasında önemli bir rol oynar.
- KV'deki silikler, embriyonik gelişimi etkileyen akışkan akışını oluşturur.
- KV'deki gen işlevini anlamak, gelişim süreçlerine dair içgörüler sağlayabilir.
- Floresan boncuklar, KV'deki akışkan dinamiklerini görselleştirmek ve analiz etmek için kullanılabilir.
Çalışmanın Amacı
- Zebra balığı embriyolarının KV hücrelerinde gen işlevini spesifik olarak modüle etmek.
- Gen modülasyonunun KV'deki asimetrik akışkan akışın üzerindeki etkisini analiz etmek.
- Floresan boncuklar kullanarak akışkan akışını görselleştirmek için bir teknik geliştirmek.
Kullanılan Yöntemler
- Orta blastula aşaması embriyolarının sarısı hücrelerine floresan morfolino oligonükleotidlerin enjekte edilmesi.
- KV'de floresan morfolinoları olan embriyoların daha fazla analiz için seçilmesi.
- KV'nin iç boşluğuna floresan boncuklar enjekte edilmesi.
- Boncuk hareketini kaydetmek ve akışkan akışını analiz etmek için video mikroskopi kullanılması.
Ana Sonuçlar
- KV hücrelerinde gen ekspresyonunun başarılı bir şekilde modüle edilmesi.
- Floresan boncuklar kullanılarak KV'deki akışkan akışının görselleştirilmesi.
- Boncuk hareketlerinin nicel analizi ile gen işlevinin akışkan dinamiği üzerindeki etkisinin değerlendirilmesi.
- Sonuçlar, spesifik gen eksikliğinin KV'deki asimetrik akışkan akışını değiştirdiğini göstermektedir.
Sonuçlar
- Geliştirilen teknik, KV hücrelerinde hedefli gen modülasyonunu sağlamaktadır.
- Floresan boncuk enjeksiyonu, zebra balığı embriyolarında akışkan dinamiğini incelemek için etkilidir.
- Sonuçlar, KV'nin sol-sağ desen oluşturmadaki rolünü anlamamıza katkıda bulunmaktadır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Understanding left-right asymmetry establishment in vertebrate embryos provides mechanistic insights into developmental signaling pathways relevant to congenital disorder modeling. The zebrafish Kupffer's vesicle model enables high-resolution visualization of cilia-driven fluid flow, supporting target validation in early developmental biology. This approach aids in de-risking hypotheses about genes regulating asymmetric signaling cascades before mammalian translation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of gene function in dorsal forerunner cells to assess impact on cilia-mediated left-right patterning.
- Operational Value: Uses stage-specific morpholino knockdown to create chimeric embryos for lineage-restricted functional analysis.
- Predictive Value: Links gene depletion to alterations in asymmetric fluid flow, providing functional readouts for target validation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Fluorescent bead injection into Kupffer's vesicle lumen allows direct visualization and quantification of motility-driven flow.
- Operational Value: Enables high-speed video capture and bead tracking for objective measurement of flow dynamics.
- Assay Readiness: Generates quantitative displacement data that can be correlated with genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models conserved Nodal signaling pathway initiation, relevant to laterality defect studies.
- Translational Continuity: Connects cilia function in zebrafish KV to asymmetric signaling in lateral plate mesoderm.
- Mechanistic De-risking: Supports evaluation of whether candidate genes affect flow symmetry before mammalian model testing.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into discovery workflows by linking genetic modulation to functional phenotypic readouts in a living embryo system.
- Discovery Biology: Tests hypotheses about gene roles in cilia organization and motility through targeted knockdown in dorsal forerunner cells.
- Screening: Delivers fluorescent beads to quantify flow as a functional output of cilia activity.
- Analytics: Uses bead tracking to generate velocity and trajectory data for flow asymmetry assessment.
- Translational Research: Connects KV flow to downstream Nodal signaling, supporting relevance to symmetry-breaking mechanisms.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for gene-function-to-phenotype mapping in vertebrate left-right patterning.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides mechanistic insight into how genes regulate cilia-dependent fluid flow and symmetry initiation.
- Operational Value: Combines lineage-specific gene knockdown with live imaging for correlated genetic and phenotypic analysis.
- Strategic Value: Enables early-stage go/no-go decisions based on functional disruption of conserved patterning mechanisms.
- Portfolio Impact: Supports prioritization of targets based on their role in establishing asymmetric signaling cascades.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryo handling, microinjection, and fluorescence microscopy.
- Dependent on precise timing of injection relative to developmental stages (dome to 30% epiboly for DFC targeting).
- Needs fluorescent bead preparation and high-speed video capture capability for flow quantification.
- Requires optimization of bead concentration and injection volume to avoid lumen obstruction or embryo damage.
- Limited to non-mammalian systems; findings require validation in higher vertebrate models for translational relevance.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:49
Stage-specific Injection of Morpholinos (MO)
3:10
Selecting Injected Embryos for Analysis
4:16
Mounting Embryos and Injection of Fluorescent Beads to Analyze Fluid Flow in Kupffer's Vesicle
5:56
Visualization and Analysis of KV Fluid Flow
6:38
Representative Kupffer's Vesicle Fluid Flow Results
7:45
Conclusion
