Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

Polarizasyon analizi için kemik iliği kaynaklı makrofajlar oluşturmak. Femur ve tibia kemikleri farelerden izole edilir ve kemik iliği hücreleri toplanır. Hücreler daha sonra makrofaj oluşumunu indüklemek için büyüme faktörleri içeren ortamda kültürlenir.

Yedi günlük kültürden sonra, kemik iliği kaynaklı makrofajlar çeşitli uyaranlar ve polarize makrofaj ile tedavi edilir. Aktivasyon yanıtları akış sitometrisi gerçek zamanlı PCR ile analiz edilir ve M1 veya M ikisine polarize aktivasyon yanıtları ile kemik iliği kaynaklı makrofajların yüksek saflığını gösteren western blos analiz sonuçları elde edilir. Uyaranlar yalan söyler.

Bu tekniğin anlamı, insüline dirençli ve CRO'lar da dahil olmak üzere çeşitlilikle ilişkili hastalıkların tedavisine veya teşhisine yönelik bir duruştur, çünkü T infiltre eden makrofaj bu bağlamda önemli bir oyuncudur, bu yöntemin görsel gösterimi, kemik iliği hücresinin hızlandırılması biraz zor olduğundan ve verim, steril bir başlıkta çalışan makrofaj oluşumunu indüklemek için yeterli çalışma hücresi hazırlığı elde etmek için kritik öneme sahiptir. Bu protokole, bir doku kültürü kabında altı ila sekiz haftalık farelerden izole edilen femur ve tibia kemikleri ile başlayın. Kemikleri PBS'de durulayın, ardından kemiklerin her iki ucunu kesmek için makas kullanın, kemiği forseps ile tutarken çok fazla çıkarmamaya dikkat edin.

Kemiğin bir ucuna% 2 ısıtmalı aktif FBS ile soğuk PBS içeren 10 mililitrelik bir şırınga ile 21'e 23 gauge bir iğne yerleştirin. İliği yeni bir doku kültürü kabına akıtmak için pistona bastırın. Daha sonra, hücreleri ayırmak için iliği aynı iğneden dört ila altı kez geçirin.

Daha sonra hücre kümelerini, kemik, saç ve diğer hücreleri veya dokuları çıkarmak için hücreleri 70 mikronluk bir hücre süzgecine dökün. Akışı 50 mililitrelik konik bir tüpte toplayın. Çözelti filtreden geçtikten sonra, akışa üç hacim% 0.8 amonyum klorür ekleyin ve 10 dakika buz üzerinde inkübe edin.

İnkübasyonu takiben kırmızı kan hücrelerini çıkarmak için, hücreleri dört santigrat derecede beş dakika boyunca 500 kez G'de döndürün. Döndürmeden sonra, hücre peletini %2 FBS ile 20 ila 50 mililitre soğuk PBS'de yeniden askıya alın. Bir hemo sitometre kullanarak hücreleri sayın.

Hücreleri beş dakika boyunca dört santigrat derece boyunca 500 kez G'de döndürün. Supinatı döktükten sonra. Protokolün bir sonraki bölümünde açıklandığı gibi BMDM oluşumunu indüklemeye devam edin BMDM oluşumunu indüklemek için Resus, izole edilmiş kemik iliği hücrelerini BMDM büyüme ortamında iki kez konsantrasyonda askıya alın.

Altı veya 12 oyuklu bir doku kültürü plakasının her bir oyuğunda mililitre tohum başına altı hücreyi bir ila iki kez 10 ila altı hücreye ortalayın ve hücreleri 37 santigrat derecede inkübe edin. Bu konsantrasyonda tohumlama, üç gün sonra akış sitometrisi için ayrılmayı kolaylaştıracaktır. Yedinci günde taze BMDM büyüme ortamına geçin.

Olgun BMDM oluşumu, CD 11 B ve F dört 80 eksprese eden hücreleri tespit etmek için akış sitometrisi analizi ve florol konjuge antikorlar kullanılarak değerlendirilir. Olgun BMDM oluşumunu doğruladıktan sonra, M1 aktivasyonu için %10 FBS ve LPS veya LPS ve interferon gama veya M iki aktivasyonu için IL dört veya IL 13 ile cove'un modifiye edilmiş do echo ortamı tazeye değiştirin. Hücreleri 24 saat sonra 37 santigrat derecede inkübe edin.

Uyarılmış b MDM'leri tabaktan ayırarak toplayın. Bunu yapmak için, ortamı hücrelerden çıkarın ve kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın. Daha sonra 0.48 milimolar içeren ılık% 0.05 tripsin ekleyin, EDTA aşırı sindirim nedeniyle yüzey proteinlerinin kaybını önlemek için 37 santigrat derecede en fazla 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra hücreleri %10 FBS içeren PBS ile iki kez yıkayın ve 1.2 mililitrelik numune tüplerine aktarın. Çeşitli zaman noktalarında CD 11 BF four 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 veya CD 86 dahil olmak üzere hücre yüzeyi antijenlerinin ekspresyonunu tespit etmek için antikorlar kullanın. Kantitatif PCR kullanarak standart akış sitometrisi boyama prosedürlerinin kullanılması.

M1 aktivasyonunu değerlendirmek için IL bir beta TNF alfa ve IL altı veya M iki aktivasyonunu değerlendirmek için IL 10 IL 13, arginaz bir ve PPAR gama ekspresyon seviyelerini belirleyin. Son olarak, olgun BMDM'nin saflığını değerlendirmek için M1 veya M iki makrofajın aktivasyonunda yer alan hücre sinyal yollarının aktivasyonunu değerlendirmek için western blotlama yapın. İndüksiyon akışını takiben, CD 11, BF, four 80, CD 11 C ve CD 2 0 6'ya karşı antikorlar kullanılarak sitometrik analiz yapıldı. MDM'ler önce DRI ve konjugatları çıkarmak için FSC ve SSC üzerine geçitlendi.

Olgun b MDM'ler, bu grafiğin sağ üst köşesinde görülen ve makrofaj polarizasyonunu değerlendirmek için kapılı popülasyonun %95 ila 99'unu tehlikeye atan CD 11 B pozitif F dört 80 pozitif alt popülasyon olarak tanımlandı. Daha fazla analiz yapıldı. İlk olarak, CD 11 B pozitif, F dört 80 pozitif hücre olan doku infiltrasyonlu makrofajları tanımlamak için geçit yapıldı.

Bunlar arasında CD 11 C pozitif ve CD 2 0 6 negatif olan M1 makrofajları ikinci kadranda görülürken, M iki makrofaj, CD 11 C negatif ve CD 2 0 6 pozitif olan dördüncü kadranda görülür. Makrofaj aktivasyonunu değerlendirmek için hücreler, M1 aktivasyonunu indüklemek için LPS veya M iki aktivasyonu için dört IL ile inkübe edildi. Aktivasyon üzerine, makrofajların boyutu, stimülasyondan 24 saat sonra M1 veya M iki makrofajın FSCA'sının tedavi edilmemiş M sıfıra kıyasla kaymasıyla kanıtlandığı gibi artmıştır.

Makrofaj aktivasyonu ile ilişkili yüzey belirteçleri de stimülasyon sonrası analiz edildi. Erken yanıt veren belirteçler CD 69, stimülasyondan beş veya 24 saat sonra değerlendirildi, CD 80 ve CD 86 belirteçleri stimülasyondan 48 saat sonra analiz edildi. Burada gösterildiği gibi, makrofajların klasik ve alternatif aktivasyonunu değerlendirmek için uyarılmış makrofajlarda CD 69, CD 80 ve CD 86 yüzey bolluğunda artış görülmüştür.

24 saat boyunca LPS veya IL dört ile uyarılanlar toplandı ve burada gösterildiği gibi kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz için toplam RNA ekstrakte edildi. Proinflamatuar sitokinlerin tedavi edilmemiş makrofaj ekspresyonu ile karşılaştırıldığında, M'de iki makrofajda yüksek arginaz bir ve PPAR gama ekspresyonu tespit edildi. NF kappa B yolunun P 65'e karşı LPS antikorları tarafından aktivasyonunu değerlendirmek için M1 makrofajlarında artmış bir beta TNF alfa interlökin ve fosfo ile ilişkili P 65, burada gösterildiği gibi western blot analizinde kullanıldı.

Alınan LPS tedavisi ile fosforile P 65'e karşı daha güçlü bir bant görülür. Birlikte, bu veriler M1 veya M iki uyarana polarize aktivasyon yanıtları ile kemik iliği kaynaklı makrofajları gösterir. Bu videoyu izledikten sonra, kemik iliği kaynaklı makrofajın nasıl oluşturulacağını ve ardından polarize aktivasyon analizinin nasıl yapıldığını iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü denerken, yanıtlarını test etmeden önce farklılaşmış makrofajın saflığını değerlendirmeyi unutmamak önemlidir. Bu prosedürü takiben, genlerin makrofajlı aktivasyonun düzenlenmesinde nasıl rol oynadığı gibi ek soruları yanıtlamak için genlerin geçici transfeksiyonu veya SHRA gibi bir yöntem gerçekleştirilebilir.