Name: Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 7 s
Description: Öğrenin, kemik iliği kaynaklı makrofajları polarize etmek ve M1/M2 fenotiplerini akış sitometri ile analiz etmek. Bu yöntem immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında bağışıklık yanıtlarını anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma, Amerikan Kalp Derneği (Dr Beiyan Zhou için BGIA 7.850.037) tarafından desteklenmiştir.

1. Kemik İliği Hücreleri İzolasyon <ol><li> 6-8 haftalık farelerin femur ve tibia kemikleri izole, saç durulayın ve sonra kemik açık kesti. </li><li> Soğuk PBS +% 2 ısı inaktive fetal sığır serumu (FBS) (3-5 ml / fare) içine iliği dışarı atılması için bir 21G iğne ve 10 ml şırınga kullanın. </li><li> Hücreleri ayırmak için bir 21G iğne ile 4-6 kez iliği Min. </li><li> Hücre kümeleri, kemik, saç ve diğer hücre / doku kaldırmak için 70 mikron hücre süzgecinden hücreleri geçmektedir. </li><li> NH4CI çözeltisi (% 0.8 NH4CI çözeltisi, Kök Hücre Teknolojisi) 3 hacim eklemek ve kırmızı kan hücreleri çıkarmak için 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edilir. </li><li> 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 500 xg&#39;de hücreleri aşağı Spin </li><li> Soğuk PBS +% 2 FBS (20-50 ml, hücre miktarına bağlı olarak) içinde hücre pelletini. </li></ol> 2. Indüksiyon BMDM Oluşumu <ol><li> BMDM büyüme ortamı içinde izole edilmiş kemik iliği hücreleri (2x10 6 hücre / a süspansel). </li></ol> BMDM büyüme ortamı: Iscove Modifiye Dulbecco ortamı (IMDM) +% 10 FBS +% 15 süzüldü (0.2 um), L-929 hücresi (ATCC CCL-1) kültür yüzey (monosit-koloni uyarıcı faktör, M-CSF ihtiva eden) veya 10 ng / ml &#39;M -CSF verildi. Not: L-929 hücre yüzer M-CSF 18 içerir. Koşullandırılmış ortam, 5 etkin aktivitesi sağlamak için 5 x 10 L-929 hücreleri 6-7 gün boyunca T75 cm2 şişelerde tohumlanmıştır, kıvamlandırılmış ortam maddesi kullanımdan önce filtre bir 0.45 mikron ile toplanmış ve geçirilir. Orta alikotları 1-2 ay için hemen kullanılabilir ya da -80 ° C&#39;de saklanabilir. <ol start="2"><li> 6 veya 12 oyuklu doku kültürü plakaları (deney tasarımına bağlı olarak) (Corning Costar) tohum hücreleri. </li><li> 3. günde taze BMDM büyüme ortamı değiştirin. </li><li> 7. günde, olgun BMDM oluşumu akış sitometri analizi kullanılarak değerlendirilmiştirve fluorofor konjuge antikorlar CD11b ve F4/80 ifade hücreleri algılamak için. </li></ol> 3. BMDM Polarize Aktivasyon <ol><li> 7. günde taze ortam uyarılması değiştirin: M1 aktivasyonu için, IMDM 50 ng / ml, IFNy ile,% 10 FBS ve 100 ng / ml LPS ya da 100 ng / ml LPS içeren kullanımı, M2 aktivasyonu için,% 10 FBS içeren IMDM kullanmak 10 ng / ml IL-4 ve / veya 10 ng / ml IL-13. </li><li> Sıcak% 0.05 tripsin kullanarak çanak bunların ayrılması ile uyarılan BMDMs toplayın, PBS% 10 FBS içeren hücreler iki kez yıkanması takip etti. </li></ol> Not: farklılaşma sonra olgun makrofajlar,% 0.05 tripsin solüsyonu (0.48 mM EDTA, Invitrogen ihtiva eden) veya Ca ve Mg-içermeyen PBS veya Hank dengeli tamponu (HBSS) içerisinde 2-5 mM EDTA ayırmak ve yeniden süspanse etmek için kullanılabilir. Tripsin içeren sindirim orta kullanırken, hücrelerin sur kaybını önlemek için en az 10 dakika süreyle 37 ° C de tedavi ediliryüz aşırı sindirim nedeniyle proteinleri. <ol start="3"><li> CD11b F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ya da standart akış sitometrisi boyama işlemleri kullanarak, çeşitli zaman noktalarında CD86 dahil olmak üzere hücre yüzey antijenlerinin ekspresyonunu tespit etmek için antikorların kullanımı. </li><li> QRT-PCR kullanılarak, IL-1β, TNF-α ve IL-6 (M1 aktivasyonu) veya IL-10, IL-13, arginase1 ve PPARy (M2 aktivasyonu) dahil olmak üzere, aktive edilmiş makrofajlar M1 ve M2 karakteristik genlerin ekspresyonunu belirlemek. Batı blot analizi ile M1 veya M2 makrofaj aktivasyonu ile ilgili hücre sinyal yollarının aktivasyonu belirleyin. </li></ol>

<ol><li>Meng, Z. X., Wang, G. X., Lin, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microrna+circuitry+links+macrophage+polarization+to+metabolic+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A microrna circuitry links macrophage polarization to metabolic homeostasis.</a> Circulation. , (2012).</li>
<li>Lumeng, C. N., Bodzin, J. L., Saltiel, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+induces+a+phenotypic+switch+in+adipose+tissue+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Obesity induces a phenotypic switch in adipose tissue macrophage polarization.</a> J. Clin. Invest. 117, 175-184 (2007).</li>
<li>Gordon, S., Taylor, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+and+macrophage+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocyte and macrophage heterogeneity.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 953-964 (2005).</li>
<li>Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+activation+of+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Alternative activation of macrophages.</a> Nat. Rev. Immunol. 3, 23-35 (2003).</li>
<li>Tabas, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+death+and+defective+inflammation+resolution+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage death and defective inflammation resolution in atherosclerosis.</a> Nat. Rev. Immunol. 10, 36-46 (2010).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Goforth, M. H., Morel, C. R., Subramanian, V., Mukundan, L., Eagle, A. R., Vats, D., Brombacher, F., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage-specific+pparg+controls+alternative+activation+and+improves+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Macrophage-specific pparg controls alternative activation and improves insulin resistance.</a> Nature. 447, 1116-1120 (2007).</li>
<li>Odegaard, J. I., Ricardo-Gonzalez, R. R., Red Eagle, A., Vats, D., Morel, C. R., Goforth, M. H., Subramanian, V., Mukundan, L., Ferrante, A. W., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+m2+activation+of+kupffer+cells+by+ppard+ameliorates+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Alternative m2 activation of kupffer cells by ppard ameliorates obesity-induced insulin resistance.</a> Cell Metabolism. 7, 496-507 (2008).</li>
<li>Vats, D., Mukundan, L., Odegaard, J. I., Zhang, L., Smith, K. L., Morel, C. R., Greaves, D. R., Murray, P. J., Chawla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxidative+metabolism+and+pgc-1%5Bbeta%5D+attenuate+macrophage-mediated+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Oxidative metabolism and pgc-1[beta] attenuate macrophage-mediated inflammation.</a> Cell Metabolism. 4, 13-24 (2006).</li>
<li>Mosser, D. M., Edwards, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+full+spectrum+of+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Exploring the full spectrum of macrophage activation.</a> Nat Rev Immunol. 8, 958-969 (2008).</li>
<li>Arkan, M. C., Hevener, A. L., Greten, F. R., Maeda, S., Li, Z. -W., Long, J. M., Wynshaw-Boris, A., Poli, G., Olefsky, J., Karin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ikk-b+links+inflammation+to+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Med%22%5BJournal%5D)">Ikk-b links inflammation to obesity-induced insulin resistance.</a> Nat. Med. 11, 191-198 (2005).</li>
<li>Saberi, M., Woods, N. -B., de Luca, C., Schenk, S., Lu, J. C., Bandyopadhyay, G., Verma, I. M., Olefsky, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematopoietic+cell-specific+deletion+of+toll-like+receptor+4+ameliorates+hepatic+and+adipose+tissue+insulin+resistance+in+high-fat-fed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Hematopoietic cell-specific deletion of toll-like receptor 4 ameliorates hepatic and adipose tissue insulin resistance in high-fat-fed mice.</a> Cell Metab. 10, 419-429 (2009).</li>
<li>Kang, K., Reilly, S. M., Karabacak, V., Gangl, M. R., Fitzgerald, K., Hatano, B., Lee, C. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte-derived+th2+cytokines+and+myeloid+ppard+regulate+macrophage+polarization+and+insulin+sensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte-derived th2 cytokines and myeloid ppard regulate macrophage polarization and insulin sensitivity.</a> Cell Metabolism. 7, 485-495 (2008).</li>
<li>Bouhlel, M. A., Derudas, B., Rigamonti, E., Dievart, R., Brozek, J., Haulon, S., Zawadzki, C., Jude, B., Torpier, G., Marx, N., Staels, B., Chinetti-Gbaguidi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pparg+activation+primes+human+monocytes+into+alternative+m2+macrophages+with+anti-inflammatory+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pparg activation primes human monocytes into alternative m2 macrophages with anti-inflammatory properties.</a> Cell Metabolism. 6, 137-143 (2007).</li>
<li>Bronte, V., Zanovello, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+immune+responses+by+l-arginine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of immune responses by l-arginine metabolism.</a> Nat. Rev. Immunol. 5, 641-654 (2005).</li>
<li>Zhuang, G., Meng, C., Guo, X., Cheruku, P. S., Shi, L., Xu, H., Li, H., Wang, G., Evans, A. R., Safe, S., Wu, C., Zhou, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+regulator+of+macrophage+activation%3A+Mir-223+in+obesity-associated+adipose+tissue+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">A novel regulator of macrophage activation: Mir-223 in obesity-associated adipose tissue inflammation.</a> Circulation. 125, 2892-2903 (2012).</li>
<li>Kradin, R. L., McCarthy, K. M., Preffer, F. I., Schneeberger, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow-cytometric+and+ultrastructural+analysis+of+alveolar+macrophage+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukoc.+Biol%22%5BJournal%5D)">Flow-cytometric and ultrastructural analysis of alveolar macrophage maturation.</a> J. Leukoc. Biol. 40, 407-417 (1986).</li>
<li>Stein, M., Keshav, S., Harris, N., Gordon, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin+4+potently+enhances+murine+macrophage+mannose+receptor+activity%3A+A+marker+of+alternative+immunologic+macrophage+activation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Interleukin 4 potently enhances murine macrophage mannose receptor activity: A marker of alternative immunologic macrophage activation.</a> J. Exp. Med. 176, 287-292 (1992).</li>
<li>Strassmann, G., Bertolini, D. R., Kerby, S. B., Fong, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+murine+mononuclear+phagocyte+inflammatory+products+by+macrophage+colony-stimulating+factor.+Lack+of+il-1+and+prostaglandin+e2+production+and+generation+of+a+specific+il-1+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Regulation of murine mononuclear phagocyte inflammatory products by macrophage colony-stimulating factor. Lack of il-1 and prostaglandin e2 production and generation of a specific il-1 inhibitor.</a> J. Immunol. 147, 1279-1285 (1991).</li>
<li>Biswas, S. K., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+interaction+with+lymphocyte+subsets%3A+Cancer+as+a+paradigm%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and interaction with lymphocyte subsets: Cancer as a paradigm.</a> Nat. Immunol. 11, 889-896 (2010).</li>
<li>Sica, A., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+plasticity+and+polarization%3A+In+vivo+veritas%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Macrophage plasticity and polarization: In vivo veritas.</a> J. Clin. Invest. 122, 787-795 (2012).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Burada kemik iliği projenitör hücrelerinden elde edilen makrofajların aktivasyonu uyarmak için basit ve in vitro olarak kolaylıkla adapte prosedür sunulmuştur. Bu prosedür, makrofaj polarizasyon sorumlu mekanizmalarının incelenmesi için de kullanılabilir. Olgun makrofajlar saflığı bu protokolü ortalama 95 ila 99% kullanılarak elde ve ek saflaştırma işlemleri gereklidir. Makrofaj polarizasyon, ektopik ifade veya gen spesifik demonte bağlamında özel ilgi genlerin işlevine araştırmak 7. günde hücrelerin transfeksi...

Klasik inflamatuar yanıtları, dokuların sızmak makrofajlar farklı genellikle konak doku fizyolojik fonksiyonları 1-8 düzenlenmesinde önemli bir rol oynar polarize etkinleştirme durumunu görüntüler. Stimülasyon üzerine, makrofaj aktivasyonu klasik (M1) ve alternatif (M2) aktivasyon 2, 4, 9 içine sıralanabilir. M1, makrofaj aktivasyonu, TNF-α ve benzeri gibi enflamatuar sitokinlerin üretimine yol açan bir Toll benzeri reseptör (TLR), ve nükleer faktör kappa B (NFKB) / c-Jun N-terminal kinaz 1 (JNK1) aktivasyonu, bağlıdır, IL- iNOS 1β ve aktivasyon böyle nitrit oksit (NO), 10, 11 gibi reaktif oksijen türlerinin artan üretimi ile sonuçlanır. Bunun aksine, M2 makrofaj aktivasyonu işe PPARy, PPARd, veya IL-4-STAT6 yolları, alternatif manoz reseptörü CD206 upregülasyonunu ile ilişkili, bir anti-enflamatuar (M2) aktivasyonu ve arginaz 1 (Arg1) 6, 12, önde gelen - 14 &lt;/&gt; Sup. Kemik iliği kökenli makrofajlar (BMDM) aktive makrofajlar 15 kutuplaşma kontrol mekanizmaları anlamak için in vitro model ideal mevcut. M2 makrofaj polarizasyon, IL-4 ve / veya IL-13 ile indüklenen edilebilir ise Özellikle, M1, makrofajların aktivasyonu, lipopolisakkarit (LPS) ile uyarılması sonucu meydana edilebilir. Olgun kemik iliği kökenli makrofajlar ve aktive makrofajlar CD11b, F4/80, CD11c, CD206, CD69, CD80 ve CD86 9, 16, 17 de dahil olmak üzere yüzey antijenleri, ifadesi için flow sitometri analizi ile tespit edilebilir. Buna ek olarak, sitokin üretimi ve makrofaj kutuplaşma ile bağlantılı hücre sinyalizasyon yolları değişiklikler kantitatif RT-PCR ve Batı sırasıyla blot ile ölçülebilir. Özetle, fare kemik iliği kökenli makrofajlar in vitro makrofaj kutuplaşma incelemek için ilgili model olarak hizmet edebilir.

<table><tbody><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30259.01</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Invitrogen</td><td>10438-026</td><td></td></tr><tr><td>Murin GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>7850</td><td></td></tr><tr><td>L-929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td></td></tr><tr><td>70 & mu; m hücre süzgeci</td><td>BD Biosciences</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>AP-9009-10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD11b-APC</td><td>eBioscience</td><td>17-0112-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare F4 / 80-FITC</td><td>eBioscience</td><td>11-4801-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD69-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0691-81</td><td></td></tr><tr><td>Anti-fare CD86-PE</td><td>eBioscience</td><td>12-0862-81</td><td></td></tr><tr><td>Propidyum İyot</td><td>İnvitrojen</td><td>P3566</td><td></td></tr></tbody></table>

kemik İliği türetilmiş makrofajlar kullanarak makrofaj polarizasyon İncelenmesi

Investigation of Macrophage Polarization Using Bone Marrow Derived Macrophages

Makalede, makrofaj polarizasyon araştırmak için in vitro model, kolayca kolayca uyarlanabilir açıklanmaktadır. GM-CSF/M-CSF varlığında, kemik iliği hematopoetik kök / progenitör hücrelerin M1 veya M2 uyarımı ile devam eden, monositik farklılaşma içine yönlendirilir. Etkinleştirme durumunu hücre yüzey antijenleri, gen ve hücre sinyal yolları değişiklikleri ile takip edilebilir.

BMDM nesil prosedürün şematik bir açıklama (Şekil 1) sunulmuştur. Onlar CD11b + F4/80 + hücreler 95% 99 (Şekil 2) temsil zaman olgun makrofaj yüksek saflıkta 7. günde görülebilir. Polarize makrofajlar CD11b, F4/80 karşı antikor kullanılarak incelenebilir, CD11c ve CD206 akım sitometri analizi ile izledi. Şekil 3 &#39;de gösterildiği gibi, M1 makrofajlar gibi tespit edilir CD11b + F4/80 + CD11c + CD206-hücrelerinin (Q2), M2 makrofajlar CD11b oysa + + F4/80 CD11c-CD206 + ...

Bu makale, kolayca kolay uyarlanabilir açıklar<em&gt; In vitro</emMakrofaj polarizasyon araştırmak için&gt; modeli. GM-CSF/M-CSF varlığında, kemik iliği hematopoetik kök / progenitör hücrelerin M1 veya M2 uyarımı ile devam eden, monositik farklılaşma içine yönlendirilir. Etkinleştirme durumunu hücre yüzey antijenleri, gen ve hücre sinyal yolları değişiklikleri ile takip edilebilir.

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

The article describes a readily easy adaptive in vitro model to investigate macrophage polarization. In the presence of GM-CSF/M-CSF, hematopoietic ...

Polarizasyon analizi için kemik iliği kaynaklı makrofajlar üretmek amacıyla kullanılır. Farelerden femur ve tibia kemikleri izole edilir ve kemik iliği hücreleri toplanır. Hücreler daha sonra, makrofaj oluşumunu indüklemek için büyüme faktörleri içeren ortamda kültüre edilir.Yedi günlük kültürden sonra, kemik iliği kaynaklı makrofajlar çeşitli stimülasyonlarla işleme tabi tutulur ve makrofaj polarizasyonu gerçekleştirilir. Aktivasyon yanıtları akış sitometrisi ve gerçek zamanlı PCR ile analiz edilir; elde edilen western blot analiz sonuçları, kemik iliği kaynaklı makrofajların yüksek saflıkta olduğunu ve M1 veya M2 stimülasyon hatlarına göre polarize aktivasyon yanıtları verdiğini gösterir.Bu tekniğin önemi, T infiltrasyonlu makrofajların bu bağlamda ana rol oynaması nedeniyle, insülin direnci ve CRO'lar dahil olmak üzere çeşitlilikle ilişkili hastalıkların tedavisi veya teşhisine yöneliktir; kemik iliği hücrelerinin hızlandırılması bir dereceye kadar zor olduğundan ve makrofaj oluşumunu indüklemek için yeterli çalışma hücresi hazırlığı elde etmek adına verim kritik olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi büyük önem taşımaktadır. Steril bir kabinde çalışın. Bu protokole, doku kültürü kabındaki altı ila sekiz haftalık farelerden izole edilen femur ve tibia kemikleri ile başlayın. Kemikleri PBS ile durulayın, ardından pensle kemiği tutarken çok fazla doku kaldırmamaya dikkat ederek, kemiklerin her iki ucunu makasla kesin.Soğuk PBS ve %2 ısı ile aktive edilmiş FBS içeren 10 mililitrelik bir şırıngaya takılı 21 veya 23 gauge iğneyi kemiğin bir ucuna yerleştirin. Pistonu basarak iliği yeni bir doku kültürü kabına boşaltın. Ardından, hücreleri ayrıştırmak için iliği aynı iğneden dört ila altı kez geçirin.Ardından, hücre kümelerini, kemiği, kılı ve diğer hücre veya dokuları uzaklaştırmak için hücreleri 70 mikronluk bir hücre süzgecine dökün. Süzülen sıvıyı 50 mililitrelik konik bir tüpe toplayın. Solüsyon filtreden geçtikten sonra, süzülen sıvıya üç hacim %0,8 amonyum klorür ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.İnkübasyon sonrası eritrositleri uzaklaştırmak için, hücreleri 4 °C'de 500 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, hücre peletini %2 FBS içeren 20 ila 50 mL soğuk PBS içerisinde yeniden süspande edin. Hücreleri bir hemositometre kullanarak sayın.Hücreleri 4 °C'de beş dakika boyunca 500 ×g'de santrifüj edin. Supernatantı dökün. Protokolün bir sonraki bölümünde açıklandığı üzere BMDM oluşumunu indüklemeye geçin. BMDM oluşumunu indüklemek için, izole edilen kemik iliği hücrelerini 2 × konsantrasyondaki BMDM büyüme ortamında resüspande edin.Mililitre başına altı hücre olacak şekilde merkezleyin, altı veya 12 kuyucuklu bir doku kültürü plağının her kuyucuğuna 1 ila 2 × 10⁶ hücre ekleyin ve hücreleri 37 °C'de inkübe edin. Bu konsantrasyonda ekim yapmak, üç gün sonra akış sitometrisi için hücrelerin ayrılmasını kolaylaştıracaktır. Yedinci günde taze BMDM büyüme ortamı ile değiştirin.Olgun BMDM oluşumu, CD 11 B ve F four 80 eksprese eden hücreleri tespit etmek için akış sitometrisi analizi ve florokrom konjuge antikorlar kullanılarak değerlendirilir. Olgun BMDM oluşumu doğrulandıktan sonra, hücreleri %10 FBS içeren taze is cove modifiyeli do echo besiyerine aktarın ve M1 aktivasyonu için LPS veya LPS ve interferon gamma ya da M2 aktivasyonu için IL four veya IL 13 ekleyin. Hücreleri 24 saat boyunca 37 °C'de inkübe edin.Uyarılmış b MDM'leri kapta ayırarak toplayın. Bunun için, hücrelerdeki besiyerini uzaklaştırın ve kalsiyum veya magnezyum içermeyen PBS ile yıkayın. Ardından, 0,48 millimolar EDTA içeren sıcak %0,05 tripsin ekleyin ve aşırı sindirim nedeniyle yüzey proteinlerinin kaybını önlemek için 37 °C'de 10 dakikadan fazla olmamak üzere inkübe edin.Ardından hücreleri %10 FBS içeren PBS ile iki kez yıkayın ve 1,2 mililitrelik örnek tüplerine aktarın. Çeşitli zaman noktalarında CD 11 BF four 80, CD 11 C, CD 2 0 6, CD 69, CD 80 veya CD 86 dahil olmak üzere hücre yüzeyi antijenlerinin ekspresyonunu saptamak için antikorlar kullanın. Kantitatif PCR ile standart akış sitometrisi boyama prosedürlerini uygulayın.M1 aktivasyonunu değerlendirmek için IL-1β, TNF-α ve IL-6 ekspresyon seviyelerini veya M2 aktivasyonunu değerlendirmek için IL-10, IL-13, arginaz-1 ve PPAR-γ ekspresyon seviyelerini belirleyin. Son olarak, olgun BMDM'lerin saflığını değerlendirmek amacıyla M1 veya M2 makrofajlarının aktivasyonunda rol oynayan hücre sinyal yolaklarının aktivasyonunu değerlendirmek için western blotting yapın. İndüksiyon sonrası, CD11b, F4/80, CD11c ve CD206b'ye karşı antikorlar kullanılarak akış sitometrik analiz gerçekleştirildi. BMDM'ler, ölü hücreleri ve konjugatları uzaklaştırmak için önce FSC ve SSC üzerinden kapılandı.Olgun b MDM'ler, bu grafiğin sağ üst köşesinde görülen ve makrofaj polarizasyonunu değerlendirmek için kapıladığımız popülasyonun %95 ila %99'unu oluşturan CD 11 B pozitif F dört 80 pozitif alt popülasyonlar olarak tanımlanmıştır. Daha ileri analizler gerçekleştirilmiştir. İlk kapılama işlemi, CD 11 B pozitif F dört 80 pozitif hücreler olan dokuya infiltre makrofajları belirlemek için yapılmıştır.Bu M1 makrofajlar arasında, CD 11 C pozitif ve CD 2 0 6 negatif olanlar ikinci quadrantta görünürken, CD 11 C negatif ve CD 2 0 6 pozitif olan M2 makrofajlar dördüncü quadrantta görülmektedir. Makrofaj aktivasyonunu değerlendirmek için hücreler, M1 aktivasyonunu indüklemek amacıyla LPS ile veya M2 aktivasyonu için IL 4 ile inkübe edilmiştir. Aktivasyon üzerine, stimülasyondan 24 saat sonra M1 veya M2 makrofajların FSCA değerindeki kaymanın M0 işlem görmemiş hücrelerle karşılaştırılmasından anlaşıldığı üzere, makrofajların boyutu artmıştır.Stimülasyon sonrası makrofaj aktivasyonuyla ilişkili yüzey belirteçleri de analiz edilmiştir. Erken yanıt veren belirteç CD 69, stimülasyondan beş veya 24 saat sonra değerlendirilmiş; CD 80 ve CD 86 belirteçleri ise stimülasyondan 48 saat sonra analiz edilmiştir. Burada gösterildiği üzere, makrofajların klasik ve alternatif aktivasyonunu değerlendirmek amacıyla, stimüle edilmiş makrofajlarda yüzey CD 69, CD 80 ve CD 86 bolluğunda artış gözlemlenmiştir.LPS veya IL-4 ile 24 saat boyunca stimüle edilen hücreler toplandı ve burada gösterildiği üzere kantitatif gerçek zamanlı PCR ile analiz edilmek üzere toplam RNA ekstre edildi. İşlem görmemiş makrofajlarla karşılaştırıldığında, M2 makrofajlarında arginaz 1 ve PPAR gamma ekspresyonunda artış tespit edildi. Proinflamatuar sitokinlerin ekspresyonu incelendiğinde, M1 makrofajlarında interlökin 1 beta ve TNF alfa artış gösterdi. LPS tarafından NF-kappa B yolunun aktivasyonunu değerlendirmek için, burada gösterildiği gibi western blot analizinde p65 ve fosfo-p65'e karşı antikorlar kullanıldı.LPS uygulamasıyla, fosforile P 65'e karşı daha güçlü bir bant görülür. Birlikte, bu veriler kemik iliği kaynaklı makrofajların M1 veya M2 stimülasyonlarına karşı polarize aktivasyon yanıtları verdiğini göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, kemik iliği kaynaklı makrofajların nasıl üretileceği ve ardından polarize aktivasyon analizinin nasıl yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.Bu prosedürü uygularken, yanıtlarını test etmeden önce farklılaşmış makrofajların saflığını değerlendirmenin önemli olduğunu unutmayın. Bu prosedürün ardından, genlerin makrofaj aktivasyonunun düzenlenmesinde nasıl rol oynadığı gibi ek soruları yanıtlamak amacıyla genlerin geçici transfeksiyonu veya SHRA gibi bir yöntem uygulanabilir.

investigation-macrophage-polarization-using-bone-marrow-derived

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Makrofajlar homeostasis merkezi bir rol oynar ve birçok dokularda patoloji. Burada sunulan protokol makrofajlar tüketen için kullanılan yöntemleri...

Farelerde Makrofajlar tükenmesi ve Sulandırma

Bu videoda, periferik kandan türetilmiş monositlerin M1 veya M2 makrofajlarına farklılaşmasını ve polarizasyonunu indüklemek için bir prosedür gösteriyoruz. Granülosit-makrofaj koloni uyarıcı faktör, lipopolisakkarit ve interferon-gama ile inkübasyon, pro-inflamatuar M1 makrofajları verirken, makrofaj koloni uyarıcı faktör ve interlökin-4 ile inkübasyon, anti-inflamatuar M2 makrofaj üretimini indükler.

Monosit Kaynaklı Hücrelerin Makrofaj Benzeri Hücrelere Farklılaşması ve Polarizasyonu

Monosit türevli histiositlerinden doğuştan gelen bağışıklık sisteminin önemli bir hücrelerdir. Burada, kullanımı kolay...

Bir<em&gt; In vitro</emİnsan Makrofaj Farklılaşma ve Polarizasyon heterojenliği Eğitim için&gt; Model

İnsan makrofaj üretimi için basit ve etkin bir protokol sunuyoruz. İnce beyaz kat çifte yoğunluk gradyanlı santrifugasyon sureti ile işlenir ve izole edilmiş monositlerin, sonra Teflon kaplı bir hücre kültürü torbalarda makrofajlara ayrılır. Bu makrofaj verim maksimize ve daha sonraki deneyler için hücre hasat kolaylaştırır.

İnsan Çift Gradient Santrifüj ile Monositlerinde ve teflon kaplı Hücre Kültürü Çantalar Makrofagların Onların Farklılaşma İzolasyonu

Metabolik yeniden programlama, M1 ve M2 makrofaj polarizasyonu için bir özellik ve önkoşuldur. Bu el yazması, fare kemik iliği türevli makrofajlarda glikoliz ve mitokondriyal fonksiyonun temel parametrelerinin ölçümü için bir testi açıklamaktadır. Bu araç, belirli faktörlerin makrofajın metabolizmasını ve fenotipini nasıl etkilediğini araştırmak için uygulanabilir.

Gerçek zamanlı Ekstrasellüler Flux Analizi Polarize M1 ve M2 Kemik İliği-türevli Makrofagların Metabolik Karakterizasyonu

Biz insan makrofajlar proteomik imzaları elde edilir ve bu düşük oksijen çevre makrofaj polarizasyon üzerindeki etkisinin belirlenmesi için geçerli bir iletişim kuralı mevcut.

Düşük oksijen ortamı altında insan makrofaj polarizasyon proteomik analizi

Bu protokol, insan M1 veya M2 polarize makrofajlardaki Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunu, periferik-kan monositlerinin GFP etiketli virülan strain H37Rv ile enfekte olan makrofaj benzeri hücrelere farklılaşmasına dayanan ve seçilen M1/M2 belirteçlerinin ifadesini içeren 10 renkli bir panel kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edilen bir yöntem sağlar.

M1 ve M2 İnsan Monosit Türevi Hücrelerin Polarizasyonu ve Mikobakteri Tüberküloz Enfeksiyonu Üzerine Akış Sitometrisi ile Analiz

M2 benzeri tümör ilişkili makrofajlar (TAM) tümör ilerlemesi ve kanserde zayıf prognoz ile ilişkilidir. Bu protokol, THP-1 monosit benzeri hücreleri 14 gün içinde M2 benzeri makrofajlara yeniden ayırt etmek ve polarize etmek için ayrıntılı bir kılavuz görevi görür. Bu model, TAM'ın tümör mikroçevriciliği içindeki antienflamatuar etkilerini araştırmak için temel oluşturur.

makrofaj Farklılaşması ve Polarizasyonu, İnsan Monosit Benzeri THP-1 Lösemi Hücre Hattı Kullanarak M2 Benzeri Bir Fenotipe Dönüştür

Bu protokol, farelerden kemik iliği kaynaklı makrofajların izolasyonunu ve kültürünü açıklamaktadır.

Farelerden Kemik İliği Kaynaklı Makrofajların İzolasyonu ve Kültürü

Burada, mevcut protokollerin güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini iyileştirmeyi ve daha fazla araştırmayı teşvik etmeyi amaçlayan, in vitro implant yüzeylerinin immünomodülatör potansiyelini değerlendirmek için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz. Salgı sitokin profilleri, mRNA ekspresyonu ve hücre yüzey belirteçleri, titanyum üzerinde yetiştirilen makrofaj polarizasyonunu araştırmak için kan monositinden türetilmiş makrofajlar kullanılarak izlendi.

İmplant Yüzeylerinde M1 ve M2 İnsan Monosit Türevi Makrofajların Polarizasyonu ve Karakterizasyonu 

Öğrenin, kemik iliği kaynaklı makrofajları polarize etmek ve M1/M2 fenotiplerini akış sitometri ile analiz etmek. Bu yöntem immünoloji ve hücre biyolojisi araştırmalarında bağışıklık yanıtlarını anlamaya yardımcı olur.

Kemik İliği Türetilmiş makrofajlar kullanarak Makrofaj Polarizasyon İncelenmesi

Daha fazla video keşfet