M1 ve M2 İnsan Monosit Türevi Hücrelerin Polarizasyonu ve Mikobakteri Tüberküloz Enfeksiyonu Üzerine Akış Sitometrisi ile Analiz

Bu protokol, insan M1 veya M2 polarize makrofajlardaki Mycobacterium tuberculosis enfeksiyonunu, periferik-kan monositlerinin GFP etiketli virülan strain H37Rv ile enfekte olan makrofaj benzeri hücrelere farklılaşmasına dayanan ve seçilen M1/M2 belirteçlerinin ifadesini içeren 10 renkli bir panel kullanılarak akış sitometrisi ile analiz edilen bir yöntem sağlar.

Bu protokol, 10 renk akış sitometrisi kullanılarak çeşitli makrofaj alt kümelerinde yeşil floresan proteini etiketli Mtb'nin görselleştirilmesi ve derin karakterizasyonuna dayalı olarak insan monosit türevi hücrelerin immün polarizasyonunu takip etme fırsatı sunar. Bu, enfeksiyondan önce ve sonra fenotip ve fonksiyonun değerlendirilmesi de dahil olmak üzere, M1 veya M2 polarize makrofajlarda Mtb enfeksiyonuna verilen yanıtları incelemek için etkili ve tekrarlanabilir bir yöntemi temsil eder. PBMC'yi insan donörü buffy coats'tan izole etmek için, 15 mililitre buffy coat kanını 50 mililitrelik bir tüpün yanından 15 mililitre yoğunluk gradyanlı ortama yavaşça yerleştirmek için bir pipet kullanın ve hücreleri santrifüjleme ile ayırın.

Üst plazma katmanını çıkarmak için steril bir Pasteur pipeti kullanın ve mononükleer hücre katmanını dikkatlice 50 mililitrelik yeni bir tüpe aktarın. Hücrelere serumsuz RPMI ortamını 50 mililitrelik bir son hacme ekleyin ve santrifüjlemeden önce tüpü birkaç kez hafifçe ters çevirin. Daha sonra hücreleri saymak için 20 mililitre serum içermeyen ortamda yeniden süspanse edin.

Makrofaj farklılaşmasını başlatmak için, hücreleri mililitre serumsuz ortam konsantrasyonu başına 5 kez 10 ila 6. hücrelere seyreltin ve iki mililitre hücreyi altı oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına tohumlayın. Hücrelerin kuyu diplerine yapışmasını sağlamak için plakayı iki ila üç saat hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. İnkübasyonun sonunda, kuyucukları yıkama başına bir mililitre serumsuz ortamla üç kez yıkayın ve mililitre başına 50 nanogram GM-CSF veya mililitre başına 50 nanogram M-CSF ile desteklenmiş iki mililitre tam RPMI ortamı ekleyin. M1 veya M2 farklılaşması için sırasıyla yapışan hücrelerin her bir oyuğuna.

Polarizasyonun başlamasından üç gün sonra, her oyuktan bir mililitre süpernatanı, uygun büyüme faktörleri ile desteklenmiş bir mililitre taze tam ortam ile dikkatlice değiştirin. Kültürün altıncı gününde, GM-CSF ile muamele edilmiş kuyucuklara mililitre interferon gama başına 50 nanogram ve mililitre LPS başına 10 nanogram ve M-CSF ile muamele edilmiş kuyucuklara mililitre IL-4 başına 20 nanogram ekleyin. Daha küçük monositlerin daha büyük makrofaj benzeri hücrelere farklılaştığından emin olmak için monositten türetilmiş hücre kültürlerinin morfolojisini ışık mikroskobu ile düzenli olarak kontrol edin.

Bir Mtb kültürü kurmak için, bir biyogüvenlik Seviye III tesisinde, hücre kültürü inkübatöründeki tüpte 24 saatlik bir inkübasyon için 50 mililitrelik filtrelenmiş kapaklı bir tüpte bir mililitre çözülmüş bakteri süspansiyonu alikotunu dokuz mililitre TB tam ortamı ile karıştırın. Ertesi gün, bakterileri santrifüjleme ile toplayın ve bakterileri hücre kültürü inkübatörüne geri döndürmeden önce peleti 15 ila 20 mililitre taze TB tam ortamında yeni bir 50 mililitrelik filtrelenmiş kapak kültürü tüpünde yeniden süspanse edin. Yedi ila 10 günlük kültürden sonra, bakterileri yıkama başına 35 ila 40 mililitre steril yıkama tamponunda iki kez yıkayın, ikinci yıkamadan sonra bakterileri bir mililitre serumsuz RPMI ortamında yeniden süspanse edin.

Bakterilere dokuz mililitre serumsuz RPMI ortamı daha ekleyin ve bakterileri Sınıf II biyogüvenlik kabininde bir su banyosu sonikatöründe 37 santigrat derecede beş dakika boyunca sonikleştirin. Daha sonra biyogüvenlik kabini içine yerleştirilmiş bir spektrofotometrede 600 nanometre dalga boyunda bir mililitre bakteri süspansiyonunun optik yoğunluğunu ölçün. Monositten türetilmiş hücreleri enfekte etmek için, bakterileri serumsuz ortamda mililitre konsantrasyon başına 5 kez 10 ila 6. koloni oluşturan birimlere seyreltin ve altı oyuklu hücre kültürü plakasının her bir oyuğundaki süpernatanı, bir mililitre taze serumsuz ortam ve beş enfeksiyon çokluğu elde etmek için oyuk başına bir mililitre bakteri süspansiyonu ile değiştirin.

Hücre kültürü inkübatöründe dört saatlik bir inkübasyondan sonra, her bir kuyucuğu, yıkama başına bir mililitre steril yıkama tamponu ile üç kez yıkayın, her yıkamadan sonra tüm tampon hacmini kuyucukların köşelerinden çıkarmak için plakayı dikkatlice eğin. Daha sonra Mtb ile enfekte olmuş monosit türevli hücreleri antibiyotik olmadan iki mililitre tam ortamda yeniden süspanse edin. Hücreleri akış sitometrisi için boyamak için, enfekte olmuş hücreleri en az 30 dakika boyunca oyuk başına 0.5 milimolar EDTA ile desteklenmiş bir mililitre FACS tamponu ile inkübe edin.

İnkübasyonun sonunda, ayrılan hücreleri nazik pipetleme ile toplayın ve hücreleri santrifüjleme için ayrı ayrı vidalı kapaklı mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri yaklaşık 50 mikrolitre florokrom konjuge anti-insan antikor kokteyli ve ilgilenilen canlılık boyası içinde yeniden süspanse edin ve hücreleri ışıktan korunarak dört santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. Yıkadıktan sonra, hücreleri 200 mikrolitre taze hazırlanmış fiksasyon tamponu ile oda sıcaklığında 30 dakika boyunca ışıktan korunarak sabitleyin.

Fiksasyon ve yıkamadan sonra, hücreleri 400 mikrolitre FACS tamponunda yeniden süspanse edin ve hücreleri bir mililitre mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Hücreleri analiz etmek için, kokteyldeki her bir florokrom konjuge antikor için floresan sinyalini telafi etmek için kompanzasyon boncukları kullanın ve negatif hücre popülasyonu için kapıyı ayarlamak için boyanmamış hücreler kullanın. Daha sonra numune başına en az 50.000 hücre elde edin.

Hem M1 hem de M2 monosit türevli hücreler, Mtb enfeksiyonu üzerine daha yüksek bir tanecikliliğe dikey bir kayma ve azaltılmış hücre boyutu gösterir. Mtb ile enfekte M1 ve M2 hücrelerinde, enfekte olmamış M0 hücrelerine kıyasla beş enfeksiyon çokluğunda gelişmiş bir hücre ölümü de gözlenir. Dikkat çekici bir şekilde, dört saatlik enfeksiyondan sonra M2 hücrelerinde M1 hücrelerine kıyasla önemli ölçüde daha yüksek bir Mtb GFP ekspresyonu gözlenir.

Enfekte olmamış M1 ve M2 hücreleri, sırasıyla CD64 ve CD86 veya CD200 reseptörleri ve CD163 ko-ekspresyonu ile karakterize edilebilir. Dört saatlik Mtb enfeksiyonundan sonra, Mtb GFP pozitif M1 polarize hücrelerde CD200 reseptör pozitif hücrelerin sıklığında artış gözlenirken, M2 hücrelerinde CD163 ekspresyonu azalır. Mtb GFP bakterileri, konfokal mikroskopi ile CD64 pozitif M1 hücrelerinde ve CD163 pozitif M2 hücrelerinde de gözlenebilir.

UMAP analizi, dört saatlik Mtb enfeksiyonunun makrofaj polarizasyonunu etkilemek için yeterli olmadığını, 24 saatlik enfeksiyonun ise farklı yüzey belirteç ekspresyon profillerini ifade eden enfekte olmamış ve enfekte M1 ve M2 hücrelerinin net bir şekilde ayrılmış kümeleriyle sonuçlandığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, PhenoGraph analizi, farklı boyutlarda 24 farklı kümenin, M1 ve M2 ile enfekte olmamış ve Mtb ile enfekte olmuş hücreler arasında benzersiz bir şekilde dağıldığını göstermektedir. M1 veya M2 polarizasyonunun veya Mtb enfektivitesinin etkinliği, insan donörleri arasında önemli ölçüde değişebilir.

Bu nedenle, deneysel varyasyonları azaltmak için her deneye en az iki donörün dahil edilmesi önerilir. Bu model, akış sitometrisi, konfokal mikroskopi, mRNA ekspresyon analizi, çözünür faktörlerin multipleks tahlilleri ve GFP ekspresyonu veya koloni oluşturan birimler kullanılarak bakteri miktar tayini kullanılarak insan makrofajlarının eşzamanlı olarak değerlendirilmesine izin verir.