Tek molekül floresans In Situ hibridizasyon (smFISH) analizi Budding Maya bitkisel büyüme ve mayoz

Bu optimize edilmiş tek moleküllü RNA in situ hibridizasyonunun veya smFISH'in genel amacı, tomurcuklanan mayanın vejetatif büyümesi ve mayoz bölünmesi sırasında hücre başına tek tek RNA moleküllerini tespit etmek ve ölçmektir. Bu yöntem, hücre altı RNA lokalizasyonunda gen ekspresyonundaki hücreden hücreye değişkenliği ortaya çıkarır ve bu nedenle gen regülasyonunu incelemek için güçlü bir tekniktir. smFISH tarafından ortaya çıkarılabilecek benzersiz bilgilerin yanı sıra, tekniğin ana avantajı, bir kez optimize edildiğinde sağlam ve yüksek oranda tekrarlanabilir olmasıdır.

Bu protokolün gösterilmesi için mayotik bir kültür kullanılacaktır. Kültürü %3 formaldehit içinde sabitlemek için, iki mililitrelik bir mikrosantrifüj tüpünde 160 mikrolitre %37 formaldehite 1840 mikrolitre kültür ekleyin. Karıştırmak için yaklaşık beş kez ters çevirin.

Tüpü 20 dakika boyunca oda sıcaklığında bir silindir tamburuna yerleştirin. 20 dakika sonra, gece boyunca döndürerek dört santigrat derecede sabitlemeye devam edin. Ertesi gün, önce 200 milimolar vanadil ribonükleozit kompleksini veya VRC'yi 65 santigrat derecede en az 10 dakika çözerek sindirime hazırlanın.

Sindirim ana karışımını hazırlamak için önce 2125 mikrolitre tampon B'yi 15 mililitrelik bir tüpe pipetleyin. Ardından, sıcak VRC'yi tamamen yeniden süspanse etmek için beş saniye boyunca girdap yapın ve 15 mililitrelik tüpe 200 mikrolitre VRC ekleyin. Karışım açık kahverengimsi yeşil renkte görünmelidir.

Mayotik numuneyi oda sıcaklığında bir buçuk dakika boyunca 21.000 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice aspire edin, peleti rahatsız etmemek için vakum ucunu peletin karşı tarafına yerleştirin. Hücreleri bir buçuk mililitre soğuk tampon B'de, karıştırmak için yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin.

Bir buçuk dakika boyunca 21.000 x g'da santrifüjleyin. Sıvının büyük kısmını vakum aspirasyonu ile çıkarın ve yaklaşık 100 mikrolitre geride bırakın. Hücreleri bir buçuk mililitre soğuk tampon B'de yeniden süspanse edin. Numuneleri santrifüjleyin, sıvıyı çıkarın ve hücreleri tekrar bir buçuk mililitre soğuk tampon B'de yeniden süspanse edin.

Bir buçuk dakika boyunca 21.000 x g'da santrifüjleyin. Pipetleme ile sıvıyı tamamen aspire edin. Hücreleri 425 mikrolitre sindirim ana karışımında yeniden süspanse edin ve kısaca girdap yapın.

Tüpe beş mikrolitre zimolyase ekleyin ve karıştırmak için iki ila üç saniye girdaplayın. Tüpü bir silindir tamburuna yerleştirin ve 30 santigrat derecede 15 ila 30 dakika sindirin. 15 dakika sonra, hücreleri her beş dakikada bir mikroskopi ile kontrol edin ve hücrelerin yaklaşık% 80'i şeffaf olmayan ve kırılmayan göründüğünde sindirimi durdurun.

Tüpü üç dakika boyunca 376 x g'da santrifüjleyin. Süpernatanı tamamen çıkarın. Karıştırmak için bir ila iki kez yukarı ve aşağı pipetleyerek hücreleri bir mililitre tampon B ile nazikçe yeniden süspanse edin.

Tüpü santrifüjleyin ve tamponu çıkarın. Hücreleri bir mililitre% 70 etanol içinde yavaşça yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında üç buçuk ila dört saat inkübe edin. Hibridizasyon prosedürüne başlamak için, hücre tüpünü üç dakika boyunca 376 x g'da santrifüjleyin.

% 70 etanolün 500 mikrolitresini tüpten çıkarın. Kalan hücreleri yeniden süspanse etmek ve hücreleri düşük yapışma özelliğine sahip bir tüpe aktarmak için nazikçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Numunenin düşük yapışma özelliğine sahip bir tüpe aktarılması, sonraki formamid yıkamaları sırasında fazla hücre kaybını önlemek için kritik öneme sahiptir.

Düşük yapışma tüpünü santrifüjleyin ve tüm etanolü çıkarın. Tüpe bir mililitre %10 formamid yıkama tamponu ekleyin ve hücreleri yeniden süspanse etmek için iki ila üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Metin protokolünde açıklandığı gibi hibridizasyon çözeltilerini hazırlarken hücrelerin yaklaşık 20 dakika oda sıcaklığında sertleşmesine izin verin.

Numuneyi santrifüjleyin ve süpernatanı tehlikeli atığa çıkarın. Tüpe her bir hibridizasyon çözeltisinden en az 50 mikrolitre ekleyin ve karıştırmak için tüpü hafifçe vurun. Karanlıkta en az 16 saat boyunca bir silindir tambur üzerinde 30 santigrat derecede inkübe edin.

Hibridizasyon tamamlandığında, ışıktan korumak için hücre tüpünü folyo kaplı bir kutuya yerleştirin. Numuneyi 376 x g'da üç dakika santrifüjleyin. Süpernatanı pipetleme yoluyla tehlikeli atığa çıkarın.

Numuneyi bir mililitre %10 formamid yıkama tamponunda iki ila üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek yeniden süspanse edin. Işıktan korumak için hücre tüpünü folyo kaplı bir kutuya geri yerleştirin ve 30 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin. 30 dakika sonra numuneyi santrifüjleyin.

Süpernatanı pipetleyerek tehlikeli atığa çıkarın ve yaklaşık 50 mikrolitre bırakın. İki ila üç kez hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyerek numuneyi bir mililitre DAPI çözeltisinde yeniden süspanse edin. Bir kez daha, hücre tüpünü folyo kaplı kutuya yerleştirin ve 30 santigrat derecede 30 dakika inkübe edin.

Numuneyi santrifüjleyin ve süpernatanı pipetleme ile tamamen çıkarın. Hemen görüntülenmeyecek numuneler için, peleti enzimler olmadan 50 mikrolitre GLOX tamponunda yeniden süspanse edin. Karıştırmak için üç ila dört kez yukarı ve aşağı pipetleyin.

Görüntüye hazır olana kadar folyo kaplı kutuda dört santigrat derecede tutun. Numunelerin hemen görüntülenmesi için, enzimlerle birlikte 15 ila 20 mikrolitre GLOX tamponu ekleyin. Beş mikrolitreyi bir kapak fişine pipetleyin ve kapak fişini bir slayt üzerine koyun.

Kapak fişinin yerleştirildiği sürgünün üzerine bir laboratuvar mendili yerleştirin. Slaytı ayarlamak için mendile hafifçe basın. Slaytı mikroskop odasına aktarmak için alüminyum folyo ile kaplı bir kutuya yerleştirin.

Bu protokol, iki mRNA izoformunu ifade eden NDC80 geninin ekspresyonunu incelemek için kullanıldı. Uzun kodu çözülmemiş transkript izoformu, kısa izoforma kıyasla 400 baz çifti beş asal uzantıya sahiptir. İki set prob tasarlandı.

CF 590 seti, uzun izoformun benzersiz beş asal bölgesine bağlanır ve Q 670 seti, her iki izoformun ortak bölgesine bağlanır. Optimize edilmiş koşullar altında, her iki prob seti için farklı smFISH noktaları açıkça tanımlandı. İki prob seti, vejetatif büyüme ve mayoz bölünme sırasında NDC80 ekspresyonunu incelemek için kullanıldı.

Vejetatif hücrelerde, Q 670 prob setinden gelen sağlam sinyal tespit edildi, ancak CF 590 prob setinden tespit edilmedi. Buna karşılık, her iki prob setinden gelen sağlam sinyal mayotik fazda tespit edildi ve noktaların çoğu birlikte lokalize sinyale sahipti. Northern blot analizi, uzun izoformun özellikle mayozda eksprese edildiğini doğruladı.

Vejetatif hücrelerin hücre başına beş kısa izoform transkript medyanına sahip olduğu bulunurken, mayotik faz hücrelerinde medyan hücre başına dört transkripte önemli ölçüde düşmüştür. Mayotik fazda, hücre başına ortalama uzun izoform transkript sayısı 21 idi ve hücrelerin% 100'ü transkripti ifade etti. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik uygun şekilde yapılırsa 72 saat içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, öncelikle sindirim süresini ve optimum sinyal-gürültü oranını elde etmek için gereken smFISH problarının konsantrasyonunu optimize etmek önemlidir. Ek olarak, nükleaz aktivitesini önlemek için sindirim ve gece boyunca hibridizasyon sırasında VRC eklemeyi unutmayın. Bu gelişme ile bu teknik, araştırmacıların dinamik gen regülasyonunu ve hücre altı RNA lokalizasyonunu keşfetmelerinin yolunu açtı.

Bu videoyu izledikten sonra, tomurcuklanan maya mayozunda tek moleküler RNA BALIĞININ nasıl gerçekleştirileceğini iyi anlamış olmalısınız.