Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA'ların görselleştirilmesi

Bu prosedürün amacı, endoplazmik retikulum veya er ile ilişkili haberci RNA'yı görselleştirmektir. Bu, ilk olarak memeli doku kültürü hücrelerinin örtü kızakları üzerine kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, er'ye bağlı olmayan sitoplazmik mRNA'yı çıkarmak için hücreleri ekstraksiyon tamponu ile tedavi etmektir.

Sonraki adımlar, hücreleri hızlı bir şekilde sabitlemek ve mRNA'yı floresan in situ hibridizasyon ile boyamaktır. Son adımlar, er ile ilişkili floresan miktarını görüntülemek ve ardından ölçmektir. Sonuç olarak, sonuçlar mRNA'ların farklı koşullar altında bu organelin yüzeyi ile nasıl ilişkili olduğunu gösterebilir.

Bu yöntem, salgı proteinlerini kodlayan mRNA'ların ribozomlardan veya protein sentezinden bağımsız olarak er'nin yüzeyinde tutulup tutulamayacağı gibi temel hücre biyolojik sorularının yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, birkaç zor hücresel manipülasyon adımı içerdiğinden kritik öneme sahiptir. Doku kültürü hücrelerinin, deneyden önce en az bir gün süreyle asitle muamele edilmiş örtü astarları üzerine tohumlanması, yedi maliyetlidir ve OS hücreleri nedeniyle, yüksek salgılanan protein üretimine ve iyi tanımlanmış ER'lere sahip oldukları için uygun seçimlerdir.

Ekzojen bir Mr NA araştırılıyorsa, tohumlamadan bir gün sonra hücreleri transfekte edin ve daha sonra MR'ye izin vermek için hücreleri 18 saat daha inkübe edin. NA ifadesi. Deney gününde. Yüksek ekstraksiyon verimliliği elde etmek için, mRNA'ların translasyon hücrelerinden bağımsız olarak ER ile etkileşime girip girmediğini tespit etmek için hücreler, ekstraksiyondan 30 dakika önce ribozomlar ve mRNA arasındaki etkileşimi bozan ajanlarla tedavi edilebilir veya

Bu durumda, translasyonel inhibitörler, saf Mycin ve Homo Harrington in veya HHT kullanılır. Kazma tonin ve bir XCHO'luk bir çalışma tamponu içeren taze hazırlanmış ekstraksiyon çözeltisini 37 santigrat dereceye ısıtarak başlayın. Bir ısıtma bloğunu 40 santigrat dereceye ayarlayın ve düz bir çalışma yüzeyi oluşturmak için ters çevrilmiş bir metal blok yerleştirin.

Metal bloğu suyla nemlendirin, ardından taze bir paraform parçasıyla kaplayın ve RNA içermeyen eldivenler ve tüy bırakmayan dokular kullanarak kabarcıkları düzeltin. Daha sonra, her bir kapak fişi çifti için, hücreleri yıkamak ve dört oyuğa sabitlemek için altı oyuklu bir plaka hazırlayın. Son iki kuyucuğa iki mililitre ısıtılmış CHO tamponu ekleyin.

Fiksasyon çözeltisinden iki mililitre ekleyin. Ardından plakayı ihtiyaç duyulana kadar 37 santigrat derecede saklayın. Isıtma bloğuna, işlenecek hücrelerin her bir kapak kayması için 100 mikrolitrelik bir ekstraksiyon çözeltisi damlatın.

Şimdi bir kuyumcu forsepsini kullanarak, hücre kaplı bir kapak fişi alın ve CHO tamponu içeren birinci ve ikinci kuyucuklara daldırın. Bu, büyüme ortamını yıkar. Ardından, kapak fişinin arka tarafındaki fazla tamponu hızla temizleyin.

Ve kısa bir süreliğine kapak kayma hücresini, ekstraksiyon çözeltisinin üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin. 10 saniye sonra, kapak kayma hücresi tarafını en az 15 dakika kalması gereken sabitleme tamponuna aktarın. Hücre ekstraksiyon adımı, ER'ye bağlı olmayan tüm cyop plasticky mRNA'yı çıkarmak için gereklidir.

Ek olarak, hücrelerin ekstraksiyon yapılmadan sabitlendiği bir kontrol kapak fişi hazırlayın. Fiksasyondan sonraki adım. Bu unex ekstrakte edilmiş kontrol hücrelerini PBS ile iki kez yıkayın ve ardından PBS ve TRITTON X 100'e nüfuz edin.

Gerekli olmasa da, ekstrakte edilen hücrelerdeki kazma, hücrelere nüfuz ettikten sonra arka plan floresansını azaltmak için aynı PBS ve Triton çözeltisi ile yıkanmalıdır. Sabitleyici ve deterjanı çıkarmak için slaytları PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, slaytları bir kerelik sodyum sitrat tamponunda veya SSC'de% 60 fide ile iki kez yıkayın.

Bununla birlikte, tüm hücreleri boyamak için bir oligo DT balık probu kullanılırsa, poli mRNA fide seviyesini %25'e düşürürArdından, balık probu ile hibridizasyon tamponunu hazırlayın. Stok balık sondasını, hibridizasyon tamponunda aynı fide konsantrasyonunda 0.2 mikromolar ile seyreltin. Şimdi boyama odasını hazırlayın.

150 milimetrelik bir Petri kabının altını suyla doldurun. Sonra su üzerinde bir parça paraform yüzdürün ve tabağı ters çevirin. Para film, su çıkarken tabağın dibine yapışacaktır.

Herhangi bir hava kabarcığı varsa, bunları eldivenlerle ve tüy bırakmayan mendillerle çıkarın, her bir kapak için kayma pipeti, balık Probunu içeren 100 mikrolitre hibridizasyon solüsyonunu para film üzerine pipetleyin. Şimdi kapak kayma hücresi tarafı aşağı bakacak şekilde çözeltinin üzerine yerleştirin. Son olarak, odayı ılık nemlendirilmiş bir odada beş ila 24 saat inkübe edin.

Balık boyama süresi sona ermeden önce, RNA'sız bir yıkama alanı hazırlayın, düz yüzeyi suyla ıslatın ve param şeritleri ile kaplayın. Hava kabarcıklarını eldiven ve tüy içermeyen mendillerle çıkarın. Boyama bittiğinde, hazneyi her bir kapak kayması için çalışma alanına aktarın Yıkama alanına bir mililitre yıkama tamponu pipetleyin.

Kapak fişlerini aktarmak için para film: İlk olarak, her bir kapak fişinin kenarına yakın bir yerde yarım mililitre balık yıkama tamponu pipetleyin. Sıvı, kılcal hareket ile kapak kızağının altına çekilecektir. Daha sonra, forseps kullanarak, kapak fişlerini hazneden çıkarın ve bunları yıkama tamponu damlalarının üzerine yerleştirin.

Ve beş dakika bekleyin. Bu yıkama tekniğini üç kez daha tekrarlayın. Yıkama alanında taze bir mililitre damla yıkama tamponu kullanın.

Bu arada, cam slaytları %70 etanol ile temizleyin ve tüy bırakmayan mendillerle kurulayın. Daha sonra her bir kapak kayma için, bir slayta 25 mikrolitre DPI montaj solüsyonu uygulayın Forseps kullanarak, bir kapak fişi alın ve fazla yıkama tamponunu çıkarmak için arka tarafını tüy bırakmayan bir mendille kurulayın. Ardından, kapak kayma hücresi aşağı bakacak şekilde montaj solüsyonunun üzerine aktarın.

Tamamlanan slaytlar, maliyet olarak görüntülenene kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Plasental alkalen fosfataz veya sitokrom P 4 58 B içeren plazmitlerle transfekte edilen yedi hücre ya tonin ile ekstrakte edildi ve daha sonra ER ile ilişkili olan bu mRNA'nın yüzdesini belirlemek için sabitlendi veya doğrudan sabitlendi. Nükleer olmayan floresan her iki numunede de ölçüldü ve her iki mRNA için ER ile ilişkili mRNA'nın fraksiyonu hesaplandı.

Sitoplazmik fraksiyonun yaklaşık% 60'ı, bu transkriptlerin ER ilişkisini izlemek için ER ile ilişkilendirildi. Ribozom ayrışması transfekte edildikten sonra yedi hücre kontrol ortamı, pur MYCIN veya HHT ile muamele edildi ve daha sonra tonin ve sabit mRNA ekstrakte edildi. Boyama, A LPP'nin, ancak CYP sekiz P bir mRNA'nın ribozom bozulmasından sonra ER ile ilişkili kaldığını ortaya çıkardı.

mRNA miktar tayini bu gözlemi destekledi ve daha da önemlisi nükleer mRNA seviyesinin tüm örneklerde tutarlı olduğunu gösterdi. Bu veriler, A LPP transkripti gibi ER hedefli mRNA'ların bir alt kümesinin, ribozom demontajından sonra ER'nin yüzeyinde tutulduğunu ortaya koymaktadır. Bu protokolü kullanarak, çeşitli mRNA'ların, mRNA nükleer ihracatını analiz etmek için kullanılan diğer tahlillerle birleştirildiğinde, endoplazmik retikül gibi farklı hücre altı bölmelere nasıl lokalize olduğunu araştırmaya başlayabiliriz.

Bu prosedür, yeni sentezlenen mRNA'ların er'nin yüzeyine ilk hedeflemesini incelemek için kullanılabilir.