Name: Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNAların görselleştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-12-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Öğrenin, memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum ile ilişkili mRNA'ları floresan in situ hibridizasyonu kullanarak görselleştirme yöntemini. Bu teknik, sitoplazmik ve ER bağlı mRNA'ları ayırt ederek gen ifadesi düzenlemesini incelemenizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Bu çalışma XAC ve AFP Ulusal Bilim ve Kanada&#39;nın Mühendislik Araştırma Konseyi bağışları ile desteklenmiştir

1. Ekstraksiyon için Materyallerinin Hazırlanması <ol><li> Hücre Hazırlanması <ol><li> Deney öncesinde en az bir gün için asit ile tedavi edilen lameller üzerine Tohum doku kültürü hücreleri. Bu iki hücre hatları salgılanan protein güçlü üretim sergilemek ve iyi tanımlanmış bir ER sahip olarak biz, COS-7 veya U2OS kullanın. Yüksek ekstraksiyon verimi elde etmek için, hücrelerin deney gününde lamel confluency% 80 geçmemesi gerektiğini unutmayın. </li><li> Belirli bir eksojen mRNA araştırılmaktadır, hücreler transfeksiyon standart protokoller kullanılarak ilgilenilen geni ihtiva eden plasmidler ile tohumlama bir gün sonra, transfekte edilir. Hücreler daha sonra ekstre etmeden önce en azından 18 saat için mRNA ifade etmek için izin vardır. </li></ol></li><li> Çeviri İnhibitörleri ile Hücreleri Tedavisi <ol><li> ER ile mRNA&#39;ların dernek bakım sağlam ribozomların etkisini test etmek için, hücrelerin dernek bozabilir çeviri inhibitörleri ile tedavi edilebilirmRNA 11 ribozomların. </li><li> (4-metil-2 ,6-dinitroanilino -) - bu tür homoharringtonin (HHT), pactamycin ya da 2 gibi bir çeviri başlatma inhibitörü, aynı anda için meşgul ribozom izin verirken, N-methylpropionamide (mdmp), transkript ile ilişkilendirilmesi yeni ribozom önlemek Çeviri 12-14 tamamlayın. Memeli hücrelerinde en proteinler için çeviri oranı ne olursa olsun, kodon kullanım veya mRNA uzunluğu 15, ikinci başına 5 amino asit olduğu için, 30 dakikalık bir muamele 27,000 nükleotidler (proteinler için kodlama yapan sürece açık okuma çerçeveleri ile mesajların ribozom kapalı temizlemek gerekir ) 9,000 amino asitler sürece. </li><li> Böyle puromisin gibi İnhibitörleri doğmakta zincirin erken ejeksiyon teşvik etmek ve böylece polysomes 12 bozabilir. Ancak tamamen mRNA ile puromisin-tedavi ribozomların dernek bozmaya, EDTA gibi magnezyum şelatörlerin digitonin ekstraksiyon tamponu 11 eklenmelidir. </li> &lt;li&gt; Bu deneyde, hücreler 200 uM puromisin, 5 uM HHT, veya ekstraksiyon önce 30 dakika için kontrol aracı ile tedavi edilir. </li></ol></li><li> Digitonin Ekstraksiyon Tampon hazırlanması. Ücretsiz (yani sitoplazmik, non-ER-ilişkili) transkript engel olmadan ER-yerelleştirilmiş mRNA&#39;ların görselleştirmek için, biz seçici digitonin, 3β-hydroxysterols ile tercihen etkileşime bir steroid glikozit ile hücre geçirgenliği. Düşük konsantrasyonlarda, digitonin seçici &#39;leakiness&#39; 16 sebep plazma zar bölümleri permeabilizes. Aksine, kolesterol yoksul ER zarı ve çekirdek zarı, 16,17 değişmeden kalır. <ol><li> Digitonin (Sigma Aldrich) tozu% 5 ağırlık / hacim deiyonize su içinde çözülür ve bu stok çözelti küçük miktarlar halinde bölünüp edilir ve -20 ° C&#39;de saklanır Bizim tecrübelerimize göre, birden fazla donma-çözülme döngüleri çözünmüş digitonin verimini azaltır. </li><li> Bir stok solüsyonuCHO 10x tampon (1x çalışma çözeltisi konsantrasyon: 115 mM Kac, 25 mM HEPES pH 7.4, 2.5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, 150 mM sakaroz), RNase içermeyen reaktiflerle hazırlanır ve -20 ° C&#39;de depolanır Bir çalışma çözeltisi (1 x tampon CHO) RNase içermeyen su ile stok çözelti seyreltilmesi ile hazırlanır ve 4 ° C&#39;de saklanır </li></ol></li></ol> 2. Digitonin Ekstraksiyon <ol><li> Ekstraksiyon Çözümleri hazırlanması <ol><li> Düz bir yüzeye sahip ısıtma bloğu ısıtılır ila 40 ° C ile ekstraksiyon sırasında bu sıcaklıkta tutulur. </li><li> RNase içermeyen bir çalışma düz bir yüzey oluşturmak için, ısıtma bloğu Parafilm M (Bemis Company, Inc) taze bir parça ile bir miktar su ve üste konan ile nemlendirilir. Parafilm levha ve ısıtma bloğu arasındaki hava kabarcıkları RNaz içermeyen eldiven ve Kimwipes (VWR) kullanılarak düzgünleştirilir. </li><li> 1x CHO tampon, bir su banyosu içinde inkübe edilerek 37 ° C&#39;ye kadar ısıtılır. </li><li> 6 oyuklu plakalar yıkamak için kullanılırve hücreler sabitleyin. 3 kuyuda her satırı bir kapak kayma için kullanılır. Satırdaki birinci iki kuyu için ısıtılmış CHO tampon, 2 ml ilave edilir. Son olarak da için, tespit çözelti 2 ml (PBS +% 4 paraformaldehit (Elektron Mikroskop Bilimleri)) ilave edilir. Hücreleri çıkarılması için hazır olana kadar Bu kaset 37 ° C inkübatör saklanabilir. </li><li> Digitonin ekstraksiyon çözeltisi hemen önce kullanmak için sıcak CHO tamponu ile% 0.025 için stok digitonin çözüm seyreltilmesi ile hazırlanır. Yine puromisin işlenmiş hücreleri için, ekstraksiyon tamponu ilave verimli ribozomların 11 bozmaya 20 mM EDTA içermelidir unutmayın. Ekstraksiyon çözeltisinden 100 ul damlaları çıkarma hemen önce, parafilm kaplı bir ısıtma bloğu üzerine yerleştirilir. </li></ol></li><li> Digitonin Ekstraksiyon ve Hücre Fiksasyon <ol><li> 37 ° C inkübatör gelen hücreleri çıkarın. </li><li> Ayıklama işlemi sırasında, lamelleri Jewler forsepsi yardımı ile işlenir. Ileforseps lamel pick up ve büyüme orta yıkamak için de içeren ikinci sonra birinci ve CHO tampon içine batırın. </li><li> Hızla bir Kimwipe ile lamel arka tarafı kapalı aşan tampon kapalı kurulayın ve hemen ekstraksiyon çözeltisi üzerine, aşağı bakacak lamel, hücre yan yerleştirin. </li><li> 10 saniye sonra, forseps ile lamel pick up ve hemen hücre yan sıra içeren% 4 paraformaldehid sabitleme tampon, yukarı bakacak, aktarın. </li><li> Oda sıcaklığında, en az 15 dakika için sabitleştirici içinde örnek inkübe izin verin. </li></ol></li><li> Unextracted Kontrol Hücrelerinin hazırlanması. Bir unextracted kontrol numunesinin hazırlanması için iyi bir fikirdir, sitoplazma içinde mRNA toplam miktarını belirlemek için. <ol><li> Lamelleri üzerinde yetiştirilen hücreler digitonin ayıklama adım (2.2.3) atlanır olması dışında, (bakınız Bölüm 2.2) yukarıdaki gibi hazırlanır. </li><li> Tespit edildikten sonra, un-Ayıklanan hücreler PBS permeabilize gerekir +% 0.1 TritonX-100 oda sıcaklığında 15 dak. </li></ol></li></ol> 3. BALIK Boyama <ol><li> Floresan in situ hibridizasyon probları için tasarlama <ol><li> Ilgili bir mRNA sekansı bu gibi birincil RNAstructure 5.0 18 olarak RNA ikincil yapı tahmini yazılımı kullanılarak katlanır. MRNA kıvrımlar görsel önemli ikincil yapıların serbest yaklaşık 50 nükleotid belirlemek için değerlendirilir. </li><li> Bu bölgenin ters tamamlayıcı prob 5 &#39;ucu (Integrated DNA Technologies firmasından satın alınmıştır) bağlanmış bir Alexa546 florofor ile sentezlenir. </li><li> Prob -20 ° C&#39;de muhafaza edilebilir 100 uM&#39;lik bir stok konsantrasyonu RNase içermeyen su ile seyreltilir </li></ol></li><li> FISH probları ile Boyama <ol><li> Digitonin-Çıkartılan hücrelerinin daha fazla geçirgenliği gerektirmez, ancak,% 0.1 2 ml ile bu sabit örnekleri tedavi Not Triton X-100 ile seyreltilirPBS FISH boyamadan önce oda sıcaklığında 15 dakika için, bir arka plan sinyali azaltmaya yardımcı olur. </li><li> Slaytlar sonra herhangi bir kalıntı paraformaldehit veya Triton X-100 uzaklaştırmak için PBS ile iki kez yıkanır. </li><li> Hücreler daha sonra 1X sodyum sitrat tampon (150 mM NaCl ve 15 mM sodyum sitrat) içinde% 25 ile% 60 formamid ile iki kere yıkanır. Genel olarak, uzunluğu 50-60 nükleotid olan belirli FISH probları için,% 60 formamid kullanılır, ancak oligo (dT) FISH sonda ile poli (A) mRNA boyama için, formamid seviyesini% 25 düşürülür. </li><li> Boyanma oda hazırlamak için, 150 mm&#39;lik bir Petri kabı alt su ile kaplıdır ve parafilm bir parça su üzerinde yüzen edilir. Böylece su parafilm tabağın tabanına bağlı sağlayan, çanak fazla döndürerek çıkarılır. Hava kabarcıkları elle Kimwipes ile kaldırılır. </li><li> Her bir lamel lekeli edilebilmesi için, eşit üzerine çıkar FISH prob ihtiva eden bir çözelti hibridizasyon 100 ul damla pipetleboyama odasında afilm. Stok FISH probunun bir çalışma konsantrasyonu için hibridizasyon tamponu içinde% 25 ile% 60 formamid (1 x SSC, 100 mg / ml dekstran sülfat, 1 mg / ml maya tRNA, 5 mM vanadil ribozit kompleks,% 25-60 formamid) ile seyreltilir 0.2 uM. Formamid miktarı, kullanılan özel sonda için optimize edilmiş ve SSC yıkama tamponu içinde olduğu gibi aynı konsantrasyonda (adım 3.3.3 bakınız) mevcut olması gerektiğine dikkat edin. </li><li> Lamel bu gibi doku kültürü kuluçka makinesi gibi bir nemlendirilmiş bir oda içinde 37 ° C sıcaklıkta boyama oda içinde FISH çözelti üzerine hücre yan yüzü aşağı bakacak şekilde yerleştirilir ve 5-24 saat için kuluçkalanır. </li></ol></li><li> Lekeli örnekleri Çamaşır ve montaj <ol><li> Bir RNaz ücretsiz yıkama alanı hazırlamak için, böyle bir laboratuar tezgah olarak düz bir yüzey üzerine parafilm bir şerit, uzandı. Parafilm yüzeye ıslak, düz olduğundan emin olmak için, üstüne parafilm yerleştirin ve elle Kimwipes ile herhangi bir hava kabarcıklarını çıkarın. </li><li> Boyama odasıdırinkübatör çıkarıldı ve bir düz yüzey üzerine yerleştirilir. Lamelleri sonra her lamel kenarında FISH yıkama tamponu yaklaşık 500 ul pipetleme tarafından süzülüyor edilir. Çözüm kılcal hareket yoluyla lamel ve parafilm arasındaki çekilecektir. </li><li> Her bir lamel için, yıkama tamponu 1 ml (1 x SCC% 25-60 formamid, 3.3.3 adım bakınız) yıkama alan parafilm (adım 3.4.1) üzerine pipetle konulur. </li><li> Forseps kullanılarak, lamelleri boyama oda çıkarılır ve her bir yıkama tamponu damla üzerine yerleştirildi ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edildi. Yıkama işlemi 3 kez tekrarlanır. </li><li> Cam slaytlar% 70 etanol ile yıkandı ve Kimwipes ile kurutulur. </li><li> Her lamel için, montaj çözümü (DAPI Fluoromount G, Güney Biotech) 25 ul slayt üzerine pipetle konulur. Bu çözüm 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindol (DAPI), lekeleri DNA içerir ve çekirdeklerin görselleştirme sağlar unutmayın. </li><li> USIng forseps ile Kimwipes, lamel arka kurutulur ve aşırı FISH yıkama tamponu örnek kurutma olmadan kapalı bulanıklaşmıştır. Her lamel sonra montaj solüsyonu damla üzerine, aşağı bakacak hücre yan yerleştirilir. </li><li> Atlı sonra numuneler etiketlenir ve 4 mağaza olabilir ° C </li></ol></li></ol> 4. Görüntüleme ve Ölçülmesi <ol><li> Görüntüleme <ol><li> Bir Epifloresans mikroskop görüntüsü FISH boyama sonrasında hücreler için kullanılır. Transfekte hücre uygun kanal parlak floresan sinyal tarafından untransfected hücreleri ayırt edilebilirler. İdeal olarak, her bir alınan alanın aynı zamanda ölçümü için arka plan floresan belirlemek için kullanılmak üzere bir untransfected hücre içerir. </li><li> Için FISH ve DAPI kanalın her alanın görüntüleri elde edilir. Hücreler protein işaretleri ile birlikte-lekeli Ek olarak, eğer, immünofloresans kanalın bir görüntü de elde edilir. Digitonin çıkarma de kullanılabilir dikkat edinizER-bağlı ribozomlar ve protein 11 görselleştirmek için. </li><li> Alanlar arasındaki floresans yoğunlukları karşılaştırıldığında olabilir emin olmak için, her bir kanal için maruz kalma süresi deney her set için sabit kalmalıdır. </li><li> Yine farklı lamelleri üzerine hücreleri arasındaki floresan yoğunlukları mukayese edilebilir olmasını sağlamak için, FISH sinyal epiluminescence yoğunluğu veya çürüme gün-gün değişiklikleri görüntüleme tek bir oturuşta lamelleri her minimize edilmelidir. </li></ol></li><li> Niceleme. ER yerelleştirilmiş mRNA miktarını ölçmek için, Nikon NIS Eleman yazılımı kullanın. Bununla birlikte bu tür ImageJ gibi diğer görüntü analiz programı kullanılır. <ol><li> Nikon NIS ELEMANI görüntü analizi aracını kullanarak, hücre çevre ve çekirdek İlgi (ROI) ayrı Bölgesi olarak özetlenmiştir. </li><li> Her bir ROI, floresan yoğunluğu (I T total hücre yoğunluğu ve ben için N içinNükleer yoğunluk) ve alan (A T ve A N) kaydedildi ve bir excel elektronik tablo ihraç edilmektedir. </li><li> Her bir görüntü için, arka plan floresan yoğunluğunu (I B) olmayan bir transfekte edilmiş bir hücre yoğunluğu kayda tarafından belirlenir. Poli (A) mRNA düzeyleri analiz ediliyor ise, bir hücre serbest bölge seçilir. </li><li> ER toplam miktarı (ekstre hücreleri) ve sitoplazmik (unextracted hücreleri) floresan formül ile hesaplanır: [A T] [I T - I B] - [A N] [I N - I B] </li><li> Nükleer boyanma yoğunluğu de hesaplanır ve çeşitli tedaviler arasında iç kontrol olarak da kullanılabilir. Çekirdekler digitonin tedavi 17 veya ribozom bozulması 11 etkilenmez yana, nükleer mRNA miktarı bu tedavilerin her biri arasında sabit kalmalıdır. Aşağıdaki formül kullanılır nükleer floresans hesaplamak için: [A N] [I N - IB] </li><li> ER-hedefli olan sitoplazmik mRNA yüzde 30-40 unextracted hücreler (tekrar 4.2.4) elde edilen ortalama sitoplazmik floresans bölünmesiyle 30-40 çıkarılan hücrelerin ortalama ER floresans (Madde 4.2.4) alınarak hesaplanabilir . Bu ayıklanır ve unextracted hücreleri, hazırlanan lekeli ve paralel görüntülü önemlidir. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Walter, P., Ibrahimi, I., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+I.+Signal+recognition+protein+%28SRP%29+binds+to+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 545-550 (1981).</li>
<li>Walter, P., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translocation+of+proteins+across+the+endoplasmic+reticulum.+II.+Signal+recognition+protein+%28SRP%29+mediates+the+selective+binding+to+microsomal+membranes+of+in-vitro-assembled+polysomes+synthesizing+secretory+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. II. Signal recognition protein (SRP) mediates the selective binding to microsomal membranes of in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein.</a> J. Cell Biol. 91, 551-556 (1981).</li>
<li>Grlich, D., Prehn, S., Hartmann, E., Kalies, K. U., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mammalian+homolog+of+SEC61p+and+SECYp+is+associated+with+ribosomes+and+nascent+polypeptides+during+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A mammalian homolog of SEC61p and SECYp is associated with ribosomes and nascent polypeptides during translocation.</a> Cell. 71, 489-503 (1992).</li>
<li>Grlich, D., Rapoport, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+translocation+into+proteoliposomes+reconstituted+from+purified+components+of+the+endoplasmic+reticulum+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Protein translocation into proteoliposomes reconstituted from purified components of the endoplasmic reticulum membrane.</a> Cell. 75, 615-630 (1993).</li>
<li>Milcarek, C., Penman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane-bound+polyribosomes+in+HeLa+cells%3A+association+of+polyadenylic+acid+with+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane-bound polyribosomes in HeLa cells: association of polyadenylic acid with membranes.</a> J. Mol. Biol. 89, 327-338 (1974).</li>
<li>Lande, M. A., Adesnik, M., Sumida, M., Tashiro, Y., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+association+of+messenger+RNA+with+microsomal+membranes+in+human+diploid+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct association of messenger RNA with microsomal membranes in human diploid fibroblasts.</a> J. Cell Biol. 65, 513-528 (1975).</li>
<li>Cardelli, J., Long, B., Pitot, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+association+of+messenger+RNA+labeled+in+the+presence+of+fluoroorotate+with+membranes+of+the+endoplasmic+reticulum+in+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Direct association of messenger RNA labeled in the presence of fluoroorotate with membranes of the endoplasmic reticulum in rat liver.</a> J. Cell Biol. 70, 47-58 (1976).</li>
<li>Adesnik, M., Lande, M., Martin, T., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retention+of+mRNA+on+the+endoplasmic+reticulum+membranes+after+in+vivo+disassembly+of+polysomes+by+an+inhibitor+of+initiation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retention of mRNA on the endoplasmic reticulum membranes after in vivo disassembly of polysomes by an inhibitor of initiation.</a> J. Cell Biol. 71, 307-313 (1976).</li>
<li>Kruppa, J., Sabatini, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+poly+A%28%2B%29+messenger+RNA+from+rat+liver+rough+microsomes+upon+disassembly+of+bound+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Release of poly A(+) messenger RNA from rat liver rough microsomes upon disassembly of bound polysomes.</a> J. Cell Biol. 74, 414-427 (1977).</li>
<li>Adesnik, M., Maschio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Segregation+of+specific+classes+of+messenger+RNA+into+free+and+membrane-bound+polysomes%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Segregation of specific classes of messenger RNA into free and membrane-bound polysomes.</a> Eur. J. Biochem. 114, 271-284 (1981).</li>
<li>Cui, X. A., Zhang, H., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p180+Promotes+the+Ribosome-Independent+Localization+of+a+Subset+of+mRNA+to+the+Endoplasmic+Reticulum%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">p180 Promotes the Ribosome-Independent Localization of a Subset of mRNA to the Endoplasmic Reticulum.</a> PLoS Biol. 10, e1001336(2012).</li>
<li>Pestka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibitors+of+ribosome+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Inhibitors of ribosome functions.</a> Annu. Rev. Microbiol. 25, 487-562 (1971).</li>
<li>Fresno, M., Jimnez, A., Vzquez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+translation+in+eukaryotic+systems+by+harringtonine%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Inhibition of translation in eukaryotic systems by harringtonine.</a> Eur. J. Biochem. 72, 323-330 (1977).</li>
<li>Weeks, D. P., Baxter, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+inhibition+of+peptide-chain+initiation+by+2-%284-methyl-2%2C6-dinitroanilino%29-N-methylpropionamide%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Specific inhibition of peptide-chain initiation by 2-(4-methyl-2,6-dinitroanilino)-N-methylpropionamide.</a> Biochemistry. 11, 3060-3064 (1972).</li>
<li>Ingolia, N. T., Lareau, L. F., Weissman, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ribosome+profiling+of+mouse+embryonic+stem+cells+reveals+the+complexity+and+dynamics+of+mammalian+proteomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ribosome profiling of mouse embryonic stem cells reveals the complexity and dynamics of mammalian proteomes.</a> Cell. 147, 789-802 (2011).</li>
<li>Lerner, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partitioning+and+translation+of+mRNAs+encoding+soluble+proteins+on+membrane-bound+ribosomes%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes.</a> RNA. 9, 1123-1137 (2003).</li>
<li>Adam, S. A., Marr, R. S., Gerace, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+protein+import+in+permeabilized+mammalian+cells+requires+soluble+cytoplasmic+factors%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Nuclear protein import in permeabilized mammalian cells requires soluble cytoplasmic factors.</a> J. Cell Biol. 111, 807-816 (1990).</li>
<li>Reuter, J. S., Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAstructure%3A+software+for+RNA+secondary+structure+prediction+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">RNAstructure: software for RNA secondary structure prediction and analysis.</a> BMC Bioinformatics. 11, 129(2010).</li>
<li>Lcuyer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+mRNA+localization+reveals+a+prominent+role+in+organizing+cellular+architecture+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Global analysis of mRNA localization reveals a prominent role in organizing cellular architecture and function.</a> Cell. 131, 174-187 (2007).</li>
<li>Lcuyer, E., Yoshida, H., Krause, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+implications+of+mRNA+localization+pathways+in+cellular+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Global implications of mRNA localization pathways in cellular organization.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 409-415 (2009).</li>
<li>Gueroussov, S., Tarnawsky, S. P., Cui, X. A., Mahadevan, K., Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mRNA+nuclear+export+kinetics+in+mammalian+cells+by+microinjection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of mRNA nuclear export kinetics in mammalian cells by microinjection.</a> J Vis Exp. 46, e2387(2010).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Çeşitli Subselüler sitelere mRNA&#39;ların lokalizasyonu, mRNA localisation proteinler ile transkript etkileşimi aracılığıyla, bir hücre içi ve yerel gereksinimler nihai hedefe proteinlerin doğru sıralama için ve gen ekspresyonu ince ayar için önemli bir yaygın bir olgudur bölge 19,20. Tahlil kullanılarak burada açıklandığı gibi, bu salgı proteinleri kodlayan mRNA ribozom ya da çeviri varlığında veya yokluğunda, ER muhafaza edilebilir olup olmadığı sorusu revisited. Aslında biz, b...

Ökaryotlarda mRNA kodlama çeviri 3,4 sırasında ribozomlar ve translocons arasındaki doğrudan etkileşim yoluyla salgılanan ve membran proteinlerinin eş Çevrimsel sinyal tanıma parçacık 1,2 ER hedeflenebilir ve ER korunabilir. Ancak, mRNA hedefli ve ribozomlar veya çeviri birinin ER bağımsız üzerinde muhafaza edilip edilemeyeceğini çok yakın zamanlara kadar belli değildi. Önceki çalışmalar hücresel fraksiyonlama teknikleri kullanılarak ER ile çeviri bağımsız mRNA ilişki olup olmadığını değinmeye çalıştık. Sert kimyasal koşulların potansiyel hassas mRNA-ER dernek kesebileceği ER türetilmiş veziküller, ribozomların kesmek için gerekli olduğu için, bu çalışmalarda 5-8 delil sağlayan, sonuçsuz ve 9,10 karşı ribozomal bağımsız mRNA ER ankraj . Bu sorunları aşmak için bir proto geliştirdikcol yalıtmak ve görüntü ER bağlı mRNA&#39;ların için. Bu prosedür, aynı anda ER morfoloji ve ilişkili moleküllerin tüm koruyarak etkin bir şekilde hücre (ER-bağlı olmayan mRNA dahil), tüm içerik sitoplazmik kaldıran bir hafif çıkarma tedavi, içerir. Bu protokolü kullanarak biz mRNA&#39;ların bir alt hedef ve sonra bağımsız ribozomlar veya çeviri 11 ER muhafaza olduğunu göstermiştir.

memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mrna&#39;ların görselleştirilmesi

Visualization of Endoplasmic Reticulum Localized mRNAs in Mammalian Cells

Ökaryotlarda salgılanan ve membran proteinleri endoplazmik retikulum (ER) yüzeyine lokalizedir kodlamak haberci RNA&#39;lar (mRNA) çoğu. Bununla birlikte, bu mRNA&#39;ların görselleştirme zor olabilir. Bu mRNA yalnızca bir kısmını ER ilişkili olduğunda özellikle doğrudur ve bu organel kendi dağıtım olmayan hedefli (yani &quot;özgür&quot;) transkript tarafından engelleniyor. Aynı anda ER bütünlüğünü korurken ER-ilişkili mRNA izlemek için, biz, hücreler seçici olarak plazma zarının bir permeabilizes digitonin ekstraksiyon çözeltisi için kısa bir maruz kalma ile muamele edildiği bir yöntem geliştirilmiştir ve bu nedenle sitoplazmik içeriğini kaldırır adres . Bu yöntem in situ hibridizasyon (FISH) flüoresan ile birleştiğinde, biri açıkça floresan mikroskobu ile ER-bound mRNA&#39;ların oluşturulabiliyor. Bu protokol kullanılarak yığın poli (A) ya da spesifik mRNA transkriptleri için ya da ER-bağlantının derecesini tespit edilebilirve hatta sayılabilir. Bu süreç içinde bir mRNA ER etkileşimlerinin doğası araştırmak için bu testte kullanılabilir.

ER-ilişkili olan mRNA yüzdesi, plasental alkalin fosfataz (ALPP) ya da sitokrom P450-8B1 (CYP8B1) ya da digitonin ile ekstre edilmiş ve daha sonra çözülmüştür, ya da direkt olarak tespit edildi içeren plazmitler ile birlikte transfekte edilmiş COS-7 hücreleri belirlemek için (bkz. Şekil 1, karşılaştırın &quot;Ctrl Çıkarılan&quot; için &quot;Ctrl Unextracted&quot;). Nükleer olmayan floresan örnekleri ve ER-ilişkili mRNA fraksiyonu (Şekil 2) hesaplanmıştır her ikisi de ö...

Burada memeli doku kültürü hücrelerinde endoplazmik retikulum ilişkili mRNA&#39;ların görselleştirmek için bir yöntem açıklanmaktadır. Bu teknik, floresan, ardından sitoplazmik boşaltılmaya digitonin ile birlikte plazma zarının geçirgenliği seçici içerir<em&gt; In situ</emYa da yığın poli (A) ya da spesifik mRNA transkriptleri tespit etmek için&gt; melezleme.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA&#39;ların görselleştirilmesi

In eukaryotes, most of the messenger RNAs (mRNAs) that encode secreted and membrane proteins are localized to the surface of the endoplasmic reticulum ...

Bu prosedürün amacı, endoplazmik retikulum veya er ile ilişkili haberci RNA'yı görselleştirmektir. Bu, ilk olarak memeli doku kültürü hücrelerinin örtü kızakları üzerine kaplanmasıyla gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, er'ye bağlı olmayan sitoplazmik mRNA'yı çıkarmak için hücreleri ekstraksiyon tamponu ile tedavi etmektir.Sonraki adımlar, hücreleri hızlı bir şekilde sabitlemek ve mRNA'yı floresan in situ hibridizasyon ile boyamaktır. Son adımlar, er ile ilişkili floresan miktarını görüntülemek ve ardından ölçmektir. Sonuç olarak, sonuçlar mRNA'ların farklı koşullar altında bu organelin yüzeyi ile nasıl ilişkili olduğunu gösterebilir.Bu yöntem, salgı proteinlerini kodlayan mRNA'ların ribozomlardan veya protein sentezinden bağımsız olarak er'nin yüzeyinde tutulup tutulamayacağı gibi temel hücre biyolojik sorularının yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntemin görsel gösterimi, birkaç zor hücresel manipülasyon adımı içerdiğinden kritik öneme sahiptir. Doku kültürü hücrelerinin, deneyden önce en az bir gün süreyle asitle muamele edilmiş örtü astarları üzerine tohumlanması, yedi maliyetlidir ve OS hücreleri nedeniyle, yüksek salgılanan protein üretimine ve iyi tanımlanmış ER'lere sahip oldukları için uygun seçimlerdir.Ekzojen bir Mr NA araştırılıyorsa, tohumlamadan bir gün sonra hücreleri transfekte edin ve daha sonra MR'ye izin vermek için hücreleri 18 saat daha inkübe edin. NA ifadesi. Deney gününde. Yüksek ekstraksiyon verimliliği elde etmek için, mRNA'ların translasyon hücrelerinden bağımsız olarak ER ile etkileşime girip girmediğini tespit etmek için hücreler, ekstraksiyondan 30 dakika önce ribozomlar ve mRNA arasındaki etkileşimi bozan ajanlarla tedavi edilebilir veya hücrelere ortamı kontrol edebilir.Bu durumda, translasyonel inhibitörler, saf Mycin ve Homo Harrington in veya HHT kullanılır. Kazma tonin ve bir XCHO'luk bir çalışma tamponu içeren taze hazırlanmış ekstraksiyon çözeltisini 37 santigrat dereceye ısıtarak başlayın. Bir ısıtma bloğunu 40 santigrat dereceye ayarlayın ve düz bir çalışma yüzeyi oluşturmak için ters çevrilmiş bir metal blok yerleştirin.Metal bloğu suyla nemlendirin, ardından taze bir paraform parçasıyla kaplayın ve RNA içermeyen eldivenler ve tüy bırakmayan dokular kullanarak kabarcıkları düzeltin. Daha sonra, her bir kapak fişi çifti için, hücreleri yıkamak ve dört oyuğa sabitlemek için altı oyuklu bir plaka hazırlayın. Son iki kuyucuğa iki mililitre ısıtılmış CHO tamponu ekleyin.Fiksasyon çözeltisinden iki mililitre ekleyin. Ardından plakayı ihtiyaç duyulana kadar 37 santigrat derecede saklayın. Isıtma bloğuna, işlenecek hücrelerin her bir kapak kayması için 100 mikrolitrelik bir ekstraksiyon çözeltisi damlatın.Şimdi bir kuyumcu forsepsini kullanarak, hücre kaplı bir kapak fişi alın ve CHO tamponu içeren birinci ve ikinci kuyucuklara daldırın. Bu, büyüme ortamını yıkar. Ardından, kapak fişinin arka tarafındaki fazla tamponu hızla temizleyin.Ve kısa bir süreliğine kapak kayma hücresini, ekstraksiyon çözeltisinin üzerine aşağı bakacak şekilde yerleştirin. 10 saniye sonra, kapak kayma hücresi tarafını en az 15 dakika kalması gereken sabitleme tamponuna aktarın. Hücre ekstraksiyon adımı, ER'ye bağlı olmayan tüm cyop plasticky mRNA'yı çıkarmak için gereklidir.Ek olarak, hücrelerin ekstraksiyon yapılmadan sabitlendiği bir kontrol kapak fişi hazırlayın. Fiksasyondan sonraki adım. Bu unex ekstrakte edilmiş kontrol hücrelerini PBS ile iki kez yıkayın ve ardından PBS ve TRITTON X 100'e nüfuz edin.Gerekli olmasa da, ekstrakte edilen hücrelerdeki kazma, hücrelere nüfuz ettikten sonra arka plan floresansını azaltmak için aynı PBS ve Triton çözeltisi ile yıkanmalıdır. Sabitleyici ve deterjanı çıkarmak için slaytları PBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra, slaytları bir kerelik sodyum sitrat tamponunda veya SSC'de% 60 fide ile iki kez yıkayın.Bununla birlikte, tüm hücreleri boyamak için bir oligo DT balık probu kullanılırsa, poli mRNA fide seviyesini %25'e düşürürArdından, balık probu ile hibridizasyon tamponunu hazırlayın. Stok balık sondasını, hibridizasyon tamponunda aynı fide konsantrasyonunda 0.2 mikromolar ile seyreltin. Şimdi boyama odasını hazırlayın.150 milimetrelik bir Petri kabının altını suyla doldurun. Sonra su üzerinde bir parça paraform yüzdürün ve tabağı ters çevirin. Para film, su çıkarken tabağın dibine yapışacaktır.Herhangi bir hava kabarcığı varsa, bunları eldivenlerle ve tüy bırakmayan mendillerle çıkarın, her bir kapak için kayma pipeti, balık Probunu içeren 100 mikrolitre hibridizasyon solüsyonunu para film üzerine pipetleyin. Şimdi kapak kayma hücresi tarafı aşağı bakacak şekilde çözeltinin üzerine yerleştirin. Son olarak, odayı ılık nemlendirilmiş bir odada beş ila 24 saat inkübe edin.Balık boyama süresi sona ermeden önce, RNA'sız bir yıkama alanı hazırlayın, düz yüzeyi suyla ıslatın ve param şeritleri ile kaplayın. Hava kabarcıklarını eldiven ve tüy içermeyen mendillerle çıkarın. Boyama bittiğinde, hazneyi her bir kapak kayması için çalışma alanına aktarın Yıkama alanına bir mililitre yıkama tamponu pipetleyin.Kapak fişlerini aktarmak için para film: İlk olarak, her bir kapak fişinin kenarına yakın bir yerde yarım mililitre balık yıkama tamponu pipetleyin. Sıvı, kılcal hareket ile kapak kızağının altına çekilecektir. Daha sonra, forseps kullanarak, kapak fişlerini hazneden çıkarın ve bunları yıkama tamponu damlalarının üzerine yerleştirin.Ve beş dakika bekleyin. Bu yıkama tekniğini üç kez daha tekrarlayın. Yıkama alanında taze bir mililitre damla yıkama tamponu kullanın.Bu arada, cam slaytları %70 etanol ile temizleyin ve tüy bırakmayan mendillerle kurulayın. Daha sonra her bir kapak kayma için, bir slayta 25 mikrolitre DPI montaj solüsyonu uygulayın Forseps kullanarak, bir kapak fişi alın ve fazla yıkama tamponunu çıkarmak için arka tarafını tüy bırakmayan bir mendille kurulayın. Ardından, kapak kayma hücresi aşağı bakacak şekilde montaj solüsyonunun üzerine aktarın.Tamamlanan slaytlar, maliyet olarak görüntülenene kadar dört santigrat derecede saklanabilir. Plasental alkalen fosfataz veya sitokrom P 4 58 B içeren plazmitlerle transfekte edilen yedi hücre ya tonin ile ekstrakte edildi ve daha sonra ER ile ilişkili olan bu mRNA'nın yüzdesini belirlemek için sabitlendi veya doğrudan sabitlendi. Nükleer olmayan floresan her iki numunede de ölçüldü ve her iki mRNA için ER ile ilişkili mRNA'nın fraksiyonu hesaplandı.Sitoplazmik fraksiyonun yaklaşık% 60'ı, bu transkriptlerin ER ilişkisini izlemek için ER ile ilişkilendirildi. Ribozom ayrışması transfekte edildikten sonra yedi hücre kontrol ortamı, pur MYCIN veya HHT ile muamele edildi ve daha sonra tonin ve sabit mRNA ekstrakte edildi. Boyama, A LPP'nin, ancak CYP sekiz P bir mRNA'nın ribozom bozulmasından sonra ER ile ilişkili kaldığını ortaya çıkardı.mRNA miktar tayini bu gözlemi destekledi ve daha da önemlisi nükleer mRNA seviyesinin tüm örneklerde tutarlı olduğunu gösterdi. Bu veriler, A LPP transkripti gibi ER hedefli mRNA'ların bir alt kümesinin, ribozom demontajından sonra ER'nin yüzeyinde tutulduğunu ortaya koymaktadır. Bu protokolü kullanarak, çeşitli mRNA'ların, mRNA nükleer ihracatını analiz etmek için kullanılan diğer tahlillerle birleştirildiğinde, endoplazmik retikül gibi farklı hücre altı bölmelere nasıl lokalize olduğunu araştırmaya başlayabiliriz.Bu prosedür, yeni sentezlenen mRNA'ların er'nin yüzeyine ilk hedeflemesini incelemek için kullanılabilir.

visualization-endoplasmic-reticulum-localized-mrnas-mammalian

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Görselleştirme RNA Yerelleştirme Xenopus Oosit

, Memeli hücrelerinin mikroskop lamelleri yerinde Subselüler fraksiyonasyon protein localisation görselleştirme sağlar .

Yapışkan ve Sigara yapışık Memeli Hücre yerinde Subselüler Fraksiyonu

Biz canlı hücre konfokal görüntüleme vasıtasıyla, endoplazmik retikulum (ER) içerisinde yerleşik transfekte floresan protein dağılımı ve hareketliliği incelemek için kullanılan görüntüleme yaklaşımı tarif eder. Biz de ultrastruktural bu subselüler bölmesinin mimarisi üzerine kendi ifade etkisini analiz.

Kültür Hücrelerinin retikulum Subdomain&#39;ler Görselleştirme

Mitokondriyal proteinleri kodlayan birçok mRNA'lar mitokondri dış membran ile ilişkilidir. Biz ilişkili mRNA'lardan ve ribozomlarla maya mitokondri izolasyonu amaçlayan bir hücre altı bölme prosedürü tarif. Bu protokol, mRNA lokalizasyonu mekanizmaları ve mitokondri yakın olarak lokalize çeviri ortaya çıkarmak için çeşitli koşullar altında yetiştirilen hücreler uygulanabilir.

Lokalize Çeviri Mekanizmaları Eğitim için Maya Mitokondri ile mRNAlarının Associated İzolasyonu

Burada, sabit hücrelerde endoplazmik retikulum ve mitokondri arasındaki endojen etkileşimleri görselleştirmek ve yüksek hassasiyet ile ölçmek için bir prosedür açıklanmaktadır. Protokol, bir mitokondri ilişkili zar arayüzünde inositol 1,4,5-trifosfat reseptörü / glukoz-regüle proteini 75 / voltaj bağımlı anyon kanalı / siklofilin D kompleksi hedefleyen in situ yakınlık ligasyonu deneyinde optimize özellikleri.

Endoplazmik retikulum ve mitokondri Etkileşimleri Çalışma ile<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity ligasyon Testi Sabit Hücrelerde

Burada, içinde canlı hücre organelleri tek zar proteinleri çok renkli yerelleştirme için bir iletişim kuralı mevcut. Fluorophores eklemek için kendi kendine etiketleme protein kullanılır. Aynı organel farklı membranlar bölmeleri içinde bulunan proteinler, ~ 18 hassasiyetle lokalize nm.

Çok renkli yerelleştirme mikroskobu canlı memeli hücre organelleri tek membran proteinlerin

Burada, moleküler işaretleri kullanarak canlı Drosophila melanogaster yumurta odasında endojen mRNA kaçakçılığı görselleştirme, algılama, analiz ve izleme için bir protokol sunuyoruz, iplik disk konfokka mikroskopi, ve açık kaynak Analizi Yazılım.

Canlı Drosophila melanogaster yumurta Chambers Içinde endojen mrnas görselleştirme ve izleme

Genetik modifikasyondan sonra tüm hücrelerde mitokondri ve endoplazmik retiplinin dağılımını incelemek için bir protokol sunuyoruz, askorbat peroksidaz 2 ve horserpu peroksidaz boyama da dahil olmak üzere bağıntılı ışık ve hacim Elektron Mikroskopisi kullanılarak aynı bölümde hedef geni olan ve olmayan hücrelerin seri bölümlemesi ve elektron mikroskobu ile seri görüntüleme.

Göreli ışık ve hacim elektron mikroskobu ile mitokondri ve endoplazmik reticulum görüntüleme

Membran temas bölgelerini (MCS'ler) incelemek için yeni yaklaşımlara duyulan ihtiyaç, bu hücresel yapıları ve bileşenlerini incelemeye olan ilginin artması nedeniyle artmıştır. Burada, MCS'lerde bulunan organel içi ve organeller arası protein komplekslerini tanımlamak ve ölçmek için önceden mevcut olan mikroskopi teknolojilerini entegre eden bir protokol sunuyoruz.

ER-Mitokondri Temas Bölgelerinde Endojen Organel İçi Protein Etkileşimlerinin Yakınlık Ligasyon Testleri ile Görselleştirilmesi ve Miktarının Belirlenmesi

Hücreleri confluency ulaşmak, pasajlandı veya geçişli olmalıdır. Bu video yapışmış ve süspansiyon hücreleri hem de alt kültüre için bir prosedür gösterecektir.

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

Öğrenin, memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum ile ilişkili mRNA'ları floresan in situ hibridizasyonu kullanarak görselleştirme yöntemini. Bu teknik, sitoplazmik ve ER bağlı mRNA'ları ayırt ederek gen ifadesi düzenlemesini incelemenizi sağlar.

Memeli hücrelerinde endoplazmik retikulum lokalize mRNA'ların görselleştirilmesi

Daha fazla video keşfet