Akım Sitometri tarafından İnsan Nötrofiller Nükleer Faktör Aktivasyon Algılama Basit ve Verimli Yöntemi

Bu deney, nötrofilleri insan periferik kanından saflaştırmak için nötrofillerden izole edilmiş ve immün olarak işaretlenmiş çekirdeklerdeki nükleer proteinleri tespit etmek ve ölçmek için akış sitometrisi kullanır. Kırmızı kan hücrelerini dekstrin ile çıkarın, ardından plazmanın yoğunluk gradyan santrifüjlemesi yapın. Daha sonra anti reseptör antikorları kullanarak, saflaştırılmış nötrofilleri integrinler veya FC reseptörleri yoluyla uyarın.

Çekirdekleri izole etmeye devam edin ve numuneleri, ilgilenilen NU nükleer faktörüne karşı spesifik antikorlarla immün etiketleme için sabitleyin. Örneğin, NF kappa B son olarak nükleer faktör aktivasyonundaki küçük değişiklikleri tespit etmek için çekirdekleri akış sitometrisi ile analiz eder. Nötrofillerin integrinleri yoluyla uyarılmasının, kappa B'nin transkripsiyon faktörü N'nin nükleer konsantrasyonunda bir artışa yol açtığını gösteren sonuçlar elde edilir. Nükleer faktör aktivasyonuna yol açan sinyal yolları genellikle raportör gen testleri veya birincil hücrelerde elektroforetik hareketlilik kayma testleri ile incelenir.

Genellikle bu yöntemler uygun değildir. Akış sitometrisi, izole edilmiş çekirdeklerdeki nükleer proteinlerin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve miktarının belirlenmesini sağlar. Sağlıklı yetişkin gönüllülerden 10 mililitre taze toplanmış kanla başlayın.

İki mililitre% 6 dekstrin T 500 çözeltisini 15 mililitrelik konik bir santrifüj tüpüne pipetleyin. Daha sonra tüpü iki veya üç kez ters çevirerek karıştırılmış 10 mililitre kan ekleyin ve 15 mililitrelik taze bir konik santrifüj tüpünde yerçekimi ile eritrosit sedimantasyonu için 45 dakika bekleyin. Beş mililitre FI fial paketi yerleştirin.

Sedimantlı eritrositlerin üzerinde oluşan lökosit bakımından zengin plazmayı hasat edin. İki faz oluşturmak için dikkatlice fial paketin üzerine koyun, dört santigrat derecede 20 dakika boyunca 516 Gs'de santrifüjleyin. Süpernatanı çıkarın ve tüpü rafa vurarak hücre peletini kırın.

Daha sonra hücreleri 10 mililitre soğuk PBS'de yeniden süspanse edin. Hücre süspansiyonunu 50 mililitrelik bir konik santrifüj tüpüne aktarın ve dört santigrat derecede beş dakika boyunca 290 Gs'de santrifüjleyin. Hücre peletini daha önce olduğu gibi kırın ve kostik eritrositlerine 10 mililitre soğuk hipotonik çözelti ekleyin.

Tüpü tam olarak bir dakika boyunca hafifçe döndürerek karıştırın. Daha sonra, 10 mililitre soğuk hipertonik çözelti karışımı ekleyin ve buz üzerinde saklayın. Şimdi nötrofilleri santrifüjleme ile peletledikten sonra hücreleri numaralandırın.

PMN'yi mililitre başına 10 ila yedi hücrede askıya alıyoruz. Soğukta PBS, hücreleri buz üzerinde tutun. 1.5 mililitrelik einor tüplere 100 mikrolitre PMN süspansiyonu ekleyin.

Daha sonra karşılık gelen monoklonal antikoru mililitre başına 10 mikrogram ekleyin ve 15 dakika buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri yıkamak için bir mililitre soğuk PBS santrifüjü ekleyin ve süpernatanı aspire edin. Daha sonra hücre peletini nazikçe kırın ve PBS ile iki kez daha yıkayın.

Bağlanmamış antikoru çıkarmak için, yıkanmış PMN'yi, ilgilenilen nükleer faktöre bağlı olarak bir ila 20 dakika boyunca 37 santigrat derecede inkübe edilen mililitre başına 60 mikrogram sıcak PBS içeren aynı başlangıç hacminde yeniden askıya alın. Şimdi bir mililitre soğuk PBS ekleyin Hücreleri santrifüjleme ile peletledikten sonra, snat'ı çıkarın ve hücre peletlerini hemen kuru bir buz etanol banyosunda dondurun. Her numune için, tüpü kuru buz seti etanol banyosundan çıkarın, silerek temizleyin ve yeniden canlandırın.

Dondurulmuş PMN peletlerini 100 mikrolitre soğuk hipotonik çözelti içinde askıya alın. Çekirdek bütünlüğünü izlemek için tüm numuneleri buz üzerine yerleştirin. Çekirdek süspansiyonunun bir Eloqua'sını trian mavisi ile boyayın.

Çekirdek süspansiyonu çok sayıda sağlam hücre veya kalıntı içeriyorsa, preparatı atmak ve prosedürü başka bir numune ile başlatmak daha iyidir. Çekirdekleri santrifüjleme ile peletledikten sonra, süpernatanı çok dikkatli bir şekilde çıkarın, ardından çekirdekleri 100 mikrolitre soğuk,% 4 Paraform aldehit çözeltisinde sabitlemek için ve çekirdekleri buz üzerinde inkübe edin. Çekirdekleri peletledikten sonra, snat'ı 100 mikrolitre soğuk geçirgenlik tamponunda dikkatlice çıkarın ve numuneleri buz üzerinde 10 dakika inkübe edin.

Daha sonra santrifüjleme ile perme çekirdeklerini hasat edin. Bu noktada, çekirdek topakları tüpün dibine iyi yapışmaz. Geleceği tekrar merkezlemeniz önerilir.

Pelet gevşerse Spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için, çekirdekleri PBS'de 500 mikrolitre soğuk,% 4 fetal sığır serumu içinde askıya alıyoruz ve 20 dakika buz üzerinde inkübe ediyoruz. Çekirdekleri santrifüjleme ile peletleyin, daha sonra çekirdekleri ve ilgilenilen nükleer faktöre karşı% 4 FBS ve mililitre başına 2.5 mikrogram monoklonal antikor içeren 100 mikrolitre soğuk PBS'yi yeniden süspanse edin. Numuneleri 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin Numuneleri %4 FBS ile 500 mikrolitre soğuk PBS ile iki kez yıkadıktan sonra,% 4 FBS ve 10 mikrogram mililitre karşılık gelen FZ etiketli ikincil antikor içeren 100 mikrolitre soğuk PBS'de 20 dakika boyunca buz üzerinde inkübe ediyoruz iki yıkamadan sonra, çekirdekleri PBS'de 400 mikrolitre soğuk% 4 Paraldehit içinde yeniden askıya alıyoruz.

İmmün etiketli çekirdekleri, bir bilgi taraması veya benzer bir cihaz gibi bir akış sitometresinde analiz edin. Edinme ayarlarını, 10'da günlük ölçeğinde iki FSC'ye, 196'da günlük ölçeğinde negatif olana, SSC'ye ve benimseme grafiğindeki kapı çekirdeklerine ayarlayın. Numune başına 10.000 çekirdek elde edin.

Ardından, 400'de log ölçeğinde ayarlanmış FL bir kanal boyunca uygun leke çekirdeklerinin floresansını analiz edin. Bu PMN saflaştırma yöntemi genellikle, PMN çekirdeklerinden% 95'ten daha büyük bir saflığa sahip uyarılmamış nötrofiller sağlar, yüksek verimle izole edilir, çekirdeğe izole edilir, stimülasyon üzerine bir nokta grafiği ile akış sitometresindeki bozulmamış PMN'den farklı bir popülasyon olarak kolayca tanınabilir. Beta bir integrinlerin çapraz bağlanmasıyla NF kappa B çekirdeğe çevrilir ve nükleer NF kappa B'deki bu artış, floresanda bir artış olarak tespit edilir.

Benzer şekilde, beta iki integrinlerin çapraz bağlanmasıyla PMN'nin uyarılması, floresanda bir artışla gösterildiği gibi NF kappa B aktivasyonunu da indükler. Bu yöntemin hassasiyeti, fibronektin gibi hücre dışı matris proteinlerini bağlayan beta bir integrinlerin, diğer hücreler üzerindeki yapışma moleküllerine bağlanan beta iki integrinlerden daha güçlü NF kappa B aktivasyonunu indüklemesiyle kanıtlandığı gibi, nükleer faktör seviyelerindeki küçük değişikliklerin tespit edilmesine izin verir. Bu yöntem, birçok farklı florokromun kullanılabildiği ve farklı hücre tiplerinden çekirdeklerin hazırlanmasına izin verdiği için büyük esneklik sunar, bu basit ve ekonomik yaklaşımı, çeşitli hücre tiplerinin çekirdeğindeki protein seviyelerinin değişikliklerini içeren sinyal iletim çalışmaları için kullanmıştır.