Akım Sitometri tarafından İnsan Nötrofiller Nükleer Faktör Aktivasyon Algılama Basit ve Verimli Yöntemi

Bu deney, insan periferik kanından nötrofilleri saflaştırmak amacıyla, izole edilmiş ve immün işaretlenmiş nötrofil çekirdeklerindeki nükleer proteinleri tespit etmek ve miktarını belirlemek için akış sitometrisi kullanır. Önce dekstrin ile eritrositleri uzaklaştırın, ardından plazmanın yoğunluk gradyanı santrifüjasyonunu gerçekleştirin. Daha sonra, anti-reseptör antikorlarını kullanarak, saflaştırılmış nötrofilleri integrinler veya FC reseptörleri aracılığıyla stimüle edin.

İlgilenilen NU nükleer faktörüne karşı spesifik antikorlar ile immün etiketleme yapmak için çekirdekleri izole etme ve örnekleri sabitleme işlemlerine geçiniz. Örneğin, NF kappa B'nin nükleer faktör aktivasyonundaki küçük değişiklikleri tespit etmek amacıyla çekirdekleri akış sitometrisi ile analiz ediniz. Nötrofillerin integrinleri aracılığıyla stimülasyonunun, transkripsiyon faktörü N of kappa B'nin nükleer konsantrasyonunda bir artışa yol açtığını gösteren sonuçlar elde edilir. Nükleer faktör aktivasyonuna yol açan sinyal yolakları genellikle primer hücrelerde reporter gen analizleri veya elektroforetik mobilite kayma analizleri (EMSA) ile incelenir.

Bu yöntemler genellikle uygun değildir. Akış sitometrisi, izole edilmiş çekirdeklerdeki nükleer proteinlerin hızlı bir şekilde tespitini ve miktar tayinini sağlar. Sağlıklı yetişkin gönüllülerden taze olarak toplanmış 10 mililitre kan ile başlayın.

15 mililitrelik konik santrifüj tüpüne iki mililitre %6 dekstrin T 500 çözeltisi pipetleyin. Ardından, tüpü iki veya üç kez tersyüz ederek karıştırın ve 10 mililitre kan ekleyip eritrositlerin yeni bir 15 mililitrelik konik santrifüj tüpünde yerçekimi ile çökelmesi için 45 dakika bekleyin. Beş mililitre FI fial paketi yerleştirin.

Çöken eritrositlerin üzerinde oluşan lökosit yönünden zengin plazmayı toplayın. İki faz oluşturacak şekilde fial pack üzerine dikkatlice katmanlar halinde ekleyin, 4 °C'de 20 dakika boyunca 516 Gs'de santrifüj edin. Süpernatantı uzaklaştırın ve tüpü raka vurarak hücre peletini parçalayın.

Ardından hücreleri 10 milliliters soğuk PBS içinde yeniden süspande edin. Hücre süspansiyonunu 50 milliliters konik santrifüj tüpüne aktarın ve 4 °C'de beş dakika boyunca 290 Gs hızında santrifüjleyin. Hücre peletini daha önce yaptığınız gibi dağıtın ve eritrositleri liz etmek için 10 milliliters soğuk hipotonik çözelti ekleyin.

Tüpü tam bir dakika boyunca hafifçe döndürerek karıştırın. Ardından, 10 mililitre soğuk hipertonik solüsyon karışımı ekleyin ve buz üzerinde saklayın. Şimdi, nötrofilleri santrifüjle çöktürdükten sonra hücreleri sayın.

PMN'leri mililitrede 10⁷ hücre olacak şekilde süspanse ediyoruz. Hücreleri soğuk PBS içinde buz üzerinde tutun. 1,5 mililitrelik eppendorf tüplerine 100 µL PMN süspansiyonu alikotlayın.

Ardından, mililitre başına 10 µg konsantrasyonda ilgili monoklonal antikoru ekleyin ve 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Hücreleri yıkamak için bir mililitre soğuk PBS ekleyin, santrifüjleyin ve süpernatanı aspire edin. Daha sonra hücre peletini nazikçe çözün ve PBS ile iki kez daha yıkayın.

Bağlanmamış antikorları uzaklaştırmak için, yıkanmış PMN'leri mililitre başına 60 µg goat anti-mouse IgG içeren başlangıçtaki aynı hacimdeki sıcak PBS içinde yeniden süspande edin ve ilgilenilen nükleer faktöre bağlı olarak 37 °C'de 1 ila 20 dakika inkübe edin. Şimdi 1 mL soğuk PBS ekleyin. Hücreleri santrifüjle peletledikten sonra süpernatanı uzaklaştırın ve hücre peletlerini hemen kuru buz-etanol banyosunda dondurun. Her bir örnek için tüpü kuru buz-etanol banyosundan çıkarın, temizleyin ve yeniden süspande edin.

Dondurulmuş PMN pelletlerini 100 µL soğuk hipotonik çözelti içinde süspande edin. Çekirdek bütünlüğünü izlemek için tüm örnekleri buz üzerine yerleştirin. Çekirdek süspansiyonunun bir kısmını tripan mavisi ile boyayın.

Çekirdek süspansiyonu çok sayıda sağlam hücre veya debris içeriyorsa, hazırlığı çöpe atmak ve prosedüre başka bir örnekle başlamak daha iyidir. Çekirdekler santrifüjle çöktürüldükten sonra, süpernatantı çok dikkatli bir şekilde uzaklaştırın; ardından çekirdekleri sabitlemek için 100 µL soğuk, %4 Paraformaldehit çözeltisi ekleyin ve çekirdekleri buz üzerinde inkübe edin. Çekirdekleri çöktürdükten sonra, süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın, 100 µL soğuk permeabilizasyon tamponu ekleyin ve örnekleri buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin.

Ardından, permeabilize çekirdekleri santrifüjleme yoluyla toplayın. Bu aşamada, çekirdek peletleri tüpün altına iyi tutunmaz. Tekrar santrifüj yapılması önerilir.

Pellet gevşerse; spesifik olmayan bağlanma bölgelerini bloke etmek için çekirdekleri 500 µL soğuk, PBS içinde %4 fetal bovine serum içinde süspande ederiz ve buz üzerinde 20 dakika inkübe ederiz. Çekirdekleri santrifüj ile pelletleriz, ardından çekirdekleri %4FBS ve mililitre başına 2,5 µg ilgili nükleer faktöre karşı monoklonal antikor içeren 100 µL soğuk PBS içinde yeniden süspande ederiz. Örnekleri buz üzerinde 20 dakika inkübe ederiz; örnekleri %4FBS içeren 500 µL soğuk PBS ile iki kez yıkadıktan sonra, çekirdekleri %4FBS ve mililitre başına 10 µg ilgili FZ işaretli sekonder antikor içeren 100 µL soğuk PBS içinde süspande ederiz ve buz üzerinde 20 dakika inkübe ederiz; iki yıkamadan sonra, çekirdekleri PBS içinde 400 µL soğuk %4Paraldehit içinde yeniden süspande ederiz.

İmünolojik olarak işaretlenmiş çekirdekleri, FACScan veya benzeri bir cihaz olan bir akış sitometresinde analiz edin. Kazanım ayarlarını; FSC logaritmik ölçekte 10⁻¹, SSC logaritmik ölçekte 196 olarak ayarlayın ve çekirdekleri nokta grafiğinde (dot plot) kapılayın (gate). Örnek başına 10.000 çekirdek toplayın.

Ardından, fitsy ile boyanmış çekirdeklerin floresanını, 400 log ölçeğine ayarlanmış FL1 kanalı üzerinden analiz edin. Bu PMN saflaştırma yöntemi genellikle %95'ten daha yüksek saflıkta uyarılmamış nötrofiller sağlar; PMN çekirdekleri yüksek verimle izole edilir ve çekirdeğe izole edilenler, akış sitometresindeki bir nokta grafiğinde, uyarılma üzerine sağlam PMN'lerden farklı bir popülasyon olarak kolayca tanınabilir. Beta 1 integrinlerin çapraz bağlanmasıyla NF kappa B çekirdeğe transloke olur ve nükleer NF kappa B'deki bu artış, floresan artışı olarak tespit edilir.

Benzer şekilde, beta iki integrinlerin çapraz bağlanmasıyla PMN'lerin stimülasyonu, floresan artışıyla belirtildiği üzere NF kappa B aktivasyonunu da tetikler. Bu yöntemin hassasiyeti, fibronektin gibi hücre dışı matris proteinlerine bağlanan beta bir integrinlerin, diğer hücrelerdeki adezyon moleküllerine bağlanan beta iki integrinlere göre daha güçlü NF kappa B aktivasyonu indüklediği gerçeğiyle kanıtlandığı üzere, nükleer faktör seviyelerindeki küçük değişikliklerin tespit edilmesine olanak tanır. Birçok farklı florokromun kullanılabilmesi ve farklı hücre tiplerinden çekirdek hazırlamaya imkan vermesi nedeniyle bu yöntem büyük bir esneklik sunar; çeşitli hücre tiplerinin çekirdeğindeki protein seviyesi değişikliklerini içeren sinyal iletim çalışmaları için bu basit ve ekonomik yaklaşım kullanılabilir.