Name: İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-06-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 18 s
Description: Keşfedin, besleyici-ücretsiz koşullarda insan iPS hücrelerinden kardiyomiyosit farklılaştırma protokolünü. Embrioid cisimcikleri kullanarak fonksiyonel kalp hücreleri üretme yöntemini öğrenin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

BS Milan-Bicocca Yaz Öğrenci Araştırma Eğitim Programı Üniversitesi tarafından desteklenmiştir, araştırma Sağlık ve İtalyan Bakanlığı Eğitim, Üniversite ve GC için Araştırma ve Fondazione Humanitas, İtalyan Bakanlığı fonlarından desteklenen, biz eleştirel okumak için Michael VG Latronico teşekkür el yazması.

1. İnsan iPS Hücre Hatlarının Besleyici Bakım gerektirmez ve Pasajlanması <ol><li> Matrigel kaplı yemekler hazırlayın. Çözünme bir bir saat boyunca buz üzerinde insan ESC nitelikli Matris şişe ve 25 ml DMEM-F12 ortamı içinde seyreltin. Buz üzerinde her şeyi tutmak ve tüm plakaları ve tüpler önceden soğutulmuş olmasını sağlamak, her 35 mm levha (veya diğer yemekler kullanılması durumunda yüzey alanı başına eşdeğer miktarda) ile 1 ml ekleyin. Alüminyum folyo ile plakalar Kapak. </li></ol> Not: Matrigel stok konsantrasyonları toplu göre farklılık gösterir. Seyreltme talimatları veri tablosunda gösterilir. <ol start="2"><li> Gece buz üzerinde plakaları tutmak ve ertesi gün buz kaldırmak. Tabaklar kullanmadan önce bir hafta için buzdolabında kadar tutulabilir. </li><li> MTESR1 tam orta (veya Nutristem orta bir şişe çözülme) ve aşağıdaki tabloya göre H-ESM (insan ESC orta) hazırlayın. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> H-ESM </td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> 500 ml İÇİN </td></tr><tr><td> Nakavt Serum Yedek (KSR) </td><td> % 20. </td><td> 100 mi </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 2 mM </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> MEM olmayan esansiyel amino asitler </td><td> 0.1 mM </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Penisilin-Streptomisin </td><td> 100 U / mL - 0.1 mg / ml &#39; </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> 0.1 mM </td><td> 900 ul </td></tr><tr><td> B27 Ek - Vitamina olmadan </td><td> % 1 </td><td> 10 mi </td></tr><tr><td> N2 desteği </td><td> % 1 </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Nakavt DMEM </td><td> - </td><td> 370 ml </td></tr></tbody></table> Hazır orta en fazla 2 hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. Tam büyüme ortamı hazırlamak için, bazik FGF sadece befor ilave edilir20 ng / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda e beslenmesi. </li></ol> Not: fare embriyonik fibroblastlar şartına H-ESM Komple iPS hücreleri yerine mTESR1 veya Nutristem bir kullanılabilir. <ol start="4"><li> Pasajlanmasını da öncesinde 30 dakika ile 2 saat boyunca 37 ° C&#39;de bir inkübatör kaplı plakalar yerleştirin. </li><li> Hücreleri izdiham ulaşmamış olsa bile, yaklaşık her 5 gün geçişli olmalıdır. Koloniler dokunmadan edilmemelidir. </li><li> Dispase, 1 ml (1 mg / ml, PBS içinde 10 mg / ml stok erimesi) büyüme ortamı ile değiştirin. </li><li> Çekti cam Pasteur pipetler ile alanları ayırt çıkarın. Çıkarılmalıdır Alanı kolonilerin merkezi bir krater benzeri veya kistik yapıları içerir, ve hücreler haline gelmiştir her alanda koloniler ayrılır ve düzleştirilmiş ve dışa doğru göç gibi görünmektedir. </li><li> Koloni sınırları parlak olur ve (genellikle 5-7 dakika civarında) ayırmak için başlayana kadar bir kültürü kaputu altında 37 ° C&#39;de inkübe edin. Discard dispase. 1 ml H-ESM ile yıkayın ve atın. </li><li> 1 ml H-ESM olarak, hasat koloniler bir hücre kaldırıcı (kazıyıcı spatula gibi) kullanımı ve 15 ml Eppendorf tüp toplamak. 1 ml H-ESM ile durulayın ve tüp ekleyin. 4 dakika 1000 RCF Spin ve süpernatant kaldırmak. </li><li> 1 ml önceden ısıtılmış büyüme ortamı (ya da mTESR1 veya Nutristem) içinde süspanse pelet. Çok fazla kümeleri kesiliyor kaçının - ve aşağı yukarı pipetle az 6-8x daha. Kaç hücre kaplama olması ve 1:5 2 tabak için örneğin gereksiz hücreleri (genellikle 1:4 ile 1:5 seyreltme), kaldırmalısınız belirleyin, 600 ul kaldırmak, daha sonra 1.6 ml taze orta ekleyin. </li><li> Plakalardan Matrigel çıkarın. Yeri hücreleri plaka üzerinde eşit dağıtarak, damla damla. Bu hücreler merkezine doğru hareket etmesine neden olacak gibi, aşırı tüp sallayarak kaçının. </li><li> Plaka arasında 1 mi, orta ve bölme ile tüp yıkayın. Her plaka nihai hacim 1.5 ml -2 olmalıdır. </li><li> Pasajlanması gün sonra hariç, her gün orta değiştirin. Her ne kadaren fazla 2-3 gün pluripotency veya farklılaşma potansiyel etkilemeden son pasaj geçtiyse orta her gün değiştirmek için ideal bir, bu arada bir kez her iki günde bir frekansta değiştirilebilir. </li><li> Hücre hattı dondurulabilir ise, 2 ml pipet ve yerine 1 ml / dondurarak saklamaya uygun vialler ile 1-2 ml mFreSR dondurma ortamı içinde yerine yeniden askıya. -80 Bir cryobox yer şişeleri ° C ve 3-4 gün içinde sıvı azot transfer. </li></ol> Not: iPS hücreleri, Manual of mikrodiseksiyon bir stereo mikroskop altında gerçekleştirilmelidir. Bu ısıtılmış bir yüzey alanı üzerinde tutulurken, bir stereomikroskop ile entegre bir in vitro fertilizasyon (IVF), iş istasyonu (örneğin KSystem bir IVF Workstation) steril koşullar altında hücrelerin manipülasyonuna olanak sağlar. Bu mevcut değilse, bir stereo düzenli bir laminar akış başlığı altında hareket ettirilebilir. 2. Embriyoid Organları Toplama ve Kardiyak induction <ol><li> Aşağıdaki tabloya göre EBM-20 ortamı hazırlayın. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> EBM-20 </td><td> Nihai konsantrasyon </td><td> 500 ml İÇİN </td></tr><tr><td> Fetal Bovine Serum (kökeni Güney Amerika) </td><td> % 20. </td><td> 100 mi </td></tr><tr><td> MEM gerekli olmayan amino asitler </td><td> 0.1 mM </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> Penisilin - Streptomisin </td><td> 100U/ml - 0.1 mg / ml &#39; </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> GlutaMAX 100X </td><td> 0.1 mM </td><td> 5 mi </td></tr><tr><td> 2-merkaptoetanol </td><td> 50um </td><td> 450 ul </td></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> - </td><td> 385 ml </td></tr></tbody></table> Güney Amerika kökenli FBS kullanımı farklılaşma verim belirlemek için önemlidir: serumun türleri diğer iş etkileyebilirfarklılaşma. 50 ug / ml &#39;lik nihai bir konsantrasyona kadar tam EBM-20, eklentinin askorbik asit (AA) hazırlanması. Tam büyüme ortamında en fazla bir hafta boyunca 4 ° C&#39;de muhafaza edilebilir. </li><li> Hasat iPS koloniler olarak (adımları 1,6-1,9) yukarıda açıklanan. </li><li> 2 ml pipet ile 1 ml EBM-20 yavaşça tekrar. Çok fazla kümeleri kesiliyor kaçının - stereomicroscope altında koloniler büyüklüğü kontrol, en fazla 2-3x daha aşağı yukarı pipet ve. 1:1 oranında ultra-düşük ek plakalar üzerinde plakası (35 mm yemek için örneğin, bir 6-plaka iyi 1 kullanın). 1 ml EBM-20 ile tüp durulayın ve plaka ekleyin. </li></ol> Not: kolonilerin boyutu verimlilik ve kalp indüksiyon zamanlaması kontrol farklılaşma etkiler. Homojen boyutlu EBS Agregasyon farklılaşması sırasında gözlenen değişkenliği azaltmak için gösterilmiştir. <ol start="4"><li> 3. günde, yeniden önlemek için bir mikroskop kullanılarak EBM-20 kez değiştirmekEBS moval. Plaka kenar yakın pipet ve orta kaldırmak tutun. </li><li> 7. günde, anahtar EBS% 0.1 jelatin ve daha önce 30 dakika boyunca 37 ° C&#39;de yerleştirilir ile kaplı plakalar için. Gerekirse, jelatin bir hücre kültürü kaputu altında çıkarıldı ve plakalar bırakılabilir O / N 35 mm tabak başına 35-40 EBS ekleyin. </li><li> Haftada iki kez alanları ve değişim EBM-20 yenerek için EBS kontrol edin. Stereomicroscope altında onlar lokalizasyonu kolaylaştırmak için, dayak alanları çanak kapağının üstünde bulunan nerede işaretleyin. Taahhüt alanlarda yaklaşık 10-20 gün sonra görünmelidir. </li><li> Spontan kasılma olduğu bölgelerde, görünür (yerine% 2 FBS ile, EBM-20 olarak hazırlamak) EBM-2 orta geçiş ve bunları 3. bölümde aşağıda açıklanan izole. Zaman </li><li> Dayak ve dayak alanlar daha fazla deneyler için gerekli olan kadar haftada iki kez orta değiştirmek için diğer alanlarda kontrol etmek için devam edin. </li></ol> Not: farklılaşma sürecinin Verimliliği oldukça bağımlıdırçeşitli faktörler, hangi en kritik kalp farklılaşma indüklemek için kullanılan özel hücre hatları ve serum olan toplu. En yüksek verimlilik elde etmek için, cardiomyogenic potansiyeli ve serum çeşitli partiler için testi hücre hatları. 3. Alanları İzolasyon ve Kültür Dayak <ol><li> Coat 12 oyuklu plakalar (4 cm2 alan) ya da 5 ug / cm 2 fibronektin ile söz konusu plakalar (12 oyuklu plakalar içerisine oyuk başına 300 ul toplam) tamamen tüm yüzeyini kaplamak için yeterli hacimde PBS içinde seyreltilmiştir. Hücre kültürü kaputu ortaya tutmak ve kurumasını bekleyin. Plakalar 4 de sarılmış ve saklanabilir ° CO / N. </li><li> Gerektiğinde bir bardak kullanarak alanı yenerek kaldırmak, Pasteur pipeti ve neşter çekti. 1 ml&#39;lik bir pipet ile fibronektin-kaplı plakalara transfer. </li><li> 1 ml EBM-2 ekleyin. </li><li> Hücreler çıkarıldı alanları gösterir ve orta değiştirmek için plaka çapraz. Diğer alanlarda b başlayabilir olarak plakalar, 1 aya kadar saklanabilirdaha sonra yemek. </li></ol> Not: Daha küçük yenerek kümeleri gerekli ise küçük parçalar halinde tatili kadar, stereomicroscope altında birkaç kez aşağı Eksplante alanı pipet ve. Bu birkaç dayak hücreleri (film 3) kümeleri ile sonuçlanacaktır. <ol start="5"><li> Analizler için hazır olana kadar haftada iki kez orta değiştirin. </li></ol> Not: Bu protokol elde kardiyomiyositleri fetal gibi morfolojik ve fonksiyonel özelliklere sahip, bir yetişkin-benzeri fenotip doğru olgunlaşmasını daha bu hücreleri ayırt etmek için kültür süresi artırılarak elde edilebilir. 4. Tek Dayak Hücreleri İzolasyon ve Analiz <ol><li> Coat 2 odacıklı slaytlar (4 cm 2 alan) ya da tüm kültür yüzeyini kapsayacak şekilde yeterli PBS içinde seyreltilmiş 5 mg / cm 2 fibronektin ile diğer uygun destekler. Bir cam destek kullanılırsa, laminin ve fibronektin ile kat (5 ug / cm &#39;&gt; 2 adet) destek. </li><li> Bölüm 3 plakalardan Pasteur pipeti / neşter ile alanı yenerek çıkarın. </li><li> 1 ml&#39;lik bir pipet, inkübasyon sırasında bir kez çalkalama tüpü 500 ul kolajenaz II (Mg, Ca ile PBS içinde 480 U / ml) ve 37 dakika inkübe 15 ° C içeren 15 ml&#39;lik bir tüpe transfer hücrelerin kullanılması. </li><li> 200 ul pipet ile yukarı ve aşağı pipetle. Herhangi kümeleri kalırsa, taze kollajenaz II aktarmak ve adım 4.3 tekrarlayın. </li><li> Hiçbir büyük kümeleri bırakılır kadar adım 4.4 tekrarlayın. </li><li> 3 ml EBM-2 (yok AA) ile kollajenaz inaktive eder. Diğer tüpler hazır olana kadar tüp daha sonra ateşli bir rafa başlık altında bırakılabilir. 4 dakika 1000 RCF santrifüj. </li><li> Süspanse pelet 1 ml% 0.25 5 dakika boyunca 37 ° C &#39;de tripsin / EDTA (1X PBS içinde% 0.5&#39; lik stok solüsyonlarından seyreltilmiş) ile inkübe edin. Aynı ilk örnekten sindirimler kesirler birleştirin. </li><li> 4 ml EBM-2 (yok AA) ile tripsin inaktive eder. Daha t hiç bir 2.5 ml şırınga bir 18G iğne ile hücre geçmekhan 7x. 4 dakika 1000 RCF santrifüj. </li><li> Tekrar süspansiyon hücre pelet başına iyi ve plaka 1 ml EBM-2. Hücreler 2-3 gün sonra kaplama fonksiyonel ve morfolojik analiz için kullanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Di Pasquale, E., Latronico, M. V., Jotti, G. S., Condorelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+vectors+and+cardiovascular+diseases%3A+a+genetic+tool+for+manipulating+cardiomyocyte+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Lentiviral vectors and cardiovascular diseases: a genetic tool for manipulating cardiomyocyte differentiation and function.</a> Gene Therapy. 19, 642-648 (2012).</li>
<li>Laflamme, M. A., Murry, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Heart regeneration.</a> Nature. 473, 326-335 (2011).</li>
<li>Mummery, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+and+induced+pluripotent+stem+cells+to+cardiomyocytes%3A+a+methods+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation+Research%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview.</a> Circulation Research. 111, 344-358 (2012).</li>
<li>Wu, S. M., Chien, K. R., Mummery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins+and+fates+of+cardiovascular+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Origins and fates of cardiovascular progenitor cells.</a> Cell. 132, 537-543 (2008).</li>
<li>Thomson, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+lines+derived+from+human+blastocysts%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts.</a> Science. 282, 1145-1147 (1998).</li>
<li>Takahashi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+pluripotent+stem+cells+from+adult+human+fibroblasts+by+defined+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors.</a> Cell. 131, 861-872 (2007).</li>
<li>Yu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell+lines+derived+from+human+somatic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells.</a> Science. 318, 1917-1920 (2007).</li>
<li>Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fresh+look+at+iPS+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A fresh look at iPS cells.</a> Cell. 137, 13-17 (2009).</li>
<li>Josowitz, R., Carvajal-Vergara, X., Lemischka, I. R., Gelb, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induced+pluripotent+stem+cell-derived+cardiomyocytes+as+models+for+genetic+cardiovascular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes as models for genetic cardiovascular disorders.</a> Curr. Opin. Cardiol. 26, 223-229 (2011).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134, 877-886 (2008).</li>
<li>Carvajal-Vergara, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell-derived+models+of+LEOPARD+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome.</a> Nature. 465, 808-812 (2012).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2010).</li>
<li>Yazawa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+induced+pluripotent+stem+cells+to+investigate+cardiac+phenotypes+in+Timothy+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Using induced pluripotent stem cells to investigate cardiac phenotypes in Timothy syndrome.</a> Nature. 471, 230-234 (2011).</li>
<li>Itzhaki, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia+with+patient-specific+human-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+College+of+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Modeling of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia with patient-specific human-induced pluripotent stem cells.</a> Journal of the American College of Cardiology. 60, 990-1000 (2012).</li>
<li>Jung, C. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dantrolene+rescues+arrhythmogenic+RYR2+defect+in+a+patient-specific+stem+cell+model+of+catecholaminergic+polymorphic+ventricular+tachycardia%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Dantrolene rescues arrhythmogenic RYR2 defect in a patient-specific stem cell model of catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia.</a> EMBO Molecular Medicine. 4, 180-191 (2012).</li>
<li>Sun, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+model+for+familial+dilated+cardiomyopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem cells as a model for familial dilated cardiomyopathy.</a> Science Translational Medicine. 4, 130ra147(2012).</li>
<li>Kehat, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+stem+cells+can+differentiate+into+myocytes+with+structural+and+functional+properties+of+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Human embryonic stem cells can differentiate into myocytes with structural and functional properties of cardiomyocytes.</a> The Journal of Clinical Investigation. 108, 407-414 (2001).</li>
<li>Cao, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+the+cardiac+differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+through+promoting+the+proliferation+of+cardiac+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances the cardiac differentiation of induced pluripotent stem cells through promoting the proliferation of cardiac progenitor cells.</a> Cell Research. 22, 219-236 (2012).</li>
<li>Takahashi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbic+acid+enhances+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+cardiac+myocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Ascorbic acid enhances differentiation of embryonic stem cells into cardiac myocytes.</a> Circulation. 107, 1912-1916 (2003).</li>
<li>Moretti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patient-specific+induced+pluripotent+stem-cell+models+for+long-QT+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Engl.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome.</a> N. Engl. J. Med. 363, 1397-1409 (2011).</li>
<li>Watanabe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ROCK+inhibitor+permits+survival+of+dissociated+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells.</a> Nature Biotechnology. 25, 681-686 (2007).</li>
</ol>

Açıklama yok mali çıkarlarının.

Pluripotent kök hücreler hatları arasında düşük verimlilik ve yüksek değişkenliği ile de olsa, CMs kendiliğinden ayırt potansiyeline sahiptir. Yeni indüksiyon yöntemlerinin geliştirilmesi bu nedenle sürecinin verimliliğini artırmak ve daha tanımlı protokoller doğru hareket odaklanmıştır. Bununla birlikte, bu yeni farklılaşma yöntemlerin en ayrıntılı kültür koşulları, zamanlama ve reaktif konsantrasyonu iyi kontrol ve pahalı sitokinler ve büyüme faktörleri ile tedavi gerektiren, oldukça karmaşıktır. Ayrıca çeşitli iPS hü...

Tarihsel olarak, insan gelişimi ve hastalık sürüş genetik ve moleküler mekanizmalar soruşturma genetiği değiştirilmiş hayvan modellerinin nesil dayanmaktadır. Ancak, çok sayıda insan fenotipleri başarıyla başlıca nedeni iki tür arasında var olan biyolojik farklılıkların, farelerde çoğaltılması için başarısız. Diğer taraftan, insan doku erişim sınırlı olabilir ve genellikle yeterli malzeme derinlemesine Deneysel çalışmalarda elde edilmesine izin yoktur. Kardiyovasküler biyoloji alanında bu sınırlamalar her iki muzdarip: insan kalbinin fizyolojisi fare bu önemli ölçüde farklı olduğu ve kalp dokusu önemli bir miktar sadece ölüm sonrası ya da kalp ameliyatı sırasında erişilebilir. Fonksiyonel insan CMs farklılaşması için en uygun kaynak bulmak bu nedenle kardiyovasküler biyoloji merkezi bir konu haline gelmiştir, ve çok çaba bu sorunu gidermek için yapılmıştır. Çeşitli hücre tipleri i, önerilmiştirncluding iskelet iskelet hücreleri yanında, yerel kardiyak kök hücreler, kemik iliği mononükleer hücreler, endotelyal ataları ve mezenkimal kök hücreler. Ancak, veri 4 tutarlı olmamıştır, bu hücreler kullanılarak elde edilmiştir. Insan embriyonik kök hücreleri (ESC) türetilmesi ilk 5 ve Yamanaka ve Thomson 6,7 ile uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücrelerin çığır açan keşfi daha sonra çözümler sunmak gibiydi: bu hücrelerin vermek için süresiz büyümeye yeteneği ve potansiyeline sahip CMs dahil olmak üzere üç germ her hücresi türevleri, yükselecek. IPS hücrelerinin kullanılması daha başka avantajları sunmaktadır: otolog yetişkin hücrelerinden türetilen, bunlar türetildiği tek tek ya da hasta ile aynı gen taşır. Bu nedenle, insan genetik hastalıklar ve gelişme mekanizmalarının incelenmesi kolaylaştırmak in vitro modeller gelişimini sağlar. Bu özelliği sayesinde ise, iPS hücreleri de o olabilirbağışıklık ret ve etik konular 8 ile ilgili vercome sorunları. EKH hala kök hücre biyolojisi alanında altın standart temsil etse de bu nedenlerden dolayı, araştırmacılar dünya çapında şu anda iPS hücresi teknolojisi karşı daha hareket ediyor. iPS hücreleri, hemen konjenital kardiyovasküler bozukluklar da dahil olmak üzere, çeşitli koşullar 9,10 için, in vitro olarak insan hastalığı olan model için kullanılmaktadırlar. Son zamanlarda, iPS hücre hastalığı modelleme uygulaması monogenik kalp hastalıkları (örneğin uzun QT sendromları, katekolaminerjik polimorfik ventriküler taşikardi) ve kalp kusurları karmaşık bir fenotip (yani Leopard ve Timothy sendromlar, dilate kardiyomiyopati) bir parçası olduğu patolojiler için yapılmıştır. Bu raporlar CMs ayrılırlar hastaya özgü iPS hücreleri in vivo hastalık olarak benzer fenotipik ve fonksiyonel özellikler gösterdiği doğruladı. Ancak,kalp soy içine iPS hücreleri tetikleme etkinliğini artırmak için hala pek çok sorun vardır. Agrega oluşumu yoluyla insan EKH gelen CMs spontan nesil embriyoid organları (EBS) başarılı 17 kanıtlanmıştır çağırdı. Bu keşfinden beri, pek çok yöntem önerilmiştir. Birçok grup büyük ölçüde farklılaşma protokol verimliliği gelişmiş ve (Mummery bakınız, C., ve diğerleri., Mevcut tüm yöntemleri 3 kapsamlı bir inceleme için sirkülasyon Araştırma (2012) kimyasal olarak tanımlanmış ve hayvan-ürün içermeyen kültür reaktifler doğru taşındı .) Bununla birlikte, EB toplama dayalı klasik yöntem hala en sık fonksiyonel çalışmalar yapmak ve hastalık mekanizmaları araştırmak için istihdam temsil eder. Bizim önerilen protokol kalp farklılaşma sürecini geliştirmek için gösterilmiştir, serum ve askorbik asit varlığında EBS içine iPS hücreleri, agregasyon ve kültür ve po alınmaktadır18,19 regüle edilebilen bu hücrelerin olgunlaşmasını etkileyebilir. Bu yazıda ayrıntılı olarak bu metodoloji üzerinden gidecek ve hastaya özgü iPS-türetilmiş CMs üretmek için besleyici-ücretsiz iPS hücre hatları nasıl kullanılacağını gösterecektir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Media and Reagents</strong</td></tr><tr><td>>Human ESC nitelikli Matrix</td><td>BD Biosciences</td><td>354277</td><td>5 ml'lik şişeyi 4 derecede çözdürün; Buz üzerinde C O / N, veri sayfası seyreltme talimatlarına göre buz üzerinde önceden soğutulmuş kriyo tüplerinde alikot ve -20 ° C'de saklayın; C .</td></tr><tr><td>Fibronektin, insan plazmasından,% 0.1 çözelti</td><td>Sigma</td><td>F0896-2MG</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 5 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Sigma</td><td>L2020-1MG</td><td>Çalışma konsantrasyonu: 5 &mu; g/cm2</td></tr><tr><td>PBS (Mg ve Ca yok), 10X</td><td>Lonza</td><td>BE17-515F</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Mg ve Ca ile), 10X</td><td>Bio Sera</td><td>XC-S2067/500</td><td></td></tr><tr><td>Dispas II, nötr proteaz, derece II</td><td>Roche</td><td>4942078001</td><td>Stok: -20 ° C'de DMEM-F12'de 10 mg / ml; C, çalışma çözeltisi: PBS'de 1 mg / ml (Mg / Ca yok)</td></tr> <tr><td>Tripsin / EDTA,% 0.5</td> <td>Sigma</td><td>T3924</td><td></td></tr><tr><td>Kollajenaz tip 2</td><td>Worthington</td><td>4176</td><td>Mg ve Ca ile PBS'de 480 U / ml'ye ( örn. 1.6 mg / ml) seyreltin</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>21331-020</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10829-018</td><td></td></tr><tr><td>Nakavt Serumu Değiştirme (KSR)</td><td>Life Technologies</td><td>10828-028</td><td>4 °C'de Çözülme; C, alikot ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>F&#8211; tal Sığır Serumu (menşei: Güney Amerika)</td><td>Invitrogen</td><td>10270-106</td><td>Batchler, kardiyojenik potansiyelleri açısından test edilmelidir. 4 ° C'de çözülün; C, 56 ° C'de ısıyı etkisiz hale getirir; 30 dakika C, alikot ve -20 ° C'de saklayın; C</td></tr><tr><td>PenStrep, penisilin-Streptomisin, 100X</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX, 100X</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>MEM NEAA, 100X</td><td>Invitrogen</td><td>11140-135</td><td></td></tr><tr><td>N2 takviyesi, 100X</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>B27 takviyesi, 50X</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercapt&#8211; thanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>Jelatin, domuz derisinden</td><td>Sigma</td><td>G1890-100G</td><td>Suda% 1 oranında stok yapın, -20 ° C'de saklayın PBS'de% 0.1'e seyreltin ve 4 ° C'de tutun; C</td></tr><tr><td>mTeSR1</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5850</td><td>Ek 5X'i temel ortam, alikot ile birleştirin ve -20 ° C'de saklayın. Tam ortamı 4 &° C'de tutmayın; 1 haftadan fazla C</td></tr><tr><td>Nutristem hESC XF</td><td>Biyolojik Endüstrilerden Stemgent</td><td>05-100-1A</td><td>4 ° C'de Çözülme; C O/N, alikot ve -20 &°C'de saklayın; Kullanana kadar C. Alikotlar 4 derecede tutulabilir; Bir haftadan fazla olmamak üzere C.</td></tr><tr><td>mFreSR</td><td>Kök Hücre Teknolojileri</td><td>5853</td><td></td></tr><tr><td>Askorbik asit</td><td>Sigma</td><td>A4544-25G</td><td>Suda 10 mg / ml'de stokları hazırlayın. Alikotları -20 ° C'de saklayın; Karanlıkta C. Son konsantrasyonda (500X)</td></tr><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>35 mm kültür kaplarında</td> EBM'ye ekleyin <td>Becton Dickinson</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>Hücre sıyırıcı</td><td>Corning Incorporated</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>12 kuyulu plakalar</td><td>Becton Dickinson</td><td>353043</td><td></td></tr><tr><td>Permanox 2 kuyulu odacıklı kızaklar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177437</td><td></td></tr><tr><td>Cam 2 kuyulu hazneli kızaklar</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>177380</td><td></td></tr><tr><td>6 oyuklu plakalar, ultra düşük bağlantı yüzeyi</td><td>Corning Incorporated</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>18G iğne</td><td>Becton Dickinson</td><td>304622</td><td></td></tr><tr><td>Cam pastör pipetleri, 230 mm</td><td>VWR International</td><td>612-1702</td><td></td></tr><tr><td>2,5 ml şırınga</td><td>Becton Dickinson</td><td>300188</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Equipments</strong</td></tr><tr><td>>IVF İş İstasyonu</td><td>KSistem, Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon SMZ1500 Stereomikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table> tarafından

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: besleyici-ücretsiz İnsan bağlı pluripotent kök hücre a farklılaşma protokolü

Generation of Human Cardiomyocytes: A Differentiation Protocol from Feeder-free Human Induced Pluripotent Stem Cells

Kalp gelişimine sürüş olaylarının araştırılması için ve insanlarda miyokard hastalıklara yol açan moleküler mekanizmaların belirlenmesi amacıyla, fonksiyonel insan kardiyomiyositlerde (CMS) oluşturmak için birinci şarttır. Ilaç keşfi ve toksikoloji çalışmaları, bu hücrelerin kullanımı da insan kaynaklı hücreler üzerinde ön-klinik olarak geçerli olmak üzere kardiyak bozuklukların tedavisinde yeni moleküller sağlayan, yüksek ölçüde yararlı olacaktır. CMs olası kaynaklarının, uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri kolayca erişilebilir hasta doku doğrudan elde edilebilir gibi, en umut verici arasındadır ve vücudun 1 her hücre tipleri neden bir içsel kapasiteye sahip. Çeşitli yöntemler kimyasal olarak tanımlanmış protokoller 2,3 için klasik embriyoid organları (EBS) toplama yaklaşımı arasında değişen, CMs içine iPS hücreleri ayırt etmek için önerilmiştir. Bu yazıda bir EBS-tabanlı protokol teklif ve göstermek nasıl bu metodolojid verimli besleyici ücretsiz iPS hücrelerinden işlevsel CM-benzeri hücreler üretmek için kullanılabilir.

Çalışmalarımızda biz birkaç iPS hücre hatları CMs oluşturulan. Bu hatlar, başlangıçta bir MEF besleyici tabaka üzerinde oluşturulan ama şimdi tanımlanmış bir ortam (mTESR1 ya da Nutristem) kullanılarak Matrigel yerleştirildi. Çeşitli tahliller, morfolojik özellikleri, pluripotent hücreler tipik markırlerinin (OKT-4, SSEA4 ve TRA1-60) ve bunların genomuna stabilite (Şekil 1) bakımı doğrulamak için kullanıldı. Kalp soy içine indüksiyon EBS ve serum ve AA (Şekil 2A</str...

Pluripotent kök hücreler, embriyonik veya uyarılmış pluripotent kök (iPS) hücreleri ya, kardiyomiyositler dahil olmak üzere insan farklılaşmış hücrelerin, değerli bir kaynak oluşturmaktadır. Burada, bir embriyoid organları tabanlı protokol ile fonksiyonel insan kardiyomiyositlerin elde etmek için bunları nasıl kullanacağınızı gösteren, iPS hücrelerin kalp indüksiyon üzerinde durulacak.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

In order to investigate the events driving heart development and to determine the molecular mechanisms leading to myocardial diseases in humans, it is ...

Bu prosedürün genel amacı, feeder-free (besleyici hücre içermeyen) koşullarda kültüre edilen insan iPS hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini farklılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle iPS hücrelerinin embriyo gövdeleri oluşturmak üzere ultra düşük yapışmalı plaklara ekilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise oluşan embriyo gövdelerinin jelatin kaplı kaplara aktarılmasıdır.Kontraktil bölgeler ortaya çıktığında, stereo mikroskop altında manuel olarak diseke edilirler ve fibronectin kaplı kaplara ekilirler. Daha ileri farklılaşma için son adım, kontraktil kümelerin enzimatik sindirimi ile tekil kardiyomiyositler elde etmektir. Nihayetinde sonuçlar, immünofloresan mikroskopi aracılığıyla tipik yapısal belirteçleri, yani kardiyak troponini eksprese eden kardiyomiyosit benzeri hücrelerin farklılaştığını gösterebilir.Bu yöntem, kardiyovasküler biyoloji alanındaki; insan kardiyomiyositi düzeyinde, kalp gelişimi ve hastalıkları sırasında kardiyak farklılaşmayı ve disfonksiyonu tetikleyen mekanizmaların neler olduğu gibi temel bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, insan hastalardan ve sağlıklı bireylerden in vitro ortamda kardiyomiyositlerin üretilmesine ola

generation-human-cardiomyocytes-differentiation-protocol-from-feeder

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz büyük bir tedarik kardiyovasküler onarım için insan kalp atalarıdır ve fonksiyonel kardiyomiyositlerde türetilmesi sağlayan küçük moleküller ile tanımlanmış koşullar altında tutulan pluripotent insan embriyonik kök hücreleri doğrudan cardioblasts indüksiyonu için bir protokol kurduk.

Küçük Molekül İndüksiyon Pluripotent İnsan Embriyonik Kök Hücreleri İnsan Kardiyak Öncüleri ve kardiyomiyositlerde Verimli türetilmesi

Makale verimli seçici referans belirteçlerinin analizi nüfusun homojenliği ve kimliğini değerlendirmek için flow sitometri ile takip Wnt yolu, modüle göre kardiyomiyositlere insan pluripotent kök hücreleri ayırt etmek için ayrıntılı yöntem anlatılmaktadır.

Sitometrisi ile Yüksek Verim kardiyomiyositlerde İnsan pluripotent kök hücrelerin Farklılaşma ve Karakterizasyonu

Burada, kardiyovasküler hastalık modellemesi ve ilaç taraması amacıyla saflaştırılmış kardiyomiyositlerin üretimini sağlayan, küçük molekül modülasyonlu kardiyak farklılaşma ve glikoz yoksunluğu aracılı kardiyomiyosit saflaştırmasını birleştiren insan kardiyomiyosit türevi için sağlam bir protokol açıklıyoruz.

Küçük Molekül-modüle Farklılaşma ve sonraki Glikoz şiddetli açlık kullanma İnsan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin yüksek oranda saf kardiyomiyositlerde türetilmesi

Pluripotent kök hücrelerden in vitro kardiyomiyositlerin üretilmesi, temel bilim ve klinik uygulamalar için in vitro olarak büyük miktarlarda kalp dokusuna erişim sağlar.  Bu protokol, hem elde edilen kardiyomiyositlerin sayısını artırmak hem de atriyal fenotipli kardiyomiyositler oluşturmak için atriyalize edici faktör Grem2'yi kullanır.

BMP rakip GREM2 kullanma Pluripotent Kök Hücreleri Atriyal kardiyomiyositlerde Farklılaşma

Burada, insan pluripotent kök hücreleri (hPSC'ler) için sağlam, hızlı ve ölçeklenebilir bir kardiyomiyosit farklılaşma protokolü sunuyoruz. Bu büyük ölçekli yöntem kullanılarak türetilen kardiyomiyositler, insan kardiyovasküler hastalık modellemesinde, yüksek verimli ilaç taramasında ve potansiyel olarak klinik uygulamalarda etkili kullanımları için yeterli hücre sayısı sağlayabilir.

Oldukça Tekrarlanabilir Küçük Molekül Tabanlı Farklılaşma Protokolü kullanarak insan pluripotent kök hücreleri gelen kardiyomiyositlerde Büyük Ölçekli Üretim

Biz kardiyomiyositlerde, endotel hücreleri ve düz kas hücreleri ve yama-aracılı sitokin teslimat hücre enjeksiyon birleştirerek nakledilen hücrelerin bütünleşmesini geliştiren bir dağıtım yöntemi, insan uyarılmış pluripotent kök hücrelerin ayırt etmek için, üç yeni ve daha etkin protokollere sunuyoruz.

Pluripotent Kök Hücre Miyokard Onarım Kardiyak Hücreleri Türetilmiş

İnsan Pluripotent Kök Hücrelerinden (hPSC-CM) türeyen kardiyomiyositlerin elektrofizyolojik karakterizasyonu, kardiyak hastalık modellemesi ve ilaç yanıtlarının belirlenmesi için çok önemlidir. Bu protokol, hPSC-CM'lerin çok elektrotlu diziler üzerinde ayrılması ve plakalanması, alan potansiyelinin ölçülmesi ve QT ve RR aralıklarının analiz edilmesi için gerekli olan bilgileri sağlar.

Çok Elektrodlu Diziler (ÇÇA&#39;lar) Kullanan İnsan Pluripotent Kök Hücresinden Türetilmiş Kardiyomiyositlerin (hPSC-CM&#39;ler) Elektrofizyolojik Analizi

Burada, fonksiyonel, sözleşme, cardiomyocyte benzeri hücreler üretmek için kardiyak farklılaşma potansiyeli insan Mezenkimal kök hücrelerin genç kaynaklarının verimli koşum için bir yöntem mevcut tüp bebek.

Vitro İnsan Mezenkimal Kök hücre farklılaşma fonksiyonel Cardiomyocyte benzeri hücre içine

Burada ilk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri cardiomyocytes insan pluripotent kök hücre üretmek için aktivin A ve lentivirus-aracılı ID1-overexpression, basit bir birleşimini kullanarak ölçeklenebilir bir yöntem açıklanmaktadır.

İlk kalp alan benzeri kardiyak ataları ve ventrikül benzeri Cardiomyocytes insan Pluripotent kök hücrelerden nesil

Bu makale, insan kaynaklı pluripotent kök hücre türevi kardiyomiyosit (hiPSC-CM) ağlarının gelişimi için bir dizi protokolün yanı sıra, hücre membranı hareket potansiyeli ölçümleri için ters şekilde electroporate etmek için multiwell MEA plakaları üzerinde kültürlü bir set içerir. Yüksek verimlilik kayıtları aynı hücre sitelerinden gün içinde tekrar tekrar elde edilir.

Tekrarlayan eylem potansiyel kayıtlar için Multiwell mikro elektrot diziler üzerinde insan iPSC-türetilen Kardiyomiyoksit ağları

Burada, hasta periferik kan mononükleer hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini sağlam bir şekilde üretmek ve genişletmek için bir protokol sunuyoruz.

Hasta Periferik Kan Mononükleer Hücrelerinden İnsan Kardiyomiyositlerinin Üretimi ve Genişlemesi

Keşfedin, besleyici-ücretsiz koşullarda insan iPS hücrelerinden kardiyomiyosit farklılaştırma protokolünü. Embrioid cisimcikleri kullanarak fonksiyonel kalp hücreleri üretme yöntemini öğrenin.

İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Daha fazla video keşfet