İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, feeder-free (besleyici hücre içermeyen) koşullarda kültüre edilen insan iPS hücrelerinden insan kardiyomiyositlerini farklılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle iPS hücrelerinin embriyo gövdeleri oluşturmak üzere ultra düşük yapışmalı plaklara ekilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı ise oluşan embriyo gövdelerinin jelatin kaplı kaplara aktarılmasıdır.

Kontraktil bölgeler ortaya çıktığında, stereo mikroskop altında manuel olarak diseke edilirler ve fibronectin kaplı kaplara ekilirler. Daha ileri farklılaşma için son adım, kontraktil kümelerin enzimatik sindirimi ile tekil kardiyomiyositler elde etmektir. Nihayetinde sonuçlar, immünofloresan mikroskopi aracılığıyla tipik yapısal belirteçleri, yani kardiyak troponini eksprese eden kardiyomiyosit benzeri hücrelerin farklılaştığını gösterebilir.

Bu yöntem, kardiyovasküler biyoloji alanındaki; insan kardiyomiyositi düzeyinde, kalp gelişimi ve hastalıkları sırasında kardiyak farklılaşmayı ve disfonksiyonu tetikleyen mekanizmaların neler olduğu gibi temel bir sorunun yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu teknik, insan hastalardan ve sağlıklı bireylerden in vitro ortamda kardiyomiyositlerin üretilmesine olanak tanıdığı için oldukça ilgi çekicidir. İkinci olarak ise, hastalığın test tüpünde yeniden oluşturulmasını sağlayarak, yeni ilaçların in vivo aşamaya geçmeden önce in vitro ortamda deneyenmesine imkan tanır.

Deneylere, 35 milimetrelik matrigel kaplı plaklarda büyütülen konfluen iPS hücre kültürleri ile başlanır. Büyütme ortamı, bir miligram diss içeren bir mililitre PBS ile değiştirilir. Hücreler, pastör pipetleri kullanılarak incelenir.

Kolonilerin merkezinde bulunan krater benzeri veya kistik yapılar gibi farklılaşmış hücrelerin bulunduğu bölgeleri uzaklaştırın. Ayrıca hücrelerin ayrıldığı, yassılaştığı ve dışarıya doğru göç ediyor gibi göründüğü tüm alanları da uzaklaştırın. Şimdi, kalan hücreleri koloni sınırları daha parlak hale gelip ayrılmaya başlayana kadar bir kültür kabininde 37 °C'de inkübe edin.

Bu işlem genellikle beş ile yedi dakika arasında sürer. Bu noktada, dispa solüsyonunu uzaklaştırın ve hücreleri 1 mL HESM ile yıkayın. Ardından yıkama solüsyonunu dökün.

Taze 1 mL HESM içerisinde, kolonileri toplamak için bir hücre toplayıcı (cell lifter) kullanın. Kolonileri 15 mL'lik bir tüpe toplayın. Ardından, hücreleri bir mL daha HESM ile yıkayın ve 1000 ×g'de dört dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından hücrelerin matrigel üzerine ekimine geçin ve kültürleme sırasında besiyerini her gün değiştirin. Önceki bölümde açıklandığı şekilde diferansiye olmamış iPS kolonlarının hasat edilmesiyle başlayın. Diferansiye olmamış popülasyonlar izole edildikten sonra, onları nazikçe bir mililitre EBM 20 içerisinde yeniden süspande edin.

İki mililitrelik bir pipet kullanarak, hücre kümelerini çok fazla parçalamayın. Pipetleme işlemini iki veya üç darbe ile sınırlayın. Darbeler arasında kolonilerin boyutunu stereoskop altında kontrol edin.

Kolonilerin tamamı yaklaşık aynı boyuta ulaştığında, artık karıştırmaya gerek yoktur. Şimdi, hasat edilen her hücre plakası için bir adet altı kuyucuklu plaka dolduracak şekilde hücreleri ultra düşük tutunumlu plakalara ekleyin. Tüpü 1 mL EBM 20 ile durulamayı ve durulama sıvısını plakaya dağıtmayı unutmayın.

Üç günlük inkübasyonun ardından, embriyo gövdelerinin uzaklaştırılmasını önlemek için bir mikroskop yardımıyla medyumu değiştirin. Pipeti plağın kenarına yakın tutun. Yedinci günde, embriyo gövdelerini 37 °C'de 30 dakika boyunca ısıtılmış %0,1 Jelatin kaplı plakalara taşıyın.

Her bir 35 milimetrelik kaba, iki mililitre besiyeri içerisinde 35 ila 40 embriyo gövdesi ekleyin. Kültürleme süresince besiyerini haftada iki kez düzenli olarak değiştirin.

Embriyo gövdelerini atan bölgeler açısından kontrol edin ve atan bölgelerin nerede bulunduğunu işaretleyin. Kapak üzerindeki kapta, yaklaşık 10 ila 20 gün sonra kasılan bölgeler ortaya çıkmalıdır. Spontan kontraksiyon gösteren bölgeler ortaya çıktığında, ortamlarını EBM two ile değiştirin. Kasılan bölgeler göründükten sonra, plaka üzerindeki diğer bölgeleri bir aya kadar kültüre etmeye ve izlemeye devam edin.

Toplamda. EBM içinde, farklılaşma sürecindeki yetersizlik birkaç faktöre oldukça bağımlıdır; bunların en kritik olanları, spesifik hücre hatları ve kardiyojenik farklılaşmayı indüklemek için kullanılan serum lotudur. En yüksek verimi elde etmek için, kardiyojenik potansiyel açısından birkaç hücre hattını ve çeşitli serum lotlarını test edin. 12 ile kaplayarak başlayın.

Kuyu başına 300 µL PBS içinde santimetrekare başına beş µg fibronectin içeren kuyucuklu plakalar, her kuyucuğun yüzeyini tamamen kaplamalıdır. Plakaların bir hücre kültürü davlumbazında ağzı açık şekilde kurumasına izin verin. Hücre kültürünün boncuklanma bölgesini temizlemek için çekilmiş bir cam pipet ve neşter kullanın.

Ardından, bir mililitrelik bir pipet kullanarak, fibronectin kaplı bir plakanın her kuyucuğuna dört ila beş klamp aktarın. Tüm toplamalar tamamlandığında, toplama plakasındaki yüklü kuyucuklara bir mililitre EBM iki ekleyin ve hücrelerin uzaklaştırıldığı alanları işaretleyin. Daha sonra medyumu değiştirin ve plakayı kültür kabinine geri yerleştirin.

Stereo mikroskop altında daha küçük atan kümeler gerekiyorsa, eksplantasyon bölgelerini bir pipetten geçirin. Bu işlem, birkaç atan hücre içeren küçük kümeler oluşturur. Kültürde.

Analize hazır hale gelene kadar besiyerini haftada iki kez değiştirin. İlk olarak, yüzeyi kaplayacak kadar PBS içinde dilüe edilmiş 20 µg fibronectin ile kaplayarak dört santimetrekarelik iki odacıklı lamlar hazırlayın. Eğer cam destek kullanılıyorsa, ek olarak 20 µg laminin ekleyin.

Boncuk kültür alanını daha önce açıklandığı şekilde izole edin. Bir mililitrelik pipet kullanarak hücreleri, 500 microliters collagenase içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 15 dakika boyunca inkübe edin ve inkübasyon sırasında tüpü bir kez sallayın.

15 dakika sonra, eğer hala topaklanmalar mevcutsa, bunları gidermek için hücreleri 200 microliter pipetle aktarın. Büyük topaklanmalar kalmadığında, hücreleri taze kollajenaz ikiye aktarın ve inkübasyonu tekrarlayın. Sindirimi, her biri hazırlandığı şekilde, askorbik asit içermeyen üç mililitre EBM iki ekleyerek sonlandırın.

Tüpleri çeker ocak altındaki ısıtmalı bir rakta saklayın, ardından oda sıcaklığında dört dakika boyunca 1000 ×g hızda santrifüjleyin. Santrifüj işleminden sonra, aynı başlangıç örneğinden elde edilen hücre fraksiyonlarının 1 mL 0.25% trypsin EDTA (PBS içinde) ile süspansiyonunu hazırlayın. Ardından süspansiyonu ısıtmalı blokta beş dakika inkübe edin ve tripsini, askorbik asit içermeyen 4 mL EBM-2 ile inaktive edin.

Ardından, mikroskop altında büyük kümeler görünmeyene kadar hücreleri 2,5 mililitrelik bir şırınga üzerindeki 18 gauge iğneden yedi kez geçirin. Daha sonra hücreleri 1000 ×g hızında dört dakika boyunca santrifüjleyin. Şimdi hücre peletini E BM two içerisinde yeniden süspanse edin ve iki kuyucuklu chamber lamlarına ekin.

Hücreler, iki ila üç günlük inkübasyonun ardından analizler için hazır olacaktır. CMS'ler, birkaç IPS hücre hattından üretilmiştir. Bu hatlar başlangıçta bir meth feeder tabakası üzerinde üretilmiş ve ardından tanımlı bir besiyeri kullanılarak hemen matrigel üzerine yerleştirilmiştir.

Hücreler, faz parlak kenarları ve belirgin çekirdeklerle insan ESC benzeri bir morfoloji sergiledi. İmmünofloresan analiz, iPS hücrelerinin transkripsiyon faktörü T four'u doğru şekilde eksprese ettiğini ve TRA one 60 yüzey antijenini eksprese ettiğini gösterdi. Sitoflorometrik analiz, tipik yüzey pluripotens antijenleri olan SS EEA four ve TRA one 60'ın ekspresyonunu doğruladı.

Kapılama stratejisi soldaki saçılım grafiğinde gösterilmiştir. Matris jel üzerinde büyütülen IP FS hücrelerinin karyotip analizi de gerçekleştirilmiştir. Kardiyak soy hattına yönlendirme, IPS hücrelerinin eb'lere agregasyonu ve belirli bir serum tipi varlığında kültüre edilmesiyle tetiklenmiştir.

Kullanılan hücre hattına bağlı olarak, sorbik asit ile büzülen alanlar toplam kültürün %20 ila %35'ini oluşturmuştur. Büzülen CMS'ler, bu bölgelerden enzimatik sindirim yoluyla izole edilmiş ve protein ekspresyonu açısından analiz edilmiştir. R-T-P-C-R, IPS kaynaklı atan hücrelerde kalbe özgü iyon kanallarının ekspresyonunu saptamış, ancak atmayan hücrelerde bu ekspresyona rastlamamıştır.

Bu kanallar arasında, voltaj bağımlı bir kalsiyum kanalının bir alt birimi olan alfa bir, tip beş voltaj kapılı bir sodyum kanalının alfa alt birimi, KQT benzeri alt familyadan bir potasyum voltaj kapılı kanalı ve miyozinin her iki formu yer almaktaydı. Ağır zincir immünofloresans analizi, tekil IPS türevli kardiyomiyositlerin yapısal proteinleri, alfa sarkomerik aktini, kardiyak troponin I'i ve kardiyaka özgü bağlantı proteini konneksin 43'ü eksprese ettiğini ortaya koymuştur. Sonuç olarak, bu teknik in vitro miyokard hastalıklarının modellenmesinin yolunu açmış ve ilaçların insan vücuduna enjekte edilmesine gerek kalmadan insan ortamında deneylenmesine olanak sağlamıştır.

Bu videoyu izledikten sonra, IPS hücrelerinin serbest koşullarda nasıl sürdürüleceği ve embrioid cisim agregasyonu temelli bir yöntemle nasıl kardiyomiyositlere farklılaştırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.