İnsan kardiyomiyositleri Üretimi: Besleyici-ücretsiz İnsan Bağlı Pluripotent Kök Hücre A Farklılaşma Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, insan kardiyomiyositlerini, besleyicisiz koşullarda kültürlenen insan IPS hücrelerinden ayırt etmektir. Bu, embriyo cisimcikleri oluşturmak için önce IPS hücrelerinin ultra düşük bağlanma plakalarına kaplanmasıyla gerçekleştirilir. İşlemin ikinci adımı, oluşan embriyo cisimciklerinin jelatin kaplı kaplara aktarılmasıdır.

Kasılma alanları ortaya çıktığında, stereo mikroskop altında manuel olarak incelenir ve fibronektin kaplı tabaklara kaplanır. Daha fazla farklılaşma için, son adım, kasılan kümelerin enzimatik sindirimi ile tek kardiyomiyositlerin elde edilmesidir. Sonuç olarak, sonuçlar, immünofloresan mikroskobu yoluyla tipik yapısal belirteçleri, yani kardiyak troponini eksprese eden kardiyomiyosit benzeri hücrelerin farklılaşmasını gösterebilir.

Bu yöntem, kardiyovasküler biyoloji alanında, kardiyovasküler gelişim sırasında kardiyo farklılaşmasını ve işlev bozukluğunu ve insan kardiyomiyosit düzeyindeki hastalıkları yönlendiren mekanizmanın hangileri olduğu gibi önemli bir soruyu yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu çok ilginç bir tekniktir, çünkü insan hastalardan ve insan bireylerden in vitro kardiyomiyositlerin üretilmesine izin verir. Ve ikinci durumda, hastalığın test tüpünde yeniden özetlenmesine izin verir, böylece yeni ilaçlar in vivo olarak gitmeden önce in vitro olarak denenebilir.

Deney: 35 milimetre matrigel kaplı plakalar üzerinde büyütülen birleşik IPS hücre kültürleri ile başlayın. Büyüme ortamını bir miligram diss içeren bir mililitre PBS ile değiştirin. Sorgulanmış cam pipetler kullanarak hücreleri inceleyin.

Kolonilerin merkezindeki krater benzeri veya kistik yapılar gibi farklılaşmış hücrelere sahip bölgeleri çıkarın. Ayrıca hücrelerin ayrıldığı, düzleştiği ve dışa doğru göç ediyormuş gibi göründüğü alanları da çıkarın. Şimdi kalan hücreleri, koloni sınırları daha parlak hale gelene ve ayrılmaya başlayana kadar bir kültür başlığı altında 37 santigrat derecede inkübe edin.

Bu genellikle beş ila yedi dakika sürer. Bu noktada, dispa solüsyonunu çıkarın ve hücreleri bir mililitre HESM ile yıkayın. Ardından yıkama solüsyonunu atın.

Taze bir mililitre HESM'de, kolonileri hasat etmek için bir hücre kaldırıcı kullanın. Kolonileri 15 mililitrelik bir tüpe toplayın. Daha sonra, hücreleri başka bir mililitre HESM ile durulayın ve dört dakika boyunca 1000 kez G'de döndürün.

Daha sonra hücreleri matrigel üzerine kaplamaya devam edin ve kültürleme sırasında ortamı günlük olarak değiştirin. Önceki bölümde açıklandığı gibi farklılaşmamış IPS kolonilerini hasat ederek başlayın. Farklılaşmamış popülasyonlar izole edildikten sonra, onları bir mililitre EBM 20'de nazikçe askıya alın.

İki mililitrelik bir pipet kullanarak hücre kümelerini çok fazla parçalamayın. Pipetlemeyi iki veya üç vuruşla sınırlayın. Vuruşlar arasında stereoskop altındaki kolonilerin boyutunu kontrol edin.

Kolonilerin hepsi yaklaşık olarak aynı boyutta olduğunda, daha fazla karıştırmaya ihtiyaç duymazlar. Şimdi hücreleri, hasat edilen hücre plakası başına altı kuyucuklu bir plakayı doldurarak ultra düşük bağlantı plakaları üzerine yerleştirin. Tüpü bir mililitre EBM 20 ile durulamayı ve durulamayı plakaya dağıtmayı unutmayın.

Kuluçka süresinin üçüncü gününden sonra, embriyo cisimlerinin çıkarılmasını önlemek için ortamı mikroskop kullanarak değiştirin. Pipeti plakanın kenarına yakın tutun. Yedinci günde, embriyo gövdelerini 30 dakika boyunca 37 santigrat derecede ısıtılmış% 0.1 Jelatin ile kaplanmış plakalara taşıyın.

İki mililitre ortamda her 35 milimetrelik çanağa 35 ila 40 embriyo gövdesi ekleyin. Kültür sırasında. Ortamı düzenli olarak haftada iki kez değiştirin.

Embriyo cisimciklerini dayak alanları için kontrol edin ve boncuk alanlarının nerede olduğunu işaretleyin. Çanak kapağının üst kısmında, boncuk büzülme alanları yaklaşık 10 ila 20 gün sonra görünmelidir. Kendiliğinden kasılma olan alanlar ortaya çıktığında, ortamlarını EBM ikiye geçirin Kasılma alanları göründükten sonra, plakadaki diğer alanları bir aya kadar kültürlemeye ve izlemeye devam edin.

Toplamda. EBM'de iki Farklılaşma sürecinin eksikliği, en kritik olanı spesifik hücre hatları ve kardiyo farklılaşmasını indüklemek için kullanılan serum partisi olan birkaç faktöre büyük ölçüde bağlıdır. En yüksek verimliliği elde etmek için, kardiyojenik potansiyel için birkaç satırı ve çeşitli serum partilerini test edin: 12 kaplama ile başlayın.

Kuyucuk başına 300 mikrolitre PBS 300 mikrolitre içinde santimetre kare başına beş mikrogram fibronektin içeren kuyu plakaları, her bir kuyu yüzeyini tamamen kaplamalıdır. Plakaların bir hücre kültürü başlığında üstü açık olarak kurumasını bekleyin. Hücre kültürünün boncuklanma alanını çıkarmak için, çekilmiş bir cam pipet ve neşter kullanın.

Daha sonra bir mililitrelik bir pipet kullanarak, fibronektin kaplı bir plakanın her bir oyuğuna dört ila beş kelepçe aktarın. Tüm toplamalar yapıldıktan sonra, hücrelerin çıkarıldığı toplama plakası işaretleme alanlarındaki yüklü kuyucuklara bir mililitre EBM iki ekleyin. Ardından ortamı değiştirin ve plakayı kültür başlığına geri koyun.

Stereo mikroskop altında daha küçük çırpma kümeleri gerekiyorsa, ekilen alanları bir pipetten geçirin. Bu, birkaç çırpma hücresi içeren küçük kümeler üretir. Kültürde.

Onlar analiz için hazır olana kadar ortamı haftada iki kez değiştirin. İlk olarak, yüzeyi kaplayacak kadar PBS ile seyreltilmiş 20 mikrogram fibronektin ile kaplayarak dört santimetre kare iki odacıklı slaytlar hazırlayın. Bir cam desteği kullanılıyorsa, 20 mikrogram daha laminin ekleyin.

Boncuk kültürü alanını daha önce tarif edildiği gibi izole edin. Bir mililitrelik bir pipet kullanarak, hücreleri 500 mikrolitre kollajenaz tüpü içeren 15 mililitrelik bir tüpe aktarın. Hücreleri 15 dakika inkübe edin ve inkübasyon sırasında tüpü bir kez çalkalayın.

15 dakika sonra, herhangi bir topak kalırsa kümeleri çıkarmak için hücreleri 200 mikrolitrelik bir pipetten geçirin. Hücreleri taze kollajenaz ikiye aktarın ve büyük topaklar kalmadığında inkübasyonu tekrarlayın. Her biri hazırlandığı kadar soik asit içermeyen üç mililitre EBM ekleyerek sindirimi sonlandırın.

Tüpleri kaputun altında ısıtılmış bir rafta saklayın, ardından oda sıcaklığında dört dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin. Santrifüjlendikten sonra, PBS'de mililitre% 0.25 tripsin EDTA'da aynı başlangıç numunesinden hücre fraksiyonlarının bir süspansiyonunu yapın. Daha sonra süspansiyonu ısıtılmış blokta beş dakika inkübe edin, tripsini soik asit olmadan dört mililitre E BM iki ile etkisiz hale getirin.

Daha sonra, hücreleri 2,5 mililitrelik bir şırınga üzerinde 18 gauge bir iğneden mikroskop altında büyük topaklar görünmeyene kadar yedi defaya kadar geçirin. Daha sonra hücreleri dört dakika boyunca 1000 kez G'de santrifüjleyin. Şimdi hücre peletini E BM ikide yeniden süspanse edin ve bunları iki kuyu odacıklı kızak üzerine yerleştirin.

Hücreler, iki ila üç günlük inkübasyondan sonra analizler için hazır olacaktır. CMS, birkaç IPS hücre hattından üretildi. Bu çizgiler başlangıçta bir metamfetamin besleyici tabakası üzerinde üretildi ve tanımlanmış bir ortam kullanılarak hemen matrigel üzerine yerleştirildi.

Hücreler, faz parlak kenarları ve belirgin çekirdekleri olan bir insan ESC benzeri morfoloji gösterdi. İmmünofloresan analizi, IPS hücrelerinin transkripsiyon faktörü T dörtünü doğru bir şekilde eksprese ettiğini ve TRA one 60 yüzey antijenini eksprese ettiğini gösterdi. Sito florometrik analiz, tipik yüzey pluripotens antijenleri, SS EEA dört ve TRA bir 60'ın ekspresyonunu doğruladı.

Geçit stratejisi sol dağılımda gösterilir. Matriks jel üzerinde büyütülen IP FS hücrelerinin bir karyotip analizi de yapıldı. Kardiyak soy içine indüksiyon, IPS hücrelerinin ebs'ye toplanması ve belirli bir serum tipinin varlığında kültürleme ile tetiklendi.

Ve sorbik asit kasılma alanları, kullanılan hücre hattına bağlı olarak toplam kültürün% 20 ila 35'ini temsil ediyordu. Kasılan CMS, enzimatik sindirim ile bu bölgelerden izole edildi ve protein ekspresyonu için analiz edildi. R-T-P-C-R, IPS'den türetilen atan hücrelerde eksprese edilen kardiyak spesifik iyon kanallarının ekspresyonunu buldu, ancak atmayan hücrelerde değil.

Bu kanallar, bir alfa olanı, voltaja bağlı bir kalsiyum kanalının bir alt birimini, tip beş voltaj kapılı sodyum kanalının bir alfa alt birimini, KQT'nin bir potasyum voltaj kapılı kanalını, alt aile gibi ve her iki miyozin formunu içeriyordu. Ağır zincirli immünofloresan analizi, tek IPS'den türetilmiş kardiyomiyositlerin yapısal proteinleri, alfa sarkomerik, aktin, kardiyak troponin I ve kardiyak spesifik bileşke, conexion 43'ü eksprese ettiğini ortaya koydu. Sonuçta, bu teknik, miyokard hastalıklarının in vitro olarak modellenmesinin yolunu açtı ve ilacı insan vücuduna enjekte etmeden ilaçların insan ortamında denenmesine izin verdi.

Bu videoyu izledikten sonra, IPS hücrelerinin serbest serbest koşullarda nasıl korunacağını ve embriyo cisimciklerinin agregasyonuna dayalı bir yöntemle kardiyomiyosite nasıl ayırt edileceğini iyi anlamış olmalısınız.