Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

Bu prosedürün genel amacı, yüksek kaliteli fırtına süper çözünürlüklü görüntülerin nasıl elde edileceğini göstermektir. Bu, önce floresan etiketli bir test numunesi hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım, anahtarlama tamponunu hazırlamak ve ardından görüntüleme odasını tamponla doldurmaktır.

Daha sonra, ham veriler bir fırtına mikroskobunda elde edilir. Son adım, yağmur fırtınası işleme yazılımını kullanarak ham verilerden süper çözünürlüklü görüntüleri yeniden oluşturmaktır. Sonuç olarak, test numuneleri, daha sonra 30 ila 50 nanometre arasındaki çözünürlüklere sahip hücrelerde fırtına süper çözünürlüklü görüntüler oluşturmak için işlenebilen yüksek kaliteli ham verilerin nasıl elde edileceğini göstermek için kullanılır, bu da geleneksel floresan mikroskobu tekniklerine göre beş ila on kat çözünürlük artışını temsil eder.

Genel olarak, bu yönteme yeni olan kişiler, çok sayıda yüksek kaliteli seyrek bağlantı toplamanın önemini anlamadıkları için mücadele edeceklerdir. Bu, doğru anahtarlama tamponunda Alexa 6 4 7 boyası kullanılarak çok daha kolay hale getirilir. Bu tekniğin görsel bir gösterimi çok önemlidir, çünkü yüksek kaliteli ham verilerin elde edilmesi, SPR çözünürlüklü görüntülerin üretilmesinde kritik öneme sahiptir.

Bu tekniğin ham video dizileri, diğer herhangi bir floresan mikroskobu biçiminden tamamen farklı görünmektedir. Camı floresan dekstrin ile kaplama işlemine başlamak için, sekiz odacıklı bir tavanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre% 0.01 polilisin çözeltisi örtün ve 10 dakika inkübe edin. 10 dakika sonra, hiçbir sıvının seyreltik kalmadığından emin olmak için polilisin çözeltisini bir pipetle çıkarın.

Dekstrin stokunun mililitre başına iki miligramın 0.25 mikrolitresi. Alexa 6 47 ila 25 mikrolitre deiyonize su, yüksek yoğunluklu bir dekstrin kaplaması oluşturmak için mililitre başına 20 mikrogramlık bir çözelti oluşturur. Alexa 6 47 çözümü.

Mililitre başına 20 mikrogramlık çözeltinin 20 mikrolitresini toplam 200 mikrolitre deiyonize suya seyreltin. Orta yoğunluklu bir çözelti için, iki mikrolitreyi 200 mikrolitre deiyonize su ile seyreltin. Düşük yoğunluklu bir çözelti için 0.2 mikrolitre seyreltin.

200 mikrolitre deiyonize suda, her bir kuyucuğa 200 mikrolitre seyreltilmiş dekstrin Alexis X 47 çözeltisi ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. Daha uzun inkübasyon süreleri kullanılabilir, bu da daha yoğun bir dekstrin kaplamasına neden olabilir. Son olarak, Dexter Xis X 47 solüsyonlarını çıkarın ve üç kez suyla yıkayın.

Önce cam üzerinde floresan aktin filamentleri hazırlamak için, sekiz odanın her bir oyuğuna 200 mikrolitre% 0.01 polilisin çözeltisi ekleyin. Camı örtün ve 10 dakika inkübe edin. Sıvı kalmadığından emin olmak için bir pipetle çıkarın.

Her odaya, daha önce üreticinin talimatlarına göre yeniden oluşturulmuş 90 mikrolitre genel aktin tamponu ekleyin. Daha sonra 10 mikrolitre 10 mikromolar önceden oluşturulmuş aktin filament çözeltisi ve bir mikrolitre foid ve Alexa 6 47 ekleyin ve karıştırmak için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin, oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin, mikroküre floresan boncukları referans belirteçleri olarak hazırlamak için bir mikrolitre tepec boncuklarını 200 mikrolitre PBS'ye seyreltmek ve karıştırın. Sulandırılan boncukları görüntüleme haznesine ekleyin ve 15 dakika kadar bekleyin.

15 dakika sonra, çözeltiyi çıkarın ve görüntülemeden önce PBS ile üç kez yıkayın, bu deneyde yaklaşık% 80 co akıcılığına kültürlenmiş bir hücre kullanılır. Kültür ortamını çıkarın ve PBS ile yıkayın. Daha sonra 10 dakika boyunca 500 mikrolitre% 4 formaldehit çözeltisi ekleyin.

Formaldehiti çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. Hücrelerin kuru kalmasına izin vermeyin ve her zaman PBS tamponlu çözeltiler kullanın. Hipotonik stresi önlemek için, mililitre başına 50 mikrogramlık bir EGF Alexa çözeltisi, 6 47 ila 200 mikrolitre% 0.1 BSA çözeltisi içeren iki mikrolitre ekleyin ve ardından bu çözeltiyi hela hücrelerine ekleyin.

Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Solüsyonu çıkarın ve PBS ile üç kez yıkayın. % 0.1 BSA'lık bir bloke edici çözelti ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.

Bundan sonra, bloke edici solüsyonu çıkarın ve görüntülemeden önce PBS ile üç kez daha yıkayın. Görüntülemeden hemen önce, glikoz enzimini ve indirgeyici ajan stok çözeltilerini karıştırarak anahtarlama tamponunu hazırlayın 50 mikrolitre, 400 mikrolitre ve 100 mikrolitre oranında, son hacmi bir mililitreye çıkarmak için PBS ekleyin. PBS'yi görüntüleme odasından çıkarın ve ardından anahtarlama arabelleği ile üst kısma kadar doldurun.

Haznenin üstüne dikkatlice bir kapak fişi yerleştirin, hiç kabarcık olmadığından ve tüm haznenin kaplandığından emin olun. Herhangi bir kabarcık görülürse, ek tampon veya PBS ile doldurun. Aksi takdirde, arabellek performansı düşebilir.

Bu prosedürün başarısı için yüksek kaliteli, seyrek bağlantı verilerinin toplanması çok önemlidir, bu nedenle mikroskopların doğru şekilde odaklandığından ve doğru çekim ayarlarının kullanıldığından emin olun. Görüntülenecek ilgilenilen floresan bir yapıyı bulun. İstediğiniz aydınlatma açısını seçin.

Bu durumda, odak dışı ışığı en aza indirerek sinyal-gürültü oranını iyileştirdiği için çim veya çok eğimli bir açı önerilir, bu da özellikle hücre örnekleri için faydalıdır. Fırtına görüntülemeden önce yapının fraksiyon sınırlı görüntüsüne bir referans alın. 10 milisaniye pozlama kamera ayarları ve yaklaşık 50 hertz veya saniyede kare döngü süresi ile görüntüleme yaparken uyarma lazerini santimetre kare başına yaklaşık iki kilovata karşılık gelen yüksek bir güce yükseltin.

Flora dörtlüsü seyrek bir yanıp sönme düzenine geçtiğinde, 10.000 kare toplayın. Bu yeniden yapılanmaya başlamak için. RAINSTORM M dosyasını MATLAB içinden açın ve yağmur fırtınası penceresinde çalıştırın.

Gözat düğmesini kullanarak analiz edilecek görüntü dosyasını seçin. Bu bir TIF dosyası olmalıdır. Piksel genişliğini, verileri elde etmek için kullanılan mikroskop sisteminin ham verileriyle eşleşecek şekilde değiştirin.

Diğer değerleri varsayılan olarak bırakın. İşlem görüntüleri düğmesine basın ve bir ön görüntü görünene kadar bekleyin. İşlemenin süresi dosya boyutuna, bilgisayar özelliklerine ve ham verilerdeki aday bağlantıların sayısına bağlı olacaktır.

Güncellenmiş bir süper çözünürlüklü görüntü oluşturmak için, gözden geçireni aç düğmesine basın, ikinci bir pencere görünecektir. Görüntü görüntüsünü istediğiniz gibi değiştirmek için kontrastı ayarla düğmesine basın. Görüntünün çok karanlık olduğu bazı durumlarda, maksimum değer düşürülmelidir.

Yararlı görüntü kalitesi ölçümleri oluşturmak ve süper çözünürlüklü görüntüyü daha da iyileştirmek için gözden geçiren penceresini kullanın. İlk üç kalite kontrol parametresini sırasıyla 5, 000, 0,1 ve 0,8 ila 3,5 varsayılan değerlerine bırakın. Foton değeri başına sayımları güncelleştirin.

Ortalama yerelleştirmeyi optimize etme, yerelleştirme numarasına karşı hassasiyet arasında denge kurmak için yerelleştirme hassasiyet sınırını değiştirin. Son görüntüde, verilerin ve numunenin kalitesine bağlı olarak 30 ila 50 nanometre değerleri önerilir. Yeniden yapılandırma ölçek faktörü varsayılanı beştir ve orijinal görüntülerdeki pikselin 160 nanometre olduğu varsayılarak, 32 nanometrelik süper çözünürlüklü pikseller üretecektir.

Ham görüntülerin piksel boyutu 100 nanometreyse, bu, 20 nanometre pikselli süper çözünürlüklü görüntüler üretecektir. Daha küçük süper çözünürlüklü pikseller üretmek için ölçek faktörünü artırın. Son görüntüde, güncellenmiş bir süper çözünürlüklü görüntü oluşturmak için gözden geçireni çalıştır düğmesine basın.

Görüntü kalitesi ölçümlerini görüntülemek için histogramları görüntüle düğmesine basın. Son olarak, tüm bu verileri kaydetmek için gözden geçirendeki görüntüyü kaydet düğmesine basın. Bu yordama, daha önce gösterildiği gibi bir görüntü oluşturarak başlayın.

İnceleyen'deki kutu izleme düğmesine basın ve incelenen görüntüdeki referans işaretçisinin üzerine bir kutuyu tıklayıp sürükleyin. Kutulu konumları gösterecek yeni bir görüntü görünene kadar bekleyin. İsterseniz, ilgilenilen nesne bir referans işaretleyici ise bu görüntüyü kaydedin.

Burada olduğu gibi, ankraj ayar düğmesine ve ardından kaymayı çıkar düğmesine tıklayarak sapma düzeltmesi yapın. Son olarak, yeni bir fırtına görüntüsü oluşturmak için gözden geçireni çalıştır'ı tekrar tıklayın. Başarılı bir dekstrin kaplaması, floresan bir tek tabaka üretmelidir ve tipik dekstrin verileri bu şekilde gösterilmiştir.

Kırınım sınırlı görüntüler, fırtına görüntülemesinden önce farklı dekstrin konsantrasyonlarını gösterir. Süper çözünürlüklü rekonstrüksiyonların piksel boyutu 25 nanometredir. 1 28 x 1 28 piksel çerçeve boyutunda 10.000 görüntü toplandı ve bu diziden tek tek kareler gösterildi.

Yüksek dekstrin konsantrasyonunda. Floresan tek katman, bu görüntülerde ve bu video segmentinde gösterildiği gibi nispeten tek tip görünmelidir. Daha düşük konsantrasyonlarda, yanıp sönmeler daha seyrek ve odakta görünecektir.

Sabit lazer aydınlatmada bu görüntü elde etme aşamasında belirgin bir arka plan olmadığından, yüksek yoğunluklu örnekte kare 2000 ile kare 8.000 arasında yapılan bir karşılaştırmada gösterildiği gibi yanıp sönme sayısı zamanla azalacaktır. Yüksek, orta ve düşük dekstrin konsantrasyonlarının süper çözünürlüklü görüntüleri arasındaki temel fark, azalan lokalizasyon sayısıdır. Bu grafik, hata çubuklarının standart sapmayı gösterdiği her bir dekstrin konsantrasyonunun ortalama üç adet 10.000 kare dizisini göstermektedir.

Bununla birlikte, floresan moleküllerinin konsantrasyonu, ham verilerdeki yanıp sönme sayısı ile lokalizasyon sayısı arasındaki bu orantılı ilişki, çerçeve başına kabul edilen lokalizasyon sayısının bu çiziminde gösterildiği gibi basit bir doğrusal ilişki değildir. Çok yüksek molekül yoğunluklarında yuvarlanan 100 kare ortalaması kullanan yazılım, herhangi bir numuneyi görüntülerken molekülleri başarılı bir şekilde lokalize edemez. Yaygın bir sorun, ortam boyunca yayılan floro kuvvetinin neden olduğu görüntü boyunca parlak ancak odaklanmamış floresan pusun varlığı olabilir.

Bu ayrılmış floresan molekülleri, anahtarlama tamponunu eklemeden önce PBS ile yıkama adımlarının sayısını artırarak veya hazneye yeni anahtarlama tamponu ekleyerek, her bir görüntü dizisinden gelen verileri işleyerek ve karşılaştırarak çok farklı süper çözünürlüklü görüntüler elde edilerek önlenebilir veya çıkarılabilir. Panel C ve D, sırasıyla A ve B panellerinde toplanan verilere karşılık gelen süper çözünürlüklü görüntü yapılarıdır. Bu grafik, yuvarlanan 100 kare ortalaması kullanarak kare başına kabul edilen yerelleştirme sayısını çizer.

Kırmızı çizgi, yüksek bir arka planın olduğu fırtına dizisi A ve C'ye, mavi çizgi, arka planın düşük olduğu B ve D'ye karşılık gelir. Yüksek ve düşük arka plan verilerine karşılık gelen görüntüler için kabul edilen yerelleştirme numarası ikinci grafikte gösterilmiştir. Bu üç kırınım sınırlı görüntü, anahtarlama tamponu ve fırtına görüntülemesinin eklenmesinden önce camın yüzeyine yapışmış önceden oluşturulmuş aktin filamentlerinin tipik verilerini gösterir.

Değişken uzunluklarda filamentler görülebilir. Çok parlak filamentler genellikle birbirine dolanmış birkaç filamenttir. Karışık alanlar yerine nispeten parlak tek filamentlerin seçilmesi, alım aşamasında daha kaliteli görüntüler elde edilmesini sağlar.

Filamentin uzunluğu boyunca parlak odakta yanıp sönmeler görülmelidir. Seyrek yanıp sönme, edinme aşamasında ve daha sonra proses verilerinde görülmelidir. Kare başına lokalizasyonlarda ince bir sürekli filament olmalıdır, kademeli bir düşüş göstermelidir.

Tipik olarak, bir filamentin yarı maksimum veya FWHM ile dolusu, görüntü J'deki çizim profili özelliğini kullanarak aktin filamentinin yakınlaştırılmış bir bölgesi boyunca düz bir çizgi çizerek ve ardından bir Gauss uyumu gerçekleştirerek ampirik bir çözünürlük tahmini olarak verilir. FWHM, 43.2 nanometre olarak hesaplanır. Bir dizi aktin filamentinin, çerçevelerin alt kümelerini işleyerek ve ilk ve son 5.000 çerçeveyi karşılaştırarak dallandığı ve/veya birbirini geçtiği durumlarda bir yanlış lokalizasyon sorunu ortaya çıkabilir.

Süper çözünürlüklü görüntüde ilk 5.000 kare kullanılarak farklı bir görüntü üretilir. Görüntünün ortasında birçok yerelleştirme görülüyor. Bununla birlikte, son 5.000 kareyi kullanırken, bu lokalizasyonların çok azı belirgindir ve görüntüdeki düşük lokalizasyon sayısı nedeniyle bir şekilde sürekli de olsa sadece filamentler kalır.

Çok yüksek bir göz kırpma yoğunluğundan şüpheleniliyorsa, görüntülerin kare başına yerelleştirme verileriyle karşılaştırılması, bu sorunun ilk kare kümesi sırasında meydana geldiğini güçlü bir şekilde düşündürebilir. Yaklaşık dört olan son kare kümesiyle karşılaştırıldığında, kare başına 10'un üzerinde ortalama yerelleştirme sayısı vardır. Fırtına mikroskobundaki bir diğer potansiyel sorun, numune objektif merceğe göre hareket ettiğinde ortaya çıkan sürüklenmedir Veri toplama aşaması boyunca, görüntü elde etme aşamasında tespit edilmesi çok zor olsa da, aktin filamentleri gibi bilinen yapıların süper çözünürlüklü görüntülerinde sapma tespit edilebilir.

Yanal kaymanın meydana gelmiş olabileceğine dair ilk işaret, yapının beklenenden daha büyük olmasıdır. Örneğin, yağmur fırtınasından elde edilen hassas limit verileriyle karşılaştırıldığında yarı maksimum ile nispeten büyük bir dolu ile, bu durumda 67 nanometre ile karşılaştırıldığında 90 nanometre. Sapmayı tespit etmenin daha iyi bir yolu, yerelleştirmeleri zaman IE'nin bir fonksiyonu olarak karşılaştırmak ve sonraki karelerdeki yerelleştirmelerin erken karelerdekilere kıyasla yer değiştirip değiştirmediğini görmektir.

Bu, bir renk kodu ile görüntülendiğinde aktin filamentleri durumunda açıkça görülebilir. B ve C panellerinde gösterildiği gibi yağmur fırtınasında kutu izleme özelliği kullanılarak, lokalizasyonlar, alındıkları andaki çerçeve numarasına karşılık gelen bir renkle görüntülenir. Örneğin, edinme dizisinin erken dönemlerinden itibaren yerelleştirmeler mavi, edinme dizisinin sonlarından itibaren yerelleştirmeler ise kırmızıdır.

Yer değiştiren renkler, ölçmek ve düzeltmek için kaymanın meydana geldiğini gösterir. Sürüklenme için, 100 nanometre çapındaki floresan boncuklar referans işaretleyici olarak kullanılabilir, birden dörde kadar olan numaralar, kırpılmış ve yakınlaştırılmış boncukları ayrı ayrı gösterir. Edinme aşamasında üç dakika 10 saniye boyunca yaklaşık 100 nanometrelik nispeten şiddetli bir sapmanın olduğu bir örnekte, aynı kutu izleme özelliği, bu örnekteki dört boncuğun tümü aynı sürüklenmeye yakın olarak gösterildiği için sürüklenmenin meydana geldiğini renk kodlaması yapmak ve doğrulamak için kullanılabilir, bunlardan birini seçmek mümkündür, bu durumda boncuk iki, referans olarak kullanmak ve sapmayı çıkarmak için mümkündür diğer boncuklardan.

Panel E ile yapılan bir karşılaştırma, yanal kaymanın düzeltildiğini göstermektedir. Son olarak, epidermal büyüme faktörü lekeli topuk hücreleri, görüntü çözünürlüğünün gerçekçi bir örneğini vermek için kullanılabilir. Hücrelerde, panel A, bazal hücre yüzeyine odaklanmış bir hela hücresinin bir kısmının kırınım sınırlı bir görüntüsünü gösterir, burada sarı kutular, kırınım sınırlı görüntüdeki belirsiz yakınlaştırılmış ilgi bölgelerinin aksine, B ve C panellerinde gösterilen ilgi alanlarına yakınlaştırıldığını gösterir.

Süper çözünürlüklü görüntüler, ara sıra izole edilmiş tek piksellerden oluşan bir küme karışımı göstermelidir. Kümelerin çapı yaklaşık 100 nanometre olacak ve muhtemelen çukurlar ve veziküller oluşturmaya karşılık gelecek. Panel D'den alınan çerçeve verileri başına EGF'nin ağırlıklı olarak aşağı regüle edildiği ve endositozlu lokalizasyonların izlendiği yol grafik G'de sunulmuştur.Bu videoyu izledikten sonra, bazı basit test örneklerinin nasıl yapılacağını, verilerin nasıl elde edileceğini ve yüksek kaliteli fırtınanın nasıl yeniden yapılandırılacağını iyi anlamalısınız, çözünürlük görüntülerine bakın.

Bu yöntemler, sürüklenme gibi bazı yaygın uyum tuzaklarından kaçınmanıza ve fırtınanızı optimize etmenize yardımcı olacaktır. Çözünürlük deneylerine bakın.