Optimize STORM Süper Çözünürlük Mikroskopi Testi Örnekleri

Bu prosedürün genel amacı, yüksek kaliteli STORM süper çözünürlüklü görüntülerin nasıl elde edileceğini göstermektir. Bu işlem, öncelikle floresan işaretli bir test örneği hazırlanarak gerçekleştirilir. İkinci adım ise anahtarlama tamponu hazırlamak ve ardından görüntüleme haznesini bu tamponla doldurmaktır.

Ardından, ham veriler bir STORM mikroskobunda elde edilir. Son adım, Rainstorm işleme yazılımını kullanarak ham verilerden süper çözünürlüklü görüntülerin yeniden oluşturulmasıdır. Nihayetinde, test örnekleri, TIRF ve konfokal dahil olmak üzere geleneksel floresan mikroskopi tekniklerine kıyasla beş ila on kat çözünürlük artışını temsil eden, hücrelerde 30 ile 50 nanometre arasındaki çözünürlüklerde STORM süper çözünürlüklü görüntüler üretmek için işlenebilen yüksek kaliteli ham verilerin nasıl elde edileceğini göstermek için kullanılır.

Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, çok sayıda yüksek kaliteli seyrek bağlantı toplamanın önemini fark etmedikleri için zorluk yaşarlar. Bu durum, doğru değiştirme tamponu içinde Alexa 6 4 7 boyası kullanılarak çok daha kolay hale getirilir. SPR çözünürlüklü görüntüler üretmek için yüksek kaliteli ham veriler elde etmek kritik olduğundan, bu tekniğin görsel bir gösterimi esastır.

Bu tekniğin ham video sekansları, diğer tüm floresan mikroskopi türlerinden tamamen farklı görünür. Camı floresan dekstrin ile kaplama prosedürüne başlamak için, sekiz odacıklı lamın her bir kuyucuğuna 200 µL %0,01'lik polilizin çözeltisi ekleyin ve 10 dakika boyunca inkübe edin. 10 dakika sonra, hiçbir sıvı kalmadığından emin olmak için polilizin çözeltisini bir pipet yardımıyla uzaklaştırın.

Yüksek yoğunluklu bir dekstrin Alexa 647 kaplaması oluşturmak için, 2 mg/mL konsantrasyonundaki dekstrin Alexa 647 stok çözeltisinden 0,25 µL, 25 µL deiyonize su içerisine eklenerek 20 µg/mL konsantrasyonunda bir çözelti hazırlanır.

20 µg/mL çözeltinin 20 µL'sini, toplam 200 µL deiyonize su içerisinde seyreltin. Orta yoğunluktaki bir çözelti için, 2 µL'yi 200 µL deiyonize su içerisinde seyreltin. Düşük yoğunluktaki bir çözelti için 0,2 µL seyreltin.

Her bir kuyucuğa 200 µL deiyonize su içerisinde 200 µL seyreltilmiş dekstrin Alexis X 47 çözeltisi ekleyin ve 10 dakika inkübe edin. Daha yoğun bir dekstrin kaplaması elde etmek için daha uzun inkübasyon süreleri uygulanabilir. Son olarak, Dexter Xis X 47 çözeltilerini uzaklaştırın ve su ile üç kez yıkayın.

Cam üzerinde floresan aktin filamentleri hazırlamak için öncelikle, sekiz bölmeli bir kapağın her bir kuyucuğuna 200 µL %0,01 polylysine çözeltisi ekleyin. Lamı kapatın ve 10 dakika boyunca inkübe edin. Hiç sıvı kalmadığından emin olmak için pipetle uzaklaştırın.

Her bir bölmeye, daha önce üretici talimatlarına göre yeniden hazırlanmış 90 µL genel aktin tamponu ekleyin. Ardından 10 µL 10 µM önceden oluşturulmuş aktin filament çözeltisi ve 1 µL foid ve Alexa 6 47 ekleyip karıştırmak için pipetle nazikçe yukarı aşağı çekin; referans işaretçiler olarak mikroküre floresan boncuklarını hazırlamak için oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 1 µL tepec boncuğunu 200 µL PBS içinde seyreltin ve karıştırın. Seyreltilmiş boncukları görüntüleme bölmesine ekleyin ve 15 dakika bekleyin.

15 dakika sonra çözeltiyi uzaklaştırın ve görüntüleme öncesinde hücreleri üç kez PBS ile yıkayın. Bu deneyde yaklaşık %80 konfluens düzeyine ulaşmış kültürlenmiş hücreler kullanılır. Kültür ortamını uzaklaştırın ve PBS ile yıkayın. Ardından 10 dakika boyunca 500 µL %4'lük formaldehit çözeltisi ekleyin.

Formaldehiti uzaklaştırın ve PBS ile üç kez yıkayın. Hücrelerin kurumasına izin vermeyin ve her zaman PBS tamponlu çözeltiler kullanın. Hipotonik stresten kaçınmak için, 200 µL %0,1 BSA çözeltisine 2 µL 50 µg/mL stok EGF Alexa, 6 47 ekleyin ve ardından bu çözeltiyi HeLa hücrelerine ilave edin.

Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. Solüsyonu uzaklaştırın ve PBS ile üç kez yıkayın. %0,1 BSA içeren bir bloklama solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 15 dakika bekletin.

Bundan sonra, bloklama solüsyonunu uzaklaştırın ve görüntülemeden önce PBS ile üç kez daha yıkayın. Görüntülemeden hemen önce, enzim glikoz ve indirgeyici ajan stok solüsyonlarını 50 µL, 400 µL ve 100 µL oranlarında karıştırarak geçiş tamponunu hazırlayın; final hacmi 1 mL'ye tamamlamak için PBS ekleyin. Görüntüleme haznesindeki PBS'yi uzaklaştırın ve ardından hazneyi ağzına kadar geçiş tamponu ile doldurun.

Lameli dikkatlice haznenin üzerine yerleştirin, hiçbir hava kabarcığı kalmadığından ve tüm haznenin kapandığından emin olun. Herhangi bir kabarcık görülürse, ek tampon çözelti veya PBS ile tamamlayın. Aksi takdirde, tampon performansı düşebilir.

Bu prosedürün başarısı için yüksek kaliteli, seyrek bağlantı verilerinin toplanması esastır; bu nedenle mikroskopların düzgün şekilde odaklandığından ve doğru görüntüleme ayarlarının kullanıldığından emin olun. Görüntülenecek ilgilendiğiniz floresan yapıyı belirleyin. İstenilen aydınlatma açısını seçin.

Bu durumda, özellikle hücre örnekleri için faydalı olan odak dışı ışığı minimize ederek sinyal-gürültü oranını iyileştirdiği için turf veya yüksek eğimli bir açı önerilir. STORM görüntülemeden önce yapının fraksiyon sınırlı görüntüsü için bir referans alın. Kamera ayarlarını 10 milisaniye pozlama ve yaklaşık 50 hertz veya saniyedeki kare sayısı çevrim süresine ayarlayarak görüntüleme yaparken, eksitasyon lazerini santimetrekare başına yaklaşık iki kilowatt'a karşılık gelen yüksek bir güce çıkarın.

Flora fours seyrek bir yanıp sönme düzenine geçtiğinde, 10.000 kare toplayın. Bu rekonstrüksiyon işlemine başlamak için MATLAB içinden RAINSTORM M dosyasını açın ve rainstorm penceresinde çalıştırın.

Gözat butonunu kullanarak analiz edilecek görüntü dosyasını seçin. Bu dosya bir TIF dosyası olmalıdır. Piksel genişliğini, verileri elde etmek için kullanılan mikroskop sisteminin ham verilerine uygun olacak şekilde değiştirin.

Diğer değerleri varsayılan haliyle bırakın. Görüntüleri işle (process images) düğmesine basın ve ön izleme görüntüsü ortaya çıkana kadar bekleyin. İşleme süresi dosya boyutuna, bilgisayar özelliklerine ve ham veriler içindeki aday bağlantıların sayısına bağlı olarak değişecektir.

Güncellenmiş bir süper çözünürlüklü görüntü oluşturmak için inceleyiciyi aç (open reviewer) düğmesine basın; böylece ikinci bir pencere açılacaktır. Görüntü görüntüsünü istediğiniz şekilde değiştirmek için kontrastı ayarla (adjust contrast) düğmesine basın. Görüntünün çok karanlık olduğu bazı durumlarda, maksimum değer düşürülmelidir.

Kullanışlı görüntü kalitesi metrikleri oluşturmak ve süper çözünürlüklü görüntüyü daha da iyileştirmek için inceleme penceresini kullanın. İlk üç kalite kontrol parametresini sırasıyla 5.000, 0,1 ve 0,8 ile 3,5 şeklindeki varsayılan değerlerinde bırakın. Foton başına sayım değerini güncelleyin.

Ortalama lokalizasyon ve hassasiyeti, lokalizasyon sayısı ile optimize etmek arasında bir denge kurmak için lokalizasyon hassasiyet eşik değerini değiştirin. Son görüntüde, verilerin ve örneğin kalitesine bağlı olarak 30 ila 50 nanometre değerleri önerilir. Rekonstrüksiyon ölçek faktörü varsayılan olarak beştir; orijinal görüntülerdeki pikselin 160 nanometre olduğu varsayıldığında, bu durum 32 nanometrelik süper çözünürlüklü pikseller oluşturacaktır.

Ham görüntülerin piksel boyutu 100 nanometre ise, bu işlem 20 nanometrelik piksellere sahip süper çözünürlüklü görüntüler oluşturacaktır. Daha küçük süper çözünürlüklü pikseller elde etmek için ölçekleme faktörünü artırın. Nihai görüntüde, güncellenmiş bir süper çözünürlüklü görüntü oluşturmak için çalıştırma gözden geçirme (run reviewer) düğmesine basın.

Görüntü kalitesi metriklerini görüntülemek için histogramları görüntüle düğmesine basın. Son olarak, tüm bu verileri kaydetmek için inceleyicideki görüntüyü kaydet düğmesine basın. Bu prosedüre, daha önce gösterildiği şekilde bir görüntü oluşturarak başlayın.

İnceleyici ekranındaki kutu takip düğmesine basın, ardından incelenen görüntü üzerindeki referans işaretleyici (fiducial marker) üzerinde bir kutu oluşturmak için tıklayıp sürükleyin. Kutuyla belirlenen konumların görüntüleneceği yeni bir görüntü belirinceye kadar bekleyin. Eğer ilgilenilen nesne bir referans işaretleyici ise, isterseniz bu görüntüyü kaydedin.

Burada olduğu gibi, önce "set anchor" düğmesine, ardından "subtract drift" düğmesine tıklayarak sürüklenme düzeltmesini gerçekleştirin. Son olarak, yeni bir STORM görüntüsü oluşturmak için tekrar "run reviewer" düğmesine tıklayın. Başarılı bir dekstrin kaplaması floresan bir tek tabaka oluşturmalıdır; tipik dekstrin verileri bu şekilde gösterilmiştir.

Kırınım sınırlı görüntüler, STORM görüntüleme öncesindeki farklı dekstrin konsantrasyonlarını göstermektedir. Süper çözünürlüklü rekonstrüksiyonların piksel boyutu 25 nanometredir. 128 x 128 piksellik bir çerçeve boyutuyla 10.000 görüntü toplanmış olup, bu diziden tekil kareler gösterilmiştir.

Yüksek dekstrin konsantrasyonunda, floresan tek tabaka bu görüntülerde ve video segmentinde gösterildiği gibi nispeten homojen görünmelidir. Daha düşük konsantrasyonlarda, yanıp sönmeler daha seyrek ve odakta görünecektir.

Sabit lazer aydınlatması altındaki bu görüntüleme aşamasında belirgin bir arka plan gürültüsü olmadığından, yüksek yoğunluklu örnekteki 2000. kare ile 8.000. kare arasındaki karşılaştırmada gösterildiği üzere, yanıp sönme sayısı zamanla azalacaktır. Yüksek, orta ve düşük dekstrin konsantrasyonlarının süper çözünürlüklü görüntüleri arasındaki temel fark, lokalizasyon sayısının azalmasıdır. Bu grafik, her bir dekstrin konsantrasyonu için üç adet 10.000 karelik dizinin ortalamasını göstermekte olup hata çubukları standart sapmayı belirtmektedir.

Ancak, ham verilerdeki floresan molekül konsantrasyonu, yanıp sönme sayısı ve lokalizasyon sayısı arasındaki bu orantılı ilişki, kare başına kabul edilen lokalizasyon sayısının gösterildiği bu grafikte görüldüğü gibi basit bir doğrusal ilişki değildir. Çok yüksek molekül yoğunluklarında 100 karelik hareketli ortalama kullanıldığında, yazılım herhangi bir örneğin görüntülemesi sırasında molekülleri başarıyla lokalize edemez. Yaygın bir sorun, floroforun ortamda yayılması nedeniyle görüntü boyunca oluşan parlak ancak odak dışı floresan pusun varlığı olabilir.

Bu ayrılmış floresan moleküllerin oluşumu, anahtarlama tamponu eklemeden önce PBS ile yapılan yıkama adımlarının sayısı artırılarak önlenebilir veya bunlar uzaklaştırılabilir; ya da işlem yapılan hazneye taze anahtarlama tamponu ekleyip her görüntü dizisinden elde edilen verileri karşılaştırmak, oldukça farklı süper çözünürlüklü görüntülerle sonuçlanır. Panel C ve D, sırasıyla panel A ve B'de toplanan verilere karşılık gelen süper çözünürlüklü görüntü oluşturumlarıdır. Bu grafik, hareketli 100 kare ortalaması kullanılarak kare başına kabul edilen lokalizasyon sayısını göstermektedir.

Kırmızı çizgi, arka planın yüksek olduğu fırtına dizisi A ve C'ye karşılık gelirken, mavi çizgi arka planın düşük olduğu B ve D'ye karşılık gelmektedir. Yüksek ve düşük arka plan verilerine karşılık gelen görüntüler için kabul edilen lokalizasyon sayısı ikinci grafikte gösterilmiştir. Bu üç difraksiyon sınırlı görüntü, anahtarlama tamponu eklenmesi ve storm görüntülemesi öncesinde cam yüzeye yapışmış önceden oluşturulmuş aktin filamentlerinin tipik verilerini göstermektedir.

Değişken uzunlukta filamentler görülebilir. Çok parlak filamentler sıklıkla birbirine dolanmış birkaç filamentten oluşur. Edinme aşamasında, dolanmış alanlar yerine nispeten parlak tekil filamentlerin seçilmesi daha kaliteli görüntüler elde edilmesini sağlar.

Filaman boyunca odak noktası parlak yanıp sönmeler görülmelidir. Edinim aşamasında ve ardından işlenen verilerde seyrek yanıp sönmeler görülmelidir. İnce, sürekli bir filaman olmalı ve kare başına yerelleştirmeler kademeli bir düşüş göstermelidir.

Tipik olarak, bir filamentin yarı maksimum tam genişliği veya FWHM, ImageJ'deki çizim profili özelliği kullanılarak aktin filamentinin yakınlaştırılmış bir bölgesi üzerinden düz bir çizgi çizilmesi ve ardından Gauss uyumu yapılmasıyla çözünürlüğün ampirik bir tahmini olarak verilir. FWHM 43.2 nanometre olarak hesaplanmıştır. Bazı aktin filamentlerinin dallandığı ve/veya birbirini kestiği durumlarda, kare alt kümeleri işlenip ilk ve son 5.000 kare karşılaştırılarak bir yanlış yerleşim problemi tespit edilebilir.

İlk 5.000 kare kullanılarak oluşturulan süper çözünürlüklü görüntüde farklı bir görüntü ortaya çıkar. Görüntünün ortasında birçok lokalizasyon görülmektedir. Ancak, son 5.000 kare kullanıldığında bu lokalizasyonların çok azı belirgin hale gelir ve görüntüdeki düşük lokalizasyon sayısı nedeniyle biraz kesintili olsalar da geriye sadece filamentler kalır.

Çok yüksek bir yanıp sönme yoğunluğundan şüpheleniliyorsa, görüntülerin kare başına lokalizasyon verileriyle karşılaştırılması, bu sorunun ilk kare seti sırasında meydana geldiğini güçlü bir şekilde gösterebilir. Son kare setinde kare başına yaklaşık dört lokalizasyon varken, ilk setle karşılaştırıldığında kare başına ortalama lokalizasyon sayısı 10'un üzerindedir. STORM mikroskobisinde karşılaşılan bir diğer potansiyel sorun, numunenin objektif lensine göre hareket etmesiyle ortaya çıkan kaymadır (drift). Görüntüleme aşamasında tespit edilmesi çok zor olsa da kayma, veri toplama aşamasında aktin filamentleri gibi bilinen yapıların süper çözünürlüklü görüntülerinde tespit edilebilir.

Yanal kaymanın meydana gelmiş olabileceğine dair ilk belirti, yapının beklenenden daha büyük olmasıdır. Örneğin, rainstorm'dan elde edilen hassasiyet sınırı verilerine kıyasla nispeten büyük bir yarı maksimum genişlik değeri ile; bu durumda 67 nanometreye karşı 90 nanometre görülmesi gibi. Kaymayı tespit etmenin daha iyi bir yolu, lokalizasyonları zamanın bir fonksiyonu olarak karşılaştırmaktır; yani, sonraki karelerdeki lokalizasyonların ilk karelerdekilere kıyasla yer değiştirip değiştirmediğine bakmaktır.

Bu durum, renk koduyla gösterildiğinde aktin filamentleri örneğinde açıkça görülebilir. Panel B ve C'de gösterildiği gibi rainstorm'daki kutu takip özelliği kullanılarak, lokalizasyonlar elde edildikleri kare numarasına karşılık gelen bir renkle görüntülenir. Örneğin, edinim dizisinin başındaki lokalizasyonlar mavi, edinim dizisinin sonundaki lokalizasyonlar ise kırmızıdır.

Kaymış renkler, ölçmek ve düzeltmek amacıyla kaymanın meydana geldiğini belirtir. Kayma için, 100 nanometre çapındaki floresan boncuklar referans işaretçiler olarak kullanılabilir; bir ile dört arasındaki rakamlar, kırpılmış ve yakınlaştırılmış boncukları tek tek göstermektedir. Edinme aşamasındaki 3 dakika 10 saniye boyunca yaklaşık 100 nanometrelik nispeten şiddetli bir kaymanın olduğu bir örnekte, aynı kutu takip özelliği, kaymanın gerçekleştiğini renk kodlarıyla belirtmek ve onaylamak için kullanılabilir; bu örnekteki dört boncuğun tamamı neredeyse aynı kaymayı gösterdiğinden, bunlardan birini (bu durumda ikinci boncuğu) referans olarak seçmek ve diğer boncuklardan kaymayı çıkarmak mümkündür.

Panel E ile yapılan bir karşılaştırma, lateral kaymanın düzeltildiğini göstermektedir. Son olarak, epidermal büyüme faktörü ile boyanmış hela hücreleri, görüntü çözünürlüğüne gerçekçi bir örnek sunmak için kullanılabilir. Hücrelerde panel A, bazal hücre yüzeyine odaklanmış bir hela hücresinin bir kısmının difraksiyon sınırlı görüntüsünü göstermektedir; burada sarı kutular, difraksiyon sınırlı görüntüdeki belirsiz yakınlaştırılmış ilgi bölgelerinin aksine, panel B ve C'de gösterilen yakınlaştırılmış ilgi bölgelerini belirtmektedir.

Süper çözünürlüklü görüntüler, kümeler ile ara sıra görülen izole tek piksellerin bir karışımını göstermelidir. Kümeler yaklaşık 100 nanometre çapında olacak ve muhtemelen oluşmakta olan çukurlara ve veziküllere karşılık gelecektir. EGF'nin ağırlıklı olarak aşağıye düzenlendiği ve endosite edildiği yol ile Panel D'deki kare başına lokalizasyon verileri Grafik G'de sunulmuştur. Bu videoyu izledikten sonra, bazı basit test örneklerinin nasıl hazırlanacağı, verilerin nasıl elde edileceği ve yüksek kaliteli STORM süper çözünürlüklü görüntülerin nasıl yeniden yapılandırılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

Bu yöntemler, kayma gibi bazı yaygın uyum hatalarından kaçınmaya ve storm işleminizi optimize etmeye yardımcı olacaktır. Çözünürlük deneylerine bakınız.