Fotonik Çip Kullanarak Yüksek İşLeç Toplam İç Yansıma Floresansı ve Direkt Stokastik Optik Rekonstrüksiyon Mikroskobu
16 Kasım 2019
Çip tabanlı süper çözünürlüklü optik mikroskopi floresan mikroskobu için yeni bir yaklaşım dır ve maliyet etkinliği ve iş akışı avantajları sunuyor. Burada TIRF mikroskobu ve lokalizasyon tabanlı süper çözünürlüklü mikroskopi için çip hazırlama ve görüntüleme protokolleri gösterilmiştir.
Bu makalenin temel amacı, yeni geliştirilen fotonik çip tabanlı TIRF mikroskobu ve dSTORM gibi tek moleküllü lokalizasyon mikroskobu nun görüntüleme prosedürünü sunmaktır. Buradaki ana bileşen optik dalga kılavuzu serisi yapılmış fotonik çip. Optik dalga kılavuzunun içindeki ışık toplam iç yansımaya göre yönlendirilir.
Işığın bir kısmı yüzeyde evanescent dalgalar şeklinde mevcuttur. Bu evanescent dalgalar, onlar katlanarak yüzeyden uzakta çürüme, yüz nanometre bir penetrasyon derinliği ile. Bu da onları TIRF aydınlatmaiçin uygun hale getirir.
Optik dalga kılavuzu üzerinden TIRF aydınlatma dalga kılavuzu geometrisi ile tanımlanan son derece geniş bir alan üzerinde kullanılabilir, ve böylece ideal yüksek iş itimat görüntüleme için uygundur. Yaklaşımımızla karşılaştırıldığında geleneksel TIRF ve dSTORM kurulumu arasındaki temel fark, görüntüleme objektifi üzerinden ışık göndermek yerine örneği aydınlatmak için fotonik çip kullanmamızdır. Yaklaşımımız aydınlatma yı ve koleksiyon ışığı kısmını ayırıp yeni görüntüleme olanakları sunar.
Çipi gofret tweezer kullanarak cam Petri kabına yerleştirin ve %1 Hellmanex çözeltisi ile tamamen kaplayın. Petri kabını 70 derecede 10 dakika ocakta yerleştirin. Hala ocak taiken, yüzeyi temiz oda doku bezi ile ovun.
Petri kabından çipi çıkarın. En az 100 mililitre deiyonlanmış su ile durulayın. En az 100 mililitre isopropanol ile durulayın, buharlaşma lekelerini önlemek için çözücünün yüzeyde kurumamasına dikkat edin.
En az 100 mililitre deiyonlanmış su ile durulayın. Çipi azot tabancasıyla kurutun. Bir Petri kabında döndürerek 150 mikrometre LIK pdms'yi daha sonra hazırlayın.
PDMS katmanından yaklaşık 1,5 santimetre kare kesmek için neşter kullanın. Çerçeveyi Petri kabından bir cızırdayarak kaldırın. Temiz ve cilalı bir çip üzerine düz yatırın.
Örnek şimdi hücre tohumlama için hazırdır. Hücre tohumlamasonra, ortamdan çip çıkarın. PDMS odasının dışındaki fazla sıvıyı çıkarmak için bir pipet kullanın.
Aynı anda yaklaşık 60 mikrolitre temiz PBS eklerken bir pipet ile PDMS odası içinde mevcut sıvı çıkarın. PBS'yi 60 mikrolitre temiz PBS ile değiştirin ve bir dakika kuluçkaya yatırın. Bu sefer beş dakika kuluçkaya yatırmaya izin vererek önceki adımı tekrarlayın.
PBS'yi çıkarın ve 60 mikrolitre boya çözeltisi ile değiştirin. Numuneyi yaklaşık 15 dakika kuluçkaya yatırın ve ışıktan koruyun. Daha önce açıklanan yordamı kullanarak numuneyi PBS ile yıkayın.
PBS'yi çıkarın ve aynı anda 40 mikrolitre görüntüleme arabelleği ile değiştirin. Hava kabarcıklarının altında oluşmasını önleyerek üzerine bir kapak kaydırın. Fazla ortamları kaldırmak için kapak kapağını görüntüleme odasına hafifçe bastırın.
Coverslip dışında herhangi bir fazla ortam kaldırmak için bir pipet kullanın. Kurutulmuş daldırma ortam artıkları tarafından oluşturulan kristalleri önlemek için kapak dışında bir su-nemli bezi ile alanı temizleyin. Kurulumun bu sürümü üç ana bileşenden oluşur.
Filtre tutucu, beyaz ışık kaynağı, kamera ve objektif tabanca ile mikroskop. Üç eksenli piezo aşaması olan bağlantı aşaması, fiber bir lazer ile, ve bir kaplin lens. Bir vakum tutucu ile, ucu ve eğim ile tek eksenli manuel aşama, örnek sahne.
Hem bağlantı hem de örnek aşaması, numune çevirisi için iki eksenli motorlu bir aşamaya monte edilmiştir. Talaşlı fişi vakum lu kamyona yerleştirin, bağlantı amacına doğru kaplin falı ile. Çipin bağlantı hedefinden yaklaşık bir odak uzaklığı olduğundan emin olun.
Vakum pompasını aç. Lazeri bir miliwatt'a çevir. Kabaca, kirişin kenarına çarpması için talaş yüksekliğini ayarlayın.
Lazeri kapat. Beyaz ışık kaynağını açın. Düşük büyütme objektif lens seçin, örneğin, bir 10x.
Mikroskobu bir dalga kılavuzuna odakla. Mikroskobu dalga kılavuzu boyunca çevirin ve optik yol ile uyumlu olup olmadığını görün. Mikroskobu kaplin kenarına taşıyın.
Lazeri bir miliwatt veya daha az açık. Lazer ışığını bulmak için mikroskobu kaplin kenarı boyunca çevirin. Kirişi çip kenarına odakla.
Optik yol boyunca bağlantı aşamasını, kaybolana kadar lazer ışını nokta boyutunu küçülten yönde ayarlayın. Işın şimdi çip yüzeyinin üstünde veya altında. Kiriş noktası yeniden belirip en üst düzeye çıkana kadar bağlantı aşaması yüksekliğini ayarlayın.
Lazer odaklanmış bir nokta oluşturana kadar önceki iki adımı tekrarlayın. Odaklanmış noktayı ilgi nin dalga kılavuzuna taşıyın. Mikroskobu kenardan kısa bir mesafe uzağa çevirin, böylece odaklanmış ışın noktası artık görünmez.
Beyaz ışığı kapat. Kontrastı ayarlayın. Dalga kılavuzu yol gösteriyorsa, dalga kılavuzu boyunca dağınık ışık açıkça görülebilmelidir.
Dağınık ışık yoğunluğunu en üst düzeye çıkarmak için bağlantı aşamasının eksenini ayarlayın. Lazeri kapat. Beyaz ışığı aç.
Gerekirse kontrastı ayarlayın. Görüntüleme bölgesine gidin. İstediğiniz hayal hedefiile odaklanın.
Beyaz ışığı kapat. Floresan filtresini takın ve lazer gücünü bir miliwatt'a çevirin. Kameranın pozlama süresini yaklaşık 100 milisaniyeye ayarlayın.
Kontrastı gerektiği gibi ayarlayın. Bağlantının hala optimize edilmiş olduğundan emin olun. Görüntüleme için ilgi çekici bir bölge bulun.
Düğümlerin ortalama sını çıkarmak için piezo sahne döngülerini açın. En az 300 görüntü yakalayın. Yakalanan görüntü yığınını sanal bir yığın kullanarak Fiji'ye yükleyin.
Fiji'deki resim menüsünden Yığınlar ve Z Project'i seçin. Projeksiyon türü, Ortalama Yoğunluk seçerek TIRF görüntü hesaplamak. Lazeri bir miliwatt'a açın ve kameranın pozlama süresini 30 milisaniyeye ayarlayın.
Kontrastı ve odağı ayarlayın. Yanıp sönene kadar lazer gücünü artırın. Örneğin küçük bir bölgesini yakınlaştırın.
Kontrastı ayarlayın. Göz kırpmaların iyi ayrılıp ayrılmadınlarını görmek için birkaç görüntü yakalayın. En iyi yanıp sönme için kameranın pozlama süresini ayarlayın.
Piezo sahne halkasını açın. Yanıp sönen yoğunluğa bağlı olarak en az 30.000 karelik bir görüntü yığını kaydedin. Fiji'yi açın ve dSTORM yığınını sanal görüntü olarak yükleyin.
Gerekirse kontrastı ayarlayın. Yeniden oluşturmak istediğiniz alanı seçmek için dikdörtgen aracını kullanın. Fiji ThunderSTORM eklentisinde Açık Çalıştır analizi.
ThunderSTORM'daki temel kamera ayarlarını cihazınıza uygun olarak ayarlayın. Kalan varsayılan parametreler genellikle tatmin edicidir. Yeniden yapılanmaya başla.
Yeniden yapılandırma yazılımı tarafından sağlanan yerelleştirme listesi, belirli olmayan yerelleştirmeleri kaldırmak için filtrelenir. Gerekirse ek bir sürüklenme düzeltmesi uygulanır. Çip tabanlı görüntüleme ile geleneksel görüntüleme arasındaki temel fark enstrümantasyon ve veri toplamadır.
Bu nedenle, yeniden yapılan görüntülerin kalitesi, ticari bir süper çözünürlüklü mikroskoptaki görüntüyle aynı şekilde değerlendirilebilir. Çok modlu dalga kılavuzları kullanıldığından, ortaya çıkan görüntü, çok az görüntü toplanırsa homojen uyarma gösterebilir. Bu, a panelinde gösterilir.
Uyarma desenlerinin miktarının artırılması, panel b'de gösterildiği gibi homojen uyarma ile sonuçlanmalıdır. Burada floresan etiketli plazma zarı ile karaciğer sinüzoidal endotel hücre, görüntüvar. A ve b panelleri kırınım sınırlı görüntülerdir.
Panel c, b panelinde insetin kırınım sınırlı bir görüntüsünü gösterir. Panel d aynı bölgenin bir dSTORM görüntüsünü gösterir. Karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin plazma zarında nano boyutlu fenestrasyonlar vardır, bu da panel d'deki süper çözünürlüklü görüntüde açıkça görülebilir.
Çip tabanlı süper çözünürlüklü görüntülemenin en önemli avantajlarından biri, ulaşılabilir geniş görüş alanıdır. Panel a floresan etiketli mikrotübulin ile karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin 500 mikron tarafından 500 mikron büyük dSTORM görüntü gösterir. Panel b, karşılaştırma için hem kırınım sınırlı hem de süper çözünürlüklü görüntülerle, a panelinden macenta insetini gösterir.
Panel c panelinden yeşil insetiyi gösterir a. Yakalanan görüntünün çözünürlüğü 77 nanometredir. Bu videoda, aydınlatma için fotonik çip kullanarak karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin geniş bir görüş TIRF ve dSTORM görüntüleme gerçekleştirdik.
Metodumuz, önceden belirlenmiş sayısal diyafram açıklığı ve düşük görüş alanı nın mikroskop amacını kullanarak TIRF'yi geleneksel olarak gerçekleştirme yönteminden daha az karmaşık, daha kompakt ve daha esnektir. DSTORM gibi lokalizasyon mikroskobu, fotonik çip kullanarak araştırdığımız birkaç süper çözünürlüklü görüntüleme tekniğinden biridir. Örneğin, ışık, yüksek kırılma indeksli optik dalga kılavuzu materyalinin içinde görüntüleme objektifi kullanılarak mümkün olduğundan çok daha sıkı bir şekilde sınırlandırılabilir.
Çip aydınlatma bu özelliği yoğunluk-dalgalanma tabanlı optik mikroskopi yöntemi ve yapılandırılmış aydınlatma mikroskopisi çözünürlüğünü artırarak uygulama buldu. Buna ek olarak, fotonik yongaları da minyatürleştirme, maliyet etkinliği ve basit bir optik kurulum yararlanır. Entegre bir teknoloji olması, diğer çipli optik fonksiyonlarla uyumlu olmasını sağlar.
Bu, konvansiyonel kırınım sınırlı mikroskoplara modernite yitirmeyi mümkün kılabilir ve düşük bir masrafla süper çözünürlük sağlar.
Genel Bakış
Bu makale, TIRF mikroskopisine ve tek molekül lokalizasyon mikroskopisine odaklanan yeni bir yonga tabanlı süper çözünür optik mikroskopi tekniği sunmaktadır. Yonga hazırlama ve görüntüleme protokolleri, bu yaklaşımın maliyet etkinliği ve verimlilikteki avantajlarını vurgulayarak detaylandırılmıştır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Floresan mikroskopi
- Süper çözünür görüntüleme
- Fotonik yonga teknolojisi
Arka Plan
- Geleneksel TIRF mikroskopi, objektif lens aydınlatmasına dayanmaktadır.
- Fotonik yongalar, ışık yönlendirimi için optik dalga kılavuzlarını kullanır.
- Evanesan dalgalar, yüzey düzeyinde yüksek çözünürlüklü görüntülemeyi sağlar.
- Bu yöntem, görüntüleme alanını ve verimliliği artırır.
Çalışmanın Amacı
- Fotonik yonga tabanlı TIRF mikroskopi kullanarak yeni bir görüntüleme prosedürü göstermek.
- Geleneksel yöntemleri yonga tabanlı yaklaşım ile karşılaştırmak.
- Yonga hazırlama ve görüntüleme için ayrıntılı protokoller sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Optik dalga kılavuzlarını kullanarak fotonik yongaların hazırlanması.
- Numune hazırlama için hücre ekimi ve inkübasyon protokolleri.
- Mikroskop, lazer ve kamera içeren görüntüleme kurulumu.
- Fiji yazılımı kullanılarak görüntü yakalama ve işleme.
Ana Sonuçlar
- Yüksek verimli görüntüleme yeteneklerinin başarılı gösterimi.
- Dalga kılavuzunda saçılan ışığın net görünürlüğü.
- Yeni kurulum kullanılarak tek moleküllerin etkili lokalizasyonu.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla geliştirilmiş görüntüleme çözünürlüğü.
Sonuçlar
- Yonga tabanlı yaklaşım, floresan mikroskopi alanında önemli avantajlar sunar.
- Aydınlatma ve toplama işlemlerinin ayrılması, görüntüleme olanaklarını artırır.
- Bu yöntem, süper çözünürlüklü mikroskopi alanında gelecekteki ilerlemeler için yol açar.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Chip-based nanoscopy decouples excitation and collection pathways, enabling large field-of-view TIRF imaging with low magnification optics. This approach supports high-throughput super-resolution imaging while maintaining resolution comparable to traditional methods, addressing discovery-stage bottlenecks in target validation and phenotypic screening. The technique enhances predictive confidence by providing quantitative, reproducible subcellular imaging data across scalable sample areas.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of subcellular structures like liver sinusoidal endothelial cell fenestrations and plasma membrane organization at 76 nm resolution.
- Operational Value: Decoupled illumination and collection allow use of low magnification lenses, increasing field of view for population-level target engagement analysis.
- Predictive Value: Large-area dSTORM imaging supports statistical robustness in target localization and heterogeneity assessment.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uniform evanescent wave excitation across waveguide-defined areas enables consistent single-molecule localization for assay readouts.
- Operational Value: Compatibility with standard microscopes and on-chip integration supports assay standardization and reuse across discovery campaigns.
- Scalability: Demonstrated 500 µm x 500 µm imaging area enables multiplexed condition testing in a single acquisition.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Disease-relevant LSEC imaging validates applicability to endothelial pathophysiology models.
- Mechanistic De-risking: Super-resolution visualization of nano-scale membrane features aids in understanding drug-target spatial relationships.
- Preclinical Alignment: Resolution and throughput support biomarker localization studies in primary or stem-cell-derived systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery to lead identification workflows, providing super-resolution readouts that inform target confidence and assay reproducibility prior to compound screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing via direct visualization of target localization and clustering in native membrane environments.
- Screening: Enables assay readiness through quantifiable, high-density localization data from large sample regions.
- Analytics: Generates filtered localization lists and drift-corrected reconstructions for objective comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Connects to preclinical validation through imaging of disease-relevant cellular ultrastructure in primary cell models.
- Enterprise Reuse: Photonic chip infrastructure can be retained across projects, reducing retooling costs for super-resolution capable imaging.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence in target validation through nanoscale resolution of membrane protein organization and dynamics.
- Operational Value: Standardized chip preparation and imaging protocol ensures reproducibility across users and sites.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on subcellular target distribution data, reducing late-stage attrition from mechanistic misunderstanding.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization of targets supported by super-resolution spatial evidence in relevant cellular contexts.
Implementation Considerations
- Expertise in photonic chip handling, fluorescence microscopy, and single-molecule localization analysis required.
- Instrumentation includes laser source, piezo stage, vacuum holder, and fluorescence filter set compatible with TIRF and dSTORM.
- Cross-team standardization needs include chip cleaning procedures, PDMS chamber fabrication, and Fiji/ThunderSTORM analysis pipelines.
- Adaptation considerations involve optimizing excitation patterns for homogeneous illumination across different waveguide geometries and sample types.
- Practical limitations include potential inhomogeneous excitation with insufficient pattern averaging and minor resolution trade-off versus high-NA objective TIRF.
