Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, maya hücrelerindeki alt nükleer organizasyonu ve bunun büyüme koşullarındaki veya mutasyonlardaki değişikliklerden nasıl etkilendiğini nicel olarak ölçmektir. Bu, otofloresanı en aza indirecek koşullarda log fazı için maya hücrelerinin büyütülmesiyle elde edilir. Daha sonra, hücreler mikroskop altında görüntülenmek üzere bir büyüme odasına yerleştirilir.

Daha sonra hücredeki farklı floresan etiketli yapılar arasındaki mesafeyi ölçmek için görüntüler alınır. Maya kültürünün büyümesi sırasında beslenme koşullarının değişmesine bağlı olan nükleer olmayan organizasyonda farklılıklar gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu yöntem, epie alanındaki subar organizasyonu veya kromatin ve gen regülasyonu arasındaki etkileşim hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir.

Toul balığı ve mayası, otoklav yerine otofloresansı azaltmak için Edinburgh minimal ortamı veya EMM ve EMM'yi ayrıca amonyum klorür ile hazırlayarak başlar. Glikoz çözeltisini sterilize etmek için 0,2 mikronluk bir filtre kullanın ve otoklav ortamına ekleyin. 30 mililitrelik tüplerde üç mililitre EMM'yi balık ve maya hücreleri ile aşılayın.

Zengin ortamda bir agar plakası üzerinde taze olarak yetiştirilen YEA, tüpleri hafifçe kapatın ve hücreleri 225 RPM ve 30 santigrat derecede bir çalkalayıcıda inkübe edin. Hücreleri her sabah ve akşam bir birka haznesi ile sayarak ve uygun yoğunluğa kadar seyrelterek iki gün boyunca log fazında tutun. Deney gününde.

Hücreler, nitrojen personeli için erken bir günlük aşaması olmalıdır. Hücreler, hücreleri bir tüp santrifüjünün dibinde bir topakta toplamak için yazılı protokolde belirtilen prosedüre atıfta bulunur, 1.5 mililitre hücre bir eend orph tüpünde maksimum 1.5 RCF'de, önce tüpü iki dakika döndürerek, daha sonra iki dakikalık ek bir dönüş için 180 derece çevirerek. Süpernatantın 10 ila 15 mikrolitresi hariç hepsini çıkarın ve kalan ortamdaki hücreleri, mililitre filtre sterilize lektin başına bir miligramlık bir alikot ile yeniden süspanse edin.

Kapak camının köşesine beş mikrolitre lektin çözeltisi ekleyin ve lektin damlasına beş mikrolitre kültür ekleyin. S pom bazlı hücrelerden oluşan bir büyüme odası oluşturmak için, temiz bir sürgü üzerine beş mikrolitre EMM pipetleyin ve kültür ile kapak camını ortam üzerinde 70 derecelik bir açıyla ters çevirin ve kenarları silikon gres ile kapatmak için yukarıdan aşağıya EMM'nin üzerine bırakın. 200 mikrolitrelik bir ucun geniş ucunu kesin ve dar ucunu iki mililitrelik bir şırıngaya takın.

Şırıngayı yaklaşık bir mililitre silikon gres ile doldurun. Büyüme odasını görüntülemek için şırınganın pistonunu hafifçe iterek kapak camının kenarlarına ince bir silikon çizgi uygulayın. Hücreleri bulmak ve kazmak için Brightfield Imaging'i kullanarak başlayın.

Konfokal mikroskopi için net bir resim elde edin. Plan apoch chromat 63 kez yağ objektif lensi ve 16 satır ortalama düzlem tarama ayarına sahip bir Zeiss LSM 700 lazer tarama mikroskobu kullanıyoruz. 0,8 mikronluk bir optik dilim elde etmek için alan birimlerini bir ila 1,1 arasında ayarlayın.

Hücreleri Alexa 4 88 ve mCherry veya GFP'yi algılayan lazerlerle tarayın. Her drenaj için 60 hücrede ölçüm yapmak için yeterli sayıda görüntü kaydedin. Taze hücrelere sahip yeni bir büyüme odasına geçin.

60 dakikalık görüntülemeden sonra, aynı odak düzlemindeki farklı floroforların sinyalleri arasındaki mesafeyi ölçmek için Zeen Light Edition programında bir görüntü açın. Ölçüm aracını açın ve her bir floresan sinyalin merkezini belirlemek için ışık yoğunluğunu ve kontrastını ayarlayın, örneğinample, mil kutup gövdesi ve nükleer membran ve aralarındaki mesafeyi ölçün. Verileri bir not defteri sayfasına aktarın.

İstatistiksel yazılımlar veya T-testi veya Man Whitney Rank toplam testi gibi testler kullanarak farklı suşlar ve tedaviler arasındaki ortalama veya medyan hücre altı mesafeleri karşılaştırın. Bu örnek suşta, PJ 1 18 5 EMM'de büyütüldü ve bir örnek, görüntüleme için bir büyüme odasına yerleştirildi. Sonra PJ 1 18 5'in bir alikotosu.

Kültür, EMMN'ye aktarıldı ve bir numune görüntüleme için bir büyüme odasına yerleştirilmeden önce 15 dakika inkübe edildi. Ölçüm aleti, lokus ile mil kutup gövdesi arasındaki ve ayrıca lokus ile nükleer membran arasındaki mesafeyi ölçmek için kullanıldı. Burada gösterildiği gibi, nitrojen açlığı çeken hücrelerde nükleer zardan iğ kutup gövdesine doğru hareket eden gen kümesinin mesafesinde, nitrojen içinde büyüyen hücrelere kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir fark vardı.

GFP ve SBP arasındaki mesafeyi ölçen veriler normal bir dağılıma sahipti ve bu nedenle ortalama mesafeler bir T-testi kullanılarak karşılaştırılabilirdi. İki ortalama değer arasında anlamlı bir fark vardı. GFP ve NM arasındaki mesafeyi ölçen veriler normal bir dağılıma sahip değildi ve bu nedenle medyan mesafeler bir adam Whitney dereceli toplam testi kullanılarak karşılaştırıldı.

Bu işlemi takiben iki medyan değer arasında anlamlı bir fark vardı. Gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler, gen ekspresyon seviyesinin alt nükleer organizasyondaki değişikliklerle nasıl ilişkili olduğuna dair ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.