Fisyon Maya Kantitatif Canlı Hücre Floresan mikroskopi Analizi

Aşağıdaki deneyin genel amacı, maya hücrelerindeki çekirdek altı organizasyonu ve bunun büyüme koşullarındaki değişikliklerden veya mutasyonlardan nasıl etkilendiğini nicel olarak ölçmektir. Bu, maya hücrelerinin otofloresenti minimize edecek koşullarda log fazına kadar büyütülmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, hücreler mikroskop altında görüntülenmek üzere bir büyüme odasına yerleştirilir.

Ardından, hücredeki farklı floresan işaretli yapılar arasındaki mesafeyi ölçmek için görüntüler alınır. Maya kültürünün büyümesi sırasında besin koşullarının değiştirilmesine bağlı olarak nükleer olmayan organizasyonda farklılıklar olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, epigenetik alanında kromatinin alt organizasyonu veya organizasyonu ile gen düzenlemesi arasındaki etkileşime dair temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.

Balık ve maya hücreleri için hazırlıklar, önce Edinburgh minimal besiyeri veya EMM ve otoflüoresansı azaltmak amacıyla amonyum klorür içeren EMM'nin, otoklavlamak yerine hazırlanmasıyla başlar. Glukoz çözeltisini sterilize etmek için 0,2 mikronluk bir filtre kullanın ve bunu otoklavlanmış besiyerine ekleyin. 30 mililitrelik tüplerdeki üç mililitre EMM'ye balık ve maya hücrelerini inoküle edin.

Zengin bir ortam olan YEA içeren agar plaklarında yeni büyütülmüş hücrelerin tüpleri hafifçe kapatın ve hücreleri 225 RPM ve 30 degrees Celsius sıcaklıktaki bir çalkalayıcıda inkübe edin. Her sabah ve akşam bir birka chamber ile sayım yaparak ve hücreleri uygun yoğunluğa seyrelterek, hücreleri iki gün boyunca log fazında tutun. Deney gününde.

Hücreler azot sınırlamasına karşı erken log fazında olmalıdır. Hücreleri bir santrifüj tüpünün dibinde tek bir pelet şeklinde toplamak için yazılı protokolde belirtilen prosedüre uyun; 1,5 mililitrelik bir eppendorf tüpündeki hücreleri, önce tüpü iki dakika santrifüjleyip ardından tüpü 180 derece döndürerek iki dakika daha santrifüjleme işlemiyle maksimum 1,5 RCF'de toplayın. Süpernatantın 10 ila 15 µL'si hariç tamamını uzaklaştırın ve hücreleri, 1 mg/mL filtre sterilize edilmiş lektin içeren bir alikotla kalan ortamda yeniden süspande edin.

Lektin çözeltisinden beş µL'yi lamın kenarına ve ardından beş µL kültürü lektin damlasının üzerine ekleyin. S pom bazal hücreleri için bir büyüme odası oluşturmak amacıyla, temiz bir lama beş µL EMM pipetleyin ve kültürü içeren lamın üzerindeki kapatma camını medyuma 70 derecelik bir açıyla ters çevirerek, kenarları silikon gres ile mühürlemek için EMM üzerine üstten gelecek şekilde bırakın. 200 µL'lik bir pipet ucunun geniş kısmını kesin ve dar kısmını iki mL'lik bir şırıngaya takın.

Şırıngayı yaklaşık bir mililitre silikon gresi ile doldurun. Büyütme odasını görüntülemek için şırınga pistonunu nazikçe iterek, lamın kenarlarına ince bir hat şeklinde silikon uygulayın. Hücreleri bulmak ve görüntülemek için Brightfield Görüntüleme ile başlayın.

Konfokal mikroskopi için net bir görüntü elde edin. Plan apochromat 63x yağ daldırma objektif lens ve 16 hat ortalamalı düzlem tarama ayarına sahip bir Zeiss LSM 700 lazer tarama mikroskobu kullanıyoruz. 0,8 mikronluk bir optik kesit elde etmek için alan birimlerini 1'den 1,1'e ayarlayın.

Hücreleri, Alexa 4 88 ve mCherry veya GFP'yi tespit eden lazerlerle tarayın. Her bir dren için 60 hücrede ölçüm yapacak kadar görüntü kaydedin. Taze hücreler içeren yeni bir büyütme odasına geçiş yapın.

60 dakikalık görüntülemeden sonra, aynı odak düzlemindeki farklı florofor sinyalleri arasındaki mesafeyi ölçmek için Zeen Light Edition programında bir görüntü açın. Ölçüm aracını açın ve örneğin, iğ iplikleri kutup gövdesi ve nükleer zar gibi her bir floresan sinyalinin merkezini belirlemek için ışık yoğunluğunu ve kontrastı ayarlayarak aralarındaki mesafeyi ölçün. Verileri bir not defteri sayfasına aktarın.

İstatistiksel yazılımlar veya T-testi ya da Mann-Whitney Rank sum testi gibi testler kullanarak farklı suşlar ve uygulamalar arasındaki ortalama veya medyan hücre altı mesafeleri karşılaştırın. Bu örnekteki PJ 1 18 5 suşu EMM içinde büyütülmüş ve görüntüleme için bir örneği büyüme odasına yerleştirilmiştir. Ardından PJ 1 18 5'ten bir alikot alınmıştır.

Kültür EMMN'ye aktarıldı ve bir örnek görüntüleme için büyüme odasına yerleştirilmeden önce 15 dakika inkübe edildi. Lokus ile iğ ipliği kutup gövdesi arasındaki mesafenin yanı sıra lokus ile nükleer membran arasındaki mesafeyi ölçmek için ölçüm aracı kullanıldı. Burada gösterildiği gibi, azotla beslenen hücrelerde gen kümesinin nükleer membrandan uzaklaşıp iğ ipliği kutup gövdesine doğru hareket etme mesafesi, azotta büyütülen hücrelere kıyasla istatistiksel olarak anlamlı bir farklılık göstermiştir.

GFP ile SBP arasındaki mesafeyi ölçen veriler normal dağılım gösterdiğinden, ortalama mesafeler T-testi kullanılarak karşılaştırıldı. İki ortalama değer arasında anlamlı bir fark vardı. GFP ile NM arasındaki mesafeyi ölçen veriler normal dağılım göstermediğinden, medyan mesafeler Mann-Whitney sıra toplam testi kullanılarak karşılaştırıldı.

Bu prosedürün ardından, iki medyan değer arasında anlamlı bir fark vardı. Gen ekspresyon seviyesinin subnükleer organizasyondaki değişikliklerle nasıl ilişkili olduğuna dair ek soruları yanıtlamak için gerçek zamanlı PCR gibi diğer yöntemler uygulanabilir.