Yüksek verimli bir kullanımı İn Vitro Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

Bu prosedürün genel amacı, bileşimsel olarak temsili, çok türlü dental plak biyofilmleri oluşturmaktır. Analize paralel olarak, bu önce temsili bir ortam ve aşılama oluşturularak elde edilir. Aşı daha sonra bir gece inkübasyondan sonra mikroakışkan çipe verilir, mikro kanalın içinde bir biyofilm oluşur.

Son olarak, biyofilm in situ iki konfokal lazer tarama mikroskobu veya epi floresan mikroskobu için yıkanır ve boyanır. Bu tekniğin akış hücreleri gibi mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, daha az malzeme kullanarak ve yapay laboratuvar ortamı gerektirmeden birden fazla deneyin paralel olarak yapılmasına izin veren yüksek verimli bir sistem olmasıdır. Başlamak için, 50 mililitrelik plastik tüplerde beş veya daha fazla gönüllüden oluşan bir kohorttan tükürük örnekleri toplayın.

Tükürük örneklerini buz üzerine yerleştirilmiş tek bir plastik kabın içine çekin. Tükürük biyopolimerleri cam yüzeylere yapışma eğiliminde olduğundan, bu kurulumda cam beherleri kullanmaktan kaçının. Daha sonra, nihai konsantrasyonu 2.5 milimolar olana kadar numuneye di thio üçlü delik ekleyin.

Karışımı buz üzerinde 10 dakika karıştırın. Tüm içeriği birkaç plastik tüpe çekin. Numuneden partikülleri ayırmak için dört santigrat derece soğutulmuş bir santrifüjde 30 dakika boyunca yüksek hızlı bir dönüş gerçekleştirin.

Tükürük doygunluğunu taze, steril bir kaba aktarın ve numuneden bakteri içermeyen bir büyüme ortamı hazırlamak için pelet fraksiyonunu atın. İlk olarak, gün kalıntısı içermeyen numuneyi üç hacim deiyonize su ile seyreltin. Daha sonra 0.22 mikro düşük protein bağlayıcı membran filtresi kullanarak.

Filtrelenmiş fraksiyonu buz üzerinde soğuk tutarken tükürüğü sterilize edin. Sterilize edilmiş solüsyonu temizleyin ve ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın. Steril 50 mililitrelik plastik tüplerde beş veya daha fazla gönüllüden oluşan bir kohorttan tükürük örnekleri toplayın.

Tükürük örneklerini oda sıcaklığında önceden sterilize edilmiş plastik bir behere veya 50 mililitrelik bir tüpe çekin. % 25 gliserol olana kadar sterilize gliserol ekleyin. %75 tükürük karışımına ulaşılır.

Kirleticilerin bir filtrasyon aşaması ile uzaklaştırıldığı büyüme ortamı protokolünün aksine, burada oral olmayan spesifik bakteri veya mantarlardan kontaminasyonu önlemek için steril teknik önemlidir. Tükürük gliserol çözeltisini karıştırın. Tükürük gliserol karışımını iyi bir şekilde ayırın ve örnekleri başlamak için ihtiyaç duyulana kadar eksi 80 santigrat derecede saklayın.

Oda sıcaklığında tezgahta hem bakteri negatif büyüme ortamı hem de bakteri pozitif aşılama için numuneleri mikroçipe aşılamadan önce burada gösterilenlere benzer mikrokanallı bir mikroakışkan çip satın alın veya üretin. Ana deneye devam etmeden önce karıştırmak için her tüpü beş saniye boyunca girdaplayın, mikroçip çıkış rezervuarına 100 mikrolitre büyüme ortamı ekleyerek başlayın. Bir bilgisayar kontrol pompası kullanarak, iki dakika boyunca mikrokanaldan orta saf akışı başlatın.

Oda sıcaklığında, uygun sıvı dolumunu sağlamak için her kanalı görsel olarak inceleyin. Mikroçipi oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin. Bu, mikrokanal yan duvarlarını, biyofilmin büyüme sırasında üzerine tutunacağı bir biyopolimer iskele ile kaplayacaktır.

Daha sonra çıkış rezervuarından manuel olarak veya kalan ortamı aspire edin ve şimdi hidrodinamik bir dengeleme yükü olarak işlev görecek olan bu fraksiyonu giriş rezervuarına aktarın. Biyopolimer iskele birikiminden sonra, çıkış rezervuarına 100 mikrolitre bakteri pozitif aşı ekleyin. Mikroçipi 37 santigrat derecelik bir sıcak plakaya yerleştirin ve orta kesme ters akışını başlatın.

Prizden giriş Rezervuarına tam olarak altı saniye boyunca seyahat edin. Ardından pompayı kapatın ve bakteri veya mantarların mikrokanal yan duvarlarına yapışmasını kolaylaştırmak için çipi statik koşullar altında 37 santigrat derecede 40 dakika inkübe edin. Daha sonra, tüm aşıları bir pipetle çıkış haznesinden çıkarın ve atın ve bir mililitre bakteri içermeyen üreme ortamı ekleyerek aynı rezervuarı yeniden doldurun.

Mikroçipi, gece boyunca büyümede kanal içi biyofilm büyümesini teşvik etmek için düşük şeffaf akış altında yaklaşık 20 saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Tüm çözeltileri hem giriş hem de çıkış rezervuarlarından pipetleyin. Giriş Haznesine 100 mikrolitre PBS uygulayın ve mikro kanalı 20 dakika boyunca yıkayın.

Girişten çıkışa kadar düşük dik ileri akış altında, biyofilm artık canlı ölü boyama için hazırdır. Biyofilm boyamadan hemen önce, boyanacak her kanal için metin protokolünde bulunduğu gibi 100 mikrolitre canlılık boyama karışımı hazırlayın. Biyofilmi lekelemek, girişten kalan tüm sıvıyı aspire etmek ve aynı rezervuarı 100 mikrolitre canlılık boyama karışımı ile yeniden doldurmak için gerekli olana kadar bu çözeltiyi ışığa maruz kalmaktan koruyun.

Ardından boyama solüsyonunu 45 dakika boyunca mikrokanaldan itin. Oda sıcaklığında düşük pay akışı altında, çipi ışığa maruz kalmaktan koruduğunuzdan emin olun. Giriş haznesinden kalan tüm sıvıyı aspire edin ve 100 mikrolitre PBS ile doldurun.

Fazla bağlanmamış boyaları çıkarmak için mikrokanalı oda sıcaklığında düşük pay akışı altında 20 dakika yıkayın. Lekeli biyofilm artık biyofilmlerin üç boyutlu mimarisini test etmek için floresan mikroskobu için hazırdır. Konfokal mikroskop ile yatay taramalar kullanan dijital rekonstrüksiyonlar, genel film yapısını herhangi bir eğik açıdan görüntülemek için kullanılabilir.

Ayrıca, canlı ölü boyama analizi, farklı kimyasal işlemlerin bir fonksiyonu olarak biyofilm içindeki hücre canlılığının mekansal bağımlılığını incelemek için aynı veri veri setine uygulanabilir. Biyofilm görüntülendikten sonra, boyanmamış kanallardan hücreler çıkarılabilir. Yüksek kesme akışında çalışan damıtılmış su kullanılarak, biyofilm florası daha sonra genomik DNA'dan 4 5 4 piro dizilimi ile tanımlanabilir.

Bu prosedürü takiben. Çeşitli koşullar altında çok türlü biyofilmlere ne olduğu gibi farklı soruları yanıtlamak için farklı türler veya bileşikler eklemek gibi başka yöntemler de gerçekleştirilebilir.