Yüksek verimli bir kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, kompozisyonel olarak temsili, çok türlü dental plak biyofilmleri oluşturmaktır. Analiz için paralel olarak bu işlem, öncelikle temsili bir besiyeri ve inokülüm oluşturularak gerçekleştirilir. İnokülüm, gece boyu süren inkübasyonun ardından mikroakışkan çipe aktarılır ve mikro kanal içerisinde bir biyofilm oluşur.

Son olarak, biyofilm yıkanır ve in situ konfokal lazer tarama mikroskobu veya epi floresan mikroskobu ile görüntüleme için boyanır. Bu tekniğin akış hücreleri gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, daha az malzeme kullanılmasına imkan tanıyan, yapay laboratuvar besiyerleri gerektirmeyen ve birden fazla deneyin paralel olarak yürütülmesine olanak sağlayan yüksek verimli bir sistem olmasıdır. Başlamak için, beş veya daha fazla gönüllüden oluşan bir kohorttan, her biri ayrı 50 mililitrelik plastik tüplere tükürük örnekleri toplayın.

Tükürük örneklerini buz üzerinde yerleştirilmiş tek bir plastik behere aktarın. Tükürük biyopolimerleri cam yüzeylere yapışma eğiliminde olduğundan, bu düzenekte cam beher kullanmaktan kaçının. Ardından, nihai konsantrasyonu 2.5 millimolar olana kadar örneğe di thio threes hole ekleyin.

Karışımı buz üzerinde 10 dakika boyunca karıştırın. Tüm içeriği birkaç plastik tüpe aktarın. Partikülleri örnekten ayırmak için dört degrees Celsius'ye soğutulmuş bir santrifüjde 30 dakika boyunca yüksek hızda çöktürme işlemi gerçekleştirin.

Örnekten bakteri içermeyen bir büyüme ortamı hazırlamak için tükürük süpernatanını taze, steril bir kaba aktarın ve pelet kısmını atın. İlk olarak, döküntüden arındırılmış örneği üç hacim deiyonize su ile seyreltin. Ardından, 0.22 µm düşük protein bağlayıcı membran filtre kullanın.

Filtrelenmiş fraksiyon buz üzerinde soğutulurken tükürüğü sterilize edin. Sterilize edilmiş çözeltiyi aktarın ve ihtiyaç duyulana kadar -80 °C'de saklayın. Beş veya daha fazla gönüllüden oluşan bir kohorttan, steril 50 mL'lik plastik tüplerle tükürük örnekleri toplayın.

Tükürük örneklerini oda sıcaklığındaki ön sterilize edilmiş plastik bir behere veya 50 milliliter tüpe aktarın. %25 glycerol ve %75 tükürük karışımı elde edilene kadar steril glycerol ekleyin.

Kontaminanların bir filtrasyon adımıyla uzaklaştırıldığı büyüme ortamı protokolünün aksine, burada oral spesifik olmayan bakteri veya mantarlardan kaynaklanan kontaminasyonu önlemek için steril teknik önemlidir. Saliva gliserol çözeltisini karıştırın. Saliva gliserol karışımını iyi şekilde alikotlayın ve numuneleri, başlama zamanı gelene kadar -80 °C'de saklayın.

Örnekleri mikroçipe eklemeden önce, hem bakteri içermeyen büyüme besiyeri hem de bakteri içeren inokülüm için oda sıcaklığında, burada gösterilenlere benzer mikrokanallara sahip bir mikroakışkan çip satın alın veya imal edin. Ana deneye geçmeden önce, karıştırmak için her tüpü beş saniye boyunca vorteksleyin; mikroçipin çıkış rezervuarına 100 µL büyüme besiyeri ekleyerek başlayın. Bilgisayar kontrollü bir pompa kullanarak mikrokanal boyunca iki dakika süreyle besiyeri kayma akışını başlatın.

Oda sıcaklığında, her bir kanalın uygun şekilde sıvı ile dolduğundan emin olmak için görsel inceleme yapın. Mikroçipi oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Bu işlem, mikrokanal yan duvarlarını, biyofilmin büyüme sırasında üzerine tutunacağı bir biyopolimer iskele ile kaplayacaktır.

Ardından, çıkış rezervuarındaki kalan medyumu manuel olarak aspire edin ve artık bir hidrodinamik dengeleme yükü görevi görecek olan bu fraksiyonu giriş rezervuarına aktarın. Biyopolimer iskele biriktirme işleminden sonra, çıkış rezervuarına 100 µL bakteri pozitif inokülümü ekleyin. Mikroçipi 37 °C'lik bir ısıtıcı plakaya yerleştirin ve orta düzey kesme ters akışını başlatın.

Tam olarak altı saniye boyunca çıkıştan giriş Rezervuarına doğru iletim sağlayın. Ardından pompayı kapatın ve bakteri veya mantarların mikrokanal yan duvarlarına tutunmasını kolaylaştırmak için çipi 37 °C'de statik koşullarda 40 dakika inkübe edin. Sonrasında, çıkış rezervuarındaki tüm inokülumu bir pipet yardımıyla çekip atın ve aynı rezervuarı bir mililitre bakteri içermeyen büyüme besiyeri ekleyerek yeniden doldurun.

Gece boyunca büyüme sonrası kanal içi biyofilm büyümesini teşvik etmek için mikroçipi 37 °C'de, düşük kayma akışı altında yaklaşık 20 saat inkübe edin. Hem giriş hem de çıkış rezervuarlarındaki tüm çözeltileri pipetle çekerek boşaltın. Giriş Rezervuarına 100 µL PBS uygulayın ve mikro kanalı 20 dakika boyunca yıkayın.

Girişten çıkışa doğru düşük kayma kuvvetli ileri akış altında, biyofilm artık canlı-ölü boyamaya hazırdır. Biyofilm boyamasından hemen önce, boyanacak her kanal için metin protokolünde belirtilen 100 µL canlılık boyama karışımını hazırlayın. Bu çözeltiyi, biyofilmi boyamak için gerekene kadar ışık maruziyetinden koruyun; girişten kalan tüm sıvıyı aspire edin ve aynı rezervuarı 100 µL canlılık boyama karışımı ile yeniden doldurun.

Ardından, boyama çözeltisini 45 dakika boyunca mikrokanal boyunca itin. Oda sıcaklığında, düşük kayma akışı altında, çipi ışık maruziyetinden koruduğunuzdan emin olun. Giriş rezervuarındaki tüm kalan sıvıyı aspire edin ve 100 µL PBS ile yeniden doldurun.

Fazla bağlanmamış boyaları uzaklaştırmak için mikrokanalı oda sıcaklığında, düşük kesme akışı altında 20 dakika boyunca yıkayın. Boyanmış biyofilm, biyofilmin üç boyutlu mimarisini değerlendirmek üzere floresan mikroskobisi için hazırdır. Konfokal mikroskop ile yapılan yatay taramalar kullanılarak oluşturulan dijital rekonstrüksiyonlar, genel film yapısını herhangi bir eğik açıdan görüntülemek için kullanılabilir.

Ayrıca, farklı kimyasal işlemlere bağlı olarak biyofilm içindeki hücre canlılığının mekansal bağımlılığını incelemek için aynı veri setine canlı/ölü boyama analizi uygulanabilir. Biyofilm görüntülendikten sonra, boyanmamış kanallardaki hücreler çıkarılabilir. Yüksek kayma akışında çalışan distile su kullanılarak, biyofilm florası daha sonra genomik DNA'dan 4 5 4 piro sekanslama ile tanımlanabilir.

Bu prosedür takip edilebilir. Çeşitli koşullar altında çok türlü biyofilmlere ne olduğu gibi farklı soruları yanıtlamak amacıyla, farklı türlerin veya bileşiklerin eklenmesi gibi diğer yöntemler de uygulanabilir.