Kültürleme Embriyonik için bir yöntem C. elegans Hücreler

Bu prosedürün genel amacı, in vitro, embriyonik, deniz zarif hücreleri ayırmak ve kültürlemektir. Bu, önce büyük miktarlarda mezar hayvanı yetiştirerek gerçekleştirilir. Daha sonraki yumurtalar yetişkinlerden izole edilir.

Daha sonra yumurtalar, yumurta kabuğunu çözmek için kitinaz ile muamele edilir. Son olarak, hücreler manuel olarak ayrıştırılır ve kültürleme için kaplanır. Sonuç olarak, immünofloresan, mikroskopi, elektrofizyoloji ve kalsiyum görüntüleme teknikleri ile hücreye özgü belirteçlerin ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Prosedürü göstermek, bir doktora sonrası laboratuvar olan ilgili olacaktır. GR yetişkin aşamasına en az dört deniz zarafeti tabağı kültürledikten ve metin protokolüne göre ortam ve çözümler hazırladıktan sonra. Yumurta izolasyonuna, önce önceden hazırlanmış fıstık lektin suyu çözeltisinden bir tüp tıraşlayarak başlayın.

Otoklav kapak fişlerini 24 oyuklu bir plakanın kuyucuklarına yerleştirin ve her bir kapak fişine 200 mikrolitre fıstık lektin ekleyin, oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin. Daha sonra, çözeltiyi aspire edin ve kuyuları yıkamak için steril su kullanın. Hücre topaklanmasını önlemek için tüm fıstık lektin izlerini çıkardıktan sonra.

Daha sonra steril otoklav suyu kullanarak, GR yetişkinlerini agar plakalarından yıkayın ve süspansiyonu iki steril konik 50 mililitrelik tüplerde toplayın. Solucanların dibe çökmesini sağlamak için tüpleri beş dakikaya kadar buzun üzerine yerleştirin Bir transfer pipeti ile suyu çıkarın ve taze, steril otoklav su santrifüjü ile değiştirin. Solucanlar 10 dakika boyunca 200 G'de.

Son yıkamadan sonra, solucanları taze steril suda askıya alın ve 10 dakika boyunca 200 G'de tekrar döndürmeden önce steril 15 mililitrelik bir konik tüpe aktarın. Solucanlar tamamen peletlenmemişse, tüpü beş dakika boyunca buzun üzerine yerleştirin. Solucanlar tamamen yerleştikten sonra, suyu çıkarın ve beş ila altı mililitre lizis çözeltisi ekleyin.

Daha sonra süspansiyonu beş ila 10 dakika boyunca hafifçe sallayın ve her iki ila üç dakikada bir, bir kapak kızağına bir damla süspansiyon yerleştirin ve stereo mikroskop altında lizis olup olmadığını kontrol edin. Solucanların% 72 80'i parçalandığında, bu noktadan itibaren döndürmeden önce dokuz mililitre yumurta tamponu ekleyerek lizis reaksiyonunu durdurun, bir bunsen brülörünü yakın ve yumurtaların yeniden kirlenmesini önlemek için açık tutun, süpernatanı dikkatlice çıkarın ve çözelti berraklaşana kadar peleti üç ila dört kez iyice yıkamak için yumurta tamponu kullanın. Daha sonra, yumurtaları hayvan leşlerinden ayırmak için son süpernatanı çıkardıktan sonra, peleti iki mililitre steril yumurta tamponunda askıya alın ve yumurta tamponuna iki mililitre% 60 sükroz ekleyin.

20 dakika santrifüjlemeden önce yumurtaları çözelti içinde iyice karıştırın. 200 G'de, tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Yumurtalar çözeltinin tepesinde yüzüyor olacak.

Bu nedenle, yumurtaları taze steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarmak için bir pipetleyici ve steril bir mililitre uç kullanın. Laminer akış başlığı altında çalışırken yumurtaları üç kez yıkamak için steril yumurta tamponu kullanın. Bakteriyel kontaminasyonu önlemek için, resus, peletlenmiş yumurtaları mililitre kinaz başına bir mililitre iki miligram içinde askıya alın ve bunları 15 mililitrelik taze bir konik tüpe aktarın.

Yumurta kabuklarının yaklaşık% 80'i sindirildiğinde enzimin tazeliğine bağlı olarak tüpü oda sıcaklığında 10 ila 30 dakika sallayın. Yumurtaları 900 G'de üç dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dikkatlice çıkardıktan sonra, üç mililitre L 15 ortamı ekleyin, yumurtaları altı santimetre çapında bir plakaya aktarın ve 18 gauge iğne ile 10 mililitrelik steril bir şırınga kullanarak manuel ayrışmaya başlayın.

Ayrışma derecesini izlemek için, taze bir Petri kabına bir damla süspansiyon koyun ve mikroskop altında görüntüleyin. Hücrelerin yaklaşık% 80'i ayrışana kadar devam edin. Hücre topaklarını, sindirilmemiş yumurtaları ve yumurtadan çıkmış larvaları çıkarmak için, süspansiyonu beş mikronluk bir filtreden nazikçe süzün ve hücreleri kültürlemek üzere hücreleri geri kazanmak için filtreden dört ila beş mililitre L 15 ortamı daha geçirin.

Süzüntüyü üç dakika boyunca 900 G'de santrifüjledikten sonra, hücreleri kuyucuk başına bir mililitre oynanan tam L 15 ortamında tekrar askıya alın ve plakaları ortam havasında 20 santigrat derecede nemli bir kapalı odada saklayın. İzole edilmiş embriyonik embriyonik ayırt etmek için, elegan hücrelerinin bir substrata yapışması gerekir. Farklılaşma işlemi kaplamadan yaklaşık iki ila üç saat sonra başlar ve yaklaşık 24 saat devam eder.

İn vitro morfolojik özellikler, in vivo olanlara oldukça benzerdir. Örneğin, burada gösterildiği gibi, bir LM ve PLM dokunma nöronları, in vivo olarak olduğu gibi, biri diğerinden daha uzun olan yalnızca iki nöronal süreç geliştirir. Bu, elegan hücrelerinde farklılaşmayı yönlendiren moleküler mekanizmaların en azından bir kısmının hücre özerk olduğunu ve bu nedenle özetlenebileceğini göstermektedir.

Hücreye özgü in vitro protein belirteçleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar da in vitro olarak gözlenebilir. Örneğin, alfa tübülin, burada gösterildiği gibi, deniz elganındaki sadece dokunma nöronlarında doymuş bir doymuş nörondur, dokunma nöronlarının doymuş bir alfa tübüline karşı yükseltilmiş bir antikorla boyanır. Ek olarak, bu panelde görüldüğü gibi, kültürlenmiş dokunma nöronları, dokunma nöronlarının in vivo olarak ölümüne neden olan toksik mutant kanal MEC four D'yi eksprese eder.

Bir MEC dört DPE 4G FP suşundan hazırlanan GFP eksprese eden nöronlar başlangıçta kültürde bulunur, ancak daha sonra dejenere olur. Bununla birlikte, tıpkı in vivo olarak, hücreler burada gösterildiği gibi bir IDE ve dantrolen ile tedavi edilerek ölümden kurtarılabilir. Yama klemp teknikleri, deniz elgan kültürlenmiş hücrelerinde potasyum onik, onik, seçici olmayan ve dopamin taşıyıcı bağımlı kanalları incelemek için kullanılır.

Hücrenin küçük boyutu nedeniyle, cam pipetlerin artan giriş direncini dengelemek için küçük bir ucu ve ardından geniş bir konisi olmalıdır. Ek olarak, pipetin ucunun altındaki zar yamasına yüksek voltajlı bir dürtü uygulanarak, hücreye zarar verebilecek emme yoluyla tüm hücre erişimi elde edilerek daha büyük başarı elde edilir. Bu şekilde, voltaj kapılı kalsiyum kanallarının rolünü incelemek için, ION dört, zara nüfuz etmek ve kalsiyum yokluğunda veya varlığında kalsiyum görüntüleme için bukalemun YC iki nokta 12'yi ifade eden dokunma nöronlarını kalibre etmek için kullanılır.

Ek olarak, dokunma nöronlarındaki ortalama serbest kalsiyum konsantrasyonunun 200 nanomolar molar olduğu tespit edilmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, vitro olarak nasıl izole edileceğini ve kültürleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Zarafeti, embriyonik hücreleri görün.