Name: Kültürleme Embriyonik için bir yöntem C. elegans Hücreler (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-21T20:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Öğrenin C. elegans embriyonik hücrelerini kitinaz ve manuel dissosiasyon kullanarak kültürleme yöntemini. Bu protokol hücre farklılaşması ve gen ekspresyonu çalışmaları için güvenilir bir model sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Christensen ve diğerleri ile karşılaştırıldığında, Yıldız (*), yeni ya da değiştirilmiş adımlarını gösterir. 1 1.. Malzeme Kur <ol><li> Hücre kültürü prosedür gebe yetişkin izole edilmiş yumurtaların büyük miktarda gerektirir. C&#39;yi büyüyecek yumurtaların büyük miktarda izole etmek için bakteriler - elegans 8P agar plakaları üzerinde NA22 (CGC C. elegans Genetik Consortium kullanılabilir) ile ekildi. Bu plakalar kullanılmıştır pepton miktarı normal olarak NGM plakalar için kullanılan 8 kez miktardır. Daha yüksek pepton konsantrasyonu OP50-, kalın tabakalar halinde büyümeye ki aksine, daha verimli NA22 bakterilerin gelişimini devam ettirir. </li></ol> 8P plakaları tarifi: 3 g NaCl, 20 g Bacto-pepton, 30 dakika süre ile, steril damıtılmış su ve otoklav içinde 1 L 25 g agar çözülür. 55 ° C&#39;de orta serin ve daha sonra 1 ml 1 MgCl2 kolesterol steril olarak filtreden geçirilmiş, 1 ml EtOH (5 mg / ml), ekleme, MgSO 4 ile 1 ml KP tamponu (500 ml stok: 5 g 2 K HPO 4, 30 g KH 2 PO 4, pH 6.00) 25 ml. 10 cm Petri kutularına (25 ml / plaka) sıvı agar ortam dökün. <ol start="2"><li> Ertesi gün NA22 E: 1 ml her bir zenginleştirilmiş pepton agar levhasının tüm yüzeyi yayılmış 2XYT ortamı (16 g tripton, 10 g maya ekstresi, steril su, pH 7.0, 1 L NaCl 5 g) 37 ° C sıcaklıkta gece boyunca kültürlendi coli Bu bakteriler gravid yetişkinlerin büyük miktarlarda büyümeyi destekleyen kalın bir tabaka oluşturacak bol bir besin kaynağı oluşturmaktadır. Bakterilerin büyümesine izin vermek üzere gece boyunca oda sıcaklığında tohumlanmış plakaları bırakın. Bu süreç, 4-5 saat boyunca 37 ° C&#39;de inkübe edilerek hızlandırılabilir. </li><li> Numaralı seribaşı 8P plakalarına hasret hayvanları aktarın. 5-6 M9 tampon veya ml su kullanılarak bir hasret NGM plaka hayvanları yıkayın ve her 8P plaka bu süspansiyonun 1-2 ml ekleyin. </li><li> Hayvanların büyüme ve çarpma unt izinil plakaları gebe yetişkinler tarafından izdiham doldurulur. </li><li> C. hazırlanması için gerekli olan yumurta izole lizis çözeltisi 5-6 ml kullanarak gebe yetişkinlerden embriyonik hücreler, elegans. </li></ol> Lysis çözelti tarifi Taze Bleach 5 mi, 10 N NaOH ve 1.25 ml steril H2O 18.5 mi Bu karışım, her kullanımdan önce taze olarak hazırlanmalıdır. <ol start="6"><li> Yumurta tampon kullanarak gebe yetişkinlerden izole yumurta yıkayın: </li></ol> Yumurta tampon tarifi 118 mM NaCl, 48 mM KCI, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 25 mM Hepes, pH 7.3, 340 mOsm ozmolarite. <ol start="7"><li> Çitinaz ile muamele edilerek yumurta çevreleyen yumurtaların çıkarın. Kitinaz asidik pH 25 ile en yüksek aktiviteye sahip bir enzimdir. 2 mg / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyonda yumurta tamponu pH 6.5 içinde kitin (Sigma, katalog no. C6137) içinde çözülür. Şitinaz stok saklamaksteril 15 ml konik tüplerde 1 ml alikotlar içinde -20 ° C&#39;de çözelti. Bu süspansiyonun tam bölenleri bir kaç ay için -20 ° C de muhafaza edilebilir. </li><li> C&#39;yi büyüyecek fıstık lektinle kaplı otoklavlanmıştır lamelleri (12 mm çap) üzerinde elegans kültür hücreleri. Steril su (0.5 mg / ml) içinde fıstık lektin çözülür. Fıstık lektin çözelti filtre otoklave olmamalıdır. Ayrıca, UV ışığı ile muamele edilmesi gerekmez. 6 aya kadar -20 ° C&#39;de saklayın 2 ml lik bir kısmı. </li><li> Tam hücre kültür ortamı (500 mi) Gibco, 50 ml cenin sığır serumu (ısı ile deaktive edilmiş), 7.7 g sükroz (45 mOsm), 100 U / ml penisilin ve 100 ug, 5 ml / 500 ml L-15 kültür ortam içeren ml Streptomisin (% 2). Tam ortam daha sonra bir 0.20 mikron gözenek filtresi kullanılarak filtre edilir. </li></ol> Yumurta tampon ve kültür ortamı, sırasıyla 340 ve 345 mOsm osmolaritesini sahip olduğunu unutmayın. Gerçekten de, memeli hücrelerinin aksine, C. elegans hücrelerin nispeten yüksek ozmotik basıncı vardırbu hücrelerin plazma membran ile doğrudan temas edecek çözümler hazırlanırken saymak içine alınması gerekir. Bu reaktiflerin tarifleri bir osmometre 1 kullanılarak ölçülmüştür istenen ozmolarite ulaşmak için ayarlanmıştır. Bu tarifleri tam olarak takip edilmektedir ve bakım Bu reaktif maddelerin hazırlanmasında kullanıldığında bir osmometre kullanmak gerekli değildir. Diğer çözümler, yemek tarifleri burada rapor edilmez veya C&#39;yi kullanmak yayınların herhangi hazırlanmış olması, gerekiyorsa Ancak, tek bir osmoter kullanmalısınız kültür hücreleri elegans. 2. Yumurta İzolasyon <ol><li> Bu (24 oyuklu plakalar içerisinde) kültürlenmiş hücrelerin 12 kuyu için yeterli yumurta toplamak için en az dört 8P plakaları ile başlamak için tavsiye edilir. </li><li> Prosedüre başlamadan önce fıstık lektin stok solüsyonu bir tüpü eritin. Bir 24-çukurlu plaka içindeki kuyuların altındaki otoklav lamelleri yerleştirin ve lamelleri fıstık lektin 200 ul ekle. 1 saat ya da u inkübentil hücreler kaplama hazırdır. Tamamen fıstık lektin çıkarın ve steril otoklavlanmış 1 ml su ile bir kez kuyu yıkayın. Lamelleri fıstık lektininin tam çıkarılması hücre topaklanma kaçınmak için gereklidir. </li><li> Steril otoklava su kullanarak agar plakaları kapalı gebe yetişkin yıkayın. İki steril konik 50 ml tüp içine süspansiyon toplayın. Tüplerin (*) altındaki solucanlar çökelmesine izin verecek şekilde 5 dakika boyunca buz üzerinde tüpler bırakın. Bir transfer plastik bir pipet ile su çıkarmak ve taze steril otoklavlanmıştır su ile değiştirin. 200 xg 10 dakika boyunca (~ 1.200 rpm) (*) masa üstü santrifüj ile solucanlar Pelet. En az 3, bu son adımı tekrarlayın. </li><li> Bir steril 15 ml konik bir tüp içine transfer solucanlar ve 200 x g&#39;de 10 dakika boyunca (~ 1,200 rpm) (*) onları pelet. Hem tüpün altındaki bakteri toplama önlemek için daha yüksek bir hız santrifüj kullanmayın. Bazen santrifüj işlemi sonrasında tamamen solucanlar topak değildir. After Her bir yıkama ve temizleme önce yüzer madde, buz üzerinde 5 dakika boyunca tüpleri. Soğutulmuş su solucanlar tüpün dibine çökme olmamıştır. </li><li> Su çıkarmak ve parçalama çözüm 5-6 ml ekleyin (Malzeme kurmak bakınız). 5-10 dakika boyunca yavaşça süspansiyon kaya ve daha sonra her 2-3 dk stereomicroscope altında solucan lisizine izleme başlar. Süspansiyonun bir damla daha kolay kontrolü için bir lamel üzerine yerleştirilebilir. Kuluçka süresi ağartıcının tazelik bağlı olarak değişir; ağartıcının küçük şişe satın almak ve her ay yeni bir şişe açın. </li><li> ~% 70-80 oranında solucan (İnkübasyonun başından itibaren 10 dakika) lize ne olursa olsun (Malzeme ayarlamak için bkz) yumurta tamponu, pH 7.3 içinde 9 ml eklenerek parçalama reaksiyonu durdurun. 10 dakika boyunca 200 x g&#39;de (1200 rpm ~) de süspansiyonu santrifüj. Yumurta (*) yeniden kirlenmesini önlemek için bankta bir Bunsen beki var Bu noktadan itibaren. </li><li> Dikkatlice steril plastik transfer pipet kullanarak süpernatant kaldırmak ve pelet 3-4 yıkayınçözüm açıktır x yumurta tamponu ile kadar. Her bir yıkama sırasında yumurta tamponunda pelet iyice karıştırın emin olun. </li><li> Yumurta% 30 sukroz çözeltisi kullanılarak Hayvan karkaslarının ayrılır. Steril yumurta tampon, 2 ml pelet yeniden süspanse edin ve 2 ml% 60 sukroz çözeltisi (steril yumurta tamponunda stoku) ekleyin. İyice karıştırın ve 200 x g (~ 1200 rpm) (*) 20 dakika boyunca santrifüj. </li><li> Dikkatlice santrifüj tüpleri çıkarın. Yumurtalar çözeltisinin üstünde yüzen. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak, yeni bir steril 15 ml konik tüp içine tüm yumurta transferi. </li><li> 10 dakika boyunca 200 x g (~ 1200 rpm) ve santrifüj tüpüne steril yumurta tampon 10 ml ilave edilir. Yıkandıkları 3 x tekrarlayın. Yumurtalar Tamamen her yıkama sırasında yumurta tampon içinde tekrar süspanse edilir emin olun. </li></ol> 3. Embriyonik hücreler Ayrılma Laminer akış kapağı steril şartlar altında Prosedürün sonraki adımlar Davranış. Hayvanlar datüm bakteri değilse en ortadan kaldırmak gerekir bakteri plakalarının, yıkama ve ağartma maddesi içeren lizis çözeltisi ile muamele elbise. Bu durumda, prosedür, bu noktada, bir laminar bir başlık kullanılarak yumurta süspansiyonu yeni bir kirlenmesini önler. <ol><li> 2 mg / ml kitinaz (yumurta tamponu pH 6.5 (*) stok), 1 ml topak haline yumurta yeniden süspanse edin ve yeni bir steril 15 ml konik tüp aktarın. Oda sıcaklığında 10-30 dakika boyunca tüp sallayın. Kesin inkübasyon süresi, enzimin ve oda sıcaklığının tazelik göre değişen ve bu nedenle her hazırlanması için belirlenmelidir. Bu inkübasyon 10 dakika sonra, ters çevrilmiş bir hücre kültürü mikroskop altında yumurta izlemeye başlamak için tavsiye edilir. Not: bizim deneyim, düşük pH şitinaz enzimatik aktivitesini arttırır. Bu nedenle, biz kitinaz (pH NaOH ile 6.5 &#39;e ayarlanır yukarıda belirtilen tarifi) eritmek için pH 6.5&#39; de yumurta tampon kullanın. </li><li> ~ Yumurtalarında% 80&#39;i tarafından sindirilir zamankitinaz tedavisi (Şekil 1 AB), 900 x g&#39;de 3 dakika boyunca (~ 2,500 rpm) (*) santrifüjleme ile yumurta pelet. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak, dikkatlice süpernatant kaldırmak ve L-15 orta 3 ml (*) ekleyin. </li><li> 6 cm çaplı plaka içine yumurta aktarın ve yavaşça bir 18 G iğne ile donatılmış bir 10 ml&#39;lik steril bir şırınga kullanılarak hücreleri ayırmak. Yeni bir plastik Petri kabı içine bir süspansiyon damla yerleştirerek ve mikroskop altında görüntüleyerek ayrışma derecesini izlemek. Zarar hücreleri önlemek için bu işlem sırasında enjektör içine hava aspire etmeyin. Hücrelerin% 80 ayrışmış olan ~ kadar ayrışma devam edin. </li><li> Steril 5 um Millipore filtresi kullanılarak süspansiyon filtre. Hücre süspansiyonları, hücre kümeleri, sindirilmemiş yumurta ve larvalarına yumurtadan çıkarmak için filtre edilmelidir. Tüm hücreleri kurtarmak için filtre boyunca taze L-15 ortamı ilave 4-5 ml filtre. Dekar önlemek için filtrasyon aşaması sırasında aşırı güç kullanmayınfiltresi ve / veya hücreleri maging. </li></ol> 4. Hücre Kültürleme <ol><li> 3 dakika boyunca (*) için 900 x g (~ 2,500 rpm) santrifüjleme ile ayrışmış hücreleri Pelet. P1000 pipet ve steril ipuçlarını kullanarak dikkatlice süpernatant kaldırmak. Tüm L-15, orta ve plakanın 1 ml / oyuk olarak pelet hücreleri yeniden süspanse edin. Ilave ortamın miktarı, kullanılan 8P plakaların sayısı, plakalar üzerinde solucanların birleştiği ve hücreler üzerinde yapılacak deneyler türüne bağlıdır. Hücre yoğunluğu bir hemositometre kullanılarak belirlenebilir. ~ 230.000 hücre / cm 2 optimal yoğunluk kaplama yama-kelepçe kayıtları için. </li><li> Kültür ortamının buharlaşmasını önlemek için ıslak kağıt havlu içeren plastik bir kap içinde Tupperware 24 kuyu plakası tutun. 20 ° C ve çevre havası ile nemlendirilmiş bir kuluçka makinesi içinde kabı saklayın. </li><li> Hücreler genellikle 24 saat içinde deneyler için hazır olduğunda morfolojik ayrım ve ekspresGFP belirteçlerin iyon tamamlandı. Hücreler kadar 2 hafta boyunca kültür içinde tutulur, fakat bunlar genellikle kaplama sonrası 7-9 gün kadar en sağlıklı. Ortam, sağlıklı hücreleri korumak için günde bir değiştirilmesi gerekir. </li></ol>

C. elegans gelişim, davranış ve yaşlanma ile ilgili genetik yollar deşifre için güçlü bir model organizmadır. Onun rahatlığı öncelikle genetik manipüle edilebilme kolaylığından ve kısa yaşam döngüsü kaynaklanıyor. Onun kolaylık rağmen, C. elegans sınırlamaları vardır. C elegans hücreler son derece küçük ve bu mikro-dizi analizi ile gen ekspresyon profili olarak, doğrudan bu tür elektrofizyolojik ve farmakolojik teknikleri gibi hücrelere erişim, veya özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektirir ...

Caenorhabditis elegans (C. elegans) hücresel fonksiyonun, farklılaşma ve davranış moleküler temellerini araştıran güçlü bir model organizmadır. Genom, metabolik ve biyosentetik yollar omurgalılar &#39;benzer olmakla birlikte, genetik ve moleküler tractability 2 çok daha fazladır. Avantajları arasında, onun büyüklüğü ve basit anatomi, onun hızlı yaşam döngüsü (25 ° C&#39;de 3 gün), kısa ömürlü (2 hafta) ve yavrular çok sayıda (&gt; 200) vardır. Nedeniyle hermaphroditic doğası ve kısa yaşam döngüsü, moleküler ve genetik manipülasyonlar C. basittir transgenik hayvanlarda 3,4 ve bu RNA girişim 5 gibi gen knock-down tekniklerin uygulanması da dahil olacak elegans. C. elegans vücut ve yumurta kabuğu şeffaf. Bu nedenle hücreleri kolayca yetişkin ve standart mikroskopi kullanılarak embriyo hem de görülebilir. Son 40 yıl içinde, C. elegans </em&gt; topluluk C için çok değerli bir kaynak yarattı mutantlar, tırnakları ve transgeniklerinin geniş bir koleksiyon, sinir sistemi 8 tam yeniden yapılanma dahil anatomi ve geliştirme 6,7 ayrıntılı bir açıklama, ve de açıklamalı ve bütün topluma mevcuttur tamamen sıralı genom (dahil elegans araştırma <a href="http://www.wormbase.com" target="_blank">www.wormbase.com</a> ). Sayısız avantajlara rağmen, bazı deneysel yaklaşımlar C. zorlu olmuştur elegans. Bu dokular ya da hücre tiplerinin hücre ve tecrit plazma zarına erişim gerektiren olanları içerir. Gerçekten C. elegans dokular kolayca enzimatik muamele ya da deterjanların tarafından sindirilir değil onun basınçlı hidrostatik iskelet, içinde hapsedilir. 1990&#39;ların sonunda Miriam Goodman ve Janet Richmond C elektrofizyolojik kayıtlar için yöntemler öncülük elegansin situ 9,10 nöronlar ve kas hücreleri. Bu yöntemler bize nöronal ve in vivo kas fonksiyonu önemli bilgiler verirken, onlar zor ve düşük verim vardır. In vivo olarak, hücre fonksiyonlarını incelemek için alternatif yöntemler çoğunlukla, özellikle bu tür GCamP ve cameleon 11-13 genetik olarak kodlanmış kalsiyum sensörler kullanılarak kalsiyum vivo görüntüleme, geliştirilmiştir. Onlar bozulmadan yaşayan hayvanlar üzerinde uygulanır çünkü bu olsa yöntemleri, farmakolojik araçların kullanımına izin vermez. Kültür C&#39;de ilk girişimi Büyük ölçekli in vitro hücre elegans doktora tezi 14 hazırlanmasında Laird Bloom tarafından yapıldı. Ne yazık ki, zorluklar substrata hücrelerin zayıf yapışması ile karşılaşılan, zayıf hücre farklılaşması ve hayatta kalma güçlü bir hücre kültür yöntemi olarak bu erken protokol kurulmasını engelledi. 1995 yılında Edgar ve arkadaşları bir prosedür yayınladıTek bir C izolasyonu ve kültürü ile hücre bölünmesini ve morfogenetiğine araştırmak. elegans 15 embriyolar. Tedavisi ve enzimatik ayrışma manuel bir kombinasyonu ile yumurta kabuğu sindirilmesi ile elde edilen embriyonik hücreler, ~ 500 hücre 15 kadar üreten, çoğalmaya devam etti. Daha sonra, Leung ve arkadaşları bağırsak morfogenetiğine çalışma blastomerlerin küçük bir sayıda kültüre. Bunlar, bir in vitro izole edilmiş E blastomere apikal adherens birleşme 16 üzerinden birbirleri ile etkileşerek intestinal lümene benzer bir yapı oluşturulur polarize bağırsak hücreleri tarafından üretilebilir olduğunu gösterdi. Buechner ve arkadaşları, kültürleme C için benzer bir yöntem rapor etmiştir. 17, in vitro olarak embriyonik hücreleri elegans. Bu erken çalışmalara dayanarak, Christensen ve arkadaşları embriyonik C kültürleme için sağlam bir protokol geliştirmiştir. elegans vitro 1 hücreler. Onlarbu izole edilmiş C göstermiştir. elegans hücreler, çeşitli hücre tipleri farklılaşmak ve hücreye özel markörlerin ekspresyonu dahil olmak üzere, in vivo olarak sahip olduğu özellikleri muhafaza edebilir. In vivo olarak zor olan çeşitli teknikler, izole edilmiş C uygulanabilir embriyonik hücreleri elegans. Bu elektrofizyolojik 1,18 19, görüntü işleme ve immünokimyasal teknikleri 20,21, hem de hücreye özgü cDNA kütüphanelerinin 22,23 inşası için (FACS) floresan aktive hücre spesifik hücre tipleri izolasyonunu içerir. Bu tür RNA girişim (RNAi) olarak Gene demonte teknikleri kültürlenmiş C uygulanabilir elegans hücreler 1 ve glikoprotein keşfi için bir araç olarak Azido-şeker kullanarak yeni bir metabolik etiketleme yöntemi, son zamanlarda in vitro kültürlenmiştir C için geliştirilmiştir elegans hücreleri, 24. Sonuç olarak, hücre kültürü yöntemi dizi o genişletirC. uygulanabilir f teknikleri Bir canlı organizmanın bağlamında gen fonksiyonunu çözmek için bir çaba elegans modeli. Biz C kültürleme için buraya protokolü açıklamak büyük ölçüde birinci Christiansen ve arkadaşları 1 tarafından tarif edilen protokole göre in vitro olduğu, embriyonik hücreler elegans.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-382</td><td></td></tr><tr><td>Difco Agar Granül</td><td>VWR Uluslararası A.Ş.</td><td>90000-784</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tripton VWR</td><td>Uluslararası A.Ş.</td><td>90000-284</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Maya Özü</td><td>VWR International Inc.</td><td>90000-724</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz'in L-15 Orta (1x) Sıvı</td><td>İnvitrojeni</td><td>11415-064</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Sığır Serumu</td><td>İnvitrojeni</td><td>16140-063</td><td></td></tr><tr><td>Penisilin-streptomisin</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Streptomyces Griseus</td><td>Sigma</td><td>C6137-25UN'dan</td><td></td>Kitinaz</tr><tr><td>NA22 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetik Merkezi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fıstık Lektin</td><td>Sigma</td><td>L0881-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma</td><td>57903-1KG</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)Glikoz</td><td>Sigma</td><td>67528-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Etilen glikol-bis (2-amin&#8211; thylether), N, N, N', N'- tetraasidik asit (EGTA)</td> <td>Sigma</td><td>E0396-25G</td><td></td></tr><tr><td>Hepes</td><td>Sigma</td><td>H3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Kolesterol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>57653-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl 2 Sigma</td><td></td> <td>C1016-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M8266-100G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>M2643-500 g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO<>sub4</td><td>Sigma</td><td>P2222-500G</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791-500G</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma</td><td>S8045-500G</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P1767-500G</td><td></td></tr><tr><td>Etanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Otoklavlanmış damıtılmış H2O</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Çamaşır Suyu</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</td></tr><tr><td>101-1000 &mu; l Mavi Dereceli Pipet Uçları</td><td>USA Scentific</td><td>1111-2821</td><td></td></tr><tr><td>10 ml Sterilize Pipet Ayrı Ayrı Sarılmış</td><td>USA Scentific</td><td>1071-0810</td><td></td></tr><tr><td>Ergonomik Değişken Hacim (100-1000 & mu; l) Uç çıkarıcılı pipetleyici</td><td>VWR International Inc.</td><td>89079-974</td><td></td></tr><tr><td>Taşınabilir Pipet Yardımı, Drummond</td><td>VWR International Inc.</td><td>53498-103</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Plastik Pipet Steril</td><td>VWR International Inc.</td><td>14670-114</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konik Tüp </td><td>ABD Scentific</td><td>1475-1611</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konik Tüp</td><td>USA Scentific</td><td>1500-1811</td><td></td></tr><tr><td>Steril 18 gauge İğneler</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td></td><td></td>305196</tr><tr><td>Steril 10 ml Şırıngalar</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td></td><td></td>305482</tr><tr><td>Plastik Şırınga Filtreleri Corning 0,20 & mu; m gözenek boyutu </td><td>Corning</td><td>431224</td><td></td></tr><tr><td>Akrodik 25 mm Şırınga filtresi w / 5 & mu; m versapor Membran</td><td>VWR Uluslararası A.Ş.</td><td>28144-095</td><td></td></tr><tr><td>60x15 mm Petri Kabı Steril</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-548</td><td></td></tr><tr><td>100x15 mm Petri Kabı Steril</td><td>VWR International Inc.</td><td>82050-912</td><td></td></tr><tr><td>12 mm Çaplı Cam Lameller</td><td>VWR International Inc.</td><td>48300-560</td><td></td></tr><tr><td>Şeffaf Hücre Kültürü Plakaları 24 Kuyulu Düz Tabanlı kapaklı </td><td>Thomas scientific</td><td>6902A09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5- İnce Forseps </td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5702</td><td>Eppendorf</td><td>022629883</td><td></td></tr><tr><td>x10 objektifli</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Laminer Akış Başlığı</td><td></td><td></td><td></td></tr> Ters Mikroskop<tr><td>Ortam havası nemlendirilmiş İnkübatör</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

kültürleme embriyonik için bir yöntem<em&gt; c. elegans</em&gt; hücreler

A Method for Culturing Embryonic C. elegans Cells

C. elegans genetik ve moleküler teknikler kolay uygulanabilir olduğu güçlü bir model sistem vardır. Yakın zamana kadar olsa da, hücreler ve özel hücre tiplerinin izolasyonu doğrudan erişim gerektiren teknikleri, C de uygulanamadı elegans. Bu sınırlama, dokuların kolayca enzimler ve / veya deterjan ile muamele ile sindirilmeyen bir basınçlı kütikül içinde sınırlı olmasından kaynaklanıyordu. Laird Bloom, Christensen ve 1 C kültürleme için sağlam bir yöntem geliştirdi meslektaşları tarafından erken öncü çalışmalara dayanarak Büyük ölçekli embriyonik hücreleri elegans. Yumurta ağartıcı / NaOH ile işlenerek gebe yetişkin izole edilmiş ve daha sonra da yumurta kabuğu kaldırmak için çitinaz ile tedavi edilir. Embriyonik hücreler daha sonra el ile pipetleme ayrılmış ve serum zenginleştirilmiş ortam içinde alt-tabaka kaplı cam üzerine kaplanmıştır. Izolasyon hücrelerin 24 saat içinde morfolojisi değiştirerek ve hücre spesifik marke ifade ederek ayırt başlarrs. C. elegans, bu yöntem kullanılarak kültür hücreleri, in vitro olarak 2 hafta kadar hayatta kalma ve elektrofizyolojik, immünokimyasal için kullanılmıştır ve bu kriteri ve mikroarray kullanılmaktadır gibi görüntüleme de analiz eder.

C. kültür hücreleri spesifik belirteçler farklılaştırmak ve ekspres hücre elegans Christensen ve tripan mavi lekelemesi kullanılarak arkadaşları göstermiştir ki, embriyonik C&gt;% 99 elegans hücreler izolasyon prosedürü hayatta. 9 gün sonra kaplama ve 22, sırasıyla% 85 ve% 65, hala 1. hayatta. İzole embriyonik C. elegans hücreleri ayırt etmek için bir alt-tabaka için uygun olmalıdır. Form kümeleri uymadığı ve onlar hayatta olup olmadığı aç...

Biz embriyonik C. büyük ölçekli kültür için burada bir revize protokol açıklar hücreleri elegans. Embriyonik C. elegans Bu yöntemi kullanarak, in vitro olarak kültürlenmiş hücreler, bir hücre özel bir şekilde genlerin ekspresyonunu ayırt ve özetlemek için görünür. Doğrudan hücrelere erişimi ya da diğer dokulardan özel hücre tiplerinin izolasyonu gerektiren C teknikleri uygulanabilir kültür hücreleri elegans.

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem<em&gt; C. elegans</em&gt; Hücreler

C. elegans is a powerful model system, in which genetic and molecular techniques are easily applicable. Until recently though, techniques that require ...

Bu prosedürün genel amacı, embriyonik deniz zambağı hücrelerini ayrıştırmak ve in vitro ortamda kültüre etmektir. Bu işlem, öncelikle büyük miktarlarda canlı hayvan yetiştirilerek gerçekleştirilir. Ardından, yetişkinlerden yumurtalar izole edilir.Ardından, yumurta kabuğunu çözmek için yumurtalar kitinaz ile işleme tabi tutulur. Son olarak, hücreler manuel olarak disosiye edilir ve kültürleme için plaklara ekilir. Nihayetinde; immünofloresan, mikroskopi, elektrofizyoloji ve kalsiyum görüntüleme teknikleri aracılığıyla hücreye özgü belirteçlerin ekspresyonunu gösteren sonuçlar elde edilebilir.Prosedür, bir doktora sonrası araştırmacı tarafından laboratuvarda gösterilecektir. En az dört plak sea elegance'ı GR yetişkin evresine kadar kültüre ettikten ve metin protokolüne uygun olarak besiyeri ve çözeltileri hazırladıktan sonra; önceden hazırlanmış bir tüp yer fıstığı lektin stok çözeltisi alarak yumurta izolasyonuna başlayın.Otoklavlanmış lamelleri 24 kuyucuklu bir plakadaki kuyucuklara yerleştirin ve her lamelin üzerine 200 microliters yer fıstığı lektini ekleyip oda sıcaklığında en az bir saat inkübe edin. Ardından, çözeltiyi aspire edin ve kuyucukları yıkamak için steril su kullanın. Hücre kümelenmesini önlemek için yer fıstığı lektininin tüm kalıntılarını temizleyin.Ardından, steril otoklav suyu kullanarak GR yetişkinlerini agar plakalardan yıkayın ve süspansiyonu iki adet steril konik 50 mililitrelik tüpte toplayın. Solucanların dibe çökmesini sağlamak için tüpleri beş dakikaya kadar buz üzerinde bekletin. Bir transfer pipeti ile suyu uzaklaştırın ve yerine taze, steril otoklav suyu ekleyin. Solucanları 200 G hızda 10 dakika boyunca santrifüjleyin.Son yıkamadan sonra, solucanları taze steril su içinde süspande edin ve 200 G'de 10 dakika boyunca tekrar santrifüjlemeden önce steril 15 mililitrelik konik bir tüpe aktarın. Solucanlar tamamen peletleşmemişse, tüpü beş dakika boyunca buz üzerinde bekletin. Solucanlar tamamen çöktükten sonra, suyu uzaklaştırın ve beş ila altı mililitre lizis çözeltisi ekleyin.Ardından süspansiyonu beş ila 10 dakika boyunca nazikçe sallayın ve her iki ila üç dakikada bir, bir damla süspansiyonu lameli üzerine yerleştirerek stereo mikroskop altında lizis olup olmadığını kontrol edin. Solucanların %72-80'i liz olduğunda, dokuz mililitre yumurta tamponu ekleyerek lizis reaksiyonunu durdurun; bu noktadan itibaren santrifüj işleminden önce bir bunsen beki yakın ve yumurtaların yeniden kontamine olmasını önlemek için açık tutun, süpernatantı dikkatlice uzaklaştırın ve çözelti berraklaşana kadar pelleti yumurta tamponu ile üç ila dört kez iyice yıkayın. Daha sonra, yumurtaları hayvan kadavralarından ayırmak için son süpernatantı uzaklaştırdıktan sonra, pelleti iki mililitre steril yumurta tamponu içerisinde süspanse edin ve yumurta tamponundaki %60 sükrozdan iki mililitre ekleyin.Santrifüjlemeden önce yumurtaları çözelti içinde iyice karıştırın. 200 G'de 20 dakika santrifüj yaptıktan sonra tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Yumurtalar çözeltinin üst kısmında yüzüyor olacaktır.Bu nedenle, yumurtaları taze ve steril bir 15 ml konik tüpe aktarmak için bir pipet ve steril bir mililitrelik uçlar kullanın. Laminar akışlı kabin altında çalışırken, yumurtaları üç kez yıkamak için steril yumurta tamponu kullanın. Bakteriyel kontaminasyon girişini önlemek için, çökelmiş yumurtaları 2 mg/mL kinaz içeren bir mililitre içerisinde süspande edin ve bunları taze bir 15 ml konik tüpe aktarın.Yumurta kabuklarının yaklaşık %80'i sindirilene kadar, enzimin tazeliğine bağlı olarak tüpü oda sıcaklığında 10 ila 30 dakika boyunca sallayın. Yumurtaları 900 G'de üç dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı dikkatlice uzaklaştırdıktan sonra, üç mililitre L 15 besiyeri ekleyin, yumurtaları altı santimetre çapındaki bir plağa aktarın ve 18 gauge iğneli 10 mililitrelik steril bir şırınga kullanarak manuel disosyasyona başlayın.Disosiyasyon derecesini izlemek için, süspansiyondan bir damlayı taze bir Petri kabına yerleştirin ve mikroskop altında inceleyin. Hücrelerin yaklaşık %80'i disosiye olana kadar işleme devam edin. Hücre kümelerini, sindirilmemiş yumurtaları ve yumurtadan çıkmış larvaları uzaklaştırmak için, süspansiyonu beş mikronluk bir filtreden nazikçe süzün ve hücreleri geri kazanıp kültüre etmek için filtreden ek olarak dört ila beş mililitre L 15 medyumu geçirin.Filtrat 900 G'de üç dakika boyunca santrifüj edildikten sonra, hücreleri kuyuk başına bir mililitre gelecek şekilde komplet L 15 besiyerinde yeniden süspanse edin ve plakları ortam havasında 20 °C'de, nemli ve kapalı bir hazne içerisinde saklayın. İzole edilen embriyonik hücrelerin farklılaşabilmesi için bir substrata tutunmaları gerekir. Farklılaşma süreci, ekimden yaklaşık iki ila üç saat sonra başlar ve yaklaşık 24 saat boyunca devam eder.İn vitro morfolojik özellikler, in vivo özelliklerle dikkat çekici derecede benzerdir. Örneğin, burada gösterildiği gibi, bir LM ve PLM dokunma nöronu, tıpkı in vivo ortamda olduğu gibi, biri diğerinden daha uzun olan yalnızca iki nöronal uzantı geliştirir. Bu durum, elegan hücrelerde diferansiyasyonu yönlendiren moleküler mekanizmaların en azından bir kısmının hücre otonom olduğunu ve dolayısıyla yeniden oluşturulabileceğini göstermektedir.Hücreye özgü olan in vitro protein belirteçleri ve translasyon sonrası modifikasyonlar da in vitro ortamda gözlemlenebilir. Örneğin, burada gösterildiği gibi, alfa tubulin deniz elganlarındaki dokunma nöronlarında asete şeklinde bulunur; dokunma nöronlarının in vitro uzantıları, asete alfa tubuline karşı geliştirilmiş bir antikor ile boyanmaktadır. Ayrıca, bu panelde görüldüğü üzere, kültürlenmiş dokunma nöronları, in vivo ortamda dokunma nöronlarının ölümüne neden olan toksik mutant kanal MEC four D'yi eksprese etmektedir.MEC four DPE 4G FP suşundan hazırlanan GFP eksprese eden nöronlar başlangıçta kültürde mevcuttur, ancak daha sonra dejenerasyona uğrarlar. Bununla birlikte, tıpkı in vivo'da olduğu gibi, burada gösterildiği üzere hücreler IDE ve dantrolen tedavisi ile ölümden kurtarılabilir. Deniz salyangozu kültür hücrelerindeki potasyum iyonik, iyonik, seçici olmayan ve dopamin taşıyıcı bağımlı kanalları incelemek için patch clamp teknikleri kullanılır.Hücrenin küçük boyutu nedeniyle, cam pipetlerin uçları küçük olmalı ve artan giriş direncini dengelemek için geniş bir koni yapısına sahip olmalıdır. Ayrıca, hücreye zarar verebilen vakum yoluyla tüm hücre erişimi sağlamak yerine, pipet ucunun altındaki membran yamasına yüksek voltajlı bir impuls uygulamakla daha büyük başarı elde edilir. Bu şekilde, voltaj kapılı kalsiyum kanallarının rolünü incelemek için, kalsiyum varlığında veya yokluğunda kalsiyum görüntüleme amacıyla chameleon YC 2.12 eksprese eden dokunma nöronlarını permeabilize etmek ve kalibre etmek için ION 4 kullanılır.Ek olarak, dokunma nöronlarındaki ortalama serbest kalsiyum konsantrasyonunun 200 nanomolar olduğu belirlenmiştir. Bu videoyu izledikten sonra, vitro ortamda embriyonik hücrelerin nasıl izole edileceği ve kültüre edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız.

a-method-for-culturing-embryonic-c-elegans-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Tüm embriyo kültürü tekniği kültür fare ve sıçan embriyolar için bize izin...

Rotator-tipi Şişe Kültür Sistemi kullanılarak Kemirgen Tüm Embriyo Kültürü Yöntemi

Kavşaklarda bulunan kümelenmiş nörotransmitter reseptörlerinin bolluğu güçlü sinaptik gücü etkiler. Bu yöntem tek-sinaps çözünürlükte üç boyutlu olarak floresan etiketli nörotransmitter reseptörleri...

Içinde Synaptic florasan Otomatik Sayısallaştırma<em&gt; C. elegans</em

Bu videoda, embriyonik C. elegans hücrelerinin in vitro olarak izole edilmesi ve steril olarak kültürlenmesi için bir yöntem tanıtılmaktadır.

Enzimatik Sindirim ve Elle Ayrışma: C. elegans Embriyolarını Hücre Kültürüne Hazırlamak İçin Bir Yöntem

Bu protokol, görüntüye Caenorhabditis elegans embriyolarında bir doku içinde bölünen hücreleri açıklamaktadır. Birkaç protokoller embriyonun erken görüntü hücre bölünmesi için, bu protokol nasıl mid geç embriyonik dönemde gelişmekte olan bir doku içinde hücre bölünmesi görüntü açıklar nasıl tarif ederken.

Sırasında Neuroblast Sitokinez görselleştirme<em&gt; C. elegans</em&gt; Embriyo

C. elegans genellikle katı agar plakaları üzerinde büyütülmüş ve sıvı kültürlerde E ile tohumlanır coli. Toksikolojik ve beslenme çalışmaları karıştırıcı bakteriyel yan ürünleri önlemek için, biz aşağı bir uygulama yelpazesi için solucanlar çok sayıda büyümeye ve senkronize etmek için, bir aksenik sıvı ortam, CeHR kullanılmaktadır.

Kültürleme Caenorhabditis elegans Mikroparçacık bombardımanı ile aksenik Sıvı Medya ve Transgenik Worms Yaratılış

Burada, nematod Caenorhabditis elegans'ın embriyonik uzamasının erken ve geç aşamalarında meydana gelen morfojenik kusurları izlemek için özel olarak tasarlanmış protokolleri detaylandırıyoruz. Sonuç olarak, bu protokoller, bu fazları düzenleyen genleri tanımlamak ve embriyonun antero-arka ekseni boyunca diferansiyel gereksinimlerini karakterize etmek için tasarlanmıştır.

Roman Metrik Nematodu Embriyonik Uzama karakterize etmek<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Burada, nörogelişme sırasında tek hücreli dinamikleri anlamak için C. elegans embriyoları yaşayan yüksek çözünürlüklü mikroskobik, Hesaplamalı araçlar ve tek hücreli etiketleme kullanarak bir Kombinatoryal yaklaşım sunuyoruz.

İzotropik hafif levha mikroskobu ve otomatik hücre Lineage analizleri kataloğa Caenorhabditis elegans Embriyogenesis Subcellular çözünürlük ile

Bu çalışma, embriyogenezin 80-100 C.'de eşzamanlı 3Boyutlu hızlandırılmış görüntülemesine olanak tanıyan yarı-yüksek iş letme protokolünü açıklamaktadır. Ayrıca, veri çözümlemesi kolaylaştırmak için görüntü işleme ve görselleştirme araçları dahildir. Bu yöntemlerin özel muhabir suşları ile birleşimi embriyogenezin ayrıntılı olarak izlenmesini sağlar.

C. elegans Embriyonik Gelişimi Analiz Etmek Için Yarı-yüksek-throughput Görüntüleme Yöntemi ve Veri Görselleştirme Araç Seti

Protokol, 36 saate kadar sürekli bir gıda arzı varlığında C. elegans yetiştirmek için kullanılan basit bir mikroakışkan çip tasarımını ve mikrofabrikasyon metodolojisini açıklamaktadır. Büyüme ve görüntüleme cihazı ayrıca, birkaç gün boyunca geliştirme sırasında hücresel ve hücre altı süreçlerin aralıklı uzun süreli yüksek çözünürlüklü görüntülenmesini sağlar.

Caenorhabditis elegans'ın Uzun Süreli Büyümesi ve Görüntülenmesi için Basit Bir Mikroakışkan Çip

Burada, yaşam boyu fizyolojik parametre takibi ve floresan ölçümü için katı ortam üzerinde izole edilmiş bireysel nematodların kültürlenmesine yönelik bir protokol sunuyoruz. Bu kültür sistemi, hayvanların kaçmasını önlemek için tek solucan kuyularının etrafında bir palmitik asit bariyeri içerir ve patojenik bakteriler ve kimyasal stresörler de dahil olmak üzere önleyici müdahalelerin kullanılmasına izin verir.

Uzunlamasına floresan izleme ve aversif müdahaleler için katı ortam üzerinde bireysel caenorhabditis elegans'ın uzun süreli kültürü

Öğrenin C. elegans embriyonik hücrelerini kitinaz ve manuel dissosiasyon kullanarak kültürleme yöntemini. Bu protokol hücre farklılaşması ve gen ekspresyonu çalışmaları için güvenilir bir model sunar.

Kültürleme Embriyonik için bir yöntem

Daha fazla video keşfet