Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çeşitli reaktif oksijen türlerini veya ROS'u ve bunların lokalizasyonunu izlemek için kolay ve çok yönlü bir çözüm sağlamak ve ROS ile ilgili hücresel mekanizmalar hakkında daha fazla bilgi sağlamaktır. Bu, ilki RST yeşil veya OB G kaplı boncuklar ve canlı mikroskopi, ob g floresein ve Alexa kullanan üç farklı test gerçekleştirilerek elde edilir. Fluor 594, BSA aracılığıyla üç mikron sica boncukların yüzeyine kovalent olarak bağlanır.

OBG floreseinden gelen floresan emisyonu, ROS tarafından oksidasyonu gösterirken, Alexa Fluor 594'ten gelen sinyal, boncukların lokalizasyonuna yardımcı olur ve floresan miktar tayini için bir kontrol görevi görür. İkinci yöntem, plaka okuyucu bazlı bir tahlilde süperokside duyarlı prob dihidro etidyum veya DHE'yi kullanır. Süperoksit tarafından oksidasyonun bir sonucu olarak, etidyum nükleer ve mitokondriyal DNA'ya interkalasyon yapabilir ve sırasıyla 522 nanometre ve 605 nanometrede uyarma ve emisyon zirvelerini kaydırır.

AUM'un floresan yoğunluğu, hücrelerde hücre içi süperoksit oluşumunun kantitatif ölçümüne izin veren süperoksit üretim miktarına karşılık gelir. Üçüncü yöntem de plaka okuyucu bazlı bir testtir. Hücre dışı hidrojen peroksit üretimini kantitatif olarak ölçmek için hidrojen peroksite duyarlı prob plex ultra red veya bir UR kullanılır.

Bir UR OX'un floresan yoğunluğu, hücrelerin dışında üretilen hidrojen peroksit miktarına karşılık gelir. O-B-G-D-H-E ve UR tahlillerine dayalı olarak dinamik ROS üretiminin lokalizasyonunu gösteren sonuçlar elde edilmiştir. Bu tekniğin, plaka hızına dayalı OB GSA'lar gibi diğer mevcut yöntemlere göre en büyük avantajı, Al Roth neslini tek hücre düzeyinde dinamik olarak görselleştirmesidir.

Bir hücre popülasyonundan gelen yansıtma ve ortalama Roth sinyali yerine. Bu tür popülasyon ortalaması yöntemleri, senkron olmayan fagositoz nedeniyle kritik bilgileri gizleme eğilimindedir. Oksi, Burt Green veya OBG ile boncuk kodlama prosedürüne başlamak için, 1.5 mililitrelik bir tüpe 3.0 mikron karboksilatlı silika boncuk süspansiyonundan bir mililitre ekleyin.

Tüpü hızlı bir şekilde döndürün, süpernatanı çıkarın. Bir mililitre PBS ekleyin ve bu şekilde girdap yapın. Boncukları PBS ile üç kez yıkayın.

Üçüncü yıkamadan sonra, süpernatanı çıkarın ve boncukları tekrar askıya alın. Mililitre siyanür başına 25 miligram içeren bir mililitre PBS'de, siyanür çözeltisi kullanımdan önce her seferinde taze olarak hazırlanmalı, bir tekerlek üzerinde 15 dakika inkübe edilmelidir. Bu, 15 dakika sonra önceden etiketlenmiş BSA'yı kovalent olarak bağlamak için karboksilatlı silika boncukları aktive edecek, tüpü santrifüjleyecek, süpernatanı çıkaracaktır.

Bir mililitre kuplaj tamponu ekleyin ve fazla siyanürü çıkarmak için hızlı bir sıkma ve girdap ile kuplaj tamponu ile üç kez girdap yıkayın, yıkanmış boncukları bir miligram OBGH iki H-F-F-B-S-A içeren 500 mikrolitre kuplaj tamponu ile karıştırın ve ardından tüpü standart bir gaz kutusundan nitrojen gazı ile doldurun. Ertesi gün karanlıkta oda sıcaklığında 14 saat boyunca bir tekerlek üzerinde inkübe edilen tüpü kapattıktan sonra, boncukları bir mililitre söndürme tamponu ile hızlı bir sıkma ve girdaplama ile iki kez yıkayarak reaktif olmayan OBG'yi söndürün, ardından söndürme tamponunu çıkarmak için kuplaj tamponu ile iki kez yıkayın. Süpernatantın çıkarılmasından sonra, BSA'ya konjuge etmek için 50 mikrogram LOR 594 cin bir orta ester içeren bir mililitre birleştirme tamponu ekleyin.

Tüpü nitrojen kapağı ile doldurun ve karanlıkta oda sıcaklığında 1,5 saat boyunca bir tekerlek üzerinde inkübe edin. 1.5 saatlik inkübasyonun sonunda, boncukları bir mililitre söndürme tamponu ile üç kez yıkayarak reaksiyonu durdurun. Bunu, boncukların bir mililitre PBS ile üç kez yıkanması takip eder.

Son olarak, Ray, boncukları hacim başına% 10 ağırlığında iki mikrolitre ile bir mililitre PBS'de askıya alın. Uzun süreli depolama için azid. Süspansiyondaki boncukların konsantrasyonunu bir hemo sitometre ile ölçün, tipik olarak mililitre başına bir ila iki kez 10 ila dokuzuncu boncuktur.

Tüpü nitrojen kapağı ile doldurun ve karanlıkta dört santigrat derece saklayın. Bu prosedüre, 10 santimetrelik bir Petri kabı plakasından katlanarak büyüyen alium hücrelerini hasat ederek başlayın. Optik olarak şeffaf plastik veya cam tabanlı üç santimetrelik tabaklar üzerinde farklı yoğunluklarda hücreler ve ertesi sabah gece boyunca büyütün.

Deneyde kullanılmak üzere yaklaşık% 80 birleşik olan yemekleri seçin. Kültür ortamını düşük akışlı veya LF ortamı ile değiştirin ve HL beş C kültür ortamının hücre dışı ve endozomal içi otofloresansını azaltmak için deneyden önce iki saat inkübe edin. LF ortamında 10 mililitre% 1.5 BDO agarı eritin ve yaklaşık bir milimetre kalınlığında bir agar tabakası oluşturmak için agarı düz bir yüzeye dökün.

Agarın katılaşması için 10 ila 15 dakika bekleyin. Agar tabakasını ikiye iki santimetre kareler halinde kesin ve daha sonra kullanmak üzere LF ortamına yerleştirin. Kullanmak. Geniş alan mikroskobunu onarın.

Çevre odasının sıcaklığını 22 santigrat dereceye ayarlayın ve deney için gerekli ayarları yapın. İki saatlik inkübasyondan sonra, LF ortamını üç santimetrelik çanaktan aspire edin, ancak hücre tek tabakasını ince bir orta tabakası ile kaplanmış halde bırakın. Önceden hazırlanmış OBG kaplı boncukları mililitrede 1.5 kez 10 ila yedinci boncuklara seyreltin ve hücre tabakasına 10 mikrolitre ekleyin.

Bir kare agar tabakası alın ve fazla sıvıyı boşaltın, ancak agarı ıslak tutun. Agar karesini yavaşça hücre tabakasının üzerine koyun. Agar kaplaması, boncuklar ve hücreler arasındaki teması arttırır, böylece alımı iyileştirir.

Ayrıca hücreleri hafifçe sıkıştırır ve onları hedefin odak düzleminde daha iyi tutar. Deneyin başarısı için kapağı tabağın üzerine yerleştirin. AGA kaplamasını hücreleri kaplarken hareket ettirmeyin ve ayrıca görüntüleme adımını hemen başlatmak çok önemlidir.

Ardından, çanağı mikroskop tablasına yerleştirin ve iki saat veya daha uzun süre boyunca her dakika kırmızı, yeşil ve faz kanallarında otomatik olarak fotoğraf çekin. ROS üretimini ölçmek için, tüm fagositoz sürecini içeren hücresel olayları seçin ve bunlara odaklanın. Profesyonel görüntü işleme yazılımı kullanarak, optimize edilmiş üç kanalı birleştirin ve resimleri bir filmde birleştirin.

Kırmızı ve yeşil kanallarda seçilen boncukların her birinin floresan yoğunluklarını ölçün. Kırmızının yeşile oranı, hücrelerin dinamik FOMO R os üretimini yansıtacaktır. Önce hücre içi süperoksit üretimini ölçmek için, 10 mililitre HL beş C ortamında, sonraki santrifüj alium hücrelerinde beş dakika boyunca 850 kez G'de% 180 birleşik alium tabağı toplayın ve SS 6.4 tampon sayım hücrelerinde orta reçine yeniden süspansiyon hücrelerini dikkatlice ve tamamen aspire edin ve mililitre başına altı hücre ila altı kez 10 nihai yoğunluğa seyreltin.

Beyaz, şeffaf olmayan 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 50 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin, SS 6.4 tamponu ile 500 kat seyreltik dihidro etidyum veya DHE stoğu. Ardından, 50 oyuklu plakanın her bir oyuğuna 96 mikrolitre seyreltilmiş DHE dağıtmak için çok kanallı bir pipet kullanın. DHE'nin son konsantrasyonu 30 mikromolardır.

Reaksiyon hemen başlayacaktır. Uyaranlar veya inhibitörler bu noktada veya belirli ihtiyaçlara göre başka zaman noktalarında eklenebilir. Hücreleri 22 santigrat derecede orta çalkalama ile inkübe edin.

Bir saat boyunca her iki dakikada bir floresan mikroplaka okuyucu ile floresan okuyun. 522 nanometrede floresan uyarımı ve 605 nanometrede emisyon ile uç nokta üst okuma modunu kullanın. Bu prosedüre, önceki segmentte gösterildiği gibi dium hücreli 96 oyuklu bir plaka hazırlayarak başlayın.

10 mililitre SS 6.4 tamponuna beş mikrolitre HRP stoğu ekleyerek seyreltilmiş at turpu peroksidaz veya HRP hazırlayın. İyice karıştırmak ve buz üzerinde tutmak için tüpü ters çevirin. Seyreltilmiş HRP çözeltisi mililitre başına 0.05 birimdir.

Bir UR stoğu ve seyreltilmiş HRP çözeltisini SS 6.4 tamponuna 6.25'lik nihai konsantrasyonlara kadar karıştırarak plex ultra kırmızı veya bir UR reaksiyon karışımını hazırlayın. Mikromolar a UR ve mililitre başına 0.005 birim. HRP, her kuyucuğa 50 mikrolitre bir UR karışımı ekleyin.

Reaksiyon hemen başlayacaktır. Uyaranlar veya inhibitörler bu noktada veya belirli ihtiyaçlara göre başka zaman noktalarında eklenebilir. Hücreleri 22 santigrat derecede orta çalkalama ile inkübe edin.

Bir saat boyunca her iki dakikada bir floresan mikroplaka okuyucu ile floresan okuyun. 530 nanometrede floresan uyarımı ve 590 nanometrede emisyon ile uç nokta üst okuma modunu kullanın. OB g floreseinin kaplama verimliliği, kaplanmış boncukları in vitro olarak oksitlemek için hidrojen peroksit ve HRP kullanılarak ve 500 nanometrede uyarma kullanılarak emisyon spektrumunu kontrol ederek test edilir.

Bu grafikte gösterildiği gibi, oksitlenmiş boncuklar, en az 11 ila 12 kat yoğunluk oranına sahip oksitlenmemiş boncuklara kıyasla 538 nanometrede önemli bir emisyon zirvesi gösterir. Dium hücrelerindeki fagozomlarda ROS oluşumu, yükselmeden sonraki ilk dakika boyunca altı x büyütme kullanılarak 40 dakika boyunca kaydedilen bu temsili hızlandırılmış filmde gösterildiği gibi mikroskopi ile kalitatif ve dinamik olarak görselleştirilebilir. Fagositoz ile, OBG floresan kaplı boncukların floresansı kırmızıdan parlak turuncuya değişti, bu da ROS'un muhtemelen doğrudan fagozomların içinde üretildiğini gösteriyor.

Hücre içi süperoksit ve hücre dışı hidrojen peroksit üretimi, sırasıyla DHE ve bir UR tahlilleri ile kantitatif olarak ölçülür. Bu iki tahlil ile ilgili biyokimyasal reaksiyonların bir özeti gösterilmiştir. Süperoksit, süperoksit dismutaz veya SOD ile hidrojen peroksite dönüştürülür ve hidrojen peroksit, DHE testinde katalaz ile su ve oksijene dönüştürülür.

Hücre içi süperoksitin orta verimli kantitatif ölçümü için bir mikroplaka okuyucu kullanılır. Temsili bir deney, e coli'den LPSA lipopolisakkarit ile uyarıldığında, AX iki hücreden dinamik süperoksit üretiminin, uyarılmamış AX iki hücreden bazal seviyeden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ve tampondaki reaksiyonun arka planının, mavi floresanın azalması ve kırmızı floresan artışının ters orantılı olduğunu göstermektedir. Beklendiği gibi.

DHE testi ile ölçülen R os üretiminin lokalizasyonu aşağıdaki sonuçlarla doğrulanmıştır. D-E-D-T-C-A membran permean süperoksit dismutaz inhibitörünün ilave ilavesi, DHE sinyalini doza bağlı bir şekilde arttırdı ve bu da D-E-D-T-C'nin süperoksit dismutaz substratının birikmesine neden olduğunu gösterdi. Alternatif olarak, bir membran IMP hidrojen peroksit söndürücünün eklenmesi, A UR testinde süperoksit üretimini etkilemedi.

Hücre dışı hidrojen peroksit üretiminin orta verimli kantitatif ölçümü için bir mikroplaka okuyucu kullanılır. Temsili bir deney, LPS ile uyarıldığında, AX iki hücreden dinamik hidrojen peroksit üretiminin, uyarılmamış AX iki hücreden gelen bazal seviyeden önemli ölçüde daha yüksek olduğunu ve çeşitli konsantrasyonlarda D-E-D-T-C veya katalaz ile muamele edildiğinde arka plan reaksiyonunun, A UR sinyali, sırasıyla hücre içi süperoksitten hidrojen peroksit üretiminin inhibisyonu ve hücre dışı hidrojen peroksitin tükenmesi nedeniyle doza bağlı bir şekilde azalır. D-E-D-T-C ve katalaz ile yapılan tedaviler, DHE ve UR tahlillerinin, bu prosedürü takiben ROS Indicum'un farklı tiplerini ve hücre altı lokalizasyonlarını spesifik olarak ölçtüğünü açıkça doğruladı.

Patojenik veya patojenik olmayan bakterilerle enfeksiyon sırasında Ross neslinin yansıtılması gibi diğer yöntemler, Dictal stallion'un kayıp oluşumu açısından farklı bakteri enfeksiyonuna nasıl yanıt vereceği gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Ve mikrobakteri marum gibi patojenik bakterilerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun BSL iki önlem gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.