Name: Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-05T18:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 41 s
Description: Öğrenin, amip hücrelerinde reaktif oksijen türlerinin canlı mikroskopi ve floresan problarıyla nicel ve nitel analizini. Bu yöntemler oksidatif stres araştırmalarında hücresel mekanizmaları anlamaya yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Biz yardım ve bu protokolleri kurmak tavsiye Dr Karl-Heinz Krause ve Vincent JAQUET müteşekkiriz, ve aynı zamanda teknik destek için NCCR bir Biyogörüntüleme Platformu ve Dr Navin Gopaldass Christoph Bauer ve Jérôme BOSSET teşekkür ederim. Araştırma İsviçre Ulusal Bilim Vakfı bir ProDoc hibe ile desteklenmektedir.

1.. Görselleştirme ve Phagosomes ROS Üretim Niteliksel Ölçümü OBG-kaplı boncuklar önceden hazırlanmış olmalıdır. Boncuk kaplama prosedürleri ve ağar bindirme tekniği yayınlanmış kaynaklardan 5,14 uyarlanmıştır. <ol><li> Bir 1.5 ml tüp içine 3,0 um karboksillenmiş silis boncuklar (yaklaşık 1.8 x 10 9 boncuk) 1 ml süspansiyonu ekleyin, taneler hızlı bir dönüş ve vorteks ile 1 ml PBS ile 3 kez yıkayın. </li><li> 25 mg / ml siyanamit (BSA prelabeled kovalent bağlamak için karboksillenmiş silis boncuklar aktif hale getirmek için) ihtiva eden 1 ml PBS içinde yeniden süspanse boncuklar, 15 dakika boyunca bir tekerlek üzerinde inkübe edilir. </li><li> Birleştirme 1 ml tampon ile yıkayın 3x hızlı bir dönüş ile (0,1 M sodyum-borat, pH 8.0) (alternatif olarak 5 saniye boyunca masa üstü bir santrifüj içerisinde küçük tam hızda santrifüj ya da bir masa üstü santrifüjü içinde 1 dakika boyunca 2000 x g&#39;de santrifüj) ve fazla siyanamid çıkarmak için karıştırın. </li><li> C 500 ul ile yıkandı, boncuk karıştırınOxyBurst Green (OBG) H2HFF (dihidro-2 &#39;, 4,5,6,7,7&#39;-hexafluorofluorescein)-BSA 1 mg içeren tampon oupling, standart kapatma önce gaz-can nitrojen gazı ile tüp doldurmak ve karanlıkta, oda sıcaklığında 14 saat boyunca (gece boyunca) bir tekerlek üzerinde inkübe edilir. </li><li> Boncuklar (PBS içerisinde 250 mM glisin) hızlı bir dönüş ve vorteks ile söndürme tampon kaldırmak için bağlantı tamponu ile iki kez reaksiyona girmemiş obg kaldırmak ve su verme için tampon 1 ml 2x yıkayın. </li><li> BSA&#39;ya konjuge Alexa Fluor 594 süksinimidil ester, 50 ug içeren bağlama tamponu 1 ml ilave edilir. Kapatma önce azot ile tüp doldurun ve karanlıkta, oda sıcaklığında 1.5 saat için bir tekerlek üzerinde inkübe edilir. </li><li> Boncuklar hızlı bir dönüş ve vorteks ile 1 ml PBS ile 3 kez yıkanmış, daha sonra, taneler hızlı bir dönüş ve reaksiyonu durdurmak için girdaplanır tampon söndürülmesi, 1 ml ile 3 kez yıkayın. </li><li> Son olarak, uzun süreli depolama için v azit / ağ% 10 2 ul PBS içinde 1 ml boncuk tekrar süspansiyon. Concentratio ölçünBir hemasitometre (genellikle yaklaşık 1-2 x 10 9 boncuk / ml) ile süspansiyon içinde boncuk n, daha önce azot ile kapatma tüpü doldurmak ve karanlıkta 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li> OBG fluoresein kaplama etkinliği, 500 nm&#39;de uyarma kullanılarak emisyon spektrumunu kontrol ile test edilebilir. Yaban turpu peroksidaz (HRP) mevcudiyetinde, H2O 2 yükseltgenmiştir olduğunda, emisyon tepe (538 nm) oksitlenmiş boncuk floresans yoğunluğu, nonoxidized kaplanmış boncuklar daha 11-12x daha yüksektir. </li><li> Hasat katlanarak optik şeffaf plastik veya cam alt ile 3 cm yemekleri hücrelerin farklı yoğunlukları plaka ve gecede onları büyümek, 10 cm Petri kabı Diktiyostelyum hücreleri büyüyor. Deney için yaklaşık% 80 konfluent olan tabakları seçin. Dictyostelium hücrelerin yetiştirilmesi için detaylı bir protokol 15 yayınlanmıştır. </li><li> Loflo ortamında (LF ortamı) ile kültür ortamı yerine inkübasyonaHL5C kültür ortamının hücre dışı ve intraendosomal otoflüoresanı azaltmak amacıyla, deneyden önce 2 hr. </li><li> Buna paralel olarak, 10-15 bekle, yaklaşık 1 mm kalınlığında bir agar tabakasının oluşturulması için düz bir yüzey (10 cm x 10 cm, yani, bir cam plaka) üzerine dökün agar, LF ortam içinde, 10 ml% 1.5 Bacto agar eriyik dk katılaşmaya. Daha sonra kullanmak için LF ortamda 2 cm x 2 cm kareler ve yeri içine agar tabakası kesti. </li><li> Bu arada, iplik-diski veya geniş alan mikroskobu hazırlamak 22 ° C çevre odasının sıcaklığını ayarlamak ve bu deney için ayarları yapın. (Tartışma ek açıklamalara bakınız). </li><li> Kuluçkadan 2 saat sonra, 3 cm çanak LF ortam aspire, ancak hücre ortamı hala tek tabaka ince bir film tabakası ile kaplanmış olmalıdır. 1.5 x 10 7 boncuk / ml &#39;ye seyreltilir kaplı boncuklar ve hücre tabakası üzerine 10 ul ekle. </li><li> Bir kare ağar levha alın, aşırı sıvı drenaj ama ıslak tutun. Yavaşça inci koymakHücre tabakanın üstünde e agar kare. Bu hücreleri üzerinde yatarken ağar kare hareket ettirmeyin. Agar kalıbı böylece alımını arttırır, boncuk ve hücreler arasındaki teması geliştirmek için kullanılabilir ve aynı zamanda hafifçe amaç odak düzleminde daha tutarak, hücreleri sıkıştırmaktadır. </li><li> , Yemeğin üzerine kapağını yerleştirin mikroskop sahne üzerine yerleştirin ve otomatik olarak, kırmızı, yeşil ve faz kanallarda fotoğraf çekmek 2 saat ya da daha uzun süre her 1 dk. </li><li> Seçin ve fagositoz tüm süreci içeren hücresel olaylara odaklanır. Optimize 3 kanal Birleştirme ve profesyonel görüntü işleme yazılımı kullanarak bir film haline resimleri bir araya. Kırmızı ve yeşil kanallarda seçilen her boncuk floresan yoğunluğu ölçmek ve yeşil / kırmızı oranı, hücrelerin dinamik phagosomal ROS üretimini yansıtır. </li></ol> 2. Hücre içi süperoksit Üretim Kantitatif ve Orta-verimlilik ölçümü <ol><li> O toplayınne% 80 konfluent HL5C ortamı 10 ml Dictyostelium&#39;un tabak. 5 dakika dikkatlice ve tamamen aspire aşırı ortam için 850 xg santrifüj Diktiyostelyum hücreleri. SS6.4 tampon maddesi içinde yeniden süspanse hücreleri [Sorensen tamponda 0.12 M sorbitol (14,69 mM KH 2 PO 4 ve 6.27 mM Na 2 HPO 4), pH 6.4], hücrelerin sayısı ve 6 x 10 6 hücre / ml &#39;lik bir son yoğunluğa seyreltilmiş (tartışma ek yorumlara bakınız). </li><li> (Tartışmada ek açıklama bakınız), saydam olmayan, beyaz bir 96 yuvalı plakanın her oyuğuna hücre süspansiyonu, 50 ul ekle. </li><li> Gerekirse her bir çok kanallı pipet kullanarak içine DHE stokları (DMSO içinde 30 mM) ile seyreltildi DHE SS6.4, pipet 50 ul ile 500 kat seyreltilir. DHE nihai konsantrasyonu, 30 uM&#39;dir. Reaksiyon hemen başlar. </li><li> Uyarılar veya inhibitörleri özel ihtiyaçlarına göre bu noktada ilave ya da başka bir zaman noktalarında edilebilir. </li><li> Son nokta &quot;üst okuma &amp; # kullanın34, 522 nm/605 nm fluoresans uyarım / emisyon ile bir floresan mikroplaka okuyucu, şekli, 22 ° C&#39;de, 1 saat, orta çalkalama 5 saniye / dakika boyunca her 2 dakikada bir okuma </li></ol> 3. Kantitatif ve hücre dışı Yüksek Verimli Ölçüm H 2 O 2 Üretimi <ol><li> 2.1 ve 2.2 &#39;de açıklandığı gibi aynı adımları izleyin. </li><li> SS6.4, girdap 10 ml HRP stoklar 5 ul (damıtılmış su içinde 100 U / ml) eklenerek seyreltilmiş HRP hazırlayın ya da iyice karıştırın ve daha sonraki kullanım için buz üzerinde tutmak için tüp ters. Seyreltilmiş HRP solüsyonu 0,05 U / ml &#39;de olduğu. </li><li> Sırasıyla AUR stok (DMSO içinde 10 mM AUR) ve 6.25 uM nihai konsantrasyonlara SS6.4 tampon seyreltilmiş HRP solüsyonu ve 0.005 U / ml karıştırılarak AUR tepkime karışım hazırlayın. Bir örnek olarak, 40 reaksiyonlar için reaksiyon karışımı hazırlamak için seyreltilmiş HRP 400 ul ve AUR stok çözeltisi 2.5 ul SS6.4 1600 ul karıştırın. </li><li> AUR karışımı 50 ul ekleGerekirse her zamanda bir çok kanallı pipet kullanarak içine Ture. Şimdi reaksiyon başlar. </li><li> Uyarılar veya inhibitörleri özel ihtiyaçlarına göre bu noktada ilave ya da başka bir zaman noktalarında edilebilir. </li><li> 530 nm/590 nm&#39;de floresan uyarma / emisyon ile bir floresan mikro plaka okuyucu bitiş noktası &quot;üst okuma&quot; modunu kullanın, 22 ° C&#39;de, 1 saat, orta sallamak 5 sn / dk boyunca her 2 dakikada okumak </li></ol>

<ol><li>Bedard, K., Krause, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+NOX+family+of+ROS-generating+NADPH+oxidases%3A+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">The NOX family of ROS-generating NADPH oxidases: physiology and pathophysiology.</a> Physiol. Rev. 87, 245-313 (2007).</li>
<li>West, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR+signalling+augments+macrophage+bactericidal+activity+through+mitochondrial+ROS%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS.</a> Nature. 472, 476-480 (2011).</li>
<li>Fey, P., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Franke, J., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+and+the+Dicty+Stock+Center%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">dictyBase and the Dicty Stock Center.</a> Methods Mol. Biol. 346, 51-74 (2006).</li>
<li>Basu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((dictyBase+2013%3A+integrating+multiple+Dictyostelid+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">dictyBase 2013: integrating multiple Dictyostelid species.</a> Nucleic Acids Res. 41, 676-683 (2013).</li>
<li>VanderVen, B. C., Yates, R. M., Russell, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intraphagosomal+measurement+of+the+magnitude+and+duration+of+the+oxidative+burst%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Intraphagosomal measurement of the magnitude and duration of the oxidative burst.</a> Traffic. 10, 372-378 (2009).</li>
<li>Cohn, C. A., Simon, S. R., Schoonen, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+fluorescence-based+techniques+for+the+quantification+of+particle-induced+hydroxyl+radicals%5BTitle%5D)+AND+%22Part.+Fibre+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Comparison of fluorescence-based techniques for the quantification of particle-induced hydroxyl radicals.</a> Part. Fibre Toxicol. 5, 2(2008).</li>
<li>Snyrychova, I., Ayaydin, F., Hideg, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+hydrogen+peroxide+in+leaves+in+vivo+-+a+comparison+of+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol.+Plant%22%5BJournal%5D)">Detecting hydrogen peroxide in leaves in vivo - a comparison of methods.</a> Physiol. Plant. 135, 1-18 (2009).</li>
<li>Rodrigues, J. V., Gomes, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+superoxide+and+hydrogen+peroxide+detection+in+biological+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Enhanced superoxide and hydrogen peroxide detection in biological assays.</a> Free Radic. Biol. Med. 49, 61-66 (2010).</li>
<li>Chen, J., Rogers, S. C., Kavdia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Kinetics+of+Dihydroethidium+Fluorescence+with+Superoxide+Using+Xanthine+Oxidase+and+Hypoxanthine+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Biomed.+Eng%22%5BJournal%5D)">Analysis of Kinetics of Dihydroethidium Fluorescence with Superoxide Using Xanthine Oxidase and Hypoxanthine Assay.</a> Ann. Biomed. Eng. , (2012).</li>
<li>Lee, C. W., Chen, Y. C., Ostafin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accuracy+of+Amplex+Red+assay+for+hydrogen+peroxide+in+the+presence+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomed.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">The accuracy of Amplex Red assay for hydrogen peroxide in the presence of nanoparticles.</a> J. Biomed. Nanotechnol. 5, 477-485 (2009).</li>
<li>Guimaraes-Ferreira, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-term+creatine+supplementation+decreases+reactive+oxygen+species+content+with+no+changes+in+expression+and+activity+of+antioxidant+enzymes+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Appl.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Short-term creatine supplementation decreases reactive oxygen species content with no changes in expression and activity of antioxidant enzymes in skeletal muscle.</a> Eur. J. Appl. Physiol. 112, 3905-3911 (2012).</li>
<li>Peng, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione+peroxidase+7+protects+against+oxidative+DNA+damage+in+oesophageal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Gut%22%5BJournal%5D)">Glutathione peroxidase 7 protects against oxidative DNA damage in oesophageal cells.</a> Gut. 61, 1250-1260 (2012).</li>
<li>Walk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipopolysaccharide+enhances+bactericidal+activity+in+Dictyostelium+discoideum+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Comp.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipopolysaccharide enhances bactericidal activity in Dictyostelium discoideum cells.</a> Dev. Comp. Immunol. 35, 850-856 (2011).</li>
<li>Fukui, Y., Yumura, S., Yumura, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar-overlay+immunofluorescence%3A+high-resolution+studies+of+cytoskeletal+components+and+their+changes+during+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Agar-overlay immunofluorescence: high-resolution studies of cytoskeletal components and their changes during chemotaxis.</a> Methods Cell Biol. 28, 347-356 (1987).</li>
<li>Fey, P., Kowal, A. S., Gaudet, P., Pilcher, K. E., Chisholm, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+growth+and+development+of+Dictyostelium+discoideum%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocols for growth and development of Dictyostelium discoideum.</a> Nat. Protoc. 2, 1307-1316 (2007).</li>
<li>Bloomfield, G., Pears, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Superoxide+signalling+required+for+multicellular+development+of+Dictyostelium%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium.</a> J. Cell. Sci. 116, 3387-3397 (2003).</li>
<li>Dieckmann, R., Gopaldass, N., Escalera, C., Soldati, T. Autophagosomes and Phagosomes. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDieckmann%2C+R+%22Methods+in+Molecular+Biology%22">Methods in Molecular Biology</a>. Deretic, V. 445, Humana Press. Totowa, NJ. 317-328 (2008).</li>
<li>Amir, Y., Edward, O. -A., Utpal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+in+vivo+detection+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Proto.+Exch%22%5BJournal%5D)">A protocol for in vivo detection of reactive oxygen species.</a> Proto. Exch. , (2008).</li>
<li>Neuhaus, E. M., Soldati, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+myosin+I+is+involved+in+membrane+recycling+from+early+endosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A myosin I is involved in membrane recycling from early endosomes.</a> J. Cell Biol. 150, 1013-1026 (2000).</li>
</ol>

Çıkar çatışması ilan etti.

Daha önce anlatılan yöntemler ile karşılaştırıldığında, deney OBG dinamik yerine hücre popülasyonundan bir ortalama ROS ölçüm sinyalinin, tek hücre düzeyinde phagosomal ROS üretim süreci görüntüler. Bu tür nüfus ortalama yöntemleri nonsynchronous fagositozu nedeniyle kritik bilgilerini gizlemek için eğilimindedir. Biz başarıyla Dictyostelium&#39;un için DHE&#39;nin ve AUR tahlilleri uyarlanmış ve protokolleri optimize. En önemlisi, biz bu iki deneylerle ölçülen türleri ve ROS hücre içi lokalizasyonu belirtildi....

Reaktif oksijen türleri (ROS) bu tür bir ev sahibi savunma, sinyalizasyon, doku gelişimi ve yaralanmaya yanıt olarak, hipertansiyon ve kanser gibi biyolojik süreçlerin çeşitli katılmaktadırlar. Iyi çalışılmış phagosomal NADPH oksidaz makine nötrofillerin phagosomes 1 yutulur bakterileri öldürmek için, oksidatif patlama olarak bilinen hızlı ROS üretimi, adamıştır. Buna ek olarak, mitokondriyal solunum zinciri, bir yan ürün olarak elektron kaçak önce sadece ROS düzensiz bir kaynak için sorumlu olduğu düşünülmektedir. Ancak, son zamanlarda, bu fare makrofaj 2 bakteri intraphagosomal öldürülmesine katkı önemli bir mekanizma olarak tespit edilmiştir. Son yıllarda, sosyal amip, Diktiyostelyum, doğuştan gelen bağışıklık yanıtının hücre içsel mekanizmaları incelemek için güçlü ve popüler bir model haline gelmiştir. Nitekim, Diktiyostelyum ve insan fagositlerdir Molecula içinde korunması bir şaşırtıcı derecede yüksek paylaşmakbakteriler, yutulmasına algılama ve 3,4 öldürmekten sorumlu r makine. Proteinler ve bu NADPH oksidazlar, katalazlar, süperoksit dismutazlar olarak ROS üretimi veya detoksifikasyon ile ilişkili enzimlerin homologları, insan ve Dictyostelium hem de bulunabilir. En iyi incelenmiş amip gibi, Dictyostelium memeli bir model sistem üzerinde birçok benzersiz avantajlar sağlar. Bunlar, 8-10 saat arasında bir ikiye katlanma süresi ile, CO2 için gerek kalmadan, oda sıcaklığında büyümesi. Kolaylıkla yapışkan ya da süspansiyon kültürleri olarak tutulabilir. Buna ek olarak, onların tam sıralı ve açıklamalı haploid genom için, kolay ve genetik manipülasyon sayesinde, Diktiyostelyum çok cazip bir deneysel model organizma olmuştur. Önceki çalışmalarda, ROS ile oksidasyon, sonra flüoresans yayarlar (toplu olarak OxyBurst Green, obg olarak da bilinir) çeşitli klorlu fluoresein ve türevleri, flüorlanmış bir ROS muhabir olarak kullanılmıştır. Hücre-permeant esthücre-geçirgen olmayan dekstran-veya protein-birleştirilmiş türevleri, hücre dışı ROS ölçmek için kullanılır ise erified türevleri sitoplazmik ROS ölçmek için kullanılır. Özellikle, OBG BSA ile kaplanmış boncuklar daha önce memeli hücrelerinde 5 phagosomal ROS üretimini tespit etmek için kullanılmıştır. Ancak, mikroplaka okuyucu-temelli yaklaşım sadece hücrelerin bir nüfus bir ortalama ROS nesil eğrisini verebilir. Mevcut protokol ile Diktiyostelyum, profesyonel phagocyte ve optimize edilmiş deney şartları kullanılarak, biz boncuklar üzerine herhangi opsonin conjugating olmadan istikrarlı ve verimli fagositozisi edinin. DHE ROS üretimi 6-9 tespit etmek için, memeli nötrofiller ve makrofajlar gibi çeşitli model sistemlerinde, kullanılmıştır. Bu arada, yöntem 8,10 özgüllüğü ve duyarlılığı üzerinde bazı tartışmalar vardır. Amplex Red, AUR ölçmek için daha uygundur, pH, daha az hassas olan bir floresan yoğunluğunun geliştirilmiş bir versiyonu olarakNonneutral ya da zayıf asidik çevrelerde ROS. AUR Geçenlerde birkaç memeli sistemlerinde 11,12 tatbik edilmiştir, ancak oldukça sık zayıf asidik büyüme ortamı gerektirir memeli olmayana modeller, kullanımı henüz rapor edilmemiştir. Buna ek olarak, nicel ve dinamik sosyal amip Diktiyostelyum ROS üretim ve yerelleştirme ölçmek için yayınlanmış protokol yoktur. Protokoller sunulan kümesinin amacı çeşitli ROS ve yerelleştirme izlemek için kolay ve çok yönlü bir çözüm sağlamak ve daha fazla ROS ile ilgili hücresel mekanizmaları içgörü vermektir. OBG deneyi için, Dictyostelium hücreler tarafından OBG-kaplı tanelerin alımından sonra phagosomal ROS kuşağın tüm süreç izlemek için canlı mikroskobu kullanılır ve bakteri öldürme intraphagosomal mekanizmasını incelemek için yeni bir yaklaşım sağlanmaktadır. Bu hücre içi superox ölçmek için, Dictyostelium &#39;da orta verim DHE ve AUR tahlilleri optimizegüçlü bir ROS uyarıcı olarak LPS ile sırasıyla ide ve hücre dışı H 2 O 2 üretimi,. Son zamanlarda LPS fagosite bakteriler 13 doğru Dictyostelium bakterisit aktivitesini artırdığı gösterilmiştir dikkat etmek gerekir. Buna ek olarak, DEDTC ve katalaz ile tedavi açıkça bu iki yöntem özellikle farklı türde ve Dictyostelium&#39;da ROS hücre içi lokalizasyonu ölçmek olduğunu doğruladı. Son olarak, OBG deneyi daha da hayvan hücrelerinin fagositik reseptörleri için ligandlar olan boncuk opsonizing ile, herhangi bir yapışkan fagositik bir hücre için adapte edilebilir. İlke olarak, DHE ve AUR deneyler ayrıca ince ayarlı uygun deneysel koşullar altında herhangi bir yapışkan ya da yapışkan olmayan hücre ölçümler için olabilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>OxyBURST Yeşil H2HFF BSA</td><td>Invitrogen</td><td>O-13291</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594</td><td>Invitrogen</td><td>A-20004</td><td></td></tr><tr><td>Karboksilatlı silika boncuklar</td><td>Kisker Biotech</td><td>PSi-3.0COOH</td><td></td></tr><tr><td>HL5C orta</td><td>ForMedium</td><td>HLC0102</td><td></td></tr><tr><td>LoFlo orta</td><td>ForMedium</td><td>LF1001</td><td></td></tr><tr><td>Bacto agar</td><td>BD</td><td>204010</td><td></td></tr><tr><td>Dihidroetidyum</td><td>Sigma</td><td>37291-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Amplex UltraRed</td><td>Invitrogen</td><td>A36006</td><td></td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz</td><td>Roche</td><td>10108090001</td><td></td></tr><tr><td>Dietilditiokarbamat (DEDTC)</td> <td>Sigma</td><td>D3506-100G</td><td></td></tr><tr><td>Katalaz</td><td>Sigma</td><td>C9322-1G</td><td></td></tr><tr><td>Siyanamid</td><td>Sigma</td><td>187364-25G</td><td></td></tr><tr><td>Lipopolisakkaritler</td><td>Sigma</td><td>L2630-25G</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENT</strong</td></tr><tr><td>>ibidi &mu;-Çanak 35 mm, yüksek</td><td>ibidi</td><td>81156</td><td>Alt kısım optik olarak şeffaf plastikten yapılmıştır</td></tr><tr><td>MatTek çanak 35 mm</td><td>MatTek şirketi</td><td>P35G-1.5-14-C</td><td>Alt kısım bir cam lamel</td></tr><tr><td>Asa Hücre Sayacı</td><td>Merck Millipore</td><td>PHCC00000</td><td></td></tr><tr><td>Beyaz 96 kuyulu plaka</td><td>Nunc</td><td>236108</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj</td><td>SORVALL</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Mikroplaka okuyucu</td><td>BioTek</td><td>Synergy Mx</td><td></td></tr></tbody></table>

tespit, görselleştirme ve bir amip model sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Detecting, Visualizing and Quantitating the Generation of Reactive Oxygen Species in an Amoeba Model System

Reaktif oksijen türleri (ROS) dinamik olarak birbirlerine ya da katalitik olarak ya da kendiliğinden ortadan reaktif ve kısa ömürlü oksijen-içeren moleküllerin, bir dizi ihtiva eder. Nedeniyle çoğu ROS ve kendi kaynakları ve subselüler yerleşimlerin çeşitliliğinin kısa yaşam süreleri için, tam bir resim sadece protokolleri bir arada kullanırken dikkatli ölçümler elde edilebilir. Burada, bir OxyBurst Yeşil (OBG) kullanarak üç farklı protokoller kümesi kaplı boncuklar, ya dihydroethidium (DHE&#39;nin) sunmak ve Amplex ultrared (AUR), nitelik ve nicelik gibi Dictyostelium&#39;da gibi profesyonel fagositlerin çeşitli ROS izlemek için. Biz dinamik tek hücre düzeyinde intraphagosomal ROS üretimi görselleştirmek için boncuk kaplama prosedürleri ve ikinci el OBG kaplı boncuklar ve canlı mikroskopi optimize edilmiş. Biz E&#39;den lipopolisakkarid (LPS) tarafından tanımlanan Dictyostelium&#39;da ROS üretimi için güçlü bir uyarıcı olarak coli. Ayrıca, developed gerçek zamanlı kantitatif olarak, sırasıyla, hücre içi ve hücre dışı H süperoksit 2 O 2 üretimi ölçmek için DHE ve AUR kullanılarak orta verimlilik gösteren deneyler.

Phagosomes ROS nesil mikroskobu (Dosya S1) ile niteliksel ve dinamik görülebilir. Alexa Fluor 594 tarafından yayılan kızıl flüoresans pH-duyarlı ve obg oksitlenmesi yeşil kanal içindeki floresan artar, phagosomal ortamda sabit kalır. In vitro emisyon spektrumu oksitlenmiş ve nonoxidized OBG-kaplanmış boncuklar oksidasyon sonra yoğunluğunda önemli bir artış gösteren, Şekil 1B karşılaştırılmaktadır. Canlı etkinlikleri vizüalizasyon, iki kanal alımının 1 dk içinde Yabanitip AX2 hü...

Biz, kalitatif ve kantitatif çalışmalar için çeşitli amoeba ve memeli hücre modellerinde uygulanabilir, reaktif oksijen türlerinin (ROS) ölçümü için protokoller kümesi uyarlanmıştır.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Reactive oxygen species (ROS) comprise a range of reactive and short-lived, oxygen-containing molecules, which are dynamically interconverted or ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, çeşitli reaktif oksijen türlerinin (ROS) ve bunların lokalizasyonunun izlenmesi için kolay ve çok yönlü bir çözüm sunmak ve ROS ile ilgili hücresel mekanizmalara dair daha derin bilgiler sağlamaktır. Bu, üç farklı analiz gerçekleştirilerek sağlanır; bunlardan ilki RST green veya OB G kaplı boncuklar ve canlı mikroskopi kullanır; ob g floresein ve Alexa Fluor 594, BSA aracılığıyla üç mikronluk silika boncukların yüzeyine kovalent olarak bağlanmıştır.OBG floreseininden gelen floresans emisyonu ROS ile oksidasyonu belirtirken, Alexa Fluor 594'ten gelen sinyal boncukların lokalize edilmesine yardımcı olur ve floresans kantifikasyonu için kontrol görevi görür. İkinci yöntem, plak okuyucu tabanlı bir analizde süperoksit duyarlı prob olan dihidro etidyum veya DHE'yi kullanır. Süperoksit ile oksidasyon sonucunda etidyum, nükleer ve mitokondriyal DNA'ya interkale olabilir ve sırasıyla 522 nanometre ve 605 nanometrede kaymış eksitasyon ve emisyon piklerine sahiptir.AUM'nin floresan yoğunluğu, süperoksit üretim miktarına karşılık gelir ve hücrelerdeki hücre içi süperoksit üretiminin kantitatif olarak ölçülmesine olanak tanır. Üçüncü yöntem de plaka okuyucu taban

detecting-visualizing-quantitating-generation-reactive-oxygen-species

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Endotel Ca2 + sinyalizasyon parakrin türetilen ROS indüksiyon görüntülenmesi anlayışlar kazanmak için etkili bir yöntem açıklanmıştır. Bu yöntem, bir ko-kültür modeli vasküler endotelyal hücreler Ca2 + seferberlik tetikleyen parakrin elde edilen ROS ölçme yararlanır.

Vasküler Ca Görselleştirme 2 + Parakrin Türetilmiş ROS tarafından tetiklenmiş Sinyal

NADPH oksidaz fagositler reaktif oksijen türlerinin ana kaynağı (ROS) 'dir. Çünkü ROS geçici doğası nedeniyle, canlı hayvanlarda ROS seviyelerini ölçmek ve izlemek zordur. Yaşayan farelerde ROS seri ölçümü için bir minimal invaziv bir yöntem tarif edilmiştir.

Farklı Hayvan Modelleri NADPH Oksidaz Aktivitesinin Biyoparlaklık Görüntüleme

Bu videoda, kültürlenmiş organoidlerde oksidatif stresi görselleştirme tekniği açıklanmaktadır. Bu çalışma, farklı ROS modülatörleri ile tedaviden sonra bir organoidde bulunan çeşitli hücre tiplerinde ROS birikimine bağlı oksidatif stres seviyesinin anlaşılmasına yardımcı olur.

Floresan Prob Görüntüleme Testi: Reaktif Oksijen Türleri İndükleyici ile Tedavi Edilen Kültürlenmiş Bağırsak Organoid Hücrelerinde Oksidatif Stresi Görselleştirmek İçin Bir Teknik

Bu el yazması oksidatif stres xenobiotic kaynaklı incelenmesi için genetik olarak kodlanmış fluorogenic gazetecilere canlı hücre görüntüleme bir uygulamada kullanımını açıklar. Bu deneysel yaklaşım eşsiz kronolojik zamanmekansal çözünürlük, duyarlılık ve özgüllük eksiklikleri toksikolojik oksidatif stres tespiti için kullanılan geleneksel yöntemlerden birçoğu kaçınırken sunmaktadır.

Genetik olarak kodlanmış Fluorogenic sensörleri kullanarak toksikolojik oksidatif stres ilişkin Değerlendirmeler yaklaşımlar görüntüleme

Burada, toplam hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diasetat (DCFH-DA) kullanarak tespit etmek için bir protokol salıyoruz. Bu yöntem, bir floresan mikroskobu ile yapışık hücrelerde hücresel ROS lokalizasyon görselleştirmek ve bir floresan plaka okuyucu ile ROS yoğunluğunu ölçmek. Bu protokol basit, verimli ve uygun maliyetlidir.

2',7'-Diklorodihidrolüorescein Diasetat Boyama ile Yapışık Hücrelerde Toplam Reaktif Oksijen Türlerinin Tespiti

Bu protokol hücre içinde hücre altı bölmesi özgü redoks durumunun değerlendirilmesi açıklanır. Redoksduyarlı floresan prob bozulmamış hücrelerde uygun oranmetrik analiz sağlar.

Hücre altı kompartmana özgü Redoksduyarlı Yeşil Floresan Protein kullanılarak Hücresel Oksidasyonun Değerlendirilmesi

Escherichia coli, yenidoğan Gram-negatif bakteriyel menenjitin önde gelen nedenidir. Bakteriyel enfeksiyon sırasında, nötrofiller tarafından üretilen reaktif oksijen türleri önemli bir bakterisidal rol oynar. Burada, menenjit E. coli'yeyanıt olarak nötrofillerdeki reaktif oksijen türlerini tespit etmek için bir yöntem sunuyoruz.

Meningitik Escherichia Coli ile Enfekte Olan Nötrofillerde Reaktif Oksijen Türlerinin Gerçek Zamanlı Nicelemesi

Mevcut protokol, nitel görüntüleme ve nicel sitometri tahlilleri kullanarak bağırsak murine organoidlerindeki reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için bir yöntem tanımlamaktadır. Bu çalışma, seçilen bileşiklerin ROS üzerindeki etkisini test etmek için potansiyel olarak diğer floresan problara genişletilebilir.

Murine Bağırsak Organoidlerinde Reaktif Oksijen Türlerine Duyarlı Florojenik Prob Kullanılarak Oksidatif Stresin Analizi

Burada, Müller glial hücrelerinde (MGC'ler) 2′,7′-diklorofloresein diasetat probu (DCFH-DA) kullanarak hücresel reaktif oksijen türlerini (ROS) tespit etmek için sistematize, erişilebilir ve tekrarlanabilir bir protokol öneriyoruz. Bu yöntem, bir akış sitometresi ile toplam hücresel ROS seviyelerini ölçer. Bu protokolün kullanımı çok kolaydır, uygundur ve yeniden üretilebilir.

Müller Glial Hücrelerinde 2′,7′-Diklorofloresein Diasetat Probu ve Akış-Sitometri Kullanılarak Reaktif Oksijen Türlerinin Miktarının Belirlenmesi

Bu protokol, yüksek verimli bir tarama yaklaşımı kullanarak bir floresan boya probu olarak dihidroetidyum (DHE) kullanarak hücre içi reaktif oksijen türlerini (ROS) ölçmek için yeni bir yöntemi açıklar. Protokol, üç farklı hepatoselüler karsinom hücre hattında hücre içi reaktif oksijen türlerinin (ROS) kantitatif değerlendirme yöntemlerini açıklar.

Dihidroetidyum (DHE) Floresan Boya Kullanılarak Reaktif Oksijen Türleri (ROS) Üretiminin Yüksek Verimli Tarama Değerlendirmesi

Öğrenin, amip hücrelerinde reaktif oksijen türlerinin canlı mikroskopi ve floresan problarıyla nicel ve nitel analizini. Bu yöntemler oksidatif stres araştırmalarında hücresel mekanizmaları anlamaya yardımcı olur.

Tespit, görselleştirme ve bir amip Model Sistemde reaktif oksijen türlerinin Üretimi nicelleştirilmesini

Daha fazla video keşfet