Peptit-Metal Komplekslerinin Yapı ve Koordinasyon Tayini 1D ve 2D ¹H NMR Kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, bakırla komplekslemiş bir Metallo şaperon protein mimetik peptidinin yapısını belirlemektir. Bu işlem, öncelikle örneğin oksijensiz bir ortamda hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, hidrojen atomları arasındaki etkileşimleri gösteren nükleer manyetik rezonans veya NMR spektroskopi verilerinin elde edilmesidir.

Ardından, uzaysal etkileşimler doğrusal bir peptit şablonu üzerine aktarılır. Son adım, verilerle uyumlu, temsili bir düşük enerjili yapı bulmaktır. Nihayetinde, NMR kaynaklı yapılar, bağlanma modunu belirlemek ve bakır bağlı kompleks üzerinde yapısal analizler gerçekleştirmek için kullanılır.

Bu tekniğin x-ışını kristalografisi gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, zayıf bağlanan kompleksleri ve ayrıca kristalleşmeyen molekül ve kompleksleri incelemek için kullanılabilmesidir. Bu yöntem bakır bağlayan proteinler hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, proteinlerin hücre içi ortamda temel ancak potansiyel olarak toksik metal iyonlarının güvenli iletimini nasıl sağladığını incelemek için diğer metal şaperonları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.

Başlangıç olarak, bakırın oksitlenmesini önlemek için numuneleri oksijensiz bir ortamda hazırlayın; APO numunesini hazırlamak için yaklaşık 1-2 mg peptidi 450-500 µL döteryumlanmış NMR saflığında çözücü içinde çözün; bakırla reaksiyona girmiş numune için ise APO peptidi ile aynı miktardaki peptidi, eş molar miktarda metal tuzu ile birlikte 450-500 µL NMR çözücüsünde çözün. Her bir çözeltiyi, merkez cam filtre kağıdı kullanarak veya incelenen bileşiklere uygun olan ve onları absorbe etmeyen başka herhangi bir teknikle filtreleyin. Homojenliği etkileyecek metal partiküllerini uzaklaştırmak için bu işlem esastır.

Çözeltileri NMR tüplerine aktarın ve tüplerdeki örnekleri kapatın. Glove box'tan ayrılmadan önce örnekleri glove box'tan çıkarın ve mühürleyin. APO ve bakırla tepkimeye girmiş örneklerin tek boyutlu proton spektrumlarını NMR cihazında kaydedin ve karşılaştırın.

APO peptit esnektir ve konformasyonların bir ortalamasını gösterir; ancak bakır ile reaksiyona girdiğinde, bağlı peptit amidleri daha rijit bir yapıya sahip olur. Bu nedenle, bakır içeren peptit spektrumu, amid bölgesindeki kimyasal kaymada önemli bir değişim göstermeli ve pikler ayrışabilir. Optimize edilmiş cozy, tox, nosy veya rosy NMR deneylerini, metin protokolünde açıklananla aynı koşullar altında kurun ve sıralı olarak çalıştırın.

Veri toplama süreci boyunca örnek bileşiminin sabit kaldığından emin olmak için her deney arasında tek boyutlu deneyler gerçekleştirin. Verileri metin protokolünde tartışıldığı şekilde işledikten sonra, NOESY ve ROSY spektrumlarının üzerine bindirilmiş bir dizi COSY ve TOCSY spektrumu hazırlayın. Spektrumdaki tüm NOE piklerini atamak için.

Parmak izi bölgesindeki toksis sinyalleriyle örtüşen piklerin atanmasıyla başlayın. Sonraki pik atama girişlerini kolaylaştırmak için, Sparky programı ile atanan pikleri, H alfa-amid protein eşleşme değerlerini dihedral açılara dönüştürerek kaydedin. Ayrıca, pikleri program içerisinden entegre ederek ve bilinen mesafeye sahip bir etkileşim kullanarak mesafe kısıtlamalarına dönüştürün.

Piklerin üst üste binmesi durumunda veya otomatik entegrasyon yöntemlerinin kullanılamadığı hallerde, pikler görsel kestirimle güçlü, orta, zayıf veya çok zayıf olarak etiketlenebilir ve bu belirlemeler sırasıyla 2.5, 3.5, 4.5 ve 5.5 angstrom'a kadar olan mesafelere dönüştürülebilir. Mesafe kısıtlamaları ve dihedral açılar, explore için doğru formatta içe aktarılır. Explore, kanonik kimyasal geometriye uyan yapıları bulmak için konformasyonel alanı tarayacaktır.

Bu parametrelerin hiçbirinin ihlal edilmediği bir topluluk oluşturmak için, deneysel olarak belirlenen mesafe kısıtlamalarına ek olarak işlem yapın. Bu, başlangıç topluluğunu oluşturacaktır. Herhangi bir yanlılık olmadan hangi kalıntıların metal bağlanmasına katıldığını belirlemek için, metale yönelik hiçbir kısıtlama kullanmadan ilk yapı belirleme çalışmasını gerçekleştirin.

Metin protokolünde açıklandığı üzere, yapıları konjuge gradyan enerji minimizasyonu ile 4.000 iterasyon boyunca minimize etmeden önce; atamalardaki hataların yanı sıra NOE enerjisinin ve simüle edilmiş diz çökme (kneeling) parametrelerinin belirlenmesini kolaylaştırmak için kısıtlamaları kademeli olarak tanıtın. Tüm topluluk üzerinde kısıtlamaların tanıtımını iteratif bir şekilde gerçekleştirerek genellikle 50 üyeden oluşan nihai bir topluluk oluşturun ve bulunan her bir NOE etkileşimi türünün sayısını raporlayın. Son olarak, kanonik kimyasal geometriye ve ampirik NMR kaynaklı kısıtlamalara uyan bir yapı topluluğu oluşturun. Toplam konformasyon sayısını, bunlardan NMR kaynaklı kısıtlamaları ihlal edenlerin sayısını ve hem ana zincir hem de tüm ağır atom RMSD değerlerini içeren tüm topluluğun RMSD değerini raporlayın.

Düşük enerjili topluluğu analiz edin ve metal iyonuna bağlanabilmek için hangi kalıntı yan zincirlerin birbirine uygun yakınlıkta olduğunu belirleyin. Bunlar belirlendikten sonra, bakır bağlanma verilerini de dahil ederek analizi tekrarlayın. NMR kaynaklı mesafe kısıtlamalarına ek olarak, belirlenen kalıntılara artık metal bağlanma kısıtlamalarını ekleyin.

Metal iyonunu ve topolojisini tanımlamak için uygun parametreleri ekleyin. Kütle, diğer atomlarla olan bağ uzunlukları, açılar ve bağ yapmayan itme parametreleri gibi uygun fiziksel bilgileri parametre dosyasına girin. Bağlanma bilgilerini topoloji dosyasına ekleyin.

Bu bilgiler, hangi bağların oluştuğunu ve koptuğunu ve bağlanma sonucunda hangi formal yüklerin değiştiğini içerir. Son olarak, daha önce yapıldığı gibi bir yapı topluluğu elde edin; çünkü çözülen topluluk, peptidin benimsediği konformasyonel alanı temsil eder. NMR ölçümü sırasında, bir başlangıç topluluğu oluşturmak için yapının tüm konformasyonlarını Mal Mall programına aktarın.

Molekülün yerel stabilitesini belirlemek için topluluğu (ensemble) inceleyin. Sekans boyunca ardışık dört kalıntılık bölgeler seçip programın en düşük enerjili yapıya veya ortalamaya göre RMSD değerlerini hesaplamasını sağlayarak ana zincir ve yan zincir RMSD değerlerini belirleyin; yerel RMSD'yi sekansın bir fonksiyonu olarak çizdirerek molekülün hangi bölgelerinin yerel stabilite gösterdiğini tespit edin, topluluğu molekülün bu bölgesi boyunca üst üste bindirin ve sonraki analizler için bu topluluğu kullanın. NMR kaynaklı kısıtlamalara uygun, düşük enerjili konformasyonları seçin.

Bunlar düşük enerjili topluluk kaydını oluşturacak ve topluluktaki konformasyon sayısını, bunların seçilme kriterlerini ve RMSD değerlerini raporlayacaktır. Metal bağlanma modu henüz belirlenmemişse, düşük enerjili topluluğu analiz edin ve hangi kalıntı yan zincirlerinin hatalı olduğunu belirleyin. Metal iyonunu bağlayabilmek için birbirlerine yakınlıkları.

Metal bağlanmasından şüphelenilen atomlar arasındaki molekül içi mesafeleri belirlemek için KYMERA kullanın. Bunlar belirlendikten sonra topluluktaki ortalama mesafeleri hesaplayın. Analizi, bakır bağlanma verilerini de dahil ederek tekrarlayın.

Topluluğu inceleyin ve MAL mall programının varsayılan arama parametrelerini kullanarak molekül içindeki yerel ikincil yapıyı belirleyin. Ardından, topluluğu kymera'ya aktarın. İkincil yapılar hidrojen bağları ile tutunur ve molekülün kararlı bölgelerini belirtir.

Kymera aracı kullanılarak hidrojen bağlanmasını belirleyin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde yapısal analize devam edin. Ardından, birbirlerini nasıl desteklediklerini ortaya çıkarmak için tüm yapısal bulguları özetleyin. Bakır bağlayıcı protein modellerini incelemek için, türetilen lineer peptit içindeki bir proteinin korunmuş bağlanma dizisinin yapısı, peptidin 6,7 ile 8,5 arasındaki amit bölgesi kullanılarak çözelti durumunda NMR ile belirlenmiştir.

Bakırla reaksiyona girdiğinde PP M'nin 6,6 ila 9,0 PP M'ye genişleme gösterdiği görüldü. Hafif bakır oksidasyonuna bağlı hat genişlemesi temel çizgide belirgindir. Burada bakıra bağlı peptidin Roy Toxi ve cozy spektrumlarının parmak izi bölgelerinin üst üste bindirilmiş hali gösterilmiştir. Örnek zamanla stabil kalmış olup spektrumlar iyi çözünürlükte çıkmış ve rosy deneyi ile elde edilen 81 NOE etkileşimi sağlamıştır.

Molekül, NO C deneyinde sıfıra yakın NOE etkileşimleri verdiğinden, reaksiyona girmiş örnek için türetilen ancak metale yönelik hiçbir kısıtlama kullanılmayan peptit topluluğu, ana zincir ve ağır atomlar üzerinde sırasıyla 1,44 ve 2,07 angstrom RMSD değerleri ile 50 yapının 47'sini vermiştir. Bunların arasından, ana zincir ve ağır atomlar üzerinde sırasıyla 0,25 ve 0,61 angstrom RMSD değerlerine sahip 13 düşük enerjili konformer ileri analizler için seçilmiştir. Yerel RMSD grafiği, üçüncü ve yedinci kalıntılar arasında bir stabilite bölgesi göstermiştir; prolin kalıntısını içeren rijit C-terminal bölgesine ek olarak, bu bölge tüm konformasyonlarda dördüncü ve yedinci kalıntılar arasında bükülmüş bir konformasyonda bulunmaktadır.

Bükülme konformasyonu, ana zincir donörleri ve akseptörleri olan glisin beş ve üç anine iki'nin yanı sıra sisteini altı ve sistein üç arasındaki hidrojen bağları ile stabilize edilmiştir. Bu bükülme, bu bölgedeki düşük ortaklaşma değerleri ile sistein üç ve sine yedide de belirgindir. Konformasyonlar bu bölge üzerinden üst üste bindirilmiş ve sistein üç, sistein altı ve metiyonin bir potansiyel bağlama kalıntıları olarak değerlendirildiğinde olası bağlama kalıntıları açısından analiz edilmiştir.

En kısa kükürt-kükürt atom mesafesi, sistein üç ve sistein altının folat grupları arasındaydı; bakır bağlanması eklenmiş ve analizde kullanılan topluluğu elde etmek için hesaplama tekrarlanmıştır. Bakıra bağlı peptidin düşük enerjili topluluğu, uç terminal aminin bağlı bakıra yakın olduğunu göstermektedir. Burada, pozitif potansiyelin mavi ve negatif potansiyelin kırmızı ile gösterildiği elektrostatik potansiyel dağılım izoyüzeyi sunulmuştur.

Arjinin kalıntısı, peptit omurgasından uzanarak elektrostatik potansiyelin pozitif bir lobunu oluştururken, omurga karbonları daha az belirgin bir negatif elektrostatik potansiyel oluşturacak şekilde bir hat boyunca dizilmiştir. Bu yöntem kavrandıktan sonra, yapısal analiz için kullanılabilecek bir konformasyon topluluğu elde etmek amacıyla, yaklaşık bir haftalık NMR süresinde bir yapısal belirleme ve ardından birkaç günlük veri işleme çalışması yapılabilir. Bu prosedürün ardından, bakır iyonunun farklı derecelerdeki bağlanma ve salınımı için gerekli koşullara yönelik ek soruları yanıtlamak amacıyla diğer peptit mutantları ve farklı koşullar analiz edilebilir.