Name: Peptit-Metal Komplekslerinin Yapı ve Koordinasyon Tayini 1D ve 2D 1H NMR Kullanılarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 14 min 44 s
Description: Öğrenin, bakır bağlı metalokaperon model peptidinin yapısını 1D ve 2D ¹H NMR kullanarak nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, metal iyonu taşıma mekanizmalarını incelemek için yapısal biyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mali destek için Human Frontier Science Program'a (Genç araştırmacı hibesi (RGY)0068-2006) teşekkür ederiz.

1. Numune Hazırlama
<ol>
	<li>Apo-numune: Yaklaşık 1-2 mg peptidi 450-500 μl döteryumlu NMR dereceli çözücü içinde çözün (biyolojik numuneler için tercih edilen çözeltiler suda %10 D2O veya numune suda çözünmezse veya onunla reaksiyona girerse d6-DMSO 11-12'dir).</li>
	<li>Bakırla reaksiyona giren numune: Yaklaşık 1-2 mg peptidi 450-500 μl NMR çözücüsü içinde eşmolar miktarda metal tuzu ile çözün.</li>
	<li>Çözeltiyi bir Sinter camı, filtrasyon kağıdı veya incelenen bileşiklere uyan ve bunları adsorbe etmeyen başka bir teknik kullanarak filtreleyin. Bu, homojenliği etkileyecek herhangi bir metalik parçacığı uzaklaştırmak için gereklidir.</li>
	<li>Çözeltiyi bir NMR tüpüne aktarın ve kapatın. Tüp kalitesinin kullanılan mıknatıs gücüne uygun olduğundan emin olun (daha fazla ayrıntı için ekipman tablosuna bakın).</li>
	<li>Numune oksijene duyarlıysa, oksidasyonu önlemek için bu adımlar inert bir ortamda yapılmalı ve tüp kapatılmalıdır.</li>
</ol>
2. NMR Veri Toplama ve İşleme13
<ol>
	<li>Apo ve bakır ile reaksiyona giren numunelerin 1D 1H spektrumlarını kaydedin ve karşılaştırın. Bakır içeren peptit spektrumu, amid bölgesinde önemli bir kimyasal kayma değişikliği göstermeli ve apo-peptit esnek olduğundan ve ortalama bir konformasyon gösterdiğinden pikler çözülmelidir, ancak bakır ile reaksiyona girdiğinde, bağlı peptit amidleri tek bir yapıya sahiptir (Şekil 2).
	<ol>
		<li>Spektrum değişmezse, reaksiyonun başarısız olduğu varsayılır.</li>
		<li>Numune yeşile dönerse, bakır atmosferde oksitlenmiş olur ve bu da bağlanma özelliklerini değiştirebilir.</li>
		<li>Her iki durumda da numunenin yeniden yapılması gerekecektir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dar çizgi genişliklerine sahip amid kalıntılarının minimum örtüşmesini sağlayan NMR ölçümleri için en uygun sıcaklık koşullarını bulun.</li>
	<li>Aynı koşullar altında (sıcaklık, pH vb.) COSY14, TOCSY15 ve NOESY16 veya ROESY17 NMR deneylerini kurun ve sırayla çalıştırın.
	<ol>
		<li>COSY (Şekil 3) ve TOCSY (Şekil 4) deneyleri, sırasıyla bitişik ve daha uzun menzilli komşu proton-proton etkileşimlerinin karşılıklı bağ etkileşimlerini tespit edecektir. COSY spektrumu HN-Hα korelasyonları hakkında bilgi verirken, TOCSY spektrumu ek olarak HN ve ilişkili kalıntıların diğer H alifatik protonları hakkında bilgi verir.</li>
		<li>NOESY ve ROESY (Şekil 5) deneyleri, yapısal bilgi vermek için bağlara bağımlı olmadan uzayda yakınlığı tespit eder. İkisi arasındaki seçim, bileşiğin etkin boyutuna ve alan kuvvetine göredir. Bu tür bazı kombinasyonlar teorik sıfır sinyalleri verir (Şekil 6) ve NOE etkileşimlerini tespit etmek için bir ROESY deneyinin çalıştırılması gerekecektir10,18.</li>
		<li>Numune su içindeyse, deneylerin bir su bastırma bileşenine sahip olması gerekir. Bu, en verimli şekilde gradyanlar19 kullanılarak gerçekleştirilir. Bu durumda, Hα hidrojenleri ile ve Hα hidrojenleri arasında etkileşimler elde etmek için numunenin bir kez atandıktan sonra saf D2O'da yeniden çalıştırılması avantajlıdır.</li>
		<li>Spin difüzyonunda minimum kayıpla maksimum sinyal oluşumunu bulmak için bir dizi kısa deney yaparak TOCSY ve NOESY veya ROESY karıştırma sürelerinin süresini optimize edin. Bunun, birikme eğrisinin doğrusal bölgesi olduğundan emin olun. 600 MHz alanlarındaki peptitler için yaygın olan değerler, TOCSY için yaklaşık 100 msn ve NOESY veya ROESY deneyleri için 150 msn karıştırma sürelerini içerir.</li>
		<li>Numune bileşiminin veri toplama boyunca sabit kaldığından emin olmak için her deney arasında 1B deneyler yapın (Şekil 7).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Minimum sinyal gücü kaybıyla maksimum çözünürlük elde etmek için uygun apodizasyon fonksiyonlarını kullanarak spektrumları işleyin ve t1 boyutunda sıfır dolgu ekleyin.
	<ol>
		<li>İkinci dereceden bir polinom fonksiyonu ile F2 ve ardından F1 boyutundaki taban çizgisini daha da düzeltin.</li>
		<li>Spektrumların kimyasal kaymasını, bilinen standartlardan (sırasıyla TMSP veya TMS) kaymalarına göre ilgili çözücülerdeki artık su veya DMSO tepe noktalarına göre dikkatlice kalibre edin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. SPARKY20 Kullanarak Tepe Atama ve Entegrasyon
<ol>
	<li>NOESY veya ROESY spektrumu üzerine yerleştirilmiş bir dizi COSY ve TOCSY spektrumu hazırlayın (Şekil 8).</li>
	<li>Spektrumdaki tüm NOE tepe noktalarını Wüthrich21 tarafından geliştirilen sıralı atama metodolojisine göre atayın.
	<ol>
		<li>Parmak izi bölgesindeki TOCSY sinyalleriyle örtüşen tepe noktaları atamakla başlayın, çünkü bu, SPARKY programıyla sonraki tepe atama girişlerini kolaylaştıracaktır (Şekil 9). Atamayı kaydedin kimyasal kayma (Şekil 10) ve 3JHNHα değeri (Şekil 11).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tepeleri mesafe kısıtlamalarına ve 3JHNHα değerlerini dihedral açılara çevirin.
	<ol>
		<li>Bu, tepe noktalarını program içinden entegre ederek ve bunları bilinen mesafenin bir etkileşimini kullanarak (metilen grubunun iki protonu arasındaki mesafe veya bir aromatik amino asidin aromatik hidrojen atomları gibi) mesafe kısıtlamalarına çevirerek yapılabilir.</li>
		<li>Tepe noktaları çakışıyorsa ve entegrasyon yöntemleri kullanılamıyorsa, görsel tahminle güçlü-orta-zayıf-çok zayıf olarak etiketlenebilirler ve bu tanımlamalar sırasıyla 2.5, 3.5, 4.5 ve 5.5 Å'ye kadar olan mesafelere çevrilebilir. Bu, peptitlerle yapılan çalışmalarda en etkili olmaktır.</li>
		<li>3JHNHα değerleri, verilen kuplaj değerlerinin çoğunun birden fazla dihedral açıdan kaynaklanabileceği Karplus denklemine göre dihedral açıların göstergesidir. Bunlar, ikincil yapının (sarmallar veya tabakalar), rastgele bobinin veya bunların konformasyonel ortalamalarının göstergesi olabilir. Bu nedenle, kısıtlamaları dikkatli bir şekilde kullanmak veya bunları uygun sonuçların teyidi olarak kullanmak önemlidir.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. XPLOR22 Kullanarak Yapı Topluluğu Oluşturmak için Moleküler Mekanik Hesaplamaları
<ol>
	<li>Mesafe kısıtlamalarını ve dihedral açıları XPLOR için doğru formatla içe aktarın. (Şekil 12, yalnızca kalıntılar arası kısıtlamalar). XPLOR, deneysel olarak bulunan mesafe kısıtlamalarına ek olarak, yukarıdaki parametrelerin hiçbirinin ihlal edilmediği bir topluluk oluşturmak için bağ uzunlukları, açılar, kiralite vb. gibi kanonik geometrik kimyasal kısıtlamalara uyan yapıları bulmak için konformasyonel alanı arayacaktır. Bu, başlangıç topluluğunu oluşturacaktır.</li>
	<li>İlk yapı belirleme çalışması, metal üzerinde herhangi bir kısıtlama kullanılmadan yapılacaktır. Bu, hangi kalıntıların herhangi bir önyargı olmaksızın metal bağlamaya katıldığını gösterecektir. Adım 4.4'e atlayın.</li>
	<li>NMR'den türetilen mesafe kısıtlamalarına ek olarak, belirlenen kalıntılara metal bağlama kısıtlamaları ekleyin.
	<ol>
		<li>Metal iyonunu ve topolojisini tanımlamak için uygun parametreler ekleyin.</li>
		<li>Uygun fiziksel bilgiler (kütle, diğer atomlarla bağ uzunlukları, açılar ve bağlanmayan itme parametreleri) parametre dosyasına konulmalıdır.</li>
		<li>Bağlama bilgilerini topoloji dosyasına ekleyin: Hangi bağların oluştuğu ve kırıldığı ve bağlama sonucunda hangi resmi yüklerin değiştirildiği.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Genellikle 10 üyeden oluşan küçük bir topluluk oluşturun.
	<ol>
		<li>Omurgadan omurgaya etkileşimlerden başlayarak, ardından omurgadan yan zincire, ardından yan zincirden yan zincire etkileşimlerden ve artık içi, sıralı etkileşimlerden giderek daha uzun aralıklı etkileşimlere geçerek kısıtlamaları kademeli olarak tanıtın. Bu, atamadaki hataların belirlenmesini kolaylaştırır.</li>
		<li>NOE enerjisini, 50 kcal/mol•Å2 sabit kuvvet sabiti olan bir kare kuyu potansiyeli olarak tanıtın. Simüle edilmiş tavlama, 1.500 K'da 1.500 3 fsec adımla ve 3,000 K'ya soğutma sırasında 1 500 fsec adımla yapılmalıdır. Son olarak, 4.000 yineleme için eşlenik gradyan enerji minimizasyonu kullanarak yapıları en aza indirin; bunlar XPLOR içinde değiştirilebilen değişkenlerdir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Genellikle 50 üyeden oluşan son bir topluluk oluşturun. Adım 4.4'ten itibaren tüm toplulukta adımları gerçekleştirin.
	<ol>
		<li>Şekil 13'te gösterildiği gibi, bulunan her bir NOE etkileşimi türünün sayısını bildirin.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kanonik kimyasal geometriye ve ampirik NMR'den türetilmiş kısıtlamalara uyan bir yapılar topluluğu oluşturun.
	<ol>
		<li>Toplam konformasyon sayısını, NMR'den türetilen kısıtlamaları ihlal edenlerin sayısını ve hem omurga hem de tüm ağır atom RMSD değerleri olmak üzere tüm topluluğun RMSD'sini bildirin.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Yapı Analizi
<ol>
	<li>Çözülmüş topluluk, NMR ölçümü sırasında peptit tarafından benimsenen konformasyonel boşluğu temsil eder. Yerel esneklik, molekülün farklı bölgelerinde değişebilir ve bu, yapısal veya işlevsel nedenlere bağlanabilir (yapısal analizin amacı, stabilite ve etki mekanizması için yapısal temeli belirlemektir).
	<ol>
		<li>Bir başlangıç topluluğu oluşturmak için yapının tüm konformasyonlarını MolMol programına23 aktarın (Şekil 14).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Molekülün yerel stabilitesini belirlemek için topluluğu inceleyin.
	<ol>
		<li>Omurga ve yan zincir RMSD değerlerini, dizi boyunca sonraki dört kalıntı bölgesini seçerek ve programın RMSD'yi en düşük enerji yapısına veya ortalamaya kadar hesaplamasını sağlayarak belirleyin.</li>
		<li>Yerel RMSD'yi dizinin bir fonksiyonu olarak çizerek molekülün hangi bölgelerinin yerel stabilite gösterdiğini belirleyin (Şekil 15).</li>
		<li>Topluluğu molekülün bu bölgesi boyunca kaplayın ve daha fazla analiz için bu topluluğu kullanın (Şekil 16).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>NMR'den türetilen kısıtlamalara (ihlal edilmemiş) uyan düşük enerjili konformasyonları seçin. Bunlar "düşük enerji topluluğunu" oluşturacaktır.
	<ol>
		<li>Topluluktaki konformasyonların sayısını, bunları seçme kriterlerini ve adım 4.6.1'de tanımlandığı gibi RMSD değerlerini bildirin.</li>
		<li>Metal ciltleme modu zaten belirlenmişse, bir sonraki adıma geçin. Aksi takdirde: Düşük enerji grubunu analiz edin ve metal iyonunu bağlayabilmek için hangi kalıntı yan zincirlerinin birbirine doğru yakınlıkta olduğunu belirleyin. Bunlar belirlendikten sonra, adım 3.3'e geri dönün ve bakır bağlama verileri de dahil olmak üzere analizi yeniden yapın (topluluk için Şekil 17 ve düşük enerjili konformer için Şekil 18).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Topluluğu inceleyin ve MolMol programının varsayılan arama parametrelerini kullanarak molekül içindeki yerel ikincil yapıyı belirleyin. İkincil yapılar hidrojen bağı ile tutulur ve molekülün kararlı bölgelerini gösterir.
	<ol>
		<li>Her bir konformerin ikincil yapısını belirleyin (Şekil 19).
		<ol>
			<li>Her ikincil yapıyı gösteren topluluğun konformerlerinin yüzdesini gösteren bir tablo oluşturun.</li>
			<li>İkincil yapı bölgelerinin, local-RMSD tarafından kararlı bölgeler olarak belirlenen bölgelerle örtüşüp örtüşmediğini belirleyin. Bu genellikle böyledir.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Molekül içindeki mesafeleri ve hidrojen bağını belirleyin.
	<ol>
		<li>Topluluğu Chimera24'e aktarın.</li>
		<li>Metal bağlanmasından şüphelenilen atomlar arasındaki molekül içi mesafeleri belirlemek için Chimera'yı kullanın. Topluluktaki ortalama mesafeleri hesaplayın.</li>
		<li>Programın varsayılan gevşemiş hidrojen bağı parametrelerini (%20 oranında) kullanarak, topluluğun her bir konformerindeki molekül içi hidrojen bağlarını belirlemek için Chimera'yı kullanın.</li>
		<li>Her bir hidrojen bağını gösteren topluluğun konformerlerinin yüzdesinin bir tablosunu oluşturun. Konformasyonların çoğunda tekrarlayan hidrojen bağları, yapının stabilitesine katkıda bulunan kararlı bir bağı gösterir.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Molekül içindeki elektrostatik etkileşimleri belirleyin.
	<ol>
		<li>Yüklü yan zincirler arasındaki etkileşimleri belirleyin.</li>
		<li>Her elektrostatik etkileşimi gösteren topluluğun konformerlerinin yüzdesini gösteren bir tablo oluşturun.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Delphi 26 programı içindeki Amber25 kuvvet alanını kullanarak elektrostatik potansiyel dağılımını hesaplayın.
	<ol>
		<li>Elektrostatik potansiyel hesaplamalarının gerçekleştirileceği topluluktan tek bir temsili konformasyon seçin.</li>
		<li>Poisson-Boltzman denklemini ve tam bir Coulombic hesaplamasını kullanarak elektrostatik potansiyel türetin. Gerekli parametreler arasında çözeltinin iyonik kuvveti, çözeltinin dielektrik değerleri (su için 80; DMSO için 40); iç peptit (genellikle 5.0 civarında); ızgaranın boyutu (genellikle 65'65'65 puan); ve peptit ile ızgaranın kenarı arasındaki minimum mesafe (10 Å). Sonuçlar genellikle bu değerlere göre oldukça sağlamdır, çünkü ana sonuç peptidin kendisi tarafından yönetilir (Şekil 21).</li>
		<li>Peptitin Van der Waals yüzeyine eşlenen elektrostatik potansiyeli inceleyin (Şekil 22).</li>
		<li>Aynı potansiyele sahip pozisyonları tanımlayan elektrostatik potansiyel izo yüzeylerini inceleyin. Diğer proteinleri veya ligandları çekebilecek veya itebilecek genişletilmiş pozitif veya negatif yüzeyler gibi biyolojik alaka düzeyini gösteren izo yüzeyleri veya amfipatik dağılım veya farklı özelliklere sahip yamalar gibi anlamlılık gösteren dağılımları bulun (Şekil 23).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Birbirlerini nasıl güçlendirdiklerini görmek için tüm yapısal bulguları toplayın.</li>
	<li>İlgili yerlerde 4.3-5.7.4 adımlarını tekrarlayın.</li>
</ol>

<ol><li>Robinson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+epitope+mimetics+as+anti-infectives%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Chem.+Biol%22%5BJournal%5D)">Protein epitope mimetics as anti-infectives.</a> Curr. Opin. Chem. Biol. 15, 379-386 (2011).</li>
<li>Huffman, D. L., Function O'Halloran, T. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((structure%2C+and+mechanism+of+intracellular+copper+trafficking+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Rev.+Biochem%22%5BJournal%5D)">structure, and mechanism of intracellular copper trafficking proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 70, 677-701 (2001).</li>
<li>Tapiero, H., Townsend, D. M., Tew, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trace+elements+in+human+physiology+and+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Copper.+Biomed.%2C+%26+Pharmacotherapy%22%5BJournal%5D)">Trace elements in human physiology and pathology.</a> Copper. Biomed., & Pharmacotherapy. 57, 386-398 (2003).</li>
<li>Boal, A. K., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Biology+of+Copper+Trafficking%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Rev%22%5BJournal%5D)">Structural Biology of Copper Trafficking.</a> Chem. Rev. 109, 4760-4779 (2009).</li>
<li>Rubino, J. T., Franz, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+chemistry+of+copper+proteins%3A+How+nature+handles+a+toxic+cargo+for+essential+function%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Inorg.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Coordination chemistry of copper proteins: How nature handles a toxic cargo for essential function.</a> J. Inorg. Biochem. 107, 129-143 (2012).</li>
<li>Wernimont, A. K., Huffman, D. L., Lamb, A. L., O'Halloran, T. V., Rosenzweig, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+copper+transfer+by+the+metallochaperone+for+the+Menkes%2FWilson+disease+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural basis for copper transfer by the metallochaperone for the Menkes/Wilson disease proteins.</a> Nat. Struct. Biol. 7, 766-771 (2000).</li>
<li>Singleton, C., Hearnshaw, S., Zhou, L., Le Brun, N. E., Hemmings, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanistic+insights+into+Cu%28I%29+cluster+transfer+between+the+chaperone+CopZ+and+its+cognate+Cu%28I%29-transporting+P-type+ATPase%2C+CopA%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+J%22%5BJournal%5D)">Mechanistic insights into Cu(I) cluster transfer between the chaperone CopZ and its cognate Cu(I)-transporting P-type ATPase, CopA.</a> Biochem. J. 424, 347-356 (2009).</li>
<li>Hearnshaw, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Tetranuclear+Cu%28I%29+Cluster+in+the+Metallochaperone+Protein+CopZ%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem%22%5BJournal%5D)">A Tetranuclear Cu(I) Cluster in the Metallochaperone Protein CopZ.</a> Biochem. 48, 9324-9326 (2009).</li>
<li>Shoshan, M. S., Tshuva, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MXCXXC+class+of+metallochaperone+proteins%3A+model+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Soc.+Rev%22%5BJournal%5D)">The MXCXXC class of metallochaperone proteins: model studies.</a> Chem. Soc. Rev. 40, 5282-5292 (2011).</li>
<li>Shoshan, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NMR+characterization+of+a+Cu%28I%29-bound+peptide+model+of+copper+metallochaperones%3A+Insights+on+the+role+of+methionine%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Comm%22%5BJournal%5D)">NMR characterization of a Cu(I)-bound peptide model of copper metallochaperones: Insights on the role of methionine.</a> Chem. Comm. 47, 6407-6409 (2011).</li>
<li>Schmitt, W., Zanotti, G., Wieland, T., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+of+different+S-deoxo-Xaa%283%29-amaninamide+analogues+in+DMSO+solution+as+determined+by+NMR+spectroscopy.+Strong+CD+effects+induced+by+beta+I%2C+beta+II+conformational+change%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Conformation of different S-deoxo-Xaa(3)-amaninamide analogues in DMSO solution as determined by NMR spectroscopy. Strong CD effects induced by beta I, beta II conformational change.</a> J. Am. Chem. Soc. 118 (3), 4380-4387 (1996).</li>
<li>Behrens, S., Matha, B., Bitan, G., Gilon, C., Kessler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure-activity+relationship+of+the+ring+portion+in+backbone-cyclic+C-terminal+hexapeptide+analogs+of+substance+P+-+NMR+and+molecular+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Peptide+and+Protein+Res%22%5BJournal%5D)">Structure-activity relationship of the ring portion in backbone-cyclic C-terminal hexapeptide analogs of substance P - NMR and molecular dynamics.</a> Int. J. Peptide and Protein Res. 48, 569-579 (1996).</li>
<li>Overview TopSpin NMR - Software for NMR Data Analysis and NMR Spectra Data Procession | Bruker Corporation [Internet]. , Bruker Corporation. Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin">http://www.bruker.com/products/mr/nmr/nmr-software/software/topspin</a> (2013).</li>
<li>Aue, W. P., Bartholdi, E., Ernst, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((2-Dimensionsl+spectroscopy-+application+to+nuclear+magnetic+resonance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chem.+Phys%22%5BJournal%5D)">2-Dimensionsl spectroscopy- application to nuclear magnetic resonance.</a> J. Chem. Phys. 64, 2229-2246 (1976).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MLEV-17-based+two-dimensional+homonuclear+magnetization+transfer+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">MLEV-17-based two-dimensional homonuclear magnetization transfer spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 65, 355-360 (1985).</li>
<li>Kumar, A., Ernst, R. R., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+two-dimensional+nuclear+overhauser+enhancement+%282D+NO%29+experiment+for+the+elucidation+of+complete+proton-proton+cross-relaxation+networks+in+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem.+Biophys.+Res.+Comm%22%5BJournal%5D)">A two-dimensional nuclear overhauser enhancement (2D NO) experiment for the elucidation of complete proton-proton cross-relaxation networks in biological macromolecules.</a> Biochem. Biophys. Res. Comm. 95, 1-6 (1980).</li>
<li>Bax, A., Davis, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+aspects+of+two-dimensional+transverse+NOE+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Magn.+Reson%22%5BJournal%5D)">Practical aspects of two-dimensional transverse NOE spectroscopy.</a> J. Magn. Reson. 63, 207-213 (1985).</li>
<li>Williamson, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+3+Applications+of+the+NOE+in+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.+Reports+on+NMR+Spectroscopy%22%5BJournal%5D)">Chapter 3 Applications of the NOE in Molecular Biology.</a> Annu. Reports on NMR Spectroscopy. 65, 77-109 (2009).</li>
<li>Piotto, M., Saudek, V., Sklenar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gradient-tailored+excitation+for+single-quantum+NMR-spectroscopy+of+aqueous+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomol.+NMR%22%5BJournal%5D)">Gradient-tailored excitation for single-quantum NMR-spectroscopy of aqueous solutions.</a> J. Biomol. NMR. 2, 661-665 (1992).</li>
<li>Sparky - NMR Assignment Program. , Available from: 
	 <a target="_blank" href="http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky">http://www.cgl.ucsf.edu/home/sparky</a> (2008).</li>
<li>Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aW%C3%BCthrich%2C+K+%22NMR+of+proteins+and+nucleic+acids%22">NMR of proteins and nucleic acids</a>. , J. Wiley & Sons Inc. (1986).</li>
<li>Nilges, M., Kuszewski, J., Brünger, A. T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNilges%2C+M+%22Comp.+aspects+study+biol.+macromol.+by+NMR%22">Comp. aspects study biol. macromol. by NMR</a>. , Plenum Press. (1991).</li>
<li>Koradi, R., Billeter, M., Wüthrich, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOLMOL%3A+A+program+for+display+and+analysis+of+macromolecular+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Molecular+Graphics%22%5BJournal%5D)">MOLMOL: A program for display and analysis of macromolecular structures.</a> J. Molecular Graphics. 14, 51(1996).</li>
<li>Pettersen, E. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UCSF+chimera+-+A+visualization+system+for+exploratory+research+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Computational+Chem%22%5BJournal%5D)">UCSF chimera - A visualization system for exploratory research and analysis.</a> J. Computational Chem. 25, 1605-1612 (2004).</li>
<li>Pearlmen, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMBER%2C+a+package+of+computer+programs+for+applying+molecular+mechanics%2C+normal+mode+analysis%2C+molecular+dynamics+and+free+energy+calculations+to+simulate+the+structural+and+energetic+properties+of+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Comp.+Phys%22%5BJournal%5D)">AMBER, a package of computer programs for applying molecular mechanics, normal mode analysis, molecular dynamics and free energy calculations to simulate the structural and energetic properties of molecules.</a> Comp. Phys. 91, 1-41 (1995).</li>
<li>Honig, B., Sharp, K., Yang, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macroscopic+models+of+aqueous+solutions-+biological+and+chemical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Chem%22%5BJournal%5D)">Macroscopic models of aqueous solutions- biological and chemical applications.</a> J. Phys. Chem. 97, 1101-1109 (1993).</li>
</ol>

Yazarlar, rekabet eden hiçbir mali çıkarları olmadığını beyan ederler.

Yapısal bilginin bağlanma mekanizmalarını anlamaya katkısı iyi kabul edilmektedir. Peptitler, protein bağlanması ve etkileşimleri için modeller olarak faydalıdır; ancak yapı belirleme için ana yöntem olan X-ışını kristalografisine uygun değildirler. NMR, yapılar çözelti içinde kolayca çözülebildiğinden, bu sistemler için özellikle yararlıdır. Bu, özellikle metal iyonunun oksidasyonunu önlemek için inert bir ortam altında ek olarak yapı belirleme gerektiren metalloşaperon mimetikleri için geçerlidir.
<p class="jove_co...

Peptitler, kendi başlarına protein modelleri, potansiyel ilaç liderleri ve terapötik ajanlar olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte, küçük boyutları ve yüksek derecede esneklikleri, kristalleşmedeki zorluklar nedeniyle genellikle X-ışını ile yapı belirlemeyi engeller.
Nükleer manyetik rezonans (NMR), peptit yapılarını ve etkileşimlerini belirlemek için kullanılabilir. Yöntem, yerel ve genel yapı, bağlanma ve daha düşük afinite etkileşimleri hakkında bilgi verebilir ve çözelti durumunda yapılabildiği için zor numunelere uygulanabilir.
Biyolojik sistemlerde bakır taşınması, iyonları oksidasyondan korumak ve toksik bakır2-5 salınımını önlemek için Cu (I) iyonlarını spesifik olarak bağlayan ve bunları bir dizi protein-protein etkileşimi yoluyla hedef proteinlerine ileten hücre içi bakır metalokoperon proteinleri tarafından sağlanır. Bağlanma bölgesi, hem NMR hem de kristalografi ile Cu (I) 'yi iki sistein kalıntısının yumuşak tiyolato ligandları ile bağlamak için gösterilen korunmuş dizi MXH / TCXanyXanyC ile karakterize edilir, ancak ek bir dış ligand da önerilmiştir6-8. Bu proteinlerin yapı-fonksiyon ilişkisi yoğun bir araştırma konusu olmuştur9.
Burada sunulan çalışmada, korunmuş bakır metalokoperon dizisini içeren bir peptit modeli sentezlendi ve inert bir ortamda Cu (I) ile reaksiyona sokuldu. Sunulan protokol, numune hazırlama, veri toplama, veri işleme, yapı oluşturma ve yapısal analiz dahil olmak üzere NMR tarafından yapı belirleme adımlarını açıklamaktadır. Analiz iki adımda yapıldı: İlk yapılar, peptidin bakır iyonuna bağlanma şekli hakkında hiçbir bilgi olmadan üretildi. Bağlama modu ampirik olarak kurulduktan sonra, yüksek çözünürlüklü bir yapı sağlamak için bu kısıtlamalar tanıtıldı. Bağlama şekli, modeldeki temel noktadır ve bu nedenle tarafsız bir şekilde belirlenmiştir.
Model peptitlerin NMR yapısal tayini, kimyagerler ve biyologlar tarafından sıklıkla kullanılan son derece değerli bir tekniktir. Farklı koşullar altında farklı peptitlere nispeten kolay bir şekilde uygulanabilir ve böylece ilgili mekanizmalara ışık tutabilir10. Yapı açıklama sürecini anlamak, önerilen yapıların güçlü ve zayıf yönlerinin daha iyi anlaşılmasını sağlar.

<table><tbody><tr><td>Avance DMX 600 MHz Spektrometre</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NMR numune tüpleri&nbsp;</td><td>Wilmad</td><td>535-PP</td><td></td></tr><tr><td>Torpido gözü</td><td>MBraun</td><td>LM05-019</td><td></td></tr><tr><td>Liyofilizatör&nbsp; &nbsp;</td><td>VirTis</td><td>tezgah üstüK</td><td></td></tr><tr><td>Peptid</td><td>BioChemia</td><td>Özel yapım</td><td>>%95 saflıkta</td></tr><tr><td>Bakır (1) klorür</td><td>Aldrich</td><td>224332</td><td></td></tr><tr><td>Hidroklorik asit</td><td>BioLab</td><td>231-595-7</td><td></td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Gadot</td><td>1310-73-2</td><td></td></tr><tr><td>d6-Dimetilsülfoksit</td><td>Aldrich</td><td>236926</td><td></td></tr><tr><td>Döteryum oksit</td><td>Aldrich</td><td>151882</td><td></td></tr></tbody></table>

peptit-metal komplekslerinin yapı ve koordinasyon tayini 1d ve 2d 1h nmr kullanılarak

Structure and Coordination Determination of Peptide-metal Complexes Using 1D and 2D 1H NMR

Bakır (I)'nin metalokoperon taşıma proteinleri tarafından bağlanması, bakır oksidasyonunu ve zararlı redoks reaksiyonlarına katılabilecek toksik iyonların salınmasını önler. MTCSGCSRPG (altı çizili korunur) dizisini içeren bir Cu (I) bağlayıcı metalokoperon proteininin peptit modelinin Cu (I) kompleksi, NMR spektroskopisi ile inert koşullar altında çözelti içinde belirlendi.
NMR, proteinlerin ve peptitlerin çözelti yapılarının belirlenmesi için yaygın olarak kabul edilen bir tekniktir. X-ışını kristalografisine uygun tek kristaller sağlamak için kristalleşmenin zorluğu nedeniyle, NMR tekniği, özellikle katı halden ziyade çözelti durumu hakkında bilgi sağladığı için son derece değerlidir. Burada, NMR ile tam üç boyutlu yapı belirlemeleri için gerekli olan tüm adımları açıklıyoruz. Protokol, bir NMR tüpünde numune hazırlama, 1D ve 2D veri toplama ve işleme, tepe atama ve entegrasyon, moleküler mekanik hesaplamalar ve yapı analizini içerir. Daha da önemlisi, analiz ilk olarak tarafsız bir şekilde güvenilir bir yapı belirlemesi sağlamak için önceden ayarlanmış herhangi bir metal-ligand bağı olmadan gerçekleştirildi.

Bakır bağlayan protein modelleri üzerine yürütülen mevcut bir çalışmanın parçası olarak, lineer MTCSGCSRPG peptidindeki korunmuş MT/HCXXC diziliminin yapısı, çözelti fazı NMR ile belirlenmiştir. Peptid, inert ortam altında CuCl ile reaksiyona sokulmuş ve pH, üniversal bir çubukla ~3.0 olarak ölçülmüştür. Peptidin amid bölgesi, bakır ile reaksiyon sonrası 6.7-8.5 ppm'den 6.6-9.0 ppm'ye doğru bir genişleme göstermiştir (Şekil 2). Hafif bakır oksidasyonundan kaynaklanan çizgi genişlemesi baz hattında belirg...

Cu (I) içeren bir metalokoperon model peptidin NMR çözelti yapısı belirlendi ve numune hazırlama ve 1D ve 2D veri toplamadan üç boyutlu bir yapıya kadar ayrıntılı bir protokol açıklandı.

Peptit-Metal Komplekslerinin Yapı ve Koordinasyon Tayini 1D ve 2D 1H NMR Kullanılarak

Copper (I) binding by metallochaperone transport proteins prevents copper oxidation and release of the toxic ions that may participate in harmful redox ...

Bu prosedürün genel amacı, bakırla komplekslemiş bir Metallo şaperon protein mimetik peptidinin yapısını belirlemektir. Bu işlem, öncelikle örneğin oksijensiz bir ortamda hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, hidrojen atomları arasındaki etkileşimleri gösteren nükleer manyetik rezonans veya NMR spektroskopi verilerinin elde edilmesidir.Ardından, uzaysal etkileşimler doğrusal bir peptit şablonu üzerine aktarılır. Son adım, verilerle uyumlu, temsili bir düşük enerjili yapı bulmaktır. Nihayetinde, NMR kaynaklı yapılar, bağlanma modunu belirlemek ve bakır bağlı kompleks üzerinde yapısal analizler gerçekleştirmek için kullanılır.Bu tekniğin x-ışını kristalografisi gibi mevcut tekniklere göre temel avantajı, zayıf bağlanan kompleksleri ve ayrıca kristalleşmeyen molekül ve kompleksleri incelemek için kullanılabilmesidir. Bu yöntem bakır bağlayan proteinler hakkında bilgi sağlayabildiği gibi, proteinlerin hücre içi ortamda temel ancak potansiyel olarak toksik metal iyonlarının güvenli iletimini nasıl sağladığını incelemek için diğer metal şaperonları gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.Başlangıç olarak, bakırın oksitlenmesini önlemek için numuneleri oksijensiz bir ortamda hazırlayın; APO numunesini hazırlamak için yaklaşık 1-2 mg peptidi 450-500 µL döteryumlanmış NMR saflığında çözücü içinde çözün; bakırla reaksiyona girmiş numune için ise APO peptidi ile aynı miktardaki peptidi, eş molar miktarda metal tuzu ile birlikte 450-500 µL NMR çözücüsünde çözün. Her bir çözeltiyi, merkez cam filtre kağıdı kullanarak veya incelenen bileşiklere uygun olan ve onları absorbe etmeyen başka herhangi bir teknikle filtreleyin. Homojenliği etkileyecek metal partiküllerini uzaklaştırmak için bu işlem esastır.Çözeltileri NMR tüplerine aktarın ve tüplerdeki örnekleri kapatın. Glove box'tan ayrılmadan önce örnekleri glove box'tan çıkarın ve mühürleyin. APO ve bakırla tepkimeye girmiş örneklerin tek boyutlu proton spektrumlarını NMR cihazında kaydedin ve karşılaştırın.APO peptit esnektir ve konformasyonların bir ortalamasını gösterir; ancak bakır ile reaksiyona girdiğinde, bağlı peptit amidleri daha rijit bir yapıya sahip olur. Bu nedenle, bakır içeren peptit spektrumu, amid bölgesindeki kimyasal kaymada önemli bir değişim göstermeli ve pikler ayrışabilir. Optimize edilmiş cozy, tox, nosy veya rosy NMR deneylerini, metin protokolünde açıklananla aynı koşullar altında kurun ve sıralı olarak çalıştırın.Veri toplama süreci boyunca örnek bileşiminin sabit kaldığından emin olmak için her deney arasında tek boyutlu deneyler gerçekleştirin. Verileri metin protokolünde tartışıldığı şekilde işledikten sonra, NOESY ve ROSY spektrumlarının üzerine bindirilmiş bir dizi COSY ve TOCSY spektrumu hazırlayın. Spektrumdaki tüm NOE piklerini atamak için.Parmak izi bölgesindeki toksis sinyalleriyle örtüşen piklerin atanmasıyla başlayın. Sonraki pik atama girişlerini kolaylaştırmak için, Sparky programı ile atanan pikleri, H alfa-amid protein eşleşme değerlerini dihedral açılara dönüştürerek kaydedin. Ayrıca, pikleri program içerisinden entegre ederek ve bilinen mesafeye sahip bir etkileşim kullanarak mesafe kısıtlamalarına dönüştürün.Piklerin üst üste binmesi durumunda veya otomatik entegrasyon yöntemlerinin kullanılamadığı hallerde, pikler görsel kestirimle güçlü, orta, zayıf veya çok zayıf olarak etiketlenebilir ve bu belirlemeler sırasıyla 2.5, 3.5, 4.5 ve 5.5 angstrom'a kadar olan mesafelere dönüştürülebilir. Mesafe kısıtlamaları ve dihedral açılar, explore için doğru formatta içe aktarılır. Explore, kanonik kimyasal geometriye uyan yapıları bulmak için konformasyonel alanı tarayacaktır.Bu parametrelerin hiçbirinin ihlal edilmediği bir topluluk oluşturmak için, deneysel olarak belirlenen mesafe kısıtlamalarına ek olarak işlem yapın. Bu, başlangıç topluluğunu oluşturacaktır. Herhangi bir yanlılık olmadan hangi kalıntıların metal bağlanmasına katıldığını belirlemek için, metale yönelik hiçbir kısıtlama kullanmadan ilk yapı belirleme çalışmasını gerçekleştirin.Metin protokolünde açıklandığı üzere, yapıları konjuge gradyan enerji minimizasyonu ile 4.000 iterasyon boyunca minimize etmeden önce; atamalardaki hataların yanı sıra NOE enerjisinin ve simüle edilmiş diz çökme (kneeling) parametrelerinin belirlenmesini kolaylaştırmak için kısıtlamaları kademeli olarak tanıtın. Tüm topluluk üzerinde kısıtlamaların tanıtımını iteratif bir şekilde gerçekleştirerek genellikle 50 üyeden oluşan nihai bir topluluk oluşturun ve bulunan her bir NOE etkileşimi türünün sayısını raporlayın. Son olarak, kanonik kimyasal geometriye ve ampirik NMR kaynaklı kısıtlamalara uyan bir yapı topluluğu oluşturun. Toplam konformasyon sayısını, bunlardan NMR kaynaklı kısıtlamaları ihlal edenlerin sayısını ve hem ana zincir hem de tüm ağır atom RMSD değerlerini içeren tüm topluluğun RMSD değerini raporlayın.Düşük enerjili topluluğu analiz edin ve metal iyonuna bağlanabilmek için hangi kalıntı yan zincirlerin birbirine uygun yakınlıkta olduğunu belirleyin. Bunlar belirlendikten sonra, bakır bağlanma verilerini de dahil ederek analizi tekrarlayın. NMR kaynaklı mesafe kısıtlamalarına ek olarak, belirlenen kalıntılara artık metal bağlanma kısıtlamalarını ekleyin.Metal iyonunu ve topolojisini tanımlamak için uygun parametreleri ekleyin. Kütle, diğer atomlarla olan bağ uzunlukları, açılar ve bağ yapmayan itme parametreleri gibi uygun fiziksel bilgileri parametre dosyasına girin. Bağlanma bilgilerini topoloji dosyasına ekleyin.Bu bilgiler, hangi bağların oluştuğunu ve koptuğunu ve bağlanma sonucunda hangi formal yüklerin değiştiğini içerir. Son olarak, daha önce yapıldığı gibi bir yapı topluluğu elde edin; çünkü çözülen topluluk, peptidin benimsediği konformasyonel alanı temsil eder. NMR ölçümü sırasında, bir başlangıç topluluğu oluşturmak için yapının tüm konformasyonlarını Mal Mall programına aktarın.Molekülün yerel stabilitesini belirlemek için topluluğu (ensemble) inceleyin. Sekans boyunca ardışık dört kalıntılık bölgeler seçip programın en düşük enerjili yapıya veya ortalamaya göre RMSD değerlerini hesaplamasını sağlayarak ana zincir ve yan zincir RMSD değerlerini belirleyin; yerel RMSD'yi sekansın bir fonksiyonu olarak çizdirerek molekülün hangi bölgelerinin yerel stabilite gösterdiğini tespit edin, topluluğu molekülün bu bölgesi boyunca üst üste bindirin ve sonraki analizler için bu topluluğu kullanın. NMR kaynaklı kısıtlamalara uygun, düşük enerjili konformasyonları seçin.Bunlar düşük enerjili topluluk kaydını oluşturacak ve topluluktaki konformasyon sayısını, bunların seçilme kriterlerini ve RMSD değerlerini raporlayacaktır. Metal bağlanma modu henüz belirlenmemişse, düşük enerjili topluluğu analiz edin ve hangi kalıntı yan zincirlerinin hatalı olduğunu belirleyin. Metal iyonunu bağlayabilmek için birbirlerine yakınlıkları.Metal bağlanmasından şüphelenilen atomlar arasındaki molekül içi mesafeleri belirlemek için KYMERA kullanın. Bunlar belirlendikten sonra topluluktaki ortalama mesafeleri hesaplayın. Analizi, bakır bağlanma verilerini de dahil ederek tekrarlayın.Topluluğu inceleyin ve MAL mall programının varsayılan arama parametrelerini kullanarak molekül içindeki yerel ikincil yapıyı belirleyin. Ardından, topluluğu kymera'ya aktarın. İkincil yapılar hidrojen bağları ile tutunur ve molekülün kararlı bölgelerini belirtir.Kymera aracı kullanılarak hidrojen bağlanmasını belirleyin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı şekilde yapısal analize devam edin. Ardından, birbirlerini nasıl desteklediklerini ortaya çıkarmak için tüm yapısal bulguları özetleyin. Bakır bağlayıcı protein modellerini incelemek için, türetilen lineer peptit içindeki bir proteinin korunmuş bağlanma dizisinin yapısı, peptidin 6,7 ile 8,5 arasındaki amit bölgesi kullanılarak çözelti durumunda NMR ile belirlenmiştir.Bakırla reaksiyona girdiğinde PP M'nin 6,6 ila 9,0 PP M'ye genişleme gösterdiği görüldü. Hafif bakır oksidasyonuna bağlı hat genişlemesi temel çizgide belirgindir. Burada bakıra bağlı peptidin Roy Toxi ve cozy spektrumlarının parmak izi bölgelerinin üst üste bindirilmiş hali gösterilmiştir. Örnek zamanla stabil kalmış olup spektrumlar iyi çözünürlükte çıkmış ve rosy deneyi ile elde edilen 81 NOE etkileşimi sağlamıştır.Molekül, NO C deneyinde sıfıra yakın NOE etkileşimleri verdiğinden, reaksiyona girmiş örnek için türetilen ancak metale yönelik hiçbir kısıtlama kullanılmayan peptit topluluğu, ana zincir ve ağır atomlar üzerinde sırasıyla 1,44 ve 2,07 angstrom RMSD değerleri ile 50 yapının 47'sini vermiştir. Bunların arasından, ana zincir ve ağır atomlar üzerinde sırasıyla 0,25 ve 0,61 angstrom RMSD değerlerine sahip 13 düşük enerjili konformer ileri analizler için seçilmiştir. Yerel RMSD grafiği, üçüncü ve yedinci kalıntılar arasında bir stabilite bölgesi göstermiştir; prolin kalıntısını içeren rijit C-terminal bölgesine ek olarak, bu bölge tüm konformasyonlarda dördüncü ve yedinci kalıntılar arasında bükülmüş bir konformasyonda bulunmaktadır.Bükülme konformasyonu, ana zincir donörleri ve akseptörleri olan glisin beş ve üç anine iki'nin yanı sıra sisteini altı ve sistein üç arasındaki hidrojen bağları ile stabilize edilmiştir. Bu bükülme, bu bölgedeki düşük ortaklaşma değerleri ile sistein üç ve sine yedide de belirgindir. Konformasyonlar bu bölge üzerinden üst üste bindirilmiş ve sistein üç, sistein altı ve metiyonin bir potansiyel bağlama kalıntıları olarak değerlendirildiğinde olası bağlama kalıntıları açısından analiz edilmiştir.En kısa kükürt-kükürt atom mesafesi, sistein üç ve sistein altının folat grupları arasındaydı; bakır bağlanması eklenmiş ve analizde kullanılan topluluğu elde etmek için hesaplama tekrarlanmıştır. Bakıra bağlı peptidin düşük enerjili topluluğu, uç terminal aminin bağlı bakıra yakın olduğunu göstermektedir. Burada, pozitif potansiyelin mavi ve negatif potansiyelin kırmızı ile gösterildiği elektrostatik potansiyel dağılım izoyüzeyi sunulmuştur.Arjinin kalıntısı, peptit omurgasından uzanarak elektrostatik potansiyelin pozitif bir lobunu oluştururken, omurga karbonları daha az belirgin bir negatif elektrostatik potansiyel oluşturacak şekilde bir hat boyunca dizilmiştir. Bu yöntem kavrandıktan sonra, yapısal analiz için kullanılabilecek bir konformasyon topluluğu elde etmek amacıyla, yaklaşık bir haftalık NMR süresinde bir yapısal belirleme ve ardından birkaç günlük veri işleme çalışması yapılabilir. Bu prosedürün ardından, bakır iyonunun farklı derecelerdeki bağlanma ve salınımı için gerekli koşullara yönelik ek soruları yanıtlamak amacıyla diğer peptit mutantları ve farklı koşullar analiz edilebilir.

structure-coordination-determination-peptide-metal-complexes-using-1d

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

Peptid-metal Komplekslerinin 1D ve 2D 1H NMR Kullanarak Yapı ve Koordinasyon Belirlenmesi

Bu protokol, antikanser ilaçların BBR3464 ve pikoplatin yönlerini birleştiren çok çekirdekli platin kompleksleri, sentezinde kullanılmak için müsait köprü ligandlar oluşturmak için izonikotinik asit ve diamino-amid birleştirme reaksiyonlarının kullanımı açıklanmaktadır.

Çekirdekli Antikanser Maddeleri olarak Platinum bispiridin tabanlı Ligandların ve kompleks Sentezlenmesi için kullanılan amid bağlantı reaksiyon

Rutenyum fosfin kompleksleri yaygın olarak sıvılaştırma homojen katalitik reaksiyonlar için kullanılmaktadır. N -triphos ligand N (CH2 PPh 2) 3 taşıyan yeni üç dişli rutenyum komplekslerinin bir dizi sentezi rapor edilmiştir. Buna ek olarak, levulinik asit ile dihidrid Ru- N -triphos kompleksinin stoikiometrik reaksiyon tarif edilmiştir.

Rutenyum bir Serisi Sentezi, Karakterizasyonu ve Tepkime<em&gt; K</em&gt; -triphos<sup&gt; Ph</sup&gt; Kompleksi

Bu makale, polar olmayan çözücülerden yeniden kristalize edilen birincil amonyum trifenilasetatlar kullanılarak kristallerde bir dizi hidrojen bağlayıcı supramoleküler kümenin inşasını açıklamaktadır. Supramoleküler kümelerin bu seçici yapısı, supramoleküler kümeler ve bileşenleri arasındaki korelasyon hakkında etkili sistematik simetrik çalışmalara yol açar.

İnşaat ve İkili veya Üçlü Amonyum trifenilasetatlar ile Supramoleküler Kümeleri Bir Seri Sistematik Simetrik Çalışmaları

Cıva(II)'nin disisteinil tetrapeptitlere farklı nispi oranlarında oluşan komplekslerin elektrosprey iyonizasyon orbitrap kütle spektrometresi ile karakterizasyonu sunulmuştur.

Elektrosprey İyonizasyon kütle spektrometresi ile Dicysteinyl tetrapeptidlerle ile Merkür (II) kompleksinin Bir Çalışma

Supramolecular protein derlemeler atomik çözünürlükte yüksek alaka nedeniyle çok önemli rolleri biyolojik olayları çeşitli yapılardır. Burada, biz bir protokol tarafından magic-açı katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (MAS SSNMR) iplik çözünmez ve kristal makromoleküllerin protein derlemeler üzerinde yüksek çözünürlüklü yapısal çalışmalar gerçekleştirmek için mevcut.

Atomik yapısal çalışmaların makromoleküllerin meclisleri tarafından katı hal Nükleer manyetik rezonans spektroskopisi

Sistein-zengin peptidler onların disülfür bağlantısı bağlı olarak farklı üç boyutlu yapılar içine katlayın. Arabellek oksidasyon istenen disülfür bağlantı yol değil tek tek disülfit izomerler hedeflenen sentezi gereklidir. Protokol ile 3 disülfür bağ peptidler ve NMR ve MS/MS çalışmaları kullanarak onların yapısal analiz sentez seçici fırsatlar.

Sentez ve μ-Conotoxin PIIIA izomerler farklı disülfür Connectivities ile yapı belirlenmesi

Imine metatez için yeni bir grup IV metal katalizör dehidroksiled silika üzerine amin metal kompleksi aşılanması ile hazırlanır. Yüzey metal parçaları FT-IR, elementer mikroanaliz ve katı hal NMR spektroskopisi ile karakterize edilir. Daha fazla dinamik nükleer polarizasyon yüzeyi geliştirilmiş NMR spektroskopi deneyleri koordinasyon küresinin belirlenmesini tamamlar.

Yüzey Organometalik Kimya metodolojisini kullanan Silika Destekli Katalizörler tarafından Imine Metatez

Iyon hareketlilik-kütle spektrometresi ve moleküler modelleme teknikleri, tasarlanmış metal bağlayıcı peptidlerin ve bakır bağlayıcı peptid metanobakinin seçici metal şelat performansını karakterize edebilir. Metal şelat peptidler yeni sınıflar geliştirilmesi metal iyon dengesizliği ile ilişkili hastalıklar için terapötik yol yardımcı olacaktır.

Metal Bağlama Oligopeptidlerinin Yapısı ve Mekanizmalarının Belirlenmesinde Iyon Hareketliliği-Kütle Spektrometresi Teknikleri ve Metal Bağlayıcı Oligopeptidlerin Redoks Aktivitesi

Karaciğer alkol dehidrogenaz SNS pincer kobalt (II) model kompleksleri hazırlanması burada sunulmaktadır. Kompleksler CoCl2·6H2O ile ligand öncülü tepki vererek hazırlanabilir ve daha sonra diethyl eter yavaş yavaş kobalt kompleksi içeren bir asetonitril çözeltisi içine yayılarak izin vererek yeniden kristalize edilebilir.

Karaciğer Alkol Dehidrogenaz SNS Kobalt(II) Kıskaç Model Kompleksleri Hazırlanması

Bir dizi sıcaklık üzerinde toplanan NMR spektrumlarının çizgi şekli analizi, kiral, sekiz koordinatlı, renyum (V) polihidrit kompleksi, ReH5 (PPh3) 2 (sn-bütil amin) iç koordinasyon-küre atomlarının yeniden düzenlenmesi için bir kılavuz görevi görür. Çizgi şekli analizi, bu atom yeniden düzenlemeleri için ΔH‡, ΔS‡ ve ΔG‡ aktivasyon parametrelerini belirlemek için de kullanılır.

Kiral Renyum Polihidrit Kompleksinde Koordinasyon Küresi Yeniden Düzenlemelerini Karakterize Etmek için Dinamik NMR Spektrumlarının Çizgi Şekli Analizi

Öğrenin, bakır bağlı metalokaperon model peptidinin yapısını 1D ve 2D ¹H NMR kullanarak nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, metal iyonu taşıma mekanizmalarını incelemek için yapısal biyoloji araştırmalarına katkı sağlar.

Peptit-Metal Komplekslerinin Yapı ve Koordinasyon Tayini 1D ve 2D ¹H NMR Kullanılarak

Daha fazla video keşfet