Peptit-Metal Komplekslerinin Yapı ve Koordinasyon Tayini 1D ve 2D 1H NMR Kullanılarak
December 16th, 2013
Cu (I) içeren bir metalokoperon model peptidin NMR çözelti yapısı belirlendi ve numune hazırlama ve 1D ve 2D veri toplamadan üç boyutlu bir yapıya kadar ayrıntılı bir protokol açıklandı.
Bu prosedürün genel amacı, bakır ile komplekslenmiş bir Metallo şaperon proteini mimetik peptidinin yapısını belirlemektir. Bu, önce numunenin oksijensiz bir ortamda hazırlanmasıyla gerçekleştirilir. İkinci adım, hidrojen atomları arasındaki etkileşimleri gösteren nükleer manyetik rezonans veya NMR spektroskopi verilerini elde etmektir.
Daha sonra, uzamsal etkileşimler doğrusal bir peptit şablonuna eşlenir. Son adım, verilere uyan temsili bir düşük enerji yapısı bulmaktır. Sonuç olarak, NMR'den türetilmiş yapılar, bağlanma modunu belirlemek ve bakır bağlı kompleks üzerinde yapısal analiz yapmak için kullanılır.
Bu tekniğin x-ışını kristalografisi gibi mevcut tekniklere göre en büyük avantajı, haftalık bağlanma komplekslerine ve ayrıca kristalleşmeyen moleküllere ve komplekslere bakmak için kullanabilmenizdir. Bu yöntem bakır bağlayıcı proteinler hakkında bilgi sağlayabilir. Proteinlerin hücre hattı ortamında temel, ancak potansiyel olarak toksik metal iyonlarının güvenli bir şekilde verilmesini nasıl sağladığını incelemek için diğer metal parçalar gibi diğer sistemlere de uygulanabilir.
Başlamak için, bakırın oksitlenmesini önlemek için numuneleri oksijensiz bir ortamda hazırlayın, APO numunesini hazırlamak için, yaklaşık bir ila iki miligram peptidi 450 ila 500 mikrolitre Döteryumlu NMR dereceli çözücü içinde çözün, bakır reaksiyona giren numune için APO peptidi ile aynı miktarı 450 ila 500 arasında bir EQU molar metal tuzu ile çözün. NMR çözücünün mikrolitreleri, her bir çözeltiyi, bir merkez cam filtrasyon kağıdı veya incelenen bileşiklere uyan ve bunları emmeyen başka bir teknik kullanarak filtreler. Bu, homojenliği etkileyecek herhangi bir metalik parçacığı uzaklaştırmak için gereklidir.
Çözeltileri NMR tüplerine aktarın ve tüplerdeki numuneleri kapatın. Torpido gözünden ayrılmadan önce numuneleri torpido gözünden çıkarın ve kapatın. APO ve bakır reaksiyona giren örneklerin tek boyutlu proton spektrumlarını NMR makinesinde kaydedin ve karşılaştırın.
APO peptidi esnektir ve ortalama bir onay gösterir, ancak bakır ile reaksiyona girdiğinde, bağlı peptit amidleri daha sert bir yapıya sahiptir. Bu nedenle, bakır içeren peptit spektrumu, amid bölgesindeki kimyasal kaymada önemli bir değişiklik göstermelidir ve tepe noktaları çözülebilir. Metin protokolünde açıklandığı gibi aynı koşullar altında optimize edilmiş, rahat toks, meraklı veya pembe NMR deneyleri kurun ve sırayla çalıştırın.
Veri toplama boyunca numune kompozisyonunun sabit kaldığından emin olmak için her deney arasında tek boyutlu deneyler yapın. Verileri metin protokolünde tartışıldığı gibi işledikten sonra, noea ve rosy spektrumu üzerine yerleştirilmiş bir dizi rahat ve spektrum hazırlayın. Spektrumdaki tüm NOE tepe noktalarını atamak için.
Parmak izi bölgesindeki toksis sinyalleriyle örtüşen tepe noktaları atayarak başlayın. Bu, Sparky programı kaydı ile sonraki tepe atama girişlerini kolaylaştıracağından, atanan tepe noktaları H alfa'yı amid proteini birleştirme değerlerine dedal açılarına çevirir. Ayrıca, tepe noktalarını program içinden entegre ederek ve bunları bilinen mesafenin bir etkileşimini kullanarak çevirerek tepe noktalarını mesafe kısıtlamalarına çevirin.
Tepe noktaları çakışıyorsa veya otomatik entegrasyon yöntemleri kullanılamıyorsa, tepe noktaları görsel tahminle güçlü, orta, zayıf veya çok zayıf olarak etiketlenebilir ve bu tanımlamalar sırasıyla 2,5, 3,5, 4,5 ve 5,5 angstrom'a kadar olan mesafelere çevrilebilir. Mesafe kısıtlamalarını ve dedal açılarını keşfetmek için doğru formatta içe aktarın. Keşfet, kanonik kimyasal geometriye uyan yapıları bulmak için onay alanını arayacaktır.
Bu parametrelerin hiçbirinin ihlal edilmediği bir topluluk oluşturmak için deneysel olarak bulunan mesafe kısıtlamalarına ek olarak. Bu, başlangıç topluluğunu oluşturacaktır. Hangi kalıntıların herhangi bir önyargı olmaksızın metal bağlamaya katıldığını bulmak için metal üzerinde herhangi bir kısıtlama kullanmadan ilk yapı belirleme çalışmasını gerçekleştirin.
4.000 yineleme için eşlenik gradyan enerji minimizasyonu kullanarak yapıları en aza indirmeden önce, metin protokolünde açıklandığı gibi NOE enerjisi ve simüle edilmiş diz çökme parametrelerinin yanı sıra atamadaki hataların belirlenmesini kolaylaştırmak için kısıtlamaları kademeli olarak tanıtın, genellikle 50 üyeden oluşan son bir topluluk oluşturun, tüm topluluk üzerinde yinelemeli bir şekilde kısıtlamaların tanıtımını gerçekleştirin, bulunan her bir NOE etkileşimi türünün sayısını bildirin. Son olarak, kanonik kimyasal geometriye ve ampirik NMR'den türetilmiş kısıtlamalar Raporuna uyan bir yapılar topluluğu oluşturun. Toplam onay sayısı, NM Rived kısıtlamalarını ihlal edenlerin sayısı ve hem omurga hem de tüm ağır atom RMSD değerleri dahil olmak üzere tüm topluluğun RMSD'si.
Düşük enerjili topluluğu analiz edin ve metal iyonunu bağlayabilmek için hangi kalıntı yan zincirlerinin birbirine doğru yakın olduğunu belirleyin. Bunlar belirlendikten sonra, bakır bağlama verileri de dahil olmak üzere analizi tekrarlayın. NMR'den türetilen mesafe kısıtlamalarına ek olarak, şimdi belirlenen kalıntılara metal bağlama kısıtlamaları ekleyin.
Metal iyonunu ve topolojisini tanımlamak için uygun parametreler ekleyin. Diğer atomlarla kütle bağı uzunlukları, açılar ve bağlanmayan itme parametreleri gibi uygun fiziksel bilgileri parametre dosyasına girin. Bağlama bilgilerini topoloji dosyasına ekleyin.
Bu bilgiler, hangi bağların oluşturulduğunu ve kırıldığını ve bağlamanın bir sonucu olarak hangi resmi ücretlerin değiştirildiğini içerir. Son olarak, çözülmüş topluluk, peptit tarafından benimsenen doğrulama alanını temsil etmeden önce olduğu gibi bir yapı topluluğu edinin. NMR ölçümü sırasında, bir başlangıç topluluğu oluşturmak için yapının tüm onaylarını Mal Mall programına aktarın.
Molekülün yerel stabilitesini belirlemek için topluluğu inceleyin. Dizi boyunca sonraki dört kalıntı bölgesini seçerek ve programın RMSD'yi en düşük enerji yapısına veya ortalamaya kadar hesaplamasını sağlayarak omurga ve yan zincir RMSD değerlerini belirleyin, yerel RMSD'yi dizinin bir fonksiyonu olarak çizerek molekülün hangi bölgelerinin yerel kararlılık gösterdiğini belirleyin, topluluğu molekülün bu bölgesi boyunca kaplayın ve daha fazla analiz için bu topluluğu kullanın. NMR'den türetilen kısıtlamalara uyan düşük enerji onaylarını seçin.
Bunlar, düşük enerjili topluluk kaydını oluşturacak ve topluluktaki onay sayısını, bunları seçme kriterlerini ve RMSD değerlerini rapor edecektir. Metal bağlama modu henüz belirlenmediyse, düşük enerjili grubu analiz edin ve hangi kalıntı yan zincirlerinin yanlış olduğunu belirleyin. Metal iyonunu bağlayabilmek için birbirine yakınlık.
Metal bağlanmasından şüphelenilen atomlar arasındaki molekül içi mesafeleri belirlemek için KYEMERA'yı kullanın. Bunlar belirlendikten sonra topluluktaki ortalama mesafeleri hesaplayın. Bakır bağlama verileri de dahil olmak üzere analizi tekrarlayın.
Topluluğu inceleyin ve MAL alışveriş merkezi programının varsayılan arama parametrelerini kullanarak molekül içindeki yerel ikincil yapıyı belirleyin. Ardından, topluluğu kymera'ya aktarın. İkincil yapılar hidrojen bağı ile tutulur ve molekülün kararlı bölgelerini gösterir.
Kymera aracını kullanarak hidrojen bağlanmasını belirleyin. Metin protokolünde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi yapısal analize devam edin. Daha sonra, birbirlerini nasıl güçlendirdiklerini ortaya çıkarmak için tüm yapısal bulguları toplayın Bakır bağlayıcı protein modellerini incelemek için, türetilmiş doğrusal peptit içindeki bir proteinin korunmuş bağlanma dizisinin yapısı, peptitin amid bölgesi olan çözelti durumu NMR ile belirlendi.
PP M, bakır ile reaksiyona girdikten sonra 6.6 ila 9.0 PP M'ye kadar bir genleşme gösterdi. Burada, Roy Toxi'nin parmak izi bölgelerinin bir kaplaması ve bakır bağlı peptidin rahat spektrumları gösterilmektedir. Numune zamanla stabildi ve spektrumlar iyi bir şekilde çözüldü ve pembe bir deneyle elde edilen 81 NOE etkileşimi verdi.
Molekül, NO C deneyinde sıfıra yakın NOE etkileşimleri verdiğinden, reaksiyona giren numune için türetilen, ancak metale herhangi bir kısıtlama kullanmayan peptit topluluğu, omurga ve ağır atomlar üzerinde sırasıyla 1.44 ve 2.07 angstrom RMSD değeri olan 50 yapı dışı 47'yi verdi. Bunlardan 13 düşük enerjili konformer, omurga ve ağır atomlar üzerinde sırasıyla 0.25 ve 0.61 angstrom RMSD değerleri ile daha fazla analiz için seçildi. Yerel RMSD grafiği, üç ve yedi kalıntılar arasında bir stabilite bölgesi gösterdi Bir prolen kalıntısı da dahil olmak üzere rijit C terminal bölgesine ek olarak, bu bölge tüm teyitlerde dört ve yedi kalıntılar arasındaki bir bükülme onayında bulunur.
Bükülme onayı, omurga donörleri ve alıcıları arasındaki hidrojen bağı ile stabilize edilir: glisin beş ve üç anin iki, ayrıca sistein altı ve sistein üç. Bu eğilme, bu bölgedeki azalmış eşleşme değerleri ile sistin üç ve sinüs yedide de belirgindir. Doğrulamalar bu bölge üzerine bindirildi ve potansiyel bağlanma kalıntıları olarak sistin üç, sistin altı ve metiyonin bir düşünüldüğünde olası bağlanma kalıntıları için analiz edildi.
En kısa kükürt-kükürt atomu mesafesi, sistein üç ve sistein altı folat grupları arasında, bakır bağlamasının tanıtılması ve analiz için kullanılan topluluğu vermek için hesaplamanın tekrarlanmasıydı. Bakır bağlı peptitin düşük enerjili topluluğu, uç terminal aminin bağlı bakıra yakın olduğunu gösterir. Burada gösterilen, pozitif potansiyeli mavi ve negatif potansiyeli kırmızı ile gösterilen elektrostatik potansiyel dağılım izoyüzeyidir.
Arginin kalıntısı, elektrostatik potansiyelin pozitif bir lobunu oluşturan peptidin omurgasından uzanırken, omurga karbon verimleri, daha az belirgin bir negatif elektrostatik potansiyel oluşturan bir çizgide düzenlenir. Bir kez ustalaştıktan sonra, yapısal analiz için kullanılabilecek bir dizi onay elde etmek için yaklaşık bir haftalık NMR süresi ve birkaç günlük bir çalışma daha içinde yapısal bir belirleme yapılabilir. Bu prosedürü takiben, bakır iyonunun farklı derecelerde bağlanması ve salınması için gerekli koşulları ele alan ek soruları yanıtlamak için diğer peptit mutanları ve farklı koşullar analiz edilebilir.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Genel Bakış
Bu çalışma, NMR spektroskopisini kullanarak bakırla kompleks halinde olan bir metallochaperon protein mimetik peptid kompleksinin yapısının belirlenmesine odaklanmaktadır. Protokol, oksijensiz ortamda numune hazırlama, veri toplama ve yapısal analizi içerir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Yapısal Biyoloji
- Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) Spektroskopisi
- Metallochaperone Araştırması
Arka Plan
- Metallochaperones, metal iyonlarının taşınmasına yardımcı olan proteinlerdir.
- Bakır, çeşitli biyolojik süreçlerde kritik bir rol oynayan esansiyel bir metaldir.
- NMR spektroskopisi, moleküler yapıları incelemek için güçlü bir tekniktir.
- Metallochaperones'in yapısının anlaşılması, işlevleri ve etkileşimleri hakkında bilgiler sağlayabilir.
Çalışmanın Amacı
- Bakır bağlı bir metallochaperon model peptidin yapısını belirlemek.
- Peptidin bakır bağlanma modunu analiz etmek.
- NMR veri toplama ve analizi için detaylı bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Oksijensiz ortamda numune hazırlama.
- Hidrojen atomu etkileşimlerini gözlemlemek için NMR spektroskopisi verilerinin elde edilmesi.
- Uzaysal etkileşimlerin lineer bir peptid şablonuna haritalanması.
- Verilere uyan temsili bir düşük enerji yapısının tanımlanması.
Ana Sonuçlar
- Metallochaperone model peptidin NMR çözüm yapısı başarıyla belirlendi.
- Veri analizi, bakırın peptit ile bağlanma etkileşimlerini ortaya koydu.
- NMR verileriyle uyumlu bir düşük enerji yapısı tanımlandı.
- Bulgular, metallochaperon işlevinin yapısal temelini anlamak için katkıda bulunuyor.
Sonuçlar
- Çalışma, NMR kullanarak metallochaperon yapılarını belirlemeye yönelik kapsamlı bir protokol sağlamaktadır.
- Bu araştırmadan elde edilen bilgiler, metallochaperon mekanizmaları üzerindeki gelecekteki çalışmalara bilgi verebilir.
- Metod, yapısal analiz için diğer metalloproteinlere uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Determining the solution-state structure of peptide-metal complexes enables mechanistic de-risking in target validation for metalloprotein drug discovery. NMR-derived structural insights support predictive confidence in early discovery by clarifying binding modes without crystallization bias. This approach informs portfolio triage for targets involving essential yet toxic metal ions like copper.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by mapping metal-binding residues in peptide models under unbiased conditions.
- Operational Value: Enables biological de-risking through structural analysis of metal coordination without preset ligand constraints.
- Predictive Value: Supports target confidence by identifying low-energy conformations that satisfy experimental NOE and dihedral constraints.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Prepares validated biological systems for downstream workflows via oxygen-free sample handling to preserve metal redox state.
- Quantitative Outputs: Generates distance and angle constraints from NOESY, COSY, TOCSY, and ROESY spectra for structural modeling.
- Reproducibility: Ensures spectral consistency through 1D proton monitoring between 2D experiments to detect sample degradation.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models metallochaperone function in copper homeostasis, a pathway implicated in neurodegenerative and oncological disorders.
- Translational Continuity: Links discovery-stage structural data to preclinical validation by defining metal-binding geometry and electrostatic potential maps.
- Risk-Adjusted Advancement: Informs go/no-go decisions by characterizing binding affinity proxies through residue proximity and hydrogen-bond network analysis.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from target validation through lead optimization by providing atomic-resolution insights into metalloprotein-ligand interactions.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by determining which residues participate in metal binding without bias.
- Screening: Delivers assay-ready, reproducible peptide-metal complexes with defined structural ensembles for compound screening.
- Analytics: Provides quantitative dihedral angles and distance constraints (up to 5.5 Å) that enable comparative analysis of binding modes.
- Translational Research: Connects to preclinical work via structural ensembles that inform mutagenesis and binding affinity studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable NMR workflow applicable to other metallochaperones and metal-ion systems beyond copper.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in metalloprotein function through unbiased structure determination.
- Operational Value: Ensures standardization and reproducibility via oxygen-free sample preparation and iterative constraint refinement.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing structural evidence for target engagement and binding specificity.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of metalloprotein targets based on solvable, biologically relevant conformations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in NMR spectroscopy, protein/peptide chemistry, and molecular modeling software (e.g., Sparky, Explore, MALMOL, KYMERA).
- Dependent on high-field NMR instruments capable of 1D and 2D experiments (COSY, TOCSY, NOESY, ROESY) under anaerobic conditions.
- Necessitates cross-team standardization for sample handling, data processing, and constraint validation across structural biology and medicinal chemistry groups.
- Involves adaptation considerations when extending to other metal ions (e.g., Zn, Fe) due to differences in coordination geometry and redox sensitivity.
- Practical limitation: Structural accuracy depends on NOE completeness and assignment quality, particularly in flexible regions as noted in the apo-state peptide.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:35
Sample Preparation
2:45
NMR Data Collection and Processing
3:50
Peak Assignment and Integration Using SPARKY
5:07
Molecular Mechanics Calculations to Generate Structure Ensemble Using XPLOR
8:07
Structure Analysis
14:04
Conclusion
10:39
Results: Structural Analysis of a Metallochaperone Protein-mimetic Peptide-copper Complex
