İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Bu prosedürün genel amacı, insan kemik iliğinin hücresel ve hücre içi mikro çevresini yakından özetleyen bir kültür sistemi kurmaktır. İlk olarak, bir doku kültürü kuyusunun yüzeyi endüstriyel matris ile kaplanır. Daha sonra kemik iliği mononükleer hücreleri veya diğer ilgili hücreler kemik iliği matrisi ile karıştırılır.

Daha sonra endüstriyel matris çıkarılır ve hücre matrisi karışımı kuyuya eklenir. Matris jölelendikten sonra, büyüme ortamı ile kaplanır. Sonuç olarak, hücreler doğrudan matriste görselleştirilebilir veya hücrelerin kültürlenmesi için mevcut yöntemlerle karşılaştırıldığında, aşağı akış analizleri için izole edilebilir.

Örneğin, standart doku kültürü yöntemleri veya hücrelerin plastik üzerinde büyütüldüğü ko-kültür modelleri. Bir 3D kültür yöntemi kullanmanın temel yararı, hücrelerin fizyolojik mikro ortamda büyütülmesidir ve bu nedenle, hücrelerin dokunun doğal koşulları içinde incelenmesine izin verir. Hücrelerin kaplanacağı 48 oyuklu bir plaka hazırlayın.

Önce her birine 65 mikrolitre endüstriyel kaplama çözeltisi ekleyerek, çözeltiyi kuyunun tüm yüzeyini kaplayacak şekilde eşit şekilde yayın. Bu yöntem diğer yüzeylere de ölçeklenebilir. Plakaların oda sıcaklığında en az 30 dakika inkübe etmesine izin verin.

Bu arada, mikrolitre PBS başına 50.000 hücrenin hücre süspansiyonunu hazırlayın. Her bir oyuğa 10 mikrolitre ekleyecek kadar hazırlayın, ardından bir einor tüpünde, hücre süspansiyonunu her biri 100 mikrolitre yeniden yapılandırılmış kemik matrisi ile karıştırın. İyice karıştırın ve kabarcıklar oluşturmaktan kaçının.

Karışımı buz üzerinde tutun, böylece plaka bittiğinde matris jelleşmez. İnkübe etme, tüm sıvıyı ve dote kaplama solüsyonunu aspirasyon yoluyla çıkarın. Daha sonra her birine matris ile 100 mikrolitre iyi karıştırılmış hücre süspansiyonu ekleyin.

yüzeyini eşit şekilde kaplamak için bir pipet kullanarak plakayı hızlı bir şekilde eğin. Hücreler tamamen yüklendiğinde topaklanacağından, süspansiyonu kuyu dolguları arasında karıştırmaya devam edin. Matris katılaşana kadar plakayı çalkalamadan 30 ila 60 dakika inkübe edin.

Daha sonra, kemik iliği büyüme ortamını 37 santigrat dereceye ayarlanmış bir su banyosunda önceden ısıtın. 30 dakikalık inkübasyondan sonra, matrisin düzgün şekilde ayarlanıp ayarlanmadığını kontrol edin. İyi bir matris, plaka eğildiğinde hareket etmeyen yumuşak jel benzeri bir tabaka oluşturur.

Matris hazır olduğunda, serolojik bir pipet kullanarak damla damla mililitre orta ile hafifçe kaplayın. Daha sonra, monte edilmiş yeniden yapılandırılmış kemik matrisi kültürünü, herhangi bir ortam değişikliği olmadan 30 güne kadar inkübatöre geri koyun. Bir ortam değişikliği gerekiyorsa, ortamın yalnızca yarısını bir kerede değiştirin.

Matris katmanını bozmadan ortamı nazikçe çıkarın. Plakayı eğin ve bir pipet kullanarak ortamı nazikçe boşaltın. Ortamı daha sonra matris üzerinden aspire etmeyin.

Hücreleri boyarken. Çözüm değişiklikleri için bu tekniği kullanın. Medyayı bir 3D kültürün kuyularından çıkarmak için, kuyunun yanından çıkarılması çok önemlidir.

Aksi takdirde, matris bozulur ve aynı tekniğe bağlı kalarak hücreler kaybolabilir. Hücreleri steril bir XPBS ile iki kez yıkayın. Daha sonra her birine yarım mililitre buz gibi soğuk hücre geri kazanım solüsyonu ekleyin.

Hücrelerle birlikte tüm matris katmanını, kuvvetlice yukarı ve aşağı pipetleyerek çıkarın. Her biri için, koleksiyonu bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra aynı kuyucuğa yarım mililitre daha geri kazanım çözeltisi ekleyin ve kalan tüm malzemeyi toplayın.

Tüm koleksiyonları girdaplayın ve buz üzerinde bir saat kuluçkaya yatırın. Bir saat boyunca, matristen hücre salınımını kolaylaştırmak için tüpleri her 15 dakikada bir girdaplayın. Bir saat sonra, karışımı görünür matris kümeleri için kontrol edin.

Hiçbiri bulunmamalıdır, ancak varsa, karışımı daha büyük bir tüpe aktarın ve iki ila beş mililitre hücre geri kazanım çözeltisi ekleyin. Daha sonra hücreleri 30 ila 60 dakika daha inkübe edin. Periyodik olarak girdap yapın ve matris kümeleri olup olmadığını tekrar kontrol edin.

Matris artık kümelenmediğinde. Karışımı 1000 RPM'de dört santigrat derecede beş ila 10 dakika santrifüjleyin. Daha sonra süpernatanı çıkarın ve hücre peletini bir mililitre soğuk XPBS'de yeniden süspanse edin.

Santrifüjlemeyi tekrarlayın. Süpernatanı taze PBS ile değiştirin ve yıkamayı tekrarlayın. Üçüncü kez.

Üçüncü PBS yıkamasından sonra, hücreleri bir sonraki prosedür için uygun solüsyonda geri kazanın. Kemik iliği hücreleri 30 gün boyunca yeniden yapılandırılmış kemik matriksinde büyütüldü ve 200 kat büyütmede ışık mikroskobu ile periyodik olarak görüntülendi. Stromal elementler ilk olarak beşinci günde tespit edildi, ancak 14. günde açıkça belirgindi.

Kültür periyodu boyunca, hücreler matris boyunca göç etti ve farklı kümeler halinde toplandı. Malign hücre kitleleri, RBM'de büyüyen stromal bileşenlerin bileşimini değerlendirmek için zamanla genişledi. RBM ile endüstriyel kaplama arasındaki geçişteki hücrelerin morfolojisi değerlendirildi.

Hücreler fibronektin, aktin ve çekirdekler için boyandı. Stromal morfolojiye sahip görselleştirme hücrelerinin, yüksek seviyelerde alkalin fosfataz aktivitesine sahip pres osteoblastlar olduğu gösterildi. Zarin tarafından belirlendiği gibi kalsiyumu mineralize edebildiler, görünür bir lipit damlacıkları varlığına sahip kırmızı boyama hücreleri, yağ ile pozitif boyamaya dayalı olarak adipositler olarak tanımlandı.

Ara sıra çoklu çekirdeğe sahip kırmızı hücreler pres osteoklast olarak kabul edildi ve tartarat dirençli asit fosfataz için pozitifti. Hücrelerin bir 3D kültürden izole edilmesinin ardından çeşitli şeyler yapabilirsiniz. Örneğin, mikro çevrede yetişen çeşitli hücrelerin hücresel fenotiplerini inceleyebilirsiniz.

Gen ve protein ekspresyonunu inceleyebilir ve hatta bu hücreler tarafından 3D koşullar altında ne tür moleküller salgılandığını belirleyebilirsiniz.