Name: Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min
Description: Keşfedin, meme kanseri hücre hatları ile kültürlenmiş periferik kan monositlerinden osteoklastogenezin insan preklinik modelini. Bu yöntem, kemik metastazı ve kemik mikroçevresindeki kanser hücresi etkileşimlerini incelemek için değerli bir araçtır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Yibin SCP2 hücre kültürünü sağlamak için Kang ve Cristiano Verna Editör Yardım için teşekkür etmek istiyorum.

insan Osteoklastlar farklılaşmış PBMCs yazılı Onam çalışmaya katılmak için veren sağlıklı donör dan. Çalışma Protokolü 1964 Helsinki Bildirgesi içinde ortaya konan etik standartlarına uygun olarak yerel Etik Komitesi tarafından kabul edildi.
 1. Osteoklast farklılaşma Not: toplamak periferik kan veya buffy kat EDTA içinde sağlıklı insan bağışçılardan. Daha az 20 mL periferik kan kullanmayın. Onlar mononükleer hücreler büyük bir bolluk var çünkü buffy kat tercih edilir. Steril doku kültürü mahallede tüm aşağıdaki adımları gerçekleştirin.
<ol><li>Seyreltik EDTA tam kan fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 1 ile 1:1. De yeniden askıya.</li>
	<li>Katman lenfosit ayrılık medya (PBS kan: lenfosit ayrılık medya, 2:1) 50 mL tüpler.
	<ol><li>30 mL 50 mL tüp içine PBS içinde seyreltilmiş kan pipet.</li>
		<li>Yavaşça lenfosit ayrılık medya 15 mL 50 mL tüp dibine temelini.</li>
	</ol></li> <li>(Fren yok) oda sıcaklığında 10 dakika vasıl 757 × g santrifüj.</li>
	<li>Mononükleer hücre toplama: <ol><li>5 mL pipet içeren mononükleer hücrelerin beyaz katman Tantanacı olmadan toplamak ve yeni bir 50 mL tüp içinde yerleştirin.</li>
		<li>20 mL PBS ile toplanan PBMCs sulandırmak.</li>
	</ol></li> <li>PBMCs yıkama: <ol><li>oda sıcaklığında 5 min için 225 x g, santrifüj.</li>
		<li>Süpernatant tüp ters çevirme tarafından atmak. Bir kez yineleyin.</li>
	</ol></li> <li>RBC lizis: Not: hücre Pelet kırmızı hücreleri arabellek çözüm lysing kırmızı kan hücresi ile tedavi edin (bkz. Tablo malzeme).
	<ol><li>Buz üzerinde 50 mL tüp</li>
		<li>Alyuvar arabellek lysing 5 mL ekleyin.</li>
		<li>Eritrosit lizis tamamlamak için 3-5 dakika bekleyin. Zaman eritrosit kirlilik derecesine göre değişir.</li>
		<li>Reaksiyon PBS 20 mL ekleyerek durdurmak.</li>
		<li>Santrifüj 225 x g oda sıcaklığında 5 min için. Süpernatant tüp ters çevirme tarafından atın. 
		Not: İsteğe bağlı: RBC lizis gerçekleştirilirse, aşağıda açıklandığı gibi PBMCs yıka.</li>
	</ol></li> <li>Yıkama PBMCs: <ol><li>, 225 x g oda sıcaklığında 5 min için PBS ve santrifüj 20 mL ekleyin.</li>
		<li>Tüpü ters çevirme süpernatant atmak.</li>
	</ol></li> <li>Tam α-MEM (%1 glutamin (ilk toplama 100 X) ve % 10 fetal sığır serum ile desteklenmiş) hücreleri yeniden askıya alma.</li>
	<li>Neubauer odası içeren hücreleri saymak.
	<ol><li>Örnek 1: 100 buzul Asetik asit seyreltik ve hücreleri saymak için seyreltme 10 µL kullanın.</li>
		<li>En az iki kez saymak ve hücre toplam ortalama sayısı toplanan almak için çoğaltır ortalamasını hesaplamak.</li>
	</ol></li> <li>Plaka hücreleri: <ol><li>plaka 750.000 PBMCs cm 2 başına bir konsantrasyon hücreleri.</li>
		<li>% 5 CO 2 atmosferde 37 ° C'de bir kuluçka kaplama hücreleri depolamak. 
		Not: Normal tam α-MEM MCSF veya RANKL GFs. unutmayın her koşul en az 3'te teknik gerçekleştirmek için olmadan ile tedavi hücreler negatif denetimleri eklemek için deneme tasarım çoğaltır. En az 3 Biyolojik çoğaltır gerçekleştirmek.</li>
	</ol></li> <li>GFs ile desteklenmiş orta değiştirin: <ol><li>3 h hücre tohum sonra bekleyin ve orta tarafından pipet (200-1000 µL)-enkaz, ekli olmayan hücreleri ve eritrositler atmak için Kaldır. 
		Not: hücre dekolmanı önlemek için orta değiştirirken dikkatli olun.</li>
		<li>Eklemek yeni tam α-20 ng/mL ile MCSF takıma MEM (500 µL/de). 
		Not: ne zaman kanser hücreleri ile ortak kültür, gün PBMC tohum sonra tohum kanser hücreleri.</li>
	</ol></li> <li>Medya her 2-3 gün (α-MEM 20 ng/mL ile MCSF takıma) değiştirme: <ol><li>200-1000 µL pipet tarafından orta atın.</li>
		<li>Ekle yeni taze medyum tarafından 200-1000 µL pipet.</li>
	</ol></li> <li>6-7 gün sonra hücre tohum, RANKL 20 ng/mL eklemek için tam α-MEM + MCSF.</li>
	<li>Orta değiştirin (tam α-MEM + MCSF + RANKL) 2-3 günde: <ol><li>200-1000 µL pipet ile orta atın.</li>
		<li>200-1000 µL pipet ile yeni orta ekleyin. Endüksiyon farklılaşma hücre tohum sonra 14 gün durdurmak.</li>
		<li>Atma orta ve yıkama PBS ile ikinci kez.</li>
	</ol></li> <li>Paraformaldehyde ile hücreleri tamir: <ol><li>hücreleri kurumaya bırakın.</li>
		<li>% 4 paraformaldehyde Ekle (Tablo malzemeleri görmek).</li>
		<li>Incubate oda sıcaklığında 20 dk için.</li>
	</ol></li> <li>At paraformaldehyde ve yıkama iki kez 500 µL PBS ile. 
	Dikkat: Paraformaldehyde toksik; Lütfen eldiven, maske ve gözlük tak.</li>
	<li>Hücreleri kuru izin.</li>
	<li>Tuzak gerçekleştirmek üretici göre boyama &#39; s yönergeleri (Tablo malzemeleri görmek).</li>
	<li>El ile 10 X büyütmede mikroskop altında Osteoklast benzeri hücreleri saymak; NA 0,30. 
	Not: Osteoklast benzeri hücreler tuzak + en az 4 çekirdekleri ile polycarion hücreleri olarak tanımlanan.</li>
</ol> 2. Kanser hücre kültürleri Not: meme adenokarsinom hücre hatları SCP2 17, üçlü negatif insandan kaynaklanan bir osteotropic hücre kültürünü gibi farklı türleri ile deneyler yapılabilir meme kanseri hücre kültürünü (MDA-MB-231) ve hormon reseptör pozitif hücre kültürünü MCF7.
<ol><li>Kültür hücreleri bir monolayer 75 cm 2 şişeler içinde olarak.
	<ol><li>75 cm 2 şişeye tohum 1.000.000 kanser hücrelerinde.</li>
		<li>Hücreleri 37 ° C'de % 1 glutamin ve % 10 fetal sığır serum %5 CO 2 atmosferde ile takıma tam α-MEM orta saklayın.</li>
	</ol></li> <li>% 90'ı confluency, hücre bağlantısını kesin: <ol><li>Orta atmak, PBS ile yıkayın ve tripsin 1 X 2-3 mL içinde PBS ekleyin.</li>
		<li>Kuluçkaya hücreler için 37 dakika 3-5 ° C.</li>
		<li>Müstakil hücrelerin enzimatik reaksiyon durdurmak için tam orta 8 mL ekleyerek bir 10 mL pipet tarafından 75 cm 2 şişeye toplamak.</li>
		<li>Vasıl 225 x g 5 dakika süreyle santrifüj</li>
	</ol></li> <li>Kanser hücrelerinin yıkama: <ol><li>PBS 10 mL ekleyin.</li>
		<li>Vasıl 600 x g 5 dakika süreyle santrifüj</li>
	</ol></li> <li>Saymak kanser hücrelerinin Neubauer odası.
	<ol><li>Kanser hücrelerinin sayısı en az iki kez ve hücre toplam ortalama sayısı toplanan almak için çoğaltır ortalamasını hesaplamak.</li>
	</ol></li></ol> 3. Ortak kültür kanser hücrelerinin bir nd monosit geçiren farklılaşma Osteoklastlar doğru doğrudan <ol><li>kanser hücreleri ekler (gözenek çapı 0.4 µm) üzerinde tohum: <ol><li>adlı bir konsantrasyon cm 2 başına 4.000 hücrelerin kanser hücrelerinin tohum.</li>
		<li>Kuluçkaya 37 ° C ve % 5 CO 2 ' de. 
		Not: Gün sonra PBMC 0.4 µm ekler ortak kültür deneyde için tohum tohum kanser hücreleri.</li>
	</ol></li> <li>24 saat bağlı kalmak hücreleri izin vermek bekleyin.</li>
	<li>Yer numaralı seribaşı eklemek kültür mononükleer kültürler üzerinde ortak kültür (bakınız Bölüm 1.10 Protokolü) başlatmak için.</li>
	<li>Medya 2-3 günde tam α-MEM ile değiştirin.
	<ol><li>200-1000 µL pipet ile orta atın.</li>
		<li>Ekle 500 µL taze orta. 
		Not: Kanser hücrelerinin osteoclastogenic gücünü anlamak için birincil amacı, ortak kültür olduğunu, bu nedenle, GFs α-MEM için eklenmez. Ortak kültür her denemeye ne dahilgative denetimleri (bkz: Not Adım 1,10 iletişim kuralı) ve RANKL ve MCSF (kanser hücreleri) tarafından ayrıştırılan Osteoklastlar pozitif kontrol eder. Kanser hücrelerinin mononükleer hücrelerin üstünde yerleştirilmedi ekler numaralı seribaşı ortak kültür negatif bir kontrol kullanılan.</li>
	</ol></li> <li>Ortak kültür durdurun ve kanser hücreleri aşağı akım analizi için kullanın: <ol><li>13 gün sonra PBMC tohum ve kanser hücre tohum sonra 12 gün yeri ekleme yeni bir tabağa.</li>
		<li>Durdurmak kanser hücre kültürü olan aşağı akım analizlerdir (konuya bakın) gerçekleştirilecek.</li>
	</ol></li> <li>Gün 14, durdurmak Osteoklast farklılaşma ve adım 1,15 bildirildiği gibi hücreleri, düzeltmek.</li>
	14-30 gün içinde veya hemen gerçekleştirmek tuzak <li>boyama. 
	Not: İsteğe bağlı boyama: tuzak + polycarion hücreleri Osteoklastlar olduğunu doğrulamak için araştırmacılar to, bir Osteoklast özgü marker algılamak için ek boyama gerçekleştirebilirsiniz. F-aktin yüzük tespiti başka bir Osteoklast özel boyama tahlil 12 , 13 , 14 yaşında.</li>
</ol>

<ol><li>Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+and+cancer%3A+the+osteoncology%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cases+Miner+Bone+Metab%22%5BJournal%5D)">Bone and cancer: the osteoncology.</a> Clin Cases Miner Bone Metab. 10 (2), 121-123 (2013).</li>
<li>Coleman, R. E., Rubens, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+clinical+course+of+bone+metastases+from+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">The clinical course of bone metastases from breast cancer.</a> Br J Cancer. 55 (1), 61-66 (1987).</li>
<li>Ibrahim, T., Mercatali, L., Amadori, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+emergency+in+oncology%3A+bone+metastases+in+breast+cancer+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Oncol+Lett%22%5BJournal%5D)">A new emergency in oncology: bone metastases in breast cancer patients.</a> Oncol Lett. 6 (2), 306-310 (2013).</li>
<li>Swartz, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+microenvironment+complexity%3A+emerging+roles+in+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tumor microenvironment complexity: emerging roles in cancer therapy.</a> Cancer Res. 72 (10), 2473-2480 (2012).</li>
<li>Roodman, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22N+Eng+J+Med%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of bone metastasis.</a> N Eng J Med. 350 (12), 1655-1664 (2004).</li>
<li>Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cancer+cell+metastasis+to+the+bone%3A+a+multistep+process%5BTitle%5D)+AND+%22Future+Oncol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process.</a> Future Oncol. 7 (11), 1285-1297 (2011).</li>
<li>Chen, Y. C., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+metastasis+to+the+bone%3A+mechanisms+of+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Breast cancer metastasis to the bone: mechanisms of bone loss.</a> Breast Cancer Res. 12 (6), 215(2010).</li>
<li>Guise, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breast+cancer+bone+metastases%3A+it%27s+all+about+the+neighborhood%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Breast cancer bone metastases: it's all about the neighborhood.</a> Cell. 154 (5), 957-959 (2013).</li>
<li>Ell, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor-induced+osteoclast+miRNA+changes+as+regulators+and+biomarkers+of+osteolytic+bonemetastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Tumor-induced osteoclast miRNA changes as regulators and biomarkers of osteolytic bonemetastasis.</a> Cancer Cell. 24 (4), 542-556 (2013).</li>
<li>Lu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VCAM-1+promotes+osteolytic+expansion+of+indolent+bone+micrometastasis+of+breast+cancer+by+engaging+%CE%B14%CE%B21-positive+osteoclast+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging α4β1-positive osteoclast progenitors.</a> Cancer Cell. 20 (6), 701-714 (2011).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteogenic+niche+promotes+early-stage+bone+colonization+of+disseminated+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells.</a> Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).</li>
<li>Liverani, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF-1+blockade+impairs+breast+cancer+osteoclastogenic+potential+in+co-culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">CSF-1 blockade impairs breast cancer osteoclastogenic potential in co-culture systems.</a> Bone. 66, 214-222 (2014).</li>
<li>Mercatali, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+everolimus+in+an+in+vitro+model+of+triple+negative+breast+cancer+and+osteoclasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">The effect of everolimus in an in vitro model of triple negative breast cancer and osteoclasts.</a> Int J Mol Sci. 1 (11), e1827(2016).</li>
<li>Glantschnig, H., Fisher, J. E., Wesolowski, G., Rodan, G. A., Reszka, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((M-CSF%2C+TNFalpha+and+RANK+ligand+promote+osteoclast+survival+by+signaling+through+mTOR%2FS6+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+DeathDiffer%22%5BJournal%5D)">M-CSF, TNFalpha and RANK ligand promote osteoclast survival by signaling through mTOR/S6 kinase.</a> Cell DeathDiffer. 10 (10), 1165-1177 (2003).</li>
<li>Sugatani, T., Hruska, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1%2FAkt2+and+mammalian+target+of+rapamycin%2FBim+play+critical+roles+in+osteoclast+differentiation+and+survival%2C+respectively%2C+whereas+Akt+is+dispensable+for+cell+survival+in+isolated+osteoclast+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Akt1/Akt2 and mammalian target of rapamycin/Bim play critical roles in osteoclast differentiation and survival, respectively, whereas Akt is dispensable for cell survival in isolated osteoclast precursors.</a> J Biol Chem. 280 (5), 3583-3589 (2005).</li>
<li>Bertoldo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+bone+metastatic+cancer%3A+role+of+the+mTOR+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Targeting bone metastatic cancer: role of the mTOR pathway.</a> Biochim Biophys Acta. 1845 (2), 248-254 (2014).</li>
<li>Kang, Y., Siegel, P. M., Shu, W., Drobnjak, M., Kakonen, S. M., Cordón-Cardo, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multigenic+program+mediating+breast+cancer+metastasis+to+bone%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone.</a> Cancer Cell. 3 (6), 537-549 (2003).</li>
<li>Simone, V., Ciavarella, S., Brunetti, O., Savonarola, A., Cives, M., Tucci, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Everolimus+restrains+the+paracrine+pro-osteoclast+activity+of+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Everolimus restrains the paracrine pro-osteoclast activity of breast cancer cells.</a> BMC Cancer. 14 (15), 692(2015).</li>
</ol>

Yazarlar hiçbir ifşa etmek çıkar çatışması var.

Kanser hücreleri ve kemik hücreleri arasında çapraz karışma mekanizmaları eğitim preklinik vitro modelleri yeni tedavi stratejileri oluşturmak için kullanılan kemik metastaz mekanizmaları tanımlamak için gereklidir. Osteoclastogenesis insan periferik kan (şekil 3) üzerinden tamamen insan vitro modeli geliştirdik. Metodoloji en iyileştirme sırasında bir dizi kritik noktaları tespit ve giderilir. İlk tohum mononükleer hücrelere miktarı ilgili. Lenfositler ve monosit, tohum os...

Kemik metastaz kemik metastazı hastalığı1,2,3boyunca gelişen hastaların % 20-25 ile birincil tümörler prostat, akciğer ve göğüs kanseri gibi farklı türleri için ortak bir sitedir. Özellikle, meme kanserli hastalarda % 70'i ölüm4' de kemik metastaz kanıtı taşımak. Tümör ve stromal hücre etkileşim birincil kanser ve ikincil Lezyonlar kanser ilerlemesi için gerekli. Kemik microenvironment osteolitik kemik metastazı meme kanseri kanser hücreleri, kemik hücreleri ve kemik microenvironment arasında meydana gelen patolojik bir kısır döngü kurulması bağlıdır. Kanser hücreleri kemik rezorpsiyonu5,6,7artan kemik dengesini bozabilir.
Yeni Matris, para yatırmak içinde dokusunu, yeni kemik oluşumu8için sorumlu ise normal ve patolojik koşullarda Osteoklastlar kemik rezorpsiyonu için sorumlu hücrelerdir. Osteoklast etkinlik dokusunu aracılığıyla onun reseptör sırası öncesi Osteoklast yüzeyinde bağlar, ön Osteoklast füzyon, olgun Osteoklastlar içine farklılaşması için gerekli bir işlem inducing RANKL, ifade tarafından düzenlenmiştir. Osteoclastogenesis indüksiyon kemik rezorpsiyonu artırır. Vivo çalışmalar çok sayıda anlayışımız kemik metastaz oluşumu9,10,11önemli ölçüde iyileştirilmiştir. Meme kanseri hücrelerinin birincil tümör ve kemik microenvironment osteoclastogenesis teşvik kemik Homeostazı, huzursuz ve kemik rezorpsiyonu8. Bu senaryoda, ortaya çıkan tüm moleküler arasındaki etkileşimler kanser hücreleri ve Osteoklastlar çok önemli önemlidir. Zaten belirtildiği gibi kemik metastaz oluşumunu mekanizmasının vivo içinde fare modellerinde aydınlatılmamıştır. Ancak, tüm in vivo hayvan deneyleri Etik Komitesi tarafından onaylanması gereksiniminin yanı sıra, in vivo deneyler yüksek maliyetler ve zaman alıcı yöntemleri de dahil olmak üzere performans çeşitli dezavantajları vardır. Birden çok yazar öncesi Osteoklastlar RAW246.79,10,11denilen bir fare satırını kullanarak osteoclastogenesis preklinik in vivo ve in vitro modelleri birleştirdik. Bu model sakıncaları hücreleri zaten öncesi Osteoklastlar olmaya kararlı olan ve insan kaynağı değildir aslında kaynaklanıyor. Bu nedenlerden dolayı translasyonel araştırma kemik kanseri hücre etkileşimleri çalışmaya vitro tamamen insan preklinik modelleri kullanılabilirliğini büyük ölçüde yarar.
Osteoclastogenesis vitro insan periferik kan örnekleri12,13başlayarak yöntemi en iyi duruma getirilmiş. Periferik kan örneklerinde var, olmayan bir küçük ölçüde de olsa, monosit, Osteoklastlar kaynaklanmaktadır. Mononükleer hücreler eritrositler ve granülosit tam kan içinde mevcut gelen ilk Ficoll yoğunluk gradient tarafından ayrılır; Onlar o zaman aksine lenfositler plastik yüzey uygun yeteneği sayesinde seçilir. Tohum sonra hücre için 14 gün kültürlü. MCSF ve RANKL monosit tarafından ilk makrofajlar ve sonra içine Osteoklastlar14,15ayırt etmek için gereken GFs vardır. RANKL farklılaşma süreci osteoclastogenesis geç dönemlerinde ikna etmek için kullanılır, ancak MCSF testin süresi boyunca gereklidir. Farklılaşma erken aşamasında MCSF çoğalırlar ve14,15hayatta monosit yardımcı olur. Osteoclastogenesis ikinci bölümü sırasında hücreleri birlikte sigorta ve yüzükler aktin F karakteristik dağılımını gösteren ve tartarat dayanıklı asit fosfataz (tuzak) ve Kalsitonin reseptör gibi belirli işaretleri ifade Osteoklastlar olarak olgun (TO) 14 , 15. bizim yöntem MCSF monosit kültür deneme ve bir arada MCSF ve RANKL ilk 7 gün 7-14 gün sonra ekleyerek oluşur. Deneme sonunda osteoclastogenesis farklılaşmış hücreler, aşağıda açıklandığı gibi sayılarak analiz edilir.
GFs tarafından ayırt etmek için indüklenen monosit kültürler preklinik modelimiz temelini oluşturur. Ortak kültür sistemi olmadan GFs meme kanseri hücrelerinin osteoclastogenic gücünü daha iyi anlamak için en iyi duruma getirilmiş. Biz ilk geliştirilen bir model dolaylı ortak kültürlerin bir orta ekleyerek (% 80 α-en az gerekli orta (α-MEM) ve % 20 şartına orta toplanan meme kanseri hücrelerinin bir kültür yaklaşık % 90 birleşmesi hücrelere farklılaşma12 geçirmekte olduğunu . (Serum yoksunluğu koşullar altında toplanan değil) şartına orta 24 saat sonra toplanan ve bir oran 1:4, taze orta karışık. Klimalı orta negatif kontrol ile ilgili olarak önemli Osteoklast farklılaşma indüklenen. Kanser hücreleri ve kemik hücreleri arasındaki karşılıklı etkileşimi hakkında bilgi kayıp olarak dolaylı ortak kültürler kullanırken, ancak, biz bizim sistemi doğrudan ortak kültürler taşıyarak geliştirilmiş. Kanser hücreleri µM ekler ve wells nerede mononükleer hücreler kaplama yerleştirdiler 0,4 numaralı seribaşı. Bu yöntemi kullanarak, hücreleri aynı ortamı paylaşmak ve salgılanan proteinler değişimi. Böylece kanser hücreleri13tarafından indüklenen osteoclastogenesis tamamen insan preklinik modeli yarattık.
Bu sistem son derece çok yönlü ve farklı araştırma amaçlı, örneğin, farmakolojik çalışmalar kemik metastaz uyuşturucu rolünün araştırılması için kullanılabilir. Bizim model çalışma etkinliği ve mekanizmaları eylem kemik hedefli tedaviler ve/veya kemik microenvironment kanser hücreleri13huzurunda antitümör ilaçların olanak sağlar. Doğru kontroller ile deney tasarımı, Yani, kanser hücrelerinin ve tek tek, kültürlü Osteoklastlar yapar uyuşturucu faaliyeti hakkında ortak kültür etkisini anlamak daha kolay. Her iki kanser hücreleri ve Osteoklastlar, örneğin, everolimus16okudu uyuşturucu hedefleyen bu yaklaşım daha da ilginç hale gelir. Bu model de kanser hücreleri ve kemik hücreleri arasındaki etkileşimin yeni yollar tanımlamak için kullanılabilir.

<table><tbody><tr><td>&alfa; MEM</td><td>Euroclone</td><td>BE12-169F</td><td></td></tr><tr><td>Glutamin</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Fetal sığır serumu</td><td>Yaşam teknolojileri</td><td>ECS0180DPR</td><td></td></tr><tr><td>hMCSF</td><td>Peprotech</td><td>300-25</td><td>Depolama endikasyonlarına uyulmalıdır</td></tr><tr><td>hRANKL</td><td>Peprotech</td><td>310-01</td><td>Depolama endikasyonlarına uyulmalıdır</td></tr><tr><td>Asit Fosfataz, Lökosit (TRAP) Kiti</td><td>Sigma Aldrich</td><td>387 A</td><td></td></tr><tr><td>Lenfosit ayırma ortamı</td><td>Biowest</td><td>L0560-100</td><td></td></tr><tr><td>Kırmızı Kan hücresi parçalama tamponu</td><td>SIgma</td><td>11814389001 ROCHE</td><td></td></tr><tr><td>Tripsin</td><td>EuroClone</td><td>COD. ECB3052D</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehit %4 sulu çözelti, EM dereceli</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>157-4-100</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 hücre hattı</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-267</td><td></td></tr><tr><td>MCF7</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>Transwell</td><td>Corning</td><td>3470-Clear</td><td>Bu ekler 24 oyuklu plakalar içindir; 6,5 mm, 0,4 & mu; M; gözenek boyutu</td></tr></tbody></table>

osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

Development of a Human Preclinical Model of Osteoclastogenesis from Peripheral Blood Monocytes Co-cultured with Breast Cancer Cell Lines

Tümör hücreleri ve kemik microenvironment kemik hücreleri arasında çapraz karışma kemik metastaz oluşumunu mekanizmasını anlamak için önemlidir. Meme kanseri hücreleri ve farklılaşma Osteoklastlar doğru geçiren monosit ortak bir kültürün bir vitro tamamen insan preklinik modeli geliştirdik. Periferik kan sağlıklı bağışçılardan toplanan başlayarak osteoclastogenesis modeli en iyi duruma getirilmiş. Periferik kan mononükleer hücreler (PBMCs) yoğunluk gradient Santrifüjü tarafından ayrılmış ilk, yüksek yoğunluklu seribaşı ve iki büyüme faktörleri (GDS) ekleyerek ayırt etmek için indüklenen: reseptör aktivatör nükleer faktör-κB ligand (RANKL) ve makrofaj Koloni uyarıcı faktör (MCSF). Hücreleri kültüründe 14 gün boyunca yaptı ve sonra sabit ve aşağı akım analizi ile analiz. Osteolitik kemik metastazı osteoclastogenesis indüksiyon etkileri kemik kanseri hücre varış biridir. Biz böylece meme kanseri hücreleri kanser hücrelerinin GFs ile ilgili olarak ayırt etme gücünü çalışmaya ortak kültürleri modelimizle meydan. Kanser hücre-Osteoklast etkileşim okuyan bir kolay yolu meme kanseri hücre kültürleri toplanan ve taze orta ile karışık şartına orta kullanımı dayalı dolaylı ortak kültürler gerçekleştirmektir. Bu karışım daha sonra Osteoklast farklılaşma ikna etmek için kullanılır. Biz de en iyi duruma getirilmiş bir yöntem hangi kanser hücreleri ve başkalaşım geçiren monosit orta paylaşmak ve salgılanan etkenler Döviz doğrudan ortak kültür. Araştırmacılar iki hücre tiplerinin karşılıklı etkileşimleri gözlemlemek ve kanser hücreleri ve Osteoklastlar için aşağı akım çözümlemesi gibi özgün dolaylı ortak kültür yöntemi üzerinde önemli bir gelişme bu. Bu yöntem metastatik kemik microenvironment ve tohum hücrenin satırlarına meme kanserinden türetilmiş dışındaki ilaçlar etkisini incelemek bize sağlar. Modeli de diğer hastalıklar gibi Osteoporoz veya diğer kemik koşulları incelemek için kullanılabilir.

Bir yöntem Osteoklastlar insan periferik kan monosit kolayca ayırt etmek için optimize edildi. Monosit kültür ile kanser hücrelerinin, kanser hücrelerinin osteoclastogenesis kemik metastazı olarak sürdürülmesi yeteneğine sahiptirler (edebiyat18' açıklandığı gibi) teyit kültürlü. Osteoklastlar kanser hücreleri ayrıştırılan ve GFs şekil 1' de gösterilmiştir. Bir Osteoklast benzeri hücre 4 veya daha fazla hücre çekirdeği ile bir hücre ve ...

Bu iletişim kuralı bir vitro insan preklinik modeli osteoclastogenesis kanser hücre-Osteoklast etkileşimi taklit etmek için meme kanseri hücre hatları ile kültürlü periferik kan monosit üzerinden gelişimi anlatılmaktadır. Model kemik metastaz oluşumunu anlayışımız daha fazla ve tedavi olanakları geliştirmek için kullanılabilir.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

The crosstalk between tumor cells and bone cells in the bone microenvironment is crucial to understanding the mechanism of bone metastasis formation. We ...

Meme kanseri hücre hatları ile kültürlenen periferik kan monositlerinden veya PBMC'lerden türetilen bu in vitro insan preklinik osteoklasogenez modelinin genel amacı, kanser hücresi osteoklast etkileşimlerini taklit etmektir. Bu yöntem, kemik metastazı alanında, kanser hücresi ve kemik mikroçevresi içindeki kemik hücresi etkileşiminin etkileri hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tamamen insana ait bir klinik öncesi model olmasıdır.Ayrıca, bu yöntem kemik metastazı hakkında fikir verebilir. Osteoporoz gibi kemikle ilgili diğer patolojik mekanizmaların incelenmesine de uygulanabilir. Bu yönteme yeni olan kişiler, sağlıklı donörler arasındaki değişkenlik ve uygun PBMC hücre yoğunluğunu seçmede mücadele edebilir.Bu yöntemin görsel gösterimi, PBMC seçimimizi görmeleri gerektiğinden ve tohumlama adımları, yeterlilik elde edilmeden önce biraz manuel deneyim gerektirdiğinden kritik öneme sahiptir. EDTA'da en az 20 mililitre sağlıklı donör tam kanı PBS'de bire bir oranında seyrelterek başlayın. İyice karıştırdıktan sonra, kan çözeltisini 50 mililitrelik konik tüplerde 30 mililitrelik alikotlara bölün.Her tüpün dibine 15 mililitre lenfosit ayı

development-human-preclinical-model-osteoclastogenesis-from

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Osteoklastlar vücutta ana kemik-rezorbe hücresi vardır. Çok sayıda osteoklastlar izole etmek için bir yeteneği osteoklast biyoloji anlama konusunda önemli ilerlemelere yol açmıştır. Bu protokol, yetiştirilmesi ve in vitro olarak osteoklast aktivitesi miktarının, izole edilmesi için bir yöntem açıklanmaktadır.

Fare Kemik İliği osteoklast türetilmesi

Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Mevcut rapor, kemik iliği mikroçevre nişinin lösemik hücreler üzerindeki etkisini, en kemodirençli alt popülasyonun zenginleştirilmesine vurgu yaparak modellemek için kullanılabilecek bir protokolü özetlemektedir.

Modelleme Kemoterapi Dayanıklı Lösemi<em&gt; İn Vitro</em

Notch sinyali, hücreler arasında doğrudan temasa dayanan bir hücresel iletişim şeklidir. Notch sinyalini in vitro olarak düzgün bir şekilde indüklemek için, Notch ligandları hücrelere hareketsiz bir durumda sunulmalıdır. Bu protokol, fare osteoklast öncülerinde Notch sinyalinin in vitro stimülasyonu için yöntemleri açıklar.

Fare Osteoklast Öncüleri Notch Sinyal uyarılması

Bu el yazması bir iletişim kuralına izole etmek ve kültür Osteoklastlar vitro fare kemik iliği ve rapamycin karmaşık 1 Osteoklast oluşumunda memeli/mekanik hedef rolü çalışmaya açıklar.

Bir RANKL tabanlı Osteoklast kültür tahlil, fare mTORC1 Osteoklast oluşumunda rol araştırmak için ilik

Burada, doğrudan/dolaylı ilişkileri monosit ve kollajen bozulması, bağışıklık hücre işe alım, hücre gibi sonuçlar ile çalışma olarak birincil meme kanser hücrelerinin de Morfoloji çözümlenecek bir üç boyutlu kültür yöntemi açıklamak işgali ve promosyon inflamasyon kanserle ilgili.

Monosit ve bir hücre dışı matriks içinde birincil meme kanseri hücreleri arasındaki iletişimi analiz özü (ECME)-üç boyutlu sistem tabanlı

Osteokuzlar, hematopoetik kök hücrelerin monosit-makrophaj soylarından elde edilen dokuya özgü makrophaj polykaryonlarındadır. Bu protokol, kemik iliği hücrelerinin nasıl yalıtılmasını açıklar, böylece geleneksel yöntemlerde bulunan kazaların riskini azaltarak büyük miktarlarda osteocsürer elde edilir.

Sıçan kemik Iliği Osteoclast precursors yalıtım, arıtma ve farklılaşma

Burada, kalsiyum fosfat kaplı hücre kültürü plakaları kullanılarak rezorpsiyon çukuru testleri için basit ve etkili bir tahlil prosedürü sunuyoruz.

Osteoklastik Rezorpsiyonu In Vitro Görselleştirmek ve Ölçmek için Basit Bir Pit Tahlil Protokolü

Osteoklastlar vücuttaki anahtar kemik emici hücrelerdir. Bu protokol, osteoklastların insan periferik kan monositlerinden in vitro farklılaşması için güvenilir bir yöntem tanımlamaktadır. Bu yöntem, homeostazda ve hastalıklarda osteoklast biyolojisini daha iyi anlamak için önemli bir araç olarak kullanılabilir.

Fonksiyonel Osteoklastların İnsan Periferik Kanı CD14+ Monositlerinden Farklılaşması

Bu protokol, insan osteoklastlarının indüklenmiş pluripotent kök hücrelerden (iPSC'ler) ayırt edilmesini sunar ve osteoklastların ve osteoklast öncüllerinin karakterizasyonu için yöntemleri açıklar.

İnsan Kaynaklı Pluripotent Kök Hücrelerden Osteoklastların Farklılaşması ve Karakterizasyonu

Keşfedin, meme kanseri hücre hatları ile kültürlenmiş periferik kan monositlerinden osteoklastogenezin insan preklinik modelini. Bu yöntem, kemik metastazı ve kemik mikroçevresindeki kanser hücresi etkileşimlerini incelemek için değerli bir araçtır.

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi (Video) | JoVE Journal

Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

Daha fazla video keşfet