Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi

Bu iletişim kuralı bir vitro insan preklinik modeli osteoclastogenesis kanser hücre-Osteoklast etkileşimi taklit etmek için meme kanseri hücre hatları ile kültürlü periferik kan monosit üzerinden gelişimi anlatılmaktadır. Model kemik metastaz oluşumunu anlayışımız daha fazla ve tedavi olanakları geliştirmek için kullanılabilir.

Meme kanseri hücre hatları ile kültürlenen periferik kan monositlerinden veya PBMC'lerden türetilen bu in vitro insan preklinik osteoklasogenez modelinin genel amacı, kanser hücresi osteoklast etkileşimlerini taklit etmektir. Bu yöntem, kemik metastazı alanında, kanser hücresi ve kemik mikroçevresi içindeki kemik hücresi etkileşiminin etkileri hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tamamen insana ait bir klinik öncesi model olmasıdır.

Ayrıca, bu yöntem kemik metastazı hakkında fikir verebilir. Osteoporoz gibi kemikle ilgili diğer patolojik mekanizmaların incelenmesine de uygulanabilir. Bu yönteme yeni olan kişiler, sağlıklı donörler arasındaki değişkenlik ve uygun PBMC hücre yoğunluğunu seçmede mücadele edebilir.

Bu yöntemin görsel gösterimi, PBMC seçimimizi görmeleri gerektiğinden ve tohumlama adımları, yeterlilik elde edilmeden önce biraz manuel deneyim gerektirdiğinden kritik öneme sahiptir. EDTA'da en az 20 mililitre sağlıklı donör tam kanı PBS'de bire bir oranında seyrelterek başlayın. İyice karıştırdıktan sonra, kan çözeltisini 50 mililitrelik konik tüplerde 30 mililitrelik alikotlara bölün.

Her tüpün dibine 15 mililitre lenfosit ayırma ortamını dikkatlice yerleştirin. Hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjleme ile ayırın. Ve buffy kaplamalar içeren beyaz mononükleer hücreyi 15 mililitrelik yeni bir tüpe çekin.

Hasat edilen hücreleri yıkama başına 20 mililitre PBS'de iki kez yıkayın, ardından kırmızı kan hücrelerinin buz üzerinde üç ila beş dakika boyunca beş mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile parçalanmasını izleyin. 20 mililitre PBS ile reaksiyonu durdurun ve beyaz kan hücrelerini santrifüjleme ile toplayın. Peleti yeniden askıya alın ve saymak için alfa M-E-M'yi tamamlayın.

Daha sonra, hücreleri, 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de inkübasyonları için 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda santimetre kare başına beş PBMC konsantrasyonunda beş kez 10 ila beş PBMC konsantrasyonunda yedi noktada plakalayın. Yaklaşık üç saat sonra, süpernatanı, kalıntıları, bağlanmamış hücreleri ve parçalanmamış eritrositleri kültürlerden çıkarın. Ve MCSF ile desteklenmiş taze ortam ekleyin.

Tohumlamadan on dört gün sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca yüzde dört paraformaldehit içinde sabitleyin. Tuzak boyama işlemini üreticinin talimatlarına göre yapın. Osteoklast benzeri hücreler, en az dört çekirdeğe sahip TRAP pozitif olacaktır.

Osteoklast benzeri hücreleri mikroskop altında 10X büyütmede manuel olarak sayın. Kanser hücresinin neden olduğu osteoklast farklılaşması için, kanser hücreleri yüzde doksan birleşmeye ulaştığında, tripsinizasyon ile ayrılırlar ve taze alfa MEM'de santimetre kare başına dört kez 10 ila üç hücre konsantrasyonunda sıfır nokta dört mikrometre gözenek eklerine eklenirler. Ertesi gün, tohumlanmış ekleri tam alfa MEM'de farklılaşmamış bir günlük plakalanmış mononükleer hücre kültürleri üzerine yerleştirin ve ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin.

Daha sonra, ko-kültürün başlamasından 11 gün sonra, ekleri istenen aşağı akış analizi için uygun reaktifi içeren yeni bir plakaya aktarın. Meme kanseri hücreleri osteoklasogenezi sürdürebilir, çünkü kanser hücreleri tarafından indüklenen oyuklardaki osteoklast sayısı, pozitif büyüme faktörü kontrol kuyularında elde edilene benzerdir. Bununla birlikte, tüm kültürlerde gözlenen osteoklast sayısı, hücreler bir anti-tümör ilacı ile tedavi edildiğinde azalır.

İlginç bir şekilde, büyüme faktörlerinden türetilen olgunlaşmış osteoklastların yüzey alanları, kanser hücreleri tarafından indüklenenlerden daha büyüktür. Bu etki, anti-tümör ilaçla tedavi edilen kültürlerde gözlenmez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa yedi sekiz saat içinde tamamlanabilir.

Bu prosedürü takiben, kanser hücresi / kemik hücresi etkileşimleri veya anti-tümör ilaç mekanizmaları hakkında ek soruları yanıtlamak için gen ekspresyon analizi, Western Blot, immünofloresan analizi veya ELISA olarak ek aşağı akış analizi gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, kemik metastazı alanındaki araştırmacıların kemik mikroçevresini tamamen insan preklinik modelinde incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, monositlerin nasıl birlikte kültürleneceğini, kanser hücreleri ile farklılaşmaya nasıl uğrayacağını iyi anlamış olmalısınız.

Biyolojik numuneler ve ilaçlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.