Osteoclastogenesis periferik kan monosit kültürlü meme kanseri hücre hatları ile birlikte gelen bir insan preklinik modelinin geliştirilmesi
13 Eylül 2017
Bu iletişim kuralı bir vitro insan preklinik modeli osteoclastogenesis kanser hücre-Osteoklast etkileşimi taklit etmek için meme kanseri hücre hatları ile kültürlü periferik kan monosit üzerinden gelişimi anlatılmaktadır. Model kemik metastaz oluşumunu anlayışımız daha fazla ve tedavi olanakları geliştirmek için kullanılabilir.
Meme kanseri hücre hatları ile kültürlenen periferik kan monositlerinden veya PBMC'lerden türetilen bu in vitro insan preklinik osteoklasogenez modelinin genel amacı, kanser hücresi osteoklast etkileşimlerini taklit etmektir. Bu yöntem, kemik metastazı alanında, kanser hücresi ve kemik mikroçevresi içindeki kemik hücresi etkileşiminin etkileri hakkındaki temel soruları yanıtlamaya yardımcı olabilir. Bu tekniğin temel avantajı, tamamen insana ait bir klinik öncesi model olmasıdır.
Ayrıca, bu yöntem kemik metastazı hakkında fikir verebilir. Osteoporoz gibi kemikle ilgili diğer patolojik mekanizmaların incelenmesine de uygulanabilir. Bu yönteme yeni olan kişiler, sağlıklı donörler arasındaki değişkenlik ve uygun PBMC hücre yoğunluğunu seçmede mücadele edebilir.
Bu yöntemin görsel gösterimi, PBMC seçimimizi görmeleri gerektiğinden ve tohumlama adımları, yeterlilik elde edilmeden önce biraz manuel deneyim gerektirdiğinden kritik öneme sahiptir. EDTA'da en az 20 mililitre sağlıklı donör tam kanı PBS'de bire bir oranında seyrelterek başlayın. İyice karıştırdıktan sonra, kan çözeltisini 50 mililitrelik konik tüplerde 30 mililitrelik alikotlara bölün.
Her tüpün dibine 15 mililitre lenfosit ayırma ortamını dikkatlice yerleştirin. Hücreleri yoğunluk gradyan santrifüjleme ile ayırın. Ve buffy kaplamalar içeren beyaz mononükleer hücreyi 15 mililitrelik yeni bir tüpe çekin.
Hasat edilen hücreleri yıkama başına 20 mililitre PBS'de iki kez yıkayın, ardından kırmızı kan hücrelerinin buz üzerinde üç ila beş dakika boyunca beş mililitre kırmızı kan hücresi lizis tamponu ile parçalanmasını izleyin. 20 mililitre PBS ile reaksiyonu durdurun ve beyaz kan hücrelerini santrifüjleme ile toplayın. Peleti yeniden askıya alın ve saymak için alfa M-E-M'yi tamamlayın.
Daha sonra, hücreleri, 37 santigrat derece ve yüzde beş CO2'de inkübasyonları için 24 oyuklu bir plakanın her bir oyuğunda santimetre kare başına beş PBMC konsantrasyonunda beş kez 10 ila beş PBMC konsantrasyonunda yedi noktada plakalayın. Yaklaşık üç saat sonra, süpernatanı, kalıntıları, bağlanmamış hücreleri ve parçalanmamış eritrositleri kültürlerden çıkarın. Ve MCSF ile desteklenmiş taze ortam ekleyin.
Tohumlamadan on dört gün sonra, hücreleri PBS ile iki kez yıkayın ve oda sıcaklığında 20 dakika boyunca yüzde dört paraformaldehit içinde sabitleyin. Tuzak boyama işlemini üreticinin talimatlarına göre yapın. Osteoklast benzeri hücreler, en az dört çekirdeğe sahip TRAP pozitif olacaktır.
Osteoklast benzeri hücreleri mikroskop altında 10X büyütmede manuel olarak sayın. Kanser hücresinin neden olduğu osteoklast farklılaşması için, kanser hücreleri yüzde doksan birleşmeye ulaştığında, tripsinizasyon ile ayrılırlar ve taze alfa MEM'de santimetre kare başına dört kez 10 ila üç hücre konsantrasyonunda sıfır nokta dört mikrometre gözenek eklerine eklenirler. Ertesi gün, tohumlanmış ekleri tam alfa MEM'de farklılaşmamış bir günlük plakalanmış mononükleer hücre kültürleri üzerine yerleştirin ve ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin.
Daha sonra, ko-kültürün başlamasından 11 gün sonra, ekleri istenen aşağı akış analizi için uygun reaktifi içeren yeni bir plakaya aktarın. Meme kanseri hücreleri osteoklasogenezi sürdürebilir, çünkü kanser hücreleri tarafından indüklenen oyuklardaki osteoklast sayısı, pozitif büyüme faktörü kontrol kuyularında elde edilene benzerdir. Bununla birlikte, tüm kültürlerde gözlenen osteoklast sayısı, hücreler bir anti-tümör ilacı ile tedavi edildiğinde azalır.
İlginç bir şekilde, büyüme faktörlerinden türetilen olgunlaşmış osteoklastların yüzey alanları, kanser hücreleri tarafından indüklenenlerden daha büyüktür. Bu etki, anti-tümör ilaçla tedavi edilen kültürlerde gözlenmez. Bir kez ustalaştıktan sonra, bu teknik düzgün bir şekilde uygulanırsa yedi sekiz saat içinde tamamlanabilir.
Bu prosedürü takiben, kanser hücresi / kemik hücresi etkileşimleri veya anti-tümör ilaç mekanizmaları hakkında ek soruları yanıtlamak için gen ekspresyon analizi, Western Blot, immünofloresan analizi veya ELISA olarak ek aşağı akış analizi gerçekleştirilebilir. Geliştirilmesinden sonra bu teknik, kemik metastazı alanındaki araştırmacıların kemik mikroçevresini tamamen insan preklinik modelinde incelemelerinin yolunu açtı. Bu videoyu izledikten sonra, monositlerin nasıl birlikte kültürleneceğini, kanser hücreleri ile farklılaşmaya nasıl uğrayacağını iyi anlamış olmalısınız.
Biyolojik numuneler ve ilaçlarla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman eldiven ve laboratuvar önlüğü giymek gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu protokol, kanser hücresi-osteoklast etkileşimini taklit etmek amacıyla, meme kanseri hücre hatları ile birlikte kültüre edilen periferik kan monositlerinden in vitro bir insan preklinik osteoklastogenez modelinin geliştirilmesini açıklamaktadır. Bu model, kemik metastazı ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve terapötik seçenekleri geliştirebilir.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Osteoklastogenez
- Kemik metastazı
- Kanser hücresi etkileşimleri
Arka Plan
- Model, periferik kan monositlerini (PBMC'ler) kullanır.
- Kanser hücreleri ile osteoklastlar arasındaki etkileşimleri taklit etmeyi amaçlar.
- Bu araştırma, kemikle ilgili patolojilerin anlaşılması açısından önem taşımaktadır.
- Sağlıklı donörler arasındaki değişkenlik sonuçları etkileyebilir.
Çalışmanın Amacı
- Kanser hücresi-osteoklast etkileşimlerini taklit etmek.
- Bu etkileşimlerin kemik mikroçevresindeki etkilerini araştırmak.
- Kemik metastazı ve ilgili durumlar hakkında içgörüler sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- PBMC'lerin meme kanseri hücre hatları ile kültürü.
- Osteoklastogenezin değerlendirilmesi.
- Kanser hücresi ve kemik hücresi etkileşimlerinin değerlendirilmesi.
- PBMC hücre yoğunluğundaki değişkenliğin analizi.
Ana Sonuçlar
- Model, kanser hücresi-osteoklast etkileşimlerini başarıyla taklit etmektedir.
- Elde edilen bilgiler, kemik metastazı için terapötik stratejilere temel oluşturabilir.
- Potansiyel uygulamalar diğer kemikle ilgili hastalıklara da genişletilebilir.
- Zorluklar arasında donör değişkenliği ve hücre yoğunluğu seçimi yer almaktadır.
Sonuçlar
- Bu insan preklinik modeli, kemik metastazının incelenmesi için değerlidir.
- Kemik mikroçevresindeki kanser hücresi etkileşimlerinin anlaşılmasını geliştirir.
- Gelecekteki çalışmalar, kemik patolojisindeki daha geniş uygulamalar için bu modelden yararlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Yönetici Endüstriyel Uygunluk
Tamamen insana özgü olan bu preklinik model, kanser hücresi-osteoklast etkileşimini fizyolojik olarak ilgili bir sistemde yeniden oluşturarak, kemik metastazındaki osteoklastojenik yolların mekanistik risklerinin azaltılmasını sağlar. Osteoklast farklılaşması ve fonksiyonuna ilişkin kantitatif veriler sağlayarak, anti-tümör terapötikler için hedef doğrulama ve analiz geliştirme süreçlerini destekler. Model, karşılıklı etkileşimlerin doğrudan gözlemlenmesine ve ilaç tedavisi altındaki her iki hücre tipinin aşağı akış analizlerine olanak tanıyarak, öncü bileşik tanımlamadaki öngörü güvenilirliğini artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Tümörle tetiklenen osteoklastogeneze dair terapötik hipotezlerin sorgulanmasını ve kemik mikroçevresindeki yolakların netleştirilmesini sağlar.
- Operasyonel Değer: Belirlenmiş ko-kültür koşulları altında primer insan monositlerinden osteoklast farklılaşmasını modelleyerek biyolojik risklerin azaltılmasını ve fonksiyonel hedef validasyonunu destekler.
- Bilimsel Değer: Kanser hücresi stimülasyonuna karşı büyüme faktörü kontrolleriyle karşılaştırmalı olarak osteoklast oluşumunu nicelendirerek prediktif güveni ve portföy önceliklendirmesini kolaylaştırır.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Bilimsel Değer: RANKL ve MCSF kullanılarak PBMC'lerden standardize osteoklast farklılaşması yoluyla, sonraki iş akışları için valide edilmiş biyolojik sistemler hazırlar.
- Operasyonel Değer: Sabit hücre yoğunluğu ekimi (7.5×10⁵ PBMC/cm²) ve süreli farklılaşma (14 gün) ile TRAP tabanlı osteoklast kantifikasyonu aracılığıyla assay standardizasyonunu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Bilimsel Değer: İlaç etkilerinin osteoklastogenez üzerindeki etkilerinin hem indirekt (kondisyonlu ortam) hem de direkt ko-kültür formatlarında test edilmesiyle güvenilir bileşik değerlendirmesine olanak tanır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Osteoklastogenez deneyi aracılığıyla osteoporoz ve diğer kemik durumları için hastalık ilişkili modellemeyi destekler.
- Operasyonel Değer: Tamamen insan hücreleri kullanarak translasyonel süreklilik sağlar ve preklinikten kliniğe ekstrapolasyonda türler arası translasyon riskini azaltır.
- Bilimsel Değer: İlaç etkinliğinin farmakodinamik biyobelirteçleri olarak osteoklast sayısı ve yüzey alanındaki değişimleri ölçerek riskten arındırılmış ilerleme kararlarına olanak tanır.
İşleme Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Model; hedef doğrulamadan öncü bileşik belirlemeye ve preklinik etkinlik testlerine kadar uzanan keşif sürekliliğine, özellikle kemik hedefli tedaviler ve kemik mikroçevre modülatörleri için uygundur.
- Keşif Biyolojisi: Osteoklast aktivasyonunda kanser hücresi kaynaklı faktörlerin hipotez testlerini ve RANKL-bağımsız osteoklast indüksiyon mekanizmalarının yolak aydınlatmasını destekler.
- Tarama: Parakrin ve jukstakrin sinyalizasyon çalışmalar için geçirgen insertler üzerinde standartlaştırılmış monosit izolasyonu, diferansiyasyonu ve meme kanseri hücre hatlarıyla ko-kültürü aracılığıyla assay hazırlığı sağlar.
- Analitikler: Deneysel koşulları karşılaştırmak için TRAP boyaması, çok çekirdekli hücre sayımı ve morfometrik analiz (yüzey alanı) yoluyla kantitatif osteoklast okumaları sunar.
- Translasyonel Araştırma: Klinik olarak ilgili meme kanseri hücre hatlarını kullanarak metastatik kemik mikroçevresi üzerindeki ilaç etkilerinin incelenmesine olanak tanıyarak preklinik süreklilikle bağlantı kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Meme kanserinin ötesinde, birden fazla kanser türü ve kemik patolojisi boyunca osteoklast modülasyonunu incelemek için yeniden kullanılabilir bir platform görevi görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Osteoklast-kanser hücresi etkileşimlerindeki mekanistik belirsizliği azaltarak, hedef doğrulamada öngörülebilir güven sağlar.
- Operasyonel Değer: Tanımlanmış PBMC izolasyonu, ekim yoğunluğu ve sitokin takviyesi protokolleri aracılığıyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlar.
- Stratejik Değer: İlaçların osteoklast oluşumu ve fonksiyonu üzerindeki etkilerinin erken değerlendirilmesine olanak tanıyarak, kemik metastaz programlarındaki geç evre biyolojik riskleri azaltır ve go/no-go kararlarını iyileştirir.
- Portföy Etkisi: Bileşiklerin osteoklastojenik potansiyelini nicelleştirerek ve kemik mikroçevre modülasyonuna dayalı ilerlemelere rehberlik ederek, riske göre ayarlanmış önceliklendirmeyi destekler.
Uygulama Hususları
- PBMC ayırımı ve monosit adezyonu dahil olmak üzere, primer insan hücresi izolasyonu, kültürü ve diferansiyasyon tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Hücre sayımı, santrifüjasyon, mikroskopi (osteoklast sayımı için 10X büyütme) ve inkübasyon (37°C, 5% CO₂) için gerekli enstrümantasyona bağlıdır.
- Değişkenliği minimize etmek için PBMC donör kaynağının, hücre yoğunluğu optimizasyonunun (7.5×10⁵ PBMC/cm²) ve ko-kültür zamanlamasının (kanser hücresi ekimi sonrası 11 gün) ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- Meme kanseri dışındaki hücre hatlarına veya RANKL/MCSF dışındaki alternatif osteoklast stimülanlarına geçişte adaptasyon değerlendirmelerini içerir.
- Osteoklast diferansiyasyon potansiyelindeki donör değişkenliği ve PBMC ekimi ile ko-kültür kurulumundaki manuel uygulama yetkinliği ihtiyacı gibi pratik sınırlamaları içerir.
