Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Bu prosedürün amacı, insan kemik dokusu explan model sisteminde meme kanseri hücre proliferasyonunu, kolonizasyonunu ve migrasyonunu incelemektir. Bu işlem, femoral baş cerrahi örneklerinden trabeküler kemik doku fragmanlarının izole edilmesi ve bunların lusiferaz ile yeşil floresan protein eksprese eden meme kanseri hücreleri ile kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Hücre proliferasyonunu ölçmek ve meme kanseri hücrelerinin kemik doku fragmanlarındaki kolonizasyonunu doğrulamak için biyolüminesans görüntüleme kullanılır.

Meme kanseri hücre kolonizasyon modelleri floresan mikroskopi ile görüntülenir. Analiz için kemik iliği kompartımanı, lüminesans ve boyama deneyleri ile akış sitometrisi aracılığıyla fragmanlardan yıkanarak boşaltılabilir. Meme kanseri hücrelerinin doku kültürü süpernatantlarına ve kemik doku fragmanlarına doğru göçü, biyolüminesans görüntüleme ile Transwell göç odacıklarında ölçülür; kemik, meme kanseri metastazının en sık görüldüğü bölgedir ve nihayetinde bu model, kemik metastatik nişindeki meme kanseri hücrelerini incelemek için yeni bir pencere sunar.

Bu modelin en büyük avantajı, insan kemik dokusu fragmanlarının mikroçevresine doğrudan erişim sağlamasıdır; bu sayede kısa süreli ko-kültür deneyleri sırasında meme kanseri hücre davranışlarını kolayca gözlemleyebilir ve analiz edebiliriz. Bu yöntem, meme kanserinin kemiğe metastazının altında yatan mekanizmalarla ilgili temel soruları, bu süreci etkili bir şekilde önleyecek ve tedavi edecek terapötik stratejiler belirleme hedefiyle çalışmak için kullanılabilir. Bu model meme kanseri metastazına dair içgörüler sağlayabilse de, prostat kanseri gibi kemiğe eğilimli diğer malignitelerin çalışılması için de kullanılabilir.

Her analizde kemik doku parçaları çeşitli noktalardan alınmalıdır. Bu işlem, femoral bir örneğin salin içerisinde toplanıp taşınmasıyla ve cerrahi eldiven giyilerek biyogüvenlik kabinindeki çalışma istasyonunun hazırlanmasıyla başlar. Bir elinizle femur başını tutun ve trabeküler kemiği çıkarmak için cerrahi bir törpü kullanın.

Fragmanlar yaklaşık iki ila beş milimetre boyutundadır. Bu adım için pensler uygun olmayacaktır. İyi kaliteli bir cerrahi koter kullanmanız gerekir.

Bu deney için, 50 µL DMEM artı %10FBS başına 100,000 hücre içeren bir meme kanseri hücresi süspansiyonu hazırlayın. Ayrıca, kemik parçalarını hareket ettirmek için bir mikropipet ucunun kesilmiş uçlarını kullanarak kemik mumu tıkaçlar hazırlayın ve bu tıkaçları bir Petri kabında saklayın. Ardından, bir pens yardımıyla tıkaçları altı kuyucuklu bir plakaya aktarın ve steril bir eldiven kullanarak tıkaçları saat 12 yönündeki konuma bastırın.

Ardından, hücre süspansiyonundan 50 µL'yi her bir kuyucuğun merkezine pipetleyin. Hücrelerin yapışmasını desteklemek için plakayı 45 dakika boyunca bir doku kültürü inkübatöründe bekletin. Plaka inkübe olurken, hücrelerin yapıştığı kemik fragmanlarını çıkarın. Üç kuyucuktaki kemik mumunun üzerine birer kemik doku fragmanı yerleştirin ve her birini GER kullanarak bastırın. Fragman içermeyen üç kuyucuk kontrol olarak kullanılır.

Ardından, her bir kuyucuğun kenarından yavaşça beş mililitre %10FBS eklenmiş DMEM ekleyin. Kemik mumu ve kemik fragmanlarının yerinden oynamaması gerekir. Daha sonra kültürü 20 ila 24 saat inkübe edin.

Ertesi gün önce hücrelerin görüntüsünü alın. Her kuyucuğa 300 µg/mL Lucifer ekleyin ve ardından plakayı hemen bir Ivis görüntüleme platformu ile görüntüleyin. Bu deney, öncekiyle benzer bir meme kanseri hücresi süspansiyonu gerektirir.

Kemik fragmanları çıkarıldıktan sonra, her bir fragmanı bir pens yardımıyla 24 kuyucuklu plakadaki boş bir kuyucuğa aktarın, ardından her bir kemik fragmanının üzerine doğrudan 50 µL hücre süspansiyonu pipetleyin ve hücre yapışmasını teşvik etmek için plakayı 45 dakika boyunca bir inkübatöre yerleştirin. Hücreler yapıştıktan sonra, her bir kuyucuğa kemik fragmanını tamamen örtecek miktarda, bir ila iki mL besiyeri yavaşça ekleyin. Ardından plakayı 20 ila 24 saat boyunca doku kültürü inkübatöründe bekletin.

Ivis görüntüleme, floresan görüntüleme veya Ivis görüntüleme için analiz edilecek kemik iliği hücrelerini toplama hazırlığı aşamasında, kemik fragmanlarını her kuyucuğa bir mililitre taze besiyeri gelecek şekilde 24 kuyucuklu bir plakaya aktarın. Her kuyucuğa mililitre başına 300 mikrogram Lucifer ekleyin ve daha önce floresan mikroskobi için açıklanan adımları izleyin. Kemik fragmanındaki kemik spiküllerini işaretlemek için her kuyucuğa beş mikrolitre floresan bisfosfat işaretleme solüsyonu pipetleyin ve plakayı 24 saat daha inkübe edin.

24 saat sonra, fragmanları fenol kırmızısı içermeyen besiyeri bulunan plaklara aktarmak için pens kullanın. Ardından, GFP eksprese eden meme kanseri hücrelerinin kolonize olduğu bölgeleri belirlemek için 485 nanometreye ve bisfosfat işaretli kemik spiküllerini tanımlamak için 680 nanometreye ayarlanmış bir floresan mikroskobu ile plakları inceleyin. Hücre sayılarının veya özelliklerinin analizi için kemik iliği kompartmanını yıkayın.

Bir fragmanı, 50 mililitrelik bir chronicle tüpü üzerindeki 70 mikronluk bir süzgece aktarın. Ardından, fragmanı 10 mililitre PBS santrifüj ile güçlü bir şekilde yıkamak için 25 gauge iğneye sahip 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Hücreleri çöktürmek için süspansiyonu oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 G'de santrifüjleyin; ardından süpernatanı aspire ederek atın.

Akış sitometrisi veya canlılık analizlerine göre, ilik hücreleri peletini PBS veya istenen diğer çözeltiler içinde yeniden süspande edin. Kemik doku parçalarının oluşturulmasıyla başlayın. Kemik fragmanlarını 12'li kuyucukların içine yerleştirin.

Her kuyucuğunda 2,2 milliliters DMEM %10FBS içeren kuyucuklu plaka hazırlayın ve bazı kontrol kuyucuklarını kemik fragmanları olmadan bırakın. Plakayı 24 saat boyunca kültüre edin. Ardından medyumu aspire ederek yenileyin ve kültüre 24 saat daha devam edin; kültür transferinin 48. saatinde, alıcı plakayı geçici olarak inkübe ederken 0,9 milliliters süpernatantı alıcı plakaya aktarın.

Transwell insertleri boş bir 24 kuyucuklu plakaya yerleştirin. Ardından her bir insert üzerine 350 µL içinde 100.000 meme kanseri hücresi ekleyin. Hücrelerin tutunmasını sağlamak için plakaları 45 dakika boyunca kültüre edin. 45 dakika sonra, insertleri bir alıcı plakaya aktarmak için pens kullanın.

İnsertleri alıcıya yerleştirirken açılı tuttuğunuzdan emin olun. Kabarcık oluşmaması için iyice süpinasyon yapın. Ardından, insertlerin bulunduğu plakayı ertesi güne kadar 37 °C'de 20 saat boyunca inkübe edin.

İnsertleri çıkarmak için pens kullanın ve her birine mililitre başına 300 mikrogram Lucifer ekleyin. Membranlardan göç eden ve alıcı plaka kuyucuklarının tabanına tutunan meme kanseri hücrelerini tespit etmek için alıcı plaka üzerinde biyolüminesans görüntüleme gerçekleştirin. Öncelikle, bir alıcı plakayı besiyeri ile doldurun ve doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Insertleri ekmek için, bunları kapaklı boş bir mikro füzyon tüp kutusuna ters çevirin. Ardından, her bir insert membranının dış alt yüzeyine 50 µL hacminde 100.000 hücre ekleyin.

Kutunun kapağını hafifçe aralık bırakarak kapatın ve insertleri doku kültürü inkübatöründe 45 dakika boyunca inkübe edin. Ardından, bir penset yardımıyla insertleri ters çevirin ve her bir insert kabına %10 FBS içeren 0,45 mililitre DMEM eklenmiş bir alıcı plaka kuyusu şeklinde transfer edin. Daha sonra, her bir insert'e üç milimetrelik bir kemik fragmanı veya cam boncuk ekleyin ve plakayı 20 saat boyunca inkübe edin.

Ertesi gün, fragmanları ve boncukları transfer etmek için pens kullanın ve bunları bir mililitre taze besiyeri içeren kuyucuklu bir plakaya yerleştirin. Her kuyucuğa 300 µg/mL Lucifer ekleyin ve biyolüminesans görüntülemeye geçin. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Meme hücresi proliferasyonunu ölçmek amacıyla, meme kanseri hücreleri immobilize kemik fragmanlarının yanına eş kültürlenmiştir. 24 saatlik kültür sonrası yapılan biyolüminesans görüntüleme, üstteki üç kuyucukta kemik fragmanlarının varlığında, alttaki üç kuyucukta kemik fragmanlarının yokluğuna kıyasla artmış meme kanseri hücresi proliferasyonu göstermiştir. Üç ayrı cerrahi örnekten alınan fragmanlar kullanılarak yapılan deneylerin sonuçları, kemiğin varlığında yokluğuna göre artmış proliferasyon olduğunu göstermiştir.

Üç durumun tamamında, kemik doku fragmanlarının hemen altına yerleştirilen MCF seven F Luke EGFP hücrelerinin kolonizasyonu, 24 saat sonra biyolüminesans görüntüleme ile gözlemlendi. 48 saat sonra, sinyaldeki azalma, ekim yoğunluğunun düşmesiyle ilişkilendirildi. Bisfosfonat reaktifi ile işaretlenen doğrudan ekimli fragmanlar, GFP pozitif meme kanseri hücrelerinin mineralize ve ilik kompartmanları içinde kolonize olduğunu ortaya koydu.

Göğüs kanseri hücrelerinin gözenekli migrasyon membranı üzerinden kemik doku kültürüne doğru gerçekleşen migrasyonu, üstteki üç kuyucukta görülen süpernatanlarda kontrole kıyasla güçlüydü. Alttaki üç kuyucukta ise besiyeri görülmüştür. Belirli bir THR örneğinden alınan üç kemik fragmanına doğru migrasyon da gözlemlenirken, boncuklar üzerine herhangi bir migrasyon gözlenmemiştir.

Bu videoyu izledikten sonra, bir femur başı örneğinden insan kemik dokusu fragmanlarının nasıl çıkarılacağı ve göğüs kanseri hücrelerinin migrasyon, kolonizasyon ve proliferasyon dahil olmak üzere davranışlarını ölçmek için bu fragmanların ko-kültür deneylerine nasıl aktarılacağı konusunda kapsamlı bir bilgi sahibi olmalısınız.