Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.

Bu prosedürün amacı, bir insan kemik dokusu explan model sisteminde meme kanseri hücre proliferasyonunu, kolonizasyonunu ve göçünü incelemektir. Bu, femur başı cerrahi örneklerinden trabeküler kemik dokusu parçalarının izole edilmesi ve bunların lusiferaz ve yeşil floresan proteini eksprese eden meme kanseri hücreleri ile kültürlenmesiyle gerçekleştirilir. Biyolüminesans görüntüleme, hücrelerin proliferasyonunu ölçmek ve kemik dokusu parçalarında meme kanseri hücrelerinin kolonizasyonunu doğrulamak için kullanılır.

Meme kanseri hücre kolonizasyon paternleri floresan mikroskobu ile görüntülenir. İlik bölmesi, akış sitometrisi, lüminesans ve boyama testleri ile analiz için parçalardan yıkanabilir. Meme kanseri hücresinin doku kültürüne, süpernatanlara ve kemik dokusu fragmanlarına doğru göçü, biyolüminesans görüntüleme ile Transwell migrasyon odalarında ölçülür Kemik, meme kanseri metastazının en sık görüldüğü yerdir ve sonuçta bu model, kemik metastatik nişi içindeki meme kanseri hücrelerini incelemek için yeni bir pencere sağlar.

Bu modelin büyük bir avantajı, insan kemik dokusu parçalarının mikro çevresine doğrudan erişim sağlaması ve kısa süreli kokültür deneyleri sırasında meme kanseri hücresi davranışını kolayca gözlemlememize ve analiz etmemize olanak sağlamasıdır. Bu yöntem, meme kanserinin altında yatan mekanizmalar, kemiğe metastazlar hakkında temel soruları incelemek ve etkili bir şekilde önlemek ve tedavi etmek için terapötik stratejileri belirlemek amacıyla kullanılabilir. Bu model meme kanseri metastazı hakkında bilgi verebilse de, prostat kanseri gibi diğer kemik arayan maligniteleri incelemek için de kullanılabilir.

Kemik dokusu parçaları her tahlilde çeşitli noktalarda toplanmalıdır. Bu, bir femur örneğinin salin içinde toplanması ve taşınması ve iş istasyonunun cerrahi eldiven giyilerek bir biyogüvenlik kabininde hazırlanmasıyla başlar. Bir elinizle femur başını tutun ve trabeküler kemiği çıkarmak için cerrahi bir ham kullanın.

Parçalar yaklaşık iki ila beş milimetre büyüklüğündedir. Forseps bu adım için çalışmaz. Kaliteli bir cerrahi hama ihtiyacınız var.

Bu deney için, 50 mikrolitre DMEM başına 100.000 hücre ve% 10 FBS içeren bir meme kanseri hücresi süspansiyonu hazırlayın. Ek olarak, bir mikro pipet ucunun kesme uçlarını kullanarak kemik parçalarını hareket ettirmek için kemik mumu tapaları hazırlayın, tıkaçları bir Petri kabında saklayın. Daha sonra forseps ile tapaları altı kuyulu bir plakaya aktarın ve steril bir eldiven kullanarak tapaları saat 12 konumuna bastırın.

Daha sonra, her birinin ortasına 50 mikrolitre hücre süspansiyonu pipetleyin. Hücre bağlanmasını teşvik etmek için plakayı 45 dakika boyunca bir doku kültürü inkübatörüne yerleştirin, plaka inkübe edilirken, hücreler plakaya bağlı hücrelerle kemik parçalarını çıkarır. Bir kemik dokusu parçasını kemik balmumunun üzerine üç oyuklu olarak yerleştirin ve her birini, parça sunucuları kontrolleri olmayan GER üç kuyucuğu kullanarak aşağı doğru bastırın.

Daha sonra, her bir kuyucuğun duvarına yavaşça beş mililitre DMEM ve% 10 FBS ekleyin. Kemik mumu ve kemik parçaları yerinden çıkarılmamalıdır. Daha sonra kültürü 20 ila 24 saat inkübe edin.

Ertesi gün önce hücreleri görüntüleyin. Her bir oyuğa mililitre başına 300 mikrogram Lucifer ekleyin ve ardından plakayı hemen bir Ivis görüntüleme platformuyla görüntüleyin. Bu deney, bir öncekine benzer bir meme kanseri hücresi süspansiyonu gerektirir.

Kemik parçalarını çıkardıktan sonra, her bir parçayı 24 oyuklu bir plakanın boş bir kuyusuna aktarmak için forseps kullanın, daha sonra 50 mikrolitre hücre süspansiyonunu doğrudan her bir kemik parçasına pipetleyin ve hücre bağlanmasını teşvik etmek için plakayı 45 dakika boyunca bir inkübatöre aktarın. Hücreler yavaşça bağlandıktan sonra, kemik parçasını batırmak için her birine yeterince bir ila iki mililitre orta ekleyin. Daha sonra plakayı 20 ila 24 saat boyunca doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Ivis görüntüleme, floresan görüntüleme veya Ivis görüntüleme için analiz için kemik iliği hücrelerinin toplanmasına hazırlanırken, kemik parçalarını oyuk başına bir mililitre taze ortam bulunan 24 oyuklu bir plakaya aktarın. Her bir oyuğa mililitre Lucifer başına 300 mikrogram ekleyin ve floresan mikroskobu için daha önce tarif edildiği gibi devam edin. Kemik parçasının kemikli spiküllerini etiketlemek için her bir oyuğa beş mikrolitre floresan bifosfat etiketleme solüsyonu pipetleyin ve plakayı 24 saat daha inkübe edin.

24 saat sonra, parçaları fenol kırmızısı içermeyen ortamlar içeren plakalara aktarmak için forseps kullanın. Ardından, meme kanseri hücrelerini ve 680 nanometreyi ifade eden GFP'yi lokalize etmek, kolonize etmek için 485 nanometrede görüntü alacak şekilde yapılandırılmış bir floresan mikroskobu kullanarak plakaları görüntüleyin. Hücre sayılarının veya özelliklerinin analizi için kemik iliği bölmesini yıkamak için bifosfat işaretli kemik spiküllerini tanımlamak.

Bir parçayı 50 mililitrelik bir kronik tüp tüpü üzerinde 70 mikronluk bir süzgecin içine aktarın. Ardından, parçayı 10 mililitre PBS santrifüjü ile kuvvetlice yıkamak için 25 gauge iğneli 10 mililitrelik bir şırınga kullanın. Hücreleri aspire etmek ve supinat reus'u atmak için oda sıcaklığında üç dakika boyunca 300 G'de süspansiyon.

Akış sitometrisi veya canlılık deneyleri başına PBS veya diğer istenen çözeltilerde kemik iliği hücrelerinin peletini bükün. Kemik dokusu snet oluşturarak başlayın. Kemik parçalarını bir 12'nin kuyularına yerleştirin.

Kuyu başına 2.2 mililitre DMEM% 10 FBS içeren kuyu plakası ve bazı kontrol kuyularını kemik parçaları olmadan bırakın. Plakayı 24 saat boyunca kültürleyin. Daha sonra ortamı aspire edin ve değiştirin ve kültüre 24 saat daha devam edin, kültüre 48 saat sonra, alıcı plakayı geçici olarak inkübe ederken 0.9 mililitre supinatı bir alıcı plakaya aktarın.

Transwell eklerini boş bir 24 kuyulu plakaya yerleştirin. Daha sonra her bir eke 350 mikrolitrede 100.000 meme kanseri hücresi iPet. Ardından, hücre bağlanmasını teşvik etmek için plakaları 45 dakika boyunca kültürleyin 45 dakika sonra, ekleri bir alıcı plakaya aktarmak için forseps kullanın.

Ekleri alıcıya yerleştirirken açı verdiğinizden emin olun. Pekala, kabarcıklar oluşmaması için supinate. Daha sonra plakayı ertesi gün 37 santigrat derecede 20 saat boyunca eklerle inkübe edin.

Ekleri çıkarmak için forseps kullanın ve her birine mililitre Lucifer başına 300 mikrogram ekleyin. Membranlardan göç eden ve alıcı plaka kuyucuklarının dibine bağlanan meme kanseri hücrelerini tespit etmek için alıcı plaka üzerinde biyolüminesans görüntüleme gerçekleştirin. İlk olarak, besiyeri olan bir alıcı plaka yükleyin ve doku kültürü inkübatörüne yerleştirin.

Ekleri tohumlamak için. Bunları kapaklı boş bir mikro kaynaşmış tüp kutusunda ters çevirin. Daha sonra, her bir ek zarın dış alt yüzeyine 50 mikrolitrede 100.000 hücre ekleyin.

Kapağı çatlak bırakarak kutuyu kapatın ve ekleri doku kültürü inkübatöründe 45 dakika inkübe edin. Daha sonra, ekleri, bir alıcı plakanın kuyularını% 10 FBS ile 0,45 mililitre DMEM'de her bir yerleştirme kabına ters çevirmek ve aktarmak için forseps kullanın. Daha sonra her bir parçaya üç milimetrelik bir kemik parçası veya cam boncuk ekleyin ve 20 saat boyunca plakaya kesin.

Ertesi gün, parçaları ve boncukları bir mililitre taze ortam içeren kuyucuklu bir plakaya aktarmak için forseps kullanın. Kuyu başına mililitre Lucifer başına 300 mikrogram ekleyin ve biyolüminesans görüntülemeye devam edin. MDA MB 2 31 F.Luke EGFP.

Meme kanseri hücreleri, meme hücresi proliferasyonunu ölçmek için hareketsiz hale getirilmiş kemik parçalarına bitişik olarak birlikte kültürlendi. 24 saatlik kültürden sonra biyolüminesans görüntüleme, alttaki üç oyukta kemik fragmanlarının yokluğuna kıyasla, üstteki üç oyukta kemik fragmanlarının varlığında meme kanseri hücresi proliferasyonunun arttığını gösterdi. Üç ayrı cerrahi örnekten alınan fragmanlar kullanılarak yapılan deneylerin sonuçları, kemik varlığında ve yokluğunda proliferasyonun arttığını gösterdi.

Her üç vakada da, 24 saat sonra biyolüminesans görüntüleme ile doğrudan kemik dokusu parçalarının altına oturan MCF yedi F Luke EGFP hücrelerinin kolonizasyonu gözlendi. Azalan sinyal, 48 saat sonra azalan tohumlama yoğunluğu ile ilişkilendirildi. Bifosfonat reaktifi ile etiketlenmiş doğrudan tohumlanmış fragmanlar, mineralize ve ilik kompartmanları içinde GFP pozitif meme kanseri hücrelerinin kolonizasyonunu ortaya çıkardı.

Meme kanseri hücrelerinin gözenekli göç zarı boyunca kemik dokusu kültürüne doğru göçü, ilk üç kuyucukta görülen süpernatantlar, kontrole göçe kıyasla sağlamdı. Orta, alttaki üç kuyuda görülür. Belirli bir THR örneğinden üç kemik parçasına göç de gözlenirken, boncuklar üzerinde herhangi bir göç gözlenmedi.

Bu videoyu izledikten sonra, bir femur başı örneğinden insan kemik dokusu parçalarının nasıl çıkarılacağını ve bunları göç, kolonizasyon ve proliferasyon dahil olmak üzere meme kanseri hücresi davranışlarını ölçmek için kokültür tahlillerine nasıl başlatacağınızı iyi anlamış olmalısınız.