Name: Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-03-15T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 41 s
Description: Keşfedin meme kanserinin kemik metastatik nişindeki davranışlarını insan femur doku eksplantları kullanarak. Biyolüminesans görüntüleme ve floresan mikroskopi ile hücre proliferasyonu ve kolonizasyonunu analiz edin.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışmalar Alternatif Araştırma ve Geliştirme Vakfı (107.588), Ulusal Sağlık Enstitüsü (1U54CA136465-04S1) ve Kaliforniya Meme Kanseri Araştırma Programı (201B-0141) hibe, kısmen finanse edildi. Biz Dr teşekkür ederim. Cömert bağış için Andrew Wilber ve R. Scott McIvor onların <pkt2 lubig=""> transponson ve pKa / hUbiC-SB11 transposaz plazmidler. Biz minnetle John Tamaresis, Ph.D. kabul istatistiksel yöntemler tavsiye için, Timothy Brown flow sitometri gerçekleştirmek için, göçler tahliller tavsiye için Georgette Henrich, Nancy Bellagamba için THR örneklerinin koleksiyonu kolaylaştırılması. </pkt2>

Femur başları Stanford Üniversitesi Tıp Okulu&#39;nda Ortopedi Bölümü&#39;nde seçmeli THR ameliyatı geçiren hastaların toplanmıştır. Tüm dokular Stanford Üniversitesi Araştırma Uyum Ofisi düzenlemelerine uygun olarak de tanımlanan örneklerin olarak toplanmıştır. 1. Bir Meme Kanseri Hücre Hattı (ler) seçilmesi <ol><li> Elde edilir ya da bir lusiferaz-GFP raportör yapısı ile, istenen göğüs kanseri hücre çizgisi (ler) transfekte. Aşağıdaki deneyler, uyku güzellik transpozon plazmid pKT2 / LuBiG ile transfeksiyon ile MDA-MB-231 ve MCF-7 göğüs kanseri hücre çizgileri ateşböceği lusiferaz dengeli bir şekilde ifadesi için tasarlanmış (Fluc) ve gelişmiş yeşil floresan protein (EGFP) kullanılarak gerçekleştirilmiştir transposaz plazmit pK / hUbiC-SB11 45,46. Not: Transfekte edilmiş hücre çizgileri MDA-MB-231-Fluc-EGFP ve MCF-7-Fluc EGFP olarak adlandırılır. </li></ol> 2. Ayırma Doku FFemoral Heads ragments <ol><li> THR ameliyatları sonrası, fizyolojik tuzlu su ile dolu bir steril kap içinde atılır femur başı toplar. Laboratuvara numune aktarın ve cerrahi 1-3 saat içinde işleme. Not: işlemede bir gecikme varsa, 4 ° C&#39;de örneği yerleştirin. </li><li> Deneyin her türü için aşağıda belirtilen şekilde steril eldiven, cerrahi rongeur, forseps, beher% 70 izopropanol ile aletleri, ve doku kültürü gemiler durulama: laminer akış doku kültürü kaputu emici mat aşağıdaki öğeleri yerleştirerek bir çalışma alanı hazırlayın . </li><li> Bir steril cerrahi eldiven giyen, bir yandan yuvarlak femur başını tutun femur maruz üst şaft istenen boyutta (~ 2-5 mm) trabeküler kemik parçaları ayıklamak için, diğer elinde rongeur kullanmak için. Kültür kabı içine kemik parçaları transfer (örneğin, 6-, 12, ya da doku kültürü plakası, veya geçiş bölmesi 24-çukurlu), proliferasyon türüne bağlı olarak, sütunonization veya göç deneyi, adım 3, 4 veya 5&#39;te tarif edildiği gibi. NOT: Her özel proliferasyon, kolonizasyon veya göç deneyi için ilk adımları tamamlandıktan sonra yukarıda tarif edildiği gibi kemik dokusu parçaları hasat edilmesi. Şekil 2&#39;de gösterildiği gibi, parçalar, boyut aralığında değişecektir. Fragmanları önce ya da standart amacıyla deneyler sonra tartılır edilebilir. </li></ol> Kemik Fragments bitişiğinde 3. Eş-kültürleme Meme Kanseri Hücreleri BLI kullanma Meme Hücre Proliferasyonunu Tedbir <ol><li> Önceki deneyden 2 x 10 5 meme kanseri hücre / 50 ul ihtiva eden bir süspansiyon hazırlamak ve kültürde kemik parçaları hareketsiz tutmak için kemik mumu fişleri hazırlayın. 3 parçaya P200 mikropipet ucu kesin ve kemik mumu küçük (~ 35 mg) adet kesmek için bir &quot;çerez kesici&quot; bir şekilde büyük parçanın dar ucunu kullanın. Petri kabı içine kemik balmumu fişlerini çıkarmak için küçük parçanın geniş ucunu kullanındepolama için. </li><li> Her kuyunun 00:00 pozisyonunda kemik balmumu bir parça koyun ve yavaşça bir steril eldivenli işaret parmağı ile bastırın. </li><li> Pipet, 6 gözlü bir plakanın her bir kuyucuğun merkezinde, DMEM,% 10 FBS + Pen-strep 1 x 10 5 göğüs kanseri hücreleri ihtiva eden bir hücre süspansiyonu 50 ul. (Alternatif olarak, arzu edildiği takdirde dağınık bir biçimde tohum hücreleri.) Hücre eki teşvik etmek için 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka koyun. </li><li> Her deney kuyu için kemik mumu 1 parça üzerine 1 kemik parçasını yerleştirin ve sabitlemek için ronjur ile hafif basınç uygulayın. Alt üç kuyu sadece kontroller olarak kemik mumu ihtiva ederken, belirli bir THR örnekten şekilde 3 kemik parçaları ilk üç kuyular yerleştirilir üç nüsha olarak deneyleri. </li><li> 5 ml&#39;lik bir pipet kullanılarak, yumuşak ve yavaş meme hücreleri veya kemik parçaları yerinden ayrılmasını önlemek üzere, her bir yan DMEM% 10 FBS, 5 ml sağlar. 37 plaka koyun76, 20-24 saat süre ile C doku kültürü kuluçka makinesine kondu. </li><li> Biyoışıldama görüntüleme gerçekleştirmek için (BLI) inkübatör plaka çıkarın ve her bir oyuğa (300 ug / ml&#39;lik bir konsantrasyon elde etmek için) lusiferin substratı ilave edin. Görüntü aşağıdaki parametreleri kullanarak bir IVIS Görüntüleme Platformu&#39;nda hemen plaka: 1 f-stop, küçük binning, 1 sn pozlama süresi, seviye D sinyal her yoğunluğunu sıra ortalama parlaklık (fotonlar / saniye / kare santimetre / Tedbir steradyan). </li><li> Tüm deney ve kontrol kuyuları için ortalama parlaklık ölçmek için İlgi (ROI) Bölgeleri tanımlamak için görüntüleme yazılımı kullanın. Bir Excel sayfası İhracat ortalama parlaklık değerleri istatistik gerçekleştirmek ve grafikler oluşturmak için. </li></ol> Kemik Fragments üstüne Doğrudan Tohumlu 4. Eş-kültürleme Meme Kanseri Hücreleri Kolonizasyon ve Hücre sayısı Eğitim için <ol><li> 24-çukurlu doku kültürü plakasının boş kuyu doğrudan kemik parçaları yerleştirmek (1 fragmanı / çukur) için forseps kullanır. </li><li> Ölmekdoğrudan her bir kemik parçasından en 1 x 03-06 Ekim meme kanseri hücreleri içeren DMEM% 10 FBS, 50 ul hücre süspansiyonu damlacık ette. Hücre eki teşvik etmek için 45 dakika boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka koyun. Yavaşça parçası tamamen ortam içine, her bir sıra bu yan içine 1-2 mi DMEM,% 10 FBS ekleyin. 20-24 saat süreyle 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde plaka inkübe edin. </li><li> İnkübasyondan sonra, her bir çukura 1 ml DMEM% 10 FBS ihtiva eden bir taze 24-yuvalı plaka her bir kemik dokusu fragmanı aktarmak için forseps kullanır. BLI gerçekleştirmek için, adımları 3,6-3,7 yukarıdaki izleyin. Buna ek olarak, parçalar, bir floresans mikroskobu kullanılarak izlenebilir ya da aşama 6&#39;da tarif edildiği gibi, meme kanseri hücresi sayısı ve özelliklerinin analizi için iliği popülasyonu elde etmek için yıkanır olabilir. </li><li> BL, pipet floresan bifosfonat etiketleme çözümü 5 ul (ön aşağıdaki floresan mikroskobu ile kalitatif değerlendirme için sağlam parçaları hazırlamak içinKemik parçalarının mineralize spikülleri etiketlemek için, her bir oyuğa) kullanılarak üreticinin talimatlarına göre düşüktü. Bir 24 saat boyunca doku kültür inkübatörü içinde plaka inkübe edin. </li><li> Floresan bifosfonat etiketleme çözeltisi içinde kültür 24 saat sonra, görüntü GFP (485 nm) ve bisfosfonat etiketin (680 nm) için yapılandırılmış bir floresan mikroskobu kullanılarak fenol kırmızısı içermeyen ortam ve görünümü içeren bir doku kültür plakalarına fragmanları aktarmak için forseps kullanır. </li></ol> 5. Kemik Doku Fragments ve kültürlü Kemik Parçası süpematantlan için Meme Kanseri Hücreleri Göç Ölçme <ol><li> Kemik doku kültürü süpernatant doğru göç. Not: üç kopya halinde, belirli bir THR örnekten şekilde 3 fragmanları deneyleri gerçekleştirmek 3 süpernatantlar oluşturmak için kullanılır. Her deney için, göç kemik süpernatanlan vs kontrol ortamını yalnızca içeren üç kuyu içeren üç kuyu boyunca karşılaştırılır. <ol><li> Kemik tis oluşturunoyuk başına 2.2 ml DMEM% 10 FBS ihtiva eden bir 12 gözlü bir levhanın gözleri içine kemik parçalarının yerleştirilmesi ile süpernatantlar dava. 24 saat boyunca 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde kültürü. 24 saat sonra ortam çekin ve 2.2 ml taze DMEM,% 10 FBS ile değiştirin. DMEM-10% FBS aynı şekilde içeren sağlıgı kontrol kuyuları. NOT: düşük operasyon sonucu meydana gelen doku travmasının yanıt olarak salgılanan faktörler kaldırmak için 24 saat sonra değiştirildi. Kemik dokusu üzerinde yüzer durumda kısımlar oluşturulacak için sadece meme kanseri hücre göçü FBS katkıları için kontrol edilmesi için dahil edilir FBS içeren ortam içeren ortam, kuyu FBS ihtiva eden. </li><li> 48 saat sonra, bir alıcı plakanın oyukları içinde her bir süpernatan / kontrol ortamı ve pipet 0.9 ml toplar. ekler sonra bu kuyulara alınacaktır. Uçlar, tohumlama sırasında doku kültürü kuluçka makinesi içinde alıcı plaka inkübe edin. Not: Kalan supernatant (~ buharlaştırmadan sonra 1 mi) secretome fiili analizi için toplanabilirrs eğer 44 istenilen. </li><li> Transwell tohum için, standart bir boş 24 oyuklu doku kültürü plakası içine yerleştirin. Şekil 1A&#39;da gösterildiği gibi, her bir ek üst, iç zar yüzeyi üzerine DMEM% 10 FBS içinde, 1 x 10 5 meme kanseri hücreleri ihtiva eden Pipet 350 ul hücre süspansiyonu. Eki teşvik etmek için 45 dakika süreyle 37 ° C&#39;de doku kültürü kuluçka makinesi içinde tohumlanır ekler ihtiva eden 24 oyuklu plaka koyun. </li><li> Hücreler ekler taşıyabilir sonra, imalatçının talimatlarına göre alıcı plaka ekler aktarmak için forseps kullanır. Açı eklemek zarında ve iyi yüzer madde alıcı arasındaki kabarcık oluşumunu önlemek için de alıcı içine yerleştirerek her ekleme. 37 ° C&#39;lik bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde 20 saat ekler ile alıcı plaka inkübe edin. NOT: insert membran ve iyi supernatan alıcı arasındaki kabarcıklar için alıcı plakasının alt tarafını kontrol edint. Kabarcıklar görülebilir iseniz, belirli ekler kaldırmak ve hiçbir kabarcıklar mevcut olana kadar iyice alıcı içine tekrar yerleştirin. </li><li> 20 saat kullanım forseps sonra alıcı plaka ekler kaldırmak için. Adımda prosedürler kullanılarak 3.6-3.7 görüntü içine göç ve alıcı plaka kuyuların dibine bağlı olan hücreleri BLI gerçekleştirmek. </li></ol></li><li> Kemik doku parçaları doğru göç. Not: üç kopya halinde, belirli bir THR örnekten şekilde 3 fragmanları deneyleri gerçekleştirmek 3 ayrı uçlar yerleştirilir ve 3 cam tanesi, kontroller olarak, 3 ayrı uçlar yerleştirilir. <ol><li> Her kuyuya 0.9 ml DMEM-10% FBS pipetleme alıcı plaka hazırlayın. Ekler hazırlanırken doku kültürü kuvöz içine yerleştirin. </li><li> Ekler tohum, bir kapağı olan plastik bir tüp mikrofuge&#39;ye kutusunun yüzeyinde onları ters çevirin. 1 x 10 5 göğüs kanseri hücreleri d içeren DMEM% 10 FBS, 50 ul hücre süspansiyonu damlacık Pipetirectly (ters ekler üzerinde yukarı baktığından) Her ekleme zarının dış, alt yüzeye. Kapaklı mikrofuge&#39;ye tüp kutusu açık kırık Kapak ve hücre eki teşvik etmek 45 dakika için 37 ° C doku inkübatör aktarın. </li><li> Doku kültürü kaputu mikrofuge&#39;ye tüp kutusunu aktarın ve sağ tarafı yukarı numaralı seribaşı ekler açmak ve alıcı plaka kuyu içine aktarmak için forseps kullanabilir. Her ekleme kabına Pipet 0.450 ml DMEM-% 10 FBS. Forseps kullanarak, her hazırlanmış ekleme fincan içine bir kemik dokusu fragmanı (~ 3 mm) aktarın. İsteğe bağlı olarak, ek bir kuyu cam boncuklar negatif kontrol olarak kullanılır. 20 saat boyunca bir doku kültür inkübatörü içinde plaka koyun. </li><li> Migrasyonun ölçülmesi için, oyuk başına 1 mi DMEM,% 10 FBS ihtiva eden bir standart 24 oyuklu doku kültürü plakası hazırlanır. Inkübatör alıcı plakasını çıkarın ve standart plaka ayrı kuyu içine her birinden eklemek kemik parçaları ve boncuk aktarmak için forseps kullanabilir. Lüsiferin eklealt-tabaka her oyuğa (300 ug / ml&#39;lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için) ve adım 3.6-3.7 prosedürleri kullanarak BLI gerçekleştirin. </li></ol></li></ol> 6. Ek öncesi ve sonrası deneysel Analizleri <ol><li> Kızarmış iliği analizi. <ol><li> 50 ml konik tüp üst yerleştirilen 70 mikron hücre süzgecinden içine bir kemik parçası aktarın. Kuvvetli bir şekilde konik bir tüp içinde kemik iliği hücreleri, bir süspansiyon elde etmek için, 10 ml PBS ile bir parçasını temizlemek için bir 25 G iğne ile 10 ml&#39;lik bir şırınga kullanın. Santrifüj hücre süspansiyonu 300 xg&#39;de 3 dakika, 21 ° C, süpernatan aspire ve PBS içinde pelet hücreleri ya da akış sitometrisi için istenen diğer bir çözüm yeniden süspanse edin. Not: Tekrar süspansiyona, miktarlar santrifüj ve uygulamadan sonra hücre peleti boyutuna bağlı olarak değişir. </li><li> Canlılık analizi için PBS ~ 75-300 ul hacim ticari olarak temin edilebilen fluorescenc kullanılarak uygun olan ve bu süspansiyonlar analiz edilebilire göre canlılığı testleri, imalatçının talimatlarına uygun olarak, geleneksel bir hemasitometre pipetlenir ve bir ters flüoresan mikroskop kullanılarak sayılmıştır. </li><li> Akış sitometrik analizi için ya da GFP-pozitif göğüs kanseri hücrelerinin saptanması göre ayrılması,% 2 FBS, 2 mM EDTA ihtiva eden 1 ml PBS içinde hücre topağı tekrar süspansiyon ve 10 konsantrasyon 1 x 10 6 hücre / ml mM HEPES, öyle ki. </li></ol></li><li> H &amp; E Boyama ve İmmünhistokimya. <ol><li> Hematoksilin ve eosin (H &amp; E) boyama ve / veya immünohistokimya için fragmanları işlemek için, bir dizi 2 kalemle etiketlenmiş plastik kasetlerinde fragmanları yerleştirin ve 24 saat süre ile,% 10 tamponlu formalin ile dolu bir kap içinde daldırın. </li><li> Parafin gömme için proses dokular, kesit ve her fragmanında mineralli spikülleri hesabını bir Dekalsifikasyon aşamasını içerir rutin protokoller kullanılarak boyanan. </li></ol></li></ol>

Rapor edilecek açıklama yok.

Mehra ark., Daha önce yüksek kaliteli dokuları ortaya ve metastatik süreci 47 çalışma, insan kemik örneklerinin kullanımını doğrularken, otopsi sırasında hasat metastatik prostat kanseri hastalarından alınan postmortem toplama ve kemik örneklerinin analizi tarif var. Burada, toplama, işleme ve meme hücre göçü, kolonizasyon ve çoğalmasını incelemek için kısa vadeli bir ko-kültür sisteminde THR cerrahi sonrası atılır femur başları elde edilen insan kemik doku parçaları kullanarak protokolleri tarif var...

tümör mikro yaygın meme kanseri ilerlemesi ve metastatik sırasında kanser hücresi davranış kritik belirleyicisi olarak kabul edilmektedir 1-3 yayıldı. Burada sunulan yöntemin amacı, insan kemik dokusundan, göğüs kanseri metastazı 4-6 en sık site mikro-içinde, meme kanseri hücrelerinin çalışma kolaylaştırmaktır. Kemik metastatik ilerlemesi 10,11 sorumlu hücreler ve salgılanan faktörler barındıran her ikisi de mineralize ve iliği bölümlerinin 7-9 oluşur. Yaygın in vivo fare modellerinde kullanılan rağmen metastatik sürecinin 12-15 sistemik çalışmalarını kolaylaştırmak, iskelet içinde hücre etkileşimleri gözlem ve doğrudan pertürbasyon için kolayca erişilebilir değildir. Eğitim ve fare kemik dokuları ve fare kemik iliği hücreleri kültür Model sistemleri daha iyi erişim sağlamak ve meme kanseri hücre m altında yatan birçok karışma ilgili anlayışlar ve mekanizmalar vermiştirMurin iskelet 16-22 etastasis. Ancak, çalışmalar kemik dokusu 23,24 için osteotropism ve türe özgü desenleri olabileceğini düşündürmektedir. Bu modeller, kemik muhtemel belirleyiciler hepsi doğal türe özgü kemik dokusu özelliklerindeki farklılıklardan, bağışıklık-eksikli fareler 11 değiştirilmiş kemik iliği popülasyonlardan elde edilen farklar, ve / veya deneylerinde kullanılan fareler nispeten genç yaş, yansıtabilir mikroçevresinin. In vitro olarak, tipik haliyle, kemik iliği türevli osteoblast veya tek katmanlar olarak kültür stromal hücreler olarak ya da genetik mühendisliği 3 boyutlu model sistemlerinde 25-35 içinde belirli kemik hücre tipleri üzerinde odaklanmıştır insan kemik eş kültürlerinde meme kanseri hücreleri incelemek için yaklaşımlar. 2-boyutlu hücre kültürü modelleri, in vitro dayanak oluşan kanser araştırmaları için yaklaşımlar var olsa da, uzun hücre davranışı temelde m değiştirilmiş olduğu kabul edilmiştirkültür sistemleri 18,36,37 onolayer. Bu matris ve kolajen gibi doğal malzemelerden oluşan iskele tabanlı modelleri dahil olmak üzere 3-boyutlu bir oturma dokuların karmaşıklığı taklit eden, işlenmiş mikroçevrelerde gelişmesine yol açmıştır ya da sentetik polimerler, doku gibi mikroçevrelerde oluşturmak için özel hücre tipleri ile tohumlandı 36-41. Engineered yaklaşımlar da kontrol ve mikroçevresinin 18,19,41-43 hormonal ortam çalışma biyoreaktör platformlarının kullanımı dahil ettik. Biomimetik modelleri ve biyoreaktörler kontrollü bir ortamda kompleks doku çevresinde birçok unsuru sağlar ve başarılı kemik 18,19,35,42,43 meme kanseri metastazı çalışma önceden uygulanmış olsa da, işlenmiş model sistemler, genel olarak yapılmasına olanak vermemektedir doğal kemik ortamında mevcut hücre tipleri ve hücre dışı matriks bileşenlerinin tam spektrum. Yakın zamana kadar, göğüs kanseriHücreler, insan kemik dokularının yerli, bozulmamış, 3-boyutlu mikroçevresinin içinde çalışılmamıştır. Biz son zamanlarda (THR) ameliyatı 44 örneklerinde total kalça protezi izole insan kemik doku parçaları kullanarak bir ko-kültür modelinin gelişmesini bildirdi. Bu örnekler hem kısa vadeli kültüründe mikro-metastazı altında yatan mekanizmaları incelemek için gerekli mineralizasyon ve kemik iliği bölmeleri liman. Önceki çalışmada, kemik parçaları 44 ile (MDA-MB-231-Fluc) ko-kültür lusiferaz sentezleyen meme kanseri hücrelerinin çoğalmasını izlemek için biyoışıldama görüntüleme (BLI) kullanılarak kanıtını prensip oluşturmuştur. Burada insan kemik dokusu eksplantlarındaki yerli mikroçevresinin kapsamında meme kanseri hücre çoğalmasını, kolonizasyonu ve göç çalışmak için deneysel protokolleri ayrıntılı bulundular. İlk olarak meme ölçmek için kemik parçaları bitişik eş-kültürleme göğüs kanseri hücreleri için bir protokol mevcutBLI kullanarak hücre çoğalması. Bu bölümde, meme hücresi süspansiyonları, kemik mumu parçaları ile hareketsiz hale kemik parçaları, bitişik 6 oyuklu plakalar içinde hücre noktalar olarak tohumlanır. Kontrol kuyuları, kemik mumu, ama hiçbir kemik fragmanı içerirler. Hücre noktalar eklemek sonra, orta eklenmiş ve plaka BLI ile ölçülür biyolüminesens sinyal yoğunluğu (hücre sayısı ile ilişkili) sonra 24 saat için kültüre edilir. Bir sonraki adımda, kolonizasyonun ve çoğalmanın çalışma kemik parçalarının doğrudan ekilmiş ko-kültür göğüs kanseri hücreleri için yöntemler sunar. İşte meme hücre süspansiyonları kolonizasyonu ve hücre sayısını izlemek için zamanla BL ve floresan mikroskobu ile kültüründe izlenir kemik doku parçaları, doğrudan pipetlenir. Bu yöntemde, kemik iliği bölme akış sitometrisi ile kolonize göğüs kanseri hücrelerinin analizi için her zaman noktasında kemik parçaları temizlendi, ya da ilik canlılığı deneyleri edilebilir. Buna ek olarak, elimizdeki deMeme kanseri hücre göçü ölçmek için kâtip, iki farklı yaklaşım. İlk yöntemde adım kemik dokusu kültür yüzer doğru göç ölçülmesi için özetlenmiştir. Transwell iç üst yüzeyleri bir 8 um gözenek büyüklüğüne sahip membranlar eklemek üzerine (Şekil 1A &#39;da gösterildiği gibi), bu protokolde, göğüs kanseri hücreleri tohumlanır. Ekler daha sonra kemik dokusu süpernatan ya da kontrol ortamı içeren oyuklara sahip bir alıcı plaka içerisine yerleştirilmiştir. 20 saatlik bir bekletme sürecinden boyunca, meme kanseri hücrelerinin az sayıda aşağı bunlar BLI tespiti için eklemek alt doku kültür kuyu içine sokma zarları içinden yer değiştirmektedir. İkinci geçiş yöntemde meme kanseri hücreleri Transwell uç zarların alt dış yüzeyleri üzerine ekilir. Kemik dokusu parçaları uç bardak içine yerleştirilir ve göğüs kanseri hücreleri (Şekil 1 B &#39;de gösterildiği gibi), kemik parçaları kolonize zarlanndan taşınmalarısonra BLI kullanarak görüntülü.

<table><tbody><tr><td>DMEM (1X) + GlutaMAX-l</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>10569-010</td><td>Tüm DMEM'leri %10 fetal sığır serumu ve %1 Pen/Strep ile tamamlayın</td></tr><tr><td>McCoy's 5A Orta (1X)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16600-082</td><td>Tüm McCoy's&nbsp;% 10 fetal sığır serumu ve% 1 Pen / Strep</td></tr><tr><td>ile tamamlayın Fetal sığır serumu</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penisillen Streptomisin</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Blastocidin (10 mgl/ml)</td><td>InvivoGen&nbsp;</td><td>ant-bl</td><td>Transfekte edilmiş hücre hatları için kullanılan ek ortam.</td></tr><tr><td>Şahin&reg; Şeffaf PET Membranlı 24 Kuyulu Plaka için Hücre Kültürü Ekleri (8.0 & mu; m gözenek boyutu)</td> <td>Corning Incorporated</td><td>353097</td><td></td></tr><tr><td>Falcon&reg; 24 Kuyu TC ile İşlenmiş Polistiren Hücre Kültürü Ekleme Yardımcı Plakası</td><td>Corning Incorporated</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>CANLI/ÖLÜ Canlılık/Sitotoksisite Kiti * memeli hücreleri için *</td> <td>İnvitrojen Tespit Teknolojileri</td><td>L-3224</td><td></td></tr><tr><td>FluoroBrite DMEM</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>A18967-01</td><td></td></tr><tr><td>D-lusiferin ateşböceği, potasyum tuzu 5 g (30 mg / ml)</td> <td>Life Technologies</td><td>L-8220</td><td></td></tr><tr><td>Steril Hücre Süzgeci 70 & mu; m</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363548</td><td></td></tr><tr><td>6 Kuyulu TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü Kümesi</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>12 İyi TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü Kümesi</td><td>Corning Incorporated</td><td>3513</td><td></td></tr><tr><td>24 İyi TC ile İşlenmiş Hücre Kültürü Kümesi</td><td>Corning Incorporated</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Friedman-Pearson Rongeur</td><td>Güzel Bilim Araçları</td><td>16021-14</td><td></td></tr><tr><td>Kemik mumu</td><td>Cerrahi Uzmanlıklar Şirketi</td><td>903</td><td></td></tr><tr><td>IVIS 50 Görüntüleme Platformu</td><td>Kumpas Yaşam Bilimleri/PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Living Image Yazılım Programı&nbsp;</td><td>Kumpas Yaşam Bilimleri/PerkinElmer</td><td>133026</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL Görüntüleme Sistemi</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>Sürüm 4.2</td><td></td></tr><tr><td>OsteoSense 680 EX</td><td>PerkinElmer</td><td>NEV10020EX</td><td></td></tr><tr><td>MCF-7 meme kanseri hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-22</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231 meme kanseri hücreleri</td><td>ATCC</td><td>HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonal fare anti-insan sitokeratini antikor</td><td>DAKO Sitomasyon Klonu</td><td>(AE1/AE3)</td><td></td></tr></tbody></table>

kültürleme İnsan femur doku eksplantlarından yöntemleri metastatik niche meme kanseri hücre kolonizasyon eğitim için

Methods for Culturing Human Femur Tissue Explants to Study Breast Cancer Cell Colonization of the Metastatic Niche

Kemik meme kanseri metastazı en sık sitedir. Yaygın mikroçevresinin etkiler kanser hücresi davranışı kabul edilmesine rağmen, çok az insan kemik dokusunun doğal mikroçevresinin içinde meme kanseri hücre özellikleri ve davranışları hakkında bilinmektedir. Biz, izlemek ölçmek ve mikro-içinde insan meme kanseri hücrelerini modüle yaklaşımlar geliştirdik Total kalça protezi ameliyatları takip atılır femur başları izole kültür, insan kemik doku parçaları. Meme kanseri hücrelerini lusiferaz için tasarlanmış ve yeşil floresan protein (EGFP) ifade gelişmiş kullanarak, tekrarlanabilir sonra meme hücreleri floresan mikroskopi kullanılarak kemik parçaları içinde biyolüminesans görüntüleme kullanılarak göç ve çoğalması desenleri (BLI), parça hücre etkileşimleri ölçmek ve değerlendirmek mümkün Akış sitometrri ile kolonizasyon. Bu modelin temel avantajları şunlardır: 1) bir yerli, mimari sağlam doku microeilgili insan hücre tiplerini içerir ve hızlı nicel ve nitel izleme ve meme ve kemik hücre özellikleri, davranışları ve etkileşimleri pertürbasyon kolaylaştırır mikroçevresinin, 2) doğrudan erişim bütünlüklü. Birincil sınırlama, şu anda, kısa vadeli kültürüne çalışmanın pencere sınırlandırmaktadır doku parçalarının, sonlu canlılık olduğunu. Model sisteminin uygulamaları metastatik niş içinde meme kanseri ve diğer kemik arayan maligniteler temel biyoloji okuyan ve etkili bir kemik dokularında meme kanseri hücrelerini hedef tedavi stratejilerinin geliştirilmesi bulunmaktadır.

Femoral Heads Doku Fragments Yalıtımlı Femur başları erkek ve Stanford Üniversitesi Tıp Okulu&#39;nda Ortopedi Bölümü&#39;nde seçmeli total kalça protezi ameliyatı geçiren kadın hastalarda (yaş 44-90 yıl) eşit sayıda toplanmıştır. Her atılır femur başı mineralli spikülleri ve kemik iliği oluşan trabeküler kemik dokusu barındıran üst femur, küçük bir bölümünü içerir. Bu doku küçük parçalar elde etmek için cerrahi bir rongeur kullanılarak mil (Şekil 2A) ve cerrahi olarak açığa...

Protokoller, insan kemik doku eksplantı model sisteminde göğüs kanseri hücre hareketi, çoğalması ve kolonizasyonu çalışmak için tarif edilmiştir.

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Bone is the most common site of breast cancer metastasis. Although it is widely accepted that the microenvironment influences cancer cell behavior, little ...

Bu prosedürün amacı, insan kemik dokusu explan model sisteminde meme kanseri hücre proliferasyonunu, kolonizasyonunu ve migrasyonunu incelemektir. Bu işlem, femoral baş cerrahi örneklerinden trabeküler kemik doku fragmanlarının izole edilmesi ve bunların lusiferaz ile yeşil floresan protein eksprese eden meme kanseri hücreleri ile kültüre edilmesiyle gerçekleştirilir. Hücre proliferasyonunu ölçmek ve meme kanseri hücrelerinin kemik doku fragmanlarındaki kolonizasyonunu doğrulamak için biyolüminesans görüntüleme kullanılır.Meme kanseri hücre kolonizasyon modelleri floresan mikroskopi ile görüntülenir. Analiz için kemik iliği kompartımanı, lüminesans ve boyama deneyleri ile akış sitometrisi aracılığıyla fragmanlardan yıkanarak boşaltılabilir. Meme kanseri hücrelerinin doku kültürü süpernatantlarına ve kemik doku fragmanlarına doğru göçü, biyolüminesans görüntüleme ile Transwell göç odacıklarında ölçülür; kemik, meme kanseri metastazının en sık görüldüğü bölgedir ve nihayetinde bu model, kemik metastatik nişindeki meme kanseri hücrelerini incelemek için yeni bir pencere sunar.Bu modelin en büyük avantajı, insan kemik dokusu fragmanlarının mikroçevresine doğrudan erişim sağlamasıdır; b

methods-for-culturing-human-femur-tissue-explants-to-study-breast

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Optik Projeksiyon Tomografi İnsan Meme Kanseri Örnekler ve Analiz Uzun vadeli Kültür

Basit bir metodu ile ilişkili epitel hücreleri üzerindeki doku fibroblastlann etkileri analiz etmek için tarif edilmiştir. Bu yöntem, üç boyutlu bir doku kültürü kombinasyonu 3D izole sonra hücrelerin analizi kolaylaştırabilir. Tekniği tümör hücreleri üzerindeki tümör-stroma etkileri ile ilişkili sistematik çalışma izin veren, habis potansiyeli değişen hücreleri için de geçerlidir.

Üç boyutlu Karışık-hücre Sfero Co-kültürden Meme Epitel Hücrelerinin İzolasyonu

Bu videoda, bir insan kemik dokusu eksplant model sisteminde kanser hücresi proliferasyonunu ve kolonizasyonunu ölçmek için femur kemik eksplantlarına bitişik meme kanseri hücrelerinin kültürlenmesi açıklanmaktadır.

BC Hücrelerinin Birlikte Kültürlenmesi: Kanser Hücresi Proliferasyonunu İncelemek için Meme Kanseri Hücrelerinin Kemik Parçalarıyla Kültürlenmesi

Standart yöntemlerle olarak hücreler, fizyolojik bir ortam üzerinden alınır ve bir çanak plastik yüzeyi üzerinde büyütülür. Birincil insan kemik iliği hücrelerinin davranışını incelemek için biz hücreler doku yerel mikro yansıtan koşullar altında yetiştirilen bir 3-D kültür sistemi oluşturulur.

İlköğretim İnsan Kemik İliği ve Maligniteleri Eğitim Bir Üç boyutlu Doku Kültürü Modeli

Sağlam doku organoids kullanılarak primer hücre kültürü çok hücresel in vivo mikroortam taklit eden bir model sistemi sağlar. Biz enzimatik doku hasarı olmadan, morfoloji farklılaşmış karışık hücre kültürü soyları ve sergiler yaşatan bir serum serbest birincil meme epitel doku kültürü modeli geliştirmiştir. Meme organoids&gt; 6 ay için geçerli kalır.

Enzimatik olmayan, Mammospheres spontan Üretimi için Ön-invaziv Meme Lezyonların Serum serbest Doku Kültürü

Burada, kanser hücresi davranışının çok hücreli etkileşimlerini ve hücre dışı matrise bağlı modülasyonunu araştırmak için yararlı olan üç boyutlu ko-kültür için bir protokol sunuyoruz. Bu deneysel modelde, kanser hücreleri, insan kanseriyle ilişkili fibroblastlarla gömülü kollajen jelleri üzerinde kültürlenir.

Tümör-stromal Etkileşim için üç boyutlu Co-kültür Modeli

Bu el yazması, farelerin lenf nodu, kemik, akciğer ve beyninden türetilen organ koşullu ortamlardan oluşan bir ex vivo model sistemi tanımlar. Bu model sistem, organ kaynaklı çözünür faktörleri ve bunların organ tropizmi ve kanser hücrelerinin metastatik davranışı üzerindeki etkilerini belirlemek ve incelemek için kullanılabilir.

Meme Kanseri Metastatik Davran Organ spesifik Etkiler incelenmesi için Organ klimalı Medya ve Uygulamaları Üretimi

Burada, kanser metastazında pulmoner alveoler makrofajların fonksiyonlarını incelemek için model ve yaklaşımı açıklıyoruz. Bu hücrelerin metastazdaki rolünü göstermek için, alveolar makrofajın klodronat lipozomlarla tükenmesi ile birlikte meme kanserinin sinjenik (4T1) modeli kullanıldı.

Meme Kanseri Metastaz alveoler makrofajlar Rolü incelenmesi

Kanser hücreleri bir kollajen jele gömülür ve daha sonra uydu tümörlerinin invazivliği ve oluşumunun izlenebileceği bir 3D kültür sistemi oluşturmak için bir aselüler fibrin jeli içine sıkıştırılır.

Kanser hücre istilası ve Uydu Tümör oluşumu keşfedin Kültür Testi Üç Boyutlu

Bu deneysel protokol, BCSC'lerin meme kanseri hücre ve doku örneklerinden izolasyonunun yanı sıra BCSC fenotipini ve fonksiyonunu değerlendirmek için kullanılabilecek in vitro ve in vivo testleri tanımlamaktadır.

İnsan Meme Kanseri Kök Hücrelerinin Hücre ve Doku Örneklerinden İzolasyonu ve Fonksiyonel Değerlendirmesi

Kanser metastazını incelemek için heteroselüler karışmayı yakalayan 3D kanser modellerine kritik bir ihtiyaç vardır. Çalışmamız, invazyon ve hücresel mekansal dağılımları incelemek için kullanılabilecek iskele ve iskelesiz bir ortamda heteromultisellüler stromal-epitel oluşumunu sunmaktadır.

İstilayı Yönlendirmek İçin Epitelyal Kanser Hücrelerinin İskelesiz 3D Kültürlerinde Heteromultihücreli Stromal Hücreler

Keşfedin meme kanserinin kemik metastatik nişindeki davranışlarını insan femur doku eksplantları kullanarak. Biyolüminesans görüntüleme ve floresan mikroskopi ile hücre proliferasyonu ve kolonizasyonunu analiz edin.

Kültürleme İnsan Femur Doku Eksplantlarından yöntemleri Metastatik Niche Meme Kanseri Hücre Kolonizasyon Eğitim için

Daha fazla video keşfet