Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Bu yöntemin genel amacı, insanlaştırılmış kemik iliği nişleri oluşturmak için farelere insan hücre taşıyıcı iskeleler implante etmek ve ardından implantlar içindeki insan hücrelerinin davranışlarını canlı görüntülemektir. Bu yöntem, kemik iliğinin farklı bileşenlerinin tek hücre çözünürlüğünde yeniden üretilmesine ve canlı olarak görüntülenmesine olanak tanıdığı için insan hematopoetik alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olacaktır. Bu sistemin çok yönlülüğü, farklı niş bileşenlerinin tek tek veya kombinasyon halinde implante edilmesine izin vermesi nedeniyle en önemli avantajlarından biridir.

Bu metodoloji, tümör metastazı veya ilaç tarama çalışmaları gibi diğer araştırma alanlarına da potansiyel olarak uygulanabilir. Uygun steril teknikleri kullanarak, sterilize edilmiş bir jelatin süngeri benzer boyutlarda 24 parçaya bölerek işe başlayın. Jelatin iskeleleri önce etanolde, ardından PBS içerisinde daldırarak yeniden yapılandırın.

Ardından, fazla sıvıyı uzaklaştırmak için her bir iskkeleyi steril bir peçete ile nazikçe kurulayın ve iskeleleri ultra düşük yapışma özellikli 24 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Bir insülin şırıngası kullanarak, 50 µL kültür ortamında bulunan 1x10⁵ ile 1x10⁶ arasındaki stromal hücreyi her bir iskeleye dikkatlice enjekte edin ve plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücreleri iskeleye enjekte ederken, iskeleden dışarıya herhangi bir sızıntı olmadığından emin olun.

Bir saat sonra, her kuyucuğu üç mililitre taze hücre kültür ortamı ile doldurun ve iskeleleri inkübatöre geri yerleştirin. 24 saat sonra, iskelelere 1 × 10⁵ hematopoetik hücre enjekte edin; ardından inkübasyon ve daha fazla ortam eklemesi yapın ve az önce gösterildiği gibi 24 saat boyunca inkübe edin. Rekombinant insan kemik morfojenetik protein iki taşıyıcı iskelelerin üretimi için, yeniden yapılandırılmış iskeleleri U tabanlı 96 kuyucuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına yerleştirin ve her bir iskeleye beş mikrolitre rekombinant insan kemik morfojenetik protein iki ekleyin.

Ardından iskaleleleri 20 µL trombin ve 20 µL fibrinojen ile kaplayın. Biyomühendislik ürünü iskalelelerin cerrahi implantasyonu için, öncelikle deney faresinin sırtındaki cerrahi alanı tıraş edin ve açığa çıkan cilt yüzeyini her yöne üç kez temizlemek için seyreltilmiş klorheksidin batırılmış bir pamuklu çubuk kullanın. Daha sonra, ciltte anteriordan posteriora doğru 0,5 ile 0,7 cm'lik bir insizyon yapmak için steril pens ve skalpel kullanın ve bir cep oluşturmak için pensi subkütan dokunun altına yerleştirin.

İskele yapısını cebin derinliklerine yerleştirin ve insizyonu cerrahi yapıştırıcı ile kapatın. Eksplantasyondan önce, implante edilen iskelelerin sekiz ila 24 hafta boyunca gelişmesine izin verin. Floresan maddelerin intravenöz uygulanması ve hayvanların ötanazi işleminden sonra, deriyi az önce gösterildiği gibi sterilize edin ve hayvanın sırtında, orijinal implantasyon bölgesinin yakınına boylamsal bir deri insizyonu yapın.

İskeletin implante edildiği subkütan cepten deriyi dikkatlice ayırın, ardından cımbız kullanarak iskeleti nazikçe kavrayın ve yapıyı geri kazanmak için iskeleti çevreleyen kalıntı membran ve dokuları dikkatlice kesin. İskeleti 35 by 10 mililitre bir Petri kabına sabitlemek için hızlı etkili yapıştırıcı yapıştırıcı kullanın. Kemik morfogenetik protein iki iskeletleri için, plakayı PBS ile doldurmadan önce, floroforların görüntülenmesine ve yüksek çözünürlüklü görüntülerin yakalanmasına olanak tanımak amacıyla mikrocerrahi mikroskop altında cerrahi bir mikro matkap kullanarak kemik yüzeyini inceltin.

Kemik kalınlığı iskeleler arasında genellikle farklılık gösterdiğinden ve yüzeyin kırılmaması önemli olduğundan, delme işlemi sırasında özellikle dikkatli olun. Kabı oda sıcaklığındaki PBS ile doldurun. Biyo-mühendislik iskelelerinin 2-foton mikroskobu ile görüntülenmesi için, iskeleyi konfokal mikroskop tablasına yerleştirin ve 20 kat 1.0 NA su daldırma objektifini seçin.

Ardından, görüntüleme yazılımının veri toplama modunda, manuel araçları göster kutusunu seçin. Lazer menüsünde, 2-foton lazerini açın ve lazerin ısınması ile stabilize olması için bekleyin. Lazer hazır olduğunda, görüntüleme kurulum menüsünde kanal modunu etkinleştirin ve her karede iz değiştirme seçeneğini açın.

Işık yolu menüsünden non-descanned ve ana demet ayırıcı olarak MBS 760 plus seçeneklerini belirleyin. Dört non-descanned dedektörü etkinleştirin ve konfigürasyonu şemada gösterildiği gibi ayarlayın. Kanallar menüsünde, lazer dalga boyunu 890 nanometreye ve gücü %50'ye ayarlayın. Her kanal için ana kazancı (gain master) 500 ile 600 arasına, dijital ofseti sıfıra ve dijital kazancı 15'e ayarlayın.

Edinim modunda, dokuya zarar vermeden ve floroforları ağartmadan yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için uygun parametreleri ayarlayın. Ardından, görüntünün ilk taraması için yakınlaştırmayı bire ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında, lensi salin çözeltisine değene kadar indirin ve bir lambayı ışık kaynağı olarak kullanarak lens odağını manuel olarak ayarlayın.

Şimdi Z-yığını (Z-stack) menüsünü etkinleştirin ve ilk son fonksiyonu seçin. Birbirini takip eden iki kesit arasındaki gerekli aralığı ayarlayın ve numunenin canlı bir taramasını görüntülemek için canlı (live) seçeneğini belirleyin; optimal pozlama için dijital kazancı (digital gain) ve dijital kaydırmayı (digital offset) gerektiği şekilde ayarlayın. Birden fazla kanalı aynı anda görselleştirmek için ayır (split) fonksiyonunu seçin.

Sahne menüsünde, canlı moddayken görüntüyü tarayın ve kemik boşluklarının konumu gibi ilgilenilen bölgeleri işaretleyin. Örnek taraması tamamlandığında, ilk ilgilenilen bölgeye gidin ve ilgilenilen alanı çevreleyen 3D Z-yığınının üst ve alt sınırlarını belirlemek için canlı moddaki ilkini ayarla (set first) ve sonuncuyu ayarla (set last) işlevlerini kullanın. Ardından merkezi, C, belirleyin ve ilgilenilen bölgenin Z-yığını görüntülemesini başlatmak için deneyi başlat düğmesine tıklayın.

Görüntüleme işlemi tamamlandığında, görüntüleri belirlenen klasöre kaydedin ve bir sonraki ilgi bölgesini tarayın. Bu temsili görüntülerde, implantasyondan sekiz hafta sonra immün yetmezlikli NSG farelerinden geri alınan farklı iskelelerin genel morfolojisi gözlemlenebilir. İnsan endotel hücreleri ile birlikte ekim yapılması iskelenin vaskülarizasyonunu artırırken, rekombinant insan kemik morfogenetik protein iki eklenmesi kemik oluşumunu tetikler.

Canlı 2-foton mikroskopisi ile görüntülenen bu iskeleler, iskelelerde kan damarlarının varlığını ve insan hematopoetik hücrelerinin iskele parenkimine uzun süreli tutunmasını ortaya koymaktadır. İnsan endotelyal ve mezenkimal stromal hücreler ekilen iskeleler, insan endotelyal hücrelerinin iskele içinde damar oluşumuna katılımını göstermekte ve sonuç olarak fare-insan kimera bir damar yapısı meydana gelmektedir. Kemik doku oluşumu ile endosteal dokudaki insancıllaştırılmış damar yapısında kemik iliği endosteal dokusuna yüksek derecede benzeyen boşlukların oluşumu, 2-foton mikroskopisi ile görselleştirilebilmektedir.

Ayrıca, rekombinant insan kemik morfogenetik protein iki taşıyıcı iskelelerde, iskele içindeki dokunun morfolojisi adipoz doku içeren olgun kemik iliğine benzemektedir; bu durum, insan mezenkimal stromal hücrelerinin adipoz doku oluşumuna da katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, tüm biyomühendislik yaklaşımları ve temel fare iskeleleri hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Her zaman aseptik bir ortam sağlamayı unutmayın ve iskeleleri kullanırken ekstra özen gösterin.

Dokuların insan-fare kimeraları olması gibi bu yöntemle ilişkili kısıtlamaları göz önünde bulundurun. Görüntülemenin ardından, iskeleler sindirilebildiği ve dolayısıyla içlerinden canlı hücreler geri kazanılabildiği için örneklerin ileri çalışmalarda kullanılabileceğini unutmayın.