Fare Malı İnsani Kemik İliği Mikro Çevrelerinin Biyomühendisliği ve Canlı Görüntüleme ile Görselleştirilmesi

Bu yöntemin genel amacı, insanlaştırılmış kemik iliği nişleri oluşturmak için insan hücre taşıyıcı iskelelerini farelere implante etmek ve daha sonra implantlar içindeki insan hücrelerinin davranışını canlı olarak görüntülemektir. Bu yöntem, insan hematopoietik alanındaki temel soruların cevaplanmasına yardımcı olacaktır, çünkü kemik iliğinin farklı bileşenlerinin tek hücre çözünürlüğünde yeniden üretilmesine ve canlı görüntüye izin verir. Bu sistemin çok yönlülüğü, farklı niş bileşenlerinin tek tek veya kombinasyon halinde implantasyonuna izin verdiği için en büyük avantajlarından biridir.

Bu metodoloji potansiyel olarak tümör metastazı veya ilaç tarama çalışmaları gibi diğer araştırma alanlarına da uygulanabilir. Uygun steril tekniği kullanarak, sterilize edilmiş bir jelatin süngeri benzer boyutta 24 parçaya keserek başlayın. Jelatin iskelelerini etanole ve ardından PBS'ye daldırarak sulandırın.

Ardından, fazla sıvıyı çıkarmak için her bir iskeleyi steril bir doku üzerine nazikçe vurun ve iskeleleri ultra düşük bağlantılı 24 oyuklu bir plakanın ayrı kuyucuklarına aktarın. Bir insülin şırıngası kullanarak, her bir iskeleye 50 mikrolitre kültür ortamında bir kez 10 ila beşinci ila bir kez 10 ila altıncı stromal hücreleri dikkatlice enjekte edin ve plakayı bir hücre kültürü inkübatörüne yerleştirin. Hücreleri iskeleye enjekte ederken, iskeleden sızıntı olmadığından emin olun.

Bir saat sonra, her bir kuyucuğu üç mililitre taze hücre kültürü ortamı ile doldurun ve iskeleleri inkübatöre geri koyun. 24 saat sonra, beşinci hematopoietik hücrelere bir kez 10 kez iskele enjekte edin, ardından inkübasyon ve daha fazla ortam ilavesi ve az önce gösterildiği gibi 24 saatlik inkübasyon yapın. Rekombinant insan kemiği morfogenetik proteini iki taşıyıcı iskelenin üretilmesi için, sulandırılmış iskeleleri U-tabanlı 96 oyuklu bir plakanın ayrı kuyularına yerleştirin ve her iskeleye iki adet beş mikrolitre rekombinant insan kemiği morfogenetik proteini ekleyin.

Daha sonra iskeleleri 20 mikrolitre trombin ve 20 mikrolitre fibrinojen ile örtün. Biyomühendislik iskelelerinin cerrahi implantasyonu için, önce deney faresinin sırtındaki cerrahi alanı tıraş edin ve açıkta kalan cilt yüzeyini her yönde üç kez temizlemek için seyreltilmiş klorheksidin içine batırılmış bir pamuk ucu kullanın. Daha sonra, deride 0,5 ila 0,7 santimetre önden arkaya bir kesi yapmak için steril forseps ve bir neşter kullanın ve bir cep yapmak için forsepsleri deri altı dokusunun altına yerleştirin.

İskeleyi cebin derinliklerine yerleştirin ve kesiği cerrahi yapıştırıcı ile kapatın. İmplante edilen iskelelerin eksplanttan önce sekiz ila 24 hafta boyunca gelişmesine izin verin. Floresan maddelerin intravenöz olarak uygulanmasından ve hayvanların ötenazi edilmesinden sonra, cildi gösterildiği gibi sterilize edin ve orijinal implantasyon bölgesinin yakınında, hayvanın arkasında uzunlamasına bir cilt kesisi yapın.

Cildi, iskelenin implante edildiği deri altı cebinden dikkatlice ayırın, ardından iskeleyi nazikçe kavramak için cımbız kullanın ve yapıyı kurtarmak için iskeleyi çevreleyen artık zarı ve dokuları dikkatlice kesin. İskeleyi 35 x 10 mililitrelik bir Petri kabına sabitlemek için hızlı etkili yapışkan yapıştırıcı kullanın. Kemik morfogenetik proteini iki iskele için, plakayı PBS ile doldurmadan önce, kemik yüzeyini inceltmek için mikrocerrahi mikroskop altında cerrahi bir mikromatkap kullanın, bu da floroforların görselleştirilmesine ve görüntülerin yüksek çözünürlükte yakalanmasına olanak tanır.

Delme işlemi sırasında özellikle dikkatli olun, çünkü kemiğin kalınlığı tipik olarak iskeleler arasında değişir ve yüzeyi kırmamak önemlidir. Çanağı oda sıcaklığında PBS ile doldurun. Biyomühendislik iskelelerinin 2 fotonlu mikroskopi görüntülemesi için, iskeleyi konfokal mikroskop aşamasına yerleştirin ve 20 kez 1.0 NA suya daldırma lensini seçin.

Ardından, görüntüleme yazılımının alım modunda, manuel araçları göster kutusunu seçin. Lazer menüsünde 2 fotonlu lazeri açın ve lazerin ısınmasına ve stabilize olmasına izin verin. Lazer hazır olduğunda, görüntüleme ayarları menüsünde kanal modunu etkinleştirin ve her karede parçayı değiştirin.

Işık yolu menüsünde, taranmamış ve uzun huzme ayırıcı MBS 760 plus'ı seçin. Taranmayan dört algılayıcıyı etkinleştirin ve yapılandırmayı şemada gösterildiği gibi ayarlayın. Kanallar menüsünde, lazer dalga boyunu 890 nanometreye ve gücü %50'ye ayarlayın Her kanal için kazanç master'ı 500 ila 600'e, dijital ofseti sıfıra ve dijital kazancı 15'e ayarlayın.

Çekim modunda, dokuya zarar vermeden ve floroforları ağartmadan yüksek çözünürlüklü görüntüler elde etmek için uygun parametreleri ayarlayın. Ardından, görüntünün ilk taraması için yakınlaştırmayı bir olarak ayarlayın. Tüm parametreler ayarlandığında, lensi tuzlu su çözeltisine değene kadar indirin ve ışık kaynağı olarak bir lamba kullanarak lens odağını manuel olarak ayarlayın.

Şimdi Z yığını menüsünü etkinleştirin ve ilk son işlevi seçin. Ardışık iki dilim arasında gerekli aralığı ayarlayın ve numunenin canlı taramasını görüntülemek için canlı'yı seçin, optimum pozlama için dijital kazancı ve dijital ofseti gerektiği gibi ayarlayın. Aynı anda birden fazla kanalı görselleştirmek için bölme işlevini seçin.

Sahne menüsünde, canlı moddayken, görüntüyü tarayın ve kemik boşluklarının konumu gibi ilgilenilen bölgeleri işaretleyin. Örnek tarama tamamlandığında, ilk ilgi alanına gidin ve ilgilenilen alanı çevreleyen 3B Z yığınının üstünü ve altını ayarlamak için canlı modda önce ayarla ve sonuncuyu ayarla işlevlerini kullanın. Ardından merkezi (C) ayarlayın ve ilgilenilen bölgenin Z yığını görüntü alımını başlatmak için denemeyi başlat düğmesine tıklayın.

Çekim tamamlandığında, görüntüleri belirlenen klasöre kaydedin ve bir sonraki ilgilenilen bölgeyi tarayın. Bu temsili görüntülerde, implantasyondan sekiz hafta sonra immün yetmezliği olan NSG farelerinden elde edilen farklı iskelelerin brüt morfolojisi gözlemlenebilir. İnsan endotel hücreleri ile birlikte tohumlama, iskelenin vaskülarizasyonunu arttırırken, rekombinant insan kemiği morfogenetik protein ikisinin eklenmesi kemik oluşumunu indükler.

Canlı 2-foton mikroskobu ile görüntülenen bu iskeleler, iskelelerdeki kan damarlarının varlığını ve iskele parankimindeki insan hematopoietik hücrelerinin uzun süreli aşılanmasını ortaya koymaktadır. İnsan endotelyal ve mezenkimal stromal hücrelerle tohumlanan iskeleler, insan endotel hücrelerinin iskele içindeki damarların oluşumuna katılımını gösterir ve bu da bir murin-insan kimerik damar sistemi ile sonuçlanır. Kemik dokusunun oluşumu, 2-foton mikroskobu ile görselleştirilebilir, ayrıca kemik iliği endosteal dokusuna çok benzeyen endosteal dokuda insanlaştırılmış vaskülatürde boşlukların oluşumu da görüntülenebilir.

Ayrıca, rekombinant insan kemiği morfogenetik proteini iki taşıyıcı iskelede, iskele içindeki dokunun morfolojisi, yağ dokusu ile olgun kemik iliğine benzer, bu da insan mezenkimal stromal hücrelerinin de yağ dokusu oluşumuna katkıda bulunduğunu düşündürür. Bu videoyu izledikten sonra, tüm biyomühendislik ve büyük fare iskeleleri hakkında iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Her zaman münzevi bir ortam sağlamayı unutmayın ve iskeleleri tutarken ekstra özen gösterin.

Dokuların insan-fare kimeraları gibi bu yöntemle ilişkili sınırlamaları aklınızda bulundurun. Görüntülemeden sonra, iskeleler sindirilebildiğinden ve bu nedenle onlardan canlı hücreler alınabileceğinden, numunelerin daha ileri çalışmalar için kullanılabileceğini unutmayın.