Name: Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Öğrenin ekstraselüler vezikülleri ayarlanabilir dirençli darbe algılama ile sayma ve boyut profilleme yöntemini. Bu teknik biyolojik sıvılarda doğrudan ölçüm sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Standart Çalışma Protokolü 1.1 Cihaz Kurulumu ve Numune Hazırlama <ol><li> Yüklü Izon Kontrol Suite yazılımı ile bir bilgisayara aleti bağlayın. </li><li> - Veya NP200 (hedef boyutu aralığı: 100 - 400 nm) en sık kullanılan bir NP150 (300 nm hedef boyut aralığı 85) EVs büyüklüğü ve konsantrasyon ölçümü için: kullanmak için nanopore boyut seçin. Bir 220 nm filtre boyunca geçirerek, numunenin, örneğin daha büyük bir EVs çıkarılmasını içeren bir protokol kullanılarak izole edilmiştir EVs çalışırken, bir NP100 gözenek (hedef boyut aralığı 70-200 nm) kullanılabilir. Bir biyolojik numunede EVs veya farklı protokolü kullanılarak izole EVs çalışırken daha az sıklıkla tıkanma gibi, NP200 kullanılabilir. Veya NP400 (hedef boyut aralığı 200-800 nm), örneğin - NP300 (600 nm hedef boyut aralığı 150) gibi diğer Nanopores ya da daha büyük olan nano-gözeneklerde, EVs büyük türleri için de kullanılabilir. </li><li> Polistiren KALİBR seçinAdım 1.1.2 seçilen Nanopore tamamlayacak tirme parçacıklar. Bir NP100 için, NP150 ve küçük gözenek NP200 sırasıyla CPC100, CPC200 ve CP100 parçacıkları kullanır. Doğru boyutlu tahmin için, kalibrasyon parçacıklar bilinmeyen parçacıklar gibi, benzer bir boyuta sahip olduğundan emin olun. </li><li> Kalibrasyon parçacıkların homojenlik, vorteks kısaca (30 sn) sağlamak. İsteğe bağlı olarak, agregatları uzaklaştırmak için sonikasyon uygulanır. </li><li> En az 40 ul lik bir hacim içinde, hedef konsantrasyona PBS içinde seyreltin kalibrasyon parçacıkları. Not: Hedef konsantrasyon adımda 1.1.2 seçilen nanopore göre değişir. Hedef konsantrasyonları nanopores birlikte verilir. </li><li> Uygula ve doğrudan alt sıvı hücre PBS 78 ul kaldırmak; nanopore konumda olduğunda alt sıvı elektrolit hücreye bir uygularken alt sıvı hücrenin bu nemlendirme nano-gözeneklere altındaki hava kabarcıklarının oluşması riskini azaltır. </li><li> Aletin 4 kolları üzerine Nanopore yerleştirin. Kullanımdijital kumpas iki zıt kolları arasındaki mesafeyi ölçmek ve &quot;Stretch&quot; girdi alanına mm mesafe girin ve nanopore streç kalibre etmek &quot;streç kalibre&quot; tıklatın. </li><li> Alt sıvı hücreye 78 ul PBS yeniden uygulanması öncesinde, cihazın karşıt kolların arasındaki mesafeyi arttırarak, böylece yan çarkı açıp kapatarak, 47 mm Nanopore gerin. Not: Elektrik paraziti önemli ölçüde ölçümlerin kalitesini etkileyebilir. Izon Kontrol Suite yazılımını çalıştırmak için bir dizüstü bilgisayar kullanırken, dizüstü bilgisayar, bir topraklı priz ve fişi kullanarak şebekeye bağlı olduğundan emin olun. Cep telefonları da elektrik girişim bir kaynak olabilir yakın enstrüman tuttu. Elektrik parazit çoğunlukla kök kare (RMS) ses&gt; 10 pA Yani, temel akımı sürekli tekrarlanan zirveleri olarak görülmektedir. Not: Hemen hemen herhangi bir tampon tRPS characteri kalibrasyon parçacıklar ve EVs seyreltmek için kullanılabilenkıymetleştirme. Tuzların varlığı, bir elektrik akımının kurulması için bir ön koşuldur. EV ölçümleri için, bir tampon madde olarak PBS kullanın. EVs doğru şekilde sağlamak üzere kalibrasyon parçacıkların her zaman aynı tampon içinde seyreltilmelidir. </li></ol> 1.2. Ölçüm için Optimal Settings belirleyin Not: Kayıttan önce, optimal ölçüm ayarlarını kurmak için önemlidir. Nano-gözeneklere geçen bir parçacık neden blokajı büyüklüğü uygulanan germe ve uygulanan gerilimine bağlıdır. Güvenilir ölçümler için RMS ses olmalıdır 0.1 nA &lt;10 pA ve mod abluka büyüklüğü olmalıdır&gt;. <ol><li> Nano-gözeneklere üzerindeki üst sıvı, hücre ve koruyucu kafese yerleştirilir ve üst sıvı içinde seyreltilmiş hücre kalibrasyon parçacıkların 40 ul getirmektedir. ≥0.8 kPa pozitif basınç uygulamak için VPM kullanın. </li><li> Kalibrasyon neden abluka olayları analiz ederken 44 mm doğru yavaş yavaş uygulanan streç azaltınparçacıklar. Nano-gözeneklere yoluyla gözenek çapı parçacıkların hareketi azaltmak zaman olasılığı daha az olacaktır ve bu nedenle, partikül oranı azalacak: edin. Ancak, gözenek nispî blokajına daha büyük bir blokaj etkinliği gelişmiş bir sinyal-gürültü oranı ile meydana gelir. Gerilimi artırarak daha abluka büyüklüğünü artırabilir ama aynı zamanda RMS gürültü artırabilir. </li><li> Uygun blokajı olaylar (Şekil 1c) &quot;Sinyal İz&quot; panelinde gözlenen kadar streç azaltın. (Modu&gt; 0.1 nA) ve tekabül eden partikül hızı&gt; 100 / dakikadır. Not: parçacık hızı en az 500 parçacık ölçüleri, ancak ideal olarak, daha az sıkı bir kesme olduğu, &lt;100 / dak tanecik oranı en az 5 dakika sürelerini kayıt neden olacaktır. (Örnek seyreltme yapılmalıdır mevcut olduğu takdirde) 2000 / dak daha yüksek oranlar daha az parçacık hassas ölçümler neden olabilir. </li></ol> Kalibrasyon 1.3 ÖlçümüParçacıklar, Uper Sıvı Hücre ve Numune Ölçümü Yıkama <ol><li> Habis beyin tümörü hücre çizgisi U87 mg / EGFRvIII hücre kültürü süpernatanından bu bölüm AGH&#39;ye karakterize edilir. Bu EVs izolasyonu ve hazırlanması daha önceden tarif edilmiş ve 18 görselleştirilmiştir. </li><li> Üst sıvı hücreye kalibrasyon parçacıkları yerleştirin. (Örneğin 0.8 kPa için) basınç VPM ve kayıt&gt; 500 parçacıkları kullanarak uygulayın. </li><li> Çok basınç ölçümünün gerçekleştirilmesi durumunda, (1.0 kPa örneğin) uygulanan basıncı artırmak ve ikinci bir kalibrasyon dosyasını kaydedin. Not: 0,2 kPa fark minimum gereklidir. </li><li> Üst sıvı hücreden kalibrasyon numune çıkarılmaktadır. Kalan parçacıkları çıkarmak için, üst sıvı hücreye 100 ul PBS ile 3 kez yıkayın. Üst sıvı hücreye örnek uygulaması başlamadan önce, üst sıvı hücreden herhangi bir kalıntı PBS kaldırmak için tüysüz bir doku kullanın. </li><li> Üst sıvı hücreye örnek tanıtmak. Bazal geçerli kalibrasyon parçacıkları ölçerken gözlenen temel akımın% 3 içinde olduğundan emin olun. Değil% 3 içinde ise, başlangıç ​​akımını stabilize etmek için aşağıda açıklanan stratejisini uygulamak. Kalibrasyon parçacıklara uygulanan kesin basınçlar uygulamaya ve örnek dosyaları kaydedin. Not: Parçacık oranı grafiği sabit bir partikül algılama (Şekil 2a) göstermelidir. Parçacık algılama, temel akımı ani bir düşüş, veya RMS gürültü ani bir artış ani kesilmesi durumunda, gözenek tıkanmış olabilir; Böylece, Kaydı duraklatmak. Bazal, dokunun geri yüklemek veya koruyucu kapağı bükün, dalgıç uygulamak, veya tamamen Nanopore çıkarın ve deiyonize su ile yıkayın ve cihaz üzerinde değiştirmek için. Not: Alternatif olarak, yaklaşık olarak 5 dakika boyunca VPM maksimum basınç ile birlikte 47 mm küçük gözenek gerilmesini arttırabilecekse. </li></ol> 1.4 Veri Analizi <ol><li> Tıklayın &quot;, Yazılımın analiz bölümüne girmek için Veri &quot;sekmesini analiz edin. &quot;İşlenmemiş Dosyaları&quot; ve seçme &quot;Süreç Files&quot; sağ tıklayarak kalibrasyon ve örnek dosyaları işleyin. </li><li> Kalibrasyon kayıtları çift &quot;Kalibre&quot; sütununda numune yanında örnek dosyaları onay kutusunu tıklatın. İlgili örnek ve kalibrasyon dosyaları seçin ve &quot;Tamam&quot; ı tıklayın. Not: Çoklu basınç kalibrasyon seçeneği birden fazla kalibrasyon dosyaları çift birden numuneler için soldaki &quot;Çok basınç Kalibrasyon&quot; sekmesini seçin kullanırken. </li><li> Bir kez başarıyla birleştiğinde, Izon Kontrol Suite yazılım gibi bir boyut dağılımı gibi farklı örnek karakteristikleri (Şekil 2b) gösterecektir, bazal süreler, tam genişlikte yarı maksimum (FWHM) ve konsantrasyon analizi. İsteğe bağlı: Bir virgülle ayrılmış dosya olarak her numune için, bireysel veri noktaları ihraç edilebilir. </li></ol> 2.lternative Protokolü - Kalibrasyon Boncuk ile Örnekleri Ani Not: İzole AGH ile çalışırken Genel olarak, standart işletim prosedürü kullanılabilir. Biyolojik numunelerde, ya da büyük protein agrega ile kontamine izole EV hazırlıklarında izole olmayan AGH, çalışırken cihazı kullanmadan zor olabilir. Bu zorluklar özellikle Nanopore engelleme (temel akımı ani düşüş), kalibrasyon ölçüm veya özdeş örnekleri (Şekil 3a) arasındaki parçacık oranlarında önemli farklılıklar% 3 içinde temel akımlarını kurtarmak için yetersizlik yüksek bir orandır. AGH ölçmek için bu güçlükleri bir alternatif protokolü görüntülendiği numuneler için 17 geliştirilmiştir. Bu yöntem, ilgi (Şekil 3b) arasında daha büyük bir numune içine polistiren kalibrasyon boncuklar eklenmesine dayanır. Bu protokol için ayrıntılı bir işlem, aşağıda tartışılmıştır. 2.1. ÖrnekHazırlık Not: alternatif bir yöntem kullanarak örnekler hazırlarken, yaklaşık aynı zamanda 1. EV-kadar-boncuk oranının sağlanması istenir, bu doğru &quot;gating &#39;sağlamak için, örnek bir&quot; sadece kalibrasyon boncuk&#39; içeren esastır kalibrasyon boncuk ve tampon mevcut (örneğin protein agrega için) arka plan parçacıkların sayısını belirlemek için. <ol><li> 300 xg&#39;de 7 dakika boyunca hücre kültürü süpernatanı Santrifüj 100 ul </li><li> PBS ve 20 ul 75 kez 10 ul süpernatan 20 ul 335 nm polistiren boncuklar (stok 7E10 / ml) ile seyreltilmiştir. </li></ol> 2.2. Numune Ölçümü <ol><li> Optimum enstrüman ayarlarını belirlemek için 1.2 bölümünde tanımlanan strateji kullanın. </li><li> Örnek ilk &#39;sadece kalibrasyon boncuk&#39; ölçün. Küçük olmayan boncuk parçacıkların arka tespiti mümkün olduğu kadar düşük olduğundan emin olun (&lt;boncukların% 10). </li><li> Her sa ölçünyapıldığı Örnek kez kayıt eşit farklı numuneler üzerinde küçük gözenek koşullarında dalgalanma dağıtmak için önceki çoğaltır. Her numunenin en az 3 suret ölçün. </li><li> Tüm örneklerin kayıt bittikten sonra &#39;kalibrasyon Kordona sadece&#39; örnek yeniden ölçmesi. </li></ol> 2.3. Veri Analizi Not: Alternatif protokolünü kullanırken, Izon Kontrol Suite yazılımının özel kullanımı konsantrasyonu hesaplama için yeterli değildir. Ek tablo yazılım gereklidir. Tablo 1, Şekil 3 &#39;de gösterilen ters örneklerinin konsantrasyonunu hesaplama örneğini gösterir. <ol><li> &#39;Kalibrasyon Kordona sadece&#39; örnek ve bir veya daha fazla örnek dosyaları açın. </li><li> AGH ve polistiren boncuklar arasındaki ayrım için bir cut-off olarak kullanılabilir (nA) hangi abluka olay boyutu belirleyin. Polistiren boncuklar nüfusun sol tabanına karşılık abluka değerini (nA) (Belirlenmesi <stRong&gt; Şekil 3b). Not: Tüm ölçümlerin bin-boyutları eşit ayarını sağlamak (&quot;Bireysel Abluka Trace&quot; altında &quot;pop-up&quot; butonuna tıklayarak erişilen &#39;ViewSettings&#39; ayarlanabilir). </li><li> Numunenin &quot;Parçacık Analiz Özeti&quot; sekmesini tıklayarak her bir numune için toplam tanecik sayımı değerlerini alabilir. </li><li> Adım 2.3.2 belirlenen eşik değeri kullanılarak, veri kümeleri filtre. &quot;Veri Filtreleme&quot; pop-up seçerek. Ekran sadece cut-off daha küçük olan parçacıklar. </li><li> &quot;Parçacık Analiz Özeti&quot; den her numune için EV sayımı değerlerini alabilir. </li><li> Kalibrasyon boncuk miktarını belirlemek için, toplam parçacıklardan EVs miktarını çıkarın. </li><li> Kalibrasyon boncuk sayımı EV sayısının bölünmesiyle EV-to-boncuk oranını belirler. </li><li> Her &amp; için belirlenen oranları ortalamasını alarak ortalama arka oranını belirleme# 8220; sadece &quot;kalibrasyon örneği boncuk. Her bir örnekten bu değerini çıkarın. </li><li> Her numune için EVs konsantrasyonunu belirlemek için kalibrasyon boncuk konsantrasyonu ile ayarlanmış EV-kadar-boncuk oranını çarpın. </li><li> EV örnek kalibrasyon boncuklarının eklenmesi ile ortaya EV seyreltme faktörü ile adım 2.3.9 bulunan konsantrasyonu çarpın. Not: Örnek örnek kurulumunda, PBS ve kalibrasyon boncuk numunenin toplam 2.5 kat seyreltme ve dolayısıyla aşama 2.3.9 bulunan konsantrasyon ham EV örnek konsantrasyonunu belirlemek için 2,5 ile çarpılmalıdır olduğunu. </li><li> Bu ortalamalar, standart sapma ve çoğaltır her grup için ortalamanın standart hatası olarak istatistikleri hesaplayın. Not: Bazı durumlarda görülmektedir AGH ve kirpi polistiren boncuklar birbiriyle örtüşmektedir. EV konsantrasyonunun düşük tahmin için düzeltme gerekli ise, kirpi polistiren boncuklar olmayan örnekleri de ölçülmelidir. Aynı kesilmeye kullanınBir &quot;boncuk kadar EV&quot; oranını belirlemek için aşama 2.3.2 belirlenen kapalı olarak, katkılı polistiren taneciklerin aralığı içinde kalan EVs oranını hesaplamak için kullanılır. Bu boncuk kadar EV oran basamağına 2.3.8 belirlenen EV-kadar-boncuk oranında eklenmelidir. </li></ol> 2.4. İsteğe bağlı: Alternatif Yöntemiyle EV Boyut Dağılımı. <ol><li> Kontrol Suite Yazılımı iki kez örnek bir kayıt açın. </li><li> Yukarıda belirlenen kesme daha büyük bir göstergedir parçacıklarına örneklerinden birine filtre seçeneklerini ayarlayın. Bu kalibrasyon parçacıkları tek gösterecektir. </li><li> &quot;Kalibrasyon dosyası&quot; filtrelenmiş örnek ayarlayın ve kalibrasyon boncuk modu boyutunu girin. </li><li> Çift örnek dosya ve 1.4.2 tarif edildiği gibi aşama 2.4.3 oluşturulan &quot;kalibrasyon dosyası&quot;. Örnek dosya artık çivili kalibrasyon boncuklar göre EVS ve kalibrasyon boncuk her ikisinin bir boyut dağılımına gösterecektir. Not: Standart operating protokol çoğunlukla EVs boyut dağılımlarının belirlenmesi için yeterli olacaktır. Bazı durumlarda bununla birlikte, kesin bir tampon komponentler imkansız ilgi EVS ile aynı tampon maddesi içinde kalibrasyon boncuk bir numune hazırlamak için yapar (plazma veya idrar gibi) bilinmemektedir. Kalibrasyon parçacıkları ile çivili bir EV örnek bu özel koşullarda EV boyut tahmininde kullanılabilir. </li></ol>

<ol><li>Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.+Nature+reviews%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+discovery%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature reviews.</a> Drug discovery. 12, 347-357 (2013).</li>
<li>Lacroix, R., Dubois, C., Leroyer, A. S., Sabatier, F., Dignat-George, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Revisited+role+of+microparticles+in+arterial+and+venous+thrombosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Revisited role of microparticles in arterial and venous thrombosis.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 24-35 (2013).</li>
<li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+as+mediators+of+intercellular+communication+in+cancer--the+emerging+science+of+cellular+%27debris%27%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+immunopathology%22%5BJournal%5D)">Microvesicles as mediators of intercellular communication in cancer--the emerging science of cellular 'debris'.</a> Seminars in immunopathology. 33, 455-467 (2011).</li>
<li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+function%3A+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9, 871-881 (2008).</li>
<li>Bobrie, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rab27a+supports+exosome-dependent+and+-independent+mechanisms+that+modify+the+tumor+microenvironment+and+can+promote+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+research%22%5BJournal%5D)">Rab27a supports exosome-dependent and -independent mechanisms that modify the tumor microenvironment and can promote tumor progression.</a> Cancer research. 72, 4920-4930 (2012).</li>
<li>Peinado, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Melanoma+exosomes+educate+bone+marrow+progenitor+cells+toward+a+pro-metastatic+phenotype+through+MET%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+medicine%22%5BJournal%5D)">Melanoma exosomes educate bone marrow progenitor cells toward a pro-metastatic phenotype through MET.</a> Nature medicine. 18, 883-891 (2012).</li>
<li>Al-Nedawi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intercellular+transfer+of+the+oncogenic+receptor+EGFRvIII+by+microvesicles+derived+from+tumour+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Intercellular transfer of the oncogenic receptor EGFRvIII by microvesicles derived from tumour cells.</a> Nature cell biology. 10, 619-624 (2008).</li>
<li>Skog, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+microvesicles+transport+RNA+and+proteins+that+promote+tumour+growth+and+provide+diagnostic+biomarkers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma microvesicles transport RNA and proteins that promote tumour growth and provide diagnostic biomarkers.</a> Nature cell biology. 10, 1470-1476 (2008).</li>
<li>Dommelen, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvesicles+and+exosomes%3A+opportunities+for+cell-derived+membrane+vesicles+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Microvesicles and exosomes: opportunities for cell-derived membrane vesicles in drug delivery.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 161, 635-644 (2012).</li>
<li>Pol, E., Coumans, F., Varga, Z., Krumrey, M., Nieuwland, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innovation+in+detection+of+microparticles+and+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+thrombosis+and+haemostasis+%3A+JTH%22%5BJournal%5D)">Innovation in detection of microparticles and exosomes.</a> Journal of thrombosis and haemostasis : JTH. 11, 36-45 (2013).</li>
<li>Vogel, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+sizing+of+nano%2Fmicroparticles+with+a+tunable+elastomeric+pore+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative sizing of nano/microparticles with a tunable elastomeric pore sensor.</a> Analytical chemistry. 83, 3499-3506 (2011).</li>
<li>Kozak, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+size+and+zeta-potential+measurements+of+individual+nanoparticles+in+dispersion+using+size-tunable+pore+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22ACS%22%5BJournal%5D)">Simultaneous size and zeta-potential measurements of individual nanoparticles in dispersion using size-tunable pore sensors.</a> ACS. 6, 6990-6997 (2012).</li>
<li>Willmott, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+tunable+nanopore+blockade+rates+to+investigate+colloidal+dispersions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+physics.+Condensed+matter+%3A+an+Institute+of+Physics+journal%22%5BJournal%5D)">Use of tunable nanopore blockade rates to investigate colloidal dispersions.</a> Journal of physics. Condensed matter : an Institute of Physics journal. 22, 454116-4510 (2010).</li>
<li>Roberts, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunable+pores+for+measuring+concentrations+of+synthetic+and+biological+nanoparticle+dispersions%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensor%22%5BJournal%5D)">Tunable pores for measuring concentrations of synthetic and biological nanoparticle dispersions.</a> Biosensor. 31, 17-25 (2012).</li>
<li>Vogel, R., Anderson, W., Eldridge, J., Glossop, B., Willmott, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+variable+pressure+method+for+characterizing+nanoparticle+surface+charge+using+pore+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">A variable pressure method for characterizing nanoparticle surface charge using pore sensors.</a> Analytical chemistry. 84, 3125-3131 (2012).</li>
<li>Kozak, D., Anderson, W., Trau, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+Particle+Velocity+and+Measurement+Sensitivity+by+Changing+Pore+Sensor+Dimensions%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Letters%22%5BJournal%5D)">Tuning Particle Velocity and Measurement Sensitivity by Changing Pore Sensor Dimensions.</a> Chemistry Letters. 41, 1134-1136 (2012).</li>
<li>Vrij, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+nanosized+extracellular+membrane+vesicles+with+scanning+ion+occlusion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Quantification of nanosized extracellular membrane vesicles with scanning ion occlusion sensing.</a> Nanomedicine. 8, 1443-1458 (2013).</li>
<li>Lasser, C., Eldh, M., Lotvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+RNA-containing+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of RNA-containing exosomes.</a> J. Vis. Exp. (3037), (2012).</li>
<li>Yang, L., Broom, M. F., Tucker, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+nanoparticulate+drug+delivery+system+using+scanning+ion+occlusion+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Characterization of a nanoparticulate drug delivery system using scanning ion occlusion sensing.</a> Pharmaceutical research. 29, 2578-2586 (2012).</li>
</ol>

Özetlenen protokol ve bu yazının yazma gelişme mali Hollandalı Beyin Vakfı, Schumacher Kramer Vakfı ve Bohnenn Fonu, kısmen, desteklenmiştir. Bu video-makale üretimi kısmen Izon tarafından sponsorted edildi.

Miktar ve tRPS kullanarak EVs boyutu karakterizasyonu için bu el yazması teklif metodolojileri tarif protokolleri. TRPS platformunun önemli avantajları küçük örneklem büyüklüğü, göreceli kısa ölçüm süresi ve gerekli numune manipülasyon yokluğu vardır. Doğru tRPS ölçümü için önkoşuldur kalibrasyon ve numune ölçümleri arasındaki özdeş koşullar tutmaktır. Bu, aynı tampon kullanımının yanı sıra küçük gözenek büyüklüğü, gerilim ve uygulanan basınç gibi aynı cihaz ayarlarını kapsamaktadır. Orijinal VPM bu şekilde, örnekler arasında uygulanan basınç arasındaki farklılıklar küçüktür neden uygulanan basıncın tam ayarı için bir mekanizmayı barındırmamaktadır. Farklı zaman noktalarında ölçülmesi Ayrıca, VPM hazırlama sıvısı içinde buharlaştırılması, küçük basınç farklılıkları neden olabilir ve bu nedenle sık sık yeniden VPM ile prime edilmiş olmalıdır. Bu kısıtlamalar, potansiyel olarak VPM2, zerk edilmesi ile çözülmüştür hangiBir tıklama bazlı ölçeğe sahip ve hava basıncı dayanır. Bu yazıda tarif edilen alternatif protokol olmayan saflaştınlmış biyolojik numuneler 17 EVs ölçümü için uygundur. Bu şekerler, lipidler, proteinler ve bazı durumlarda, diğer daha büyük parçalardan tampon bileşenleri, geçerli olmak üzere standart bir protokol için çok fazla ölçüm koşulları etkileyebilecek inanıyoruz. Numunenin iki ayn yapı yerine değerlerle karşılaştırılarak kalibrasyon boncuklarının ilavesinin, &quot;gerçek zamanlı kalibrasyon &#39;getirmektedir. Farklı ve / veya bilinmeyen bir akışkan arka plan içeriğini numuneler (örneğin, farklı vericilerden kan plazması) karşılaştırırken Bu yöntem özellikle uygundur. Farklılıklar AGH ve polistiren parçacıkların (örneğin, parçacık yoğunluğu ve yüzey yükü), teorik modellerin yanı sıra deneysel veriler arasındaki mevcut olmasına rağmen miktar ve AGH boyutu profil için polistiren boncuk kullanılabilirliğini altını,önkoşul altında olduğu önemli bir basınç 15,19 uygulanır. Elektrokinetik güçlerin etkisini en aza indirmek için, göreceli olarak daha yüksek NP150 / nano-gözeneklere NP200 ve önemli bir basıncın kullanımı tavsiye edilir. AGH ve kalibrasyon boncuk boyutuna göre ayırt edilir. Sonuç olarak, çok küçük gözenek EVS ve daha büyük partiküllerin kalibrasyon her ikisinin tespit gözlenen bir çapa, gerilme uygulayarak açılmalıdır. Gözenek açılması küçük parçacıklara karşı hassasiyetini azaltacaktır yana, yalnızca kaydedilir belirli bir boyutta (genellikle AGH&gt; 120 nm bir 335 nm kalibrasyon boncuk kullanılarak) daha büyük EVS. EVs için en düşük saptama sınırı bir NP150 nano-gözeneklere 203 nm kalibrasyon boncuklar kullanılarak, yaklaşık 90 nm&#39;ye düşürülebilir. Büyük AGH nanopore sık sık tıkanma neden Ancak, bu kurulum geçerli olmayabilir. Bu engellemekten EVs varlığı kurulum kullanımını zorlamaktır nerede rea çok küçük AGH bir nüfus,bulgulama eşiğine ch, tespit edilemez. Boyutu 100 nm daha küçük partikülleri ölçmek için çalışırken zorluk sistemi artar çalıştırmak için. Bu gibi durumlarda, belirleme elektrolit tuz konsantrasyonunun arttırılması yoluyla iyileştirilebilir. Artan iyon konsantrasyonu küçük parçacıklar için nispeten artmış abluka büyüklüklerini (büyük sinyal-gürültü oranı) neden olacaktır. EVs ölçümleri için bu tekniğin yaşayabilirliği yüksek tuz konsantrasyonları EVs hacmini etkileyebilir gibi olsa da güncellenmelidir. Sonuç olarak, bir platform tRPS doğrudan miktar ve EVs büyüklük bakımından kullanılabilir. Herhangi bir izolasyon veya EV manipülasyon (antikor bağlama veya floresan etiketleme) gerekli olduğundan, platform, biyolojik sıvılar içinde, doğrudan EV ölçümü için uygundur. Alternatif bir protokol bellek bileşenleri önemli ölçüde gözenek cloggin neden burada numuneler için yararlı olabilir sağlanmıştırişlersiz standart protokol güvenilir kullanımını sağlayarak g olaylar.

Hücresel kökenli kesecikler vücut sıvılarında 1 oldukça bol. Bu sözde-dışı vezikülleri (EVS) (50 - 1000 nm boyutunda) hücre membranı ile çoklu vesiküler organların ikisi füzyonu veya hücre zarının doğrudan dışarı tomurcuklanma ile oluşturulmaktadır. Son yıllarda, AGH&#39;ye bilimsel ilgi çok yeni fonksiyonlar ve EVs özellikleri tarif edilmektedir, ki 1 EV odaklı yayınların bir bolluk ile sonuçlanan, artmıştır. AGH artık, sinyal iletimi, bağışıklık düzenlemesi, ve kan pıhtılaşmasının 1-4 gibi fizyolojik ve patalojik sürece, geniş bir dizi dahil olmak inanılmaktadır. Kanserde, AGH premetastatik niş 5,6, anjiyojenez 8 ön-kanserli içerik 7,8 transferini ve uyarım oluşumunda rol oynamaktadır. Bunun yanı sıra, AGH terapötik ajanların 9 teslimi ajanlar olarak incelenmiştir. Bu de rağmenyadaki gelişmeler, EVs güvenilir ölçümü zor kalır. Geleneksel olarak, dolaylı ölçüm yöntemleri toplam protein içeriğinin veya spesifik protein miktarının dayananlar kullanılır. Geniş kullanılmasına rağmen, bu teknikler protein başına EV farklar için hesap yoktur, ve AGH protein agrega ve proteinleri kirletici arasında ayrım yoktur. Ayrıca, bu teknikler çoğu durumda biyolojik numunelerde EV konsantrasyonlarının karşılaştırması yapmak imkansız hale EVs izolasyonunu gerektirir. Bu nedenle, çabaları daha hassas ve doğrudan EV ölçümü için 10 yapılabildiği yeni yöntemler geliştirmek için yapılmaktadır. Bu rapor, güvenilir ölçümü ve AGH boyutu profil için ayarlanabilir rezistif darbe algılama (tRPS) kullanımını açıklar. Şu anda, qNano alet (Şekil 1a) tRPS için piyasada bulunan tek bir platformdur. TRPS olarak, iletken olmayan bir elastik zar wi noktalamanano-boyutlu bir gözenek inci iki akışkan hücrelerini ayıran. Diğer hücre partikülsüz elektrolit ile doldurulur ise sıvı hücrelerinden biri, söz konusu numunesi ile dikkatle doldurulmuştur. Bir voltaj uygulanarak, bir iyonik akış / elektrik akımı gözenekten partiküllerinin transferi üzerine değiştirilmiş olan (Şekil 1b) kurulur. Bu akım blokajının (&#39;dirençli darbe&#39;) büyüklüğü parçacık 11 (Şekil 1c) hacmi ile doğru orantılıdır. Blokajı süresi örneğin yük ya da 12 gibi şekil parçacık özellikleri üzerine dayanır partiküllerinin zeta-potansiyelini değerlendirmek için de kullanılabilir. Bilinmeyen parçacık büyüklüğü profil bilinen bir çapa sahip taneciklerin kalibrasyon kaynaklanan direnç darbelerle hasardan kaynaklanan darbeleri dirençli karşılaştırılmasıyla yapılabilir. Blokajın olayın büyüklüğü yanı sıra, bu ortaya çıktığı oranı ölçülür. Bu sayım oran dinleriparçacık konsantrasyonuna es. Konsantrasyon ve ablukaya oranı bilinen konsantrasyon ve tanecik büyüklüğü ile tek bir kalibrasyon numune kullanılarak doğrusal olarak orantılı olduğu için 13 konsantrasyon 14 ve bilinmeyen bir numune boyutu dağılımının 11 ölçülmesini sağlar. Nano-gözeneklere parçacıklarının hareketi elektro kinetik (elektroforetik ve elektro-ozmotik) ve akışkan kuvvetlerinin 15 tarafından belirlenir. Değişken basınç modülü (VPM) akışkan hücreler arasında bir basınç farkı kullanılarak ek bir kuvvet olarak indüklenebilir. Pozitif bir basınç uygulanması, parçacık konsantrasyon düşük olduğunda yararlı olabilir parçacıkların akış hızını artırır. Ayrıca, basınç elektro kinetik güçlerin etkisini azaltmak için uygulanabilir. Göreceli küçük bir gözenek çapına sahip olan nano-gözeneklerde kullanıldığında bu özellikle önemlidir (NP100 muhtemelen NP150 ve NP200) sıklıkta EVs tespiti için kullanılır.Bu nano-gözeneklerde için, önemli bir basınç uygulanması bile, elektro kinetik kuvvetler, partikül yüzey yüküne bağlı olarak, 16 nonnegligible kalabilir. Birden fazla basınçlarda parçacık hızını ölçerek, bir elektro kinetik düzeltilmiş, ve böylece daha hassas EV konsantrasyonu hesaplanabilir. Burada ayrıntılı protokolleri, EVs boyut dağılımına ve konsantrasyonunu tespit etmek için temin edilmiştir. Numuneleri, bilinen boyutları ve konsantrasyon 17 polistiren boncuklar ile tutturuldu yerlerde normal çalışma protokolü yanında, alternatif bir yaklaşım tarif edilmektedir. Bu gerçek-zamanlı bir ayarlama tekniği, idrar, plazma ve hücre kültürü üstte kalan sıvı ya da biyolojik sıvılarda, doğrudan EV&#39;lerini ölçümü sırasında teknik sorunlardan bazılarını karşılaşılan üstesinden gelmek için kullanılabilir ölçüm uzun bir süre boyunca nano-gözeneklere stabilitesi olamaz zaman sağlanmalıdır.

<table><tbody><tr><td><a href="http://www.izon.com/trps-with-qnano/">qNano instrument</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/vpm/">Değişken basınç modülü</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td><a href="http://www.izon.com/products/components-and-consumables/nanopores/">Nanopore</a></td><td>Izon Science Ltd.</td><td>NP100, NP200</td><td>Nanopor seçimi hedef partiküle göre değişir. Farklı hedef boyutlar için farklı nano gözenekler mevcuttur.</td></tr><tr><td>Kalibrasyon Parçacıkları</td><td>Izon Science Ltd.</td><td>CPC100, CPC200, CPC400</td><td>Kalibrasyon partikülleri farklı boyutlarda mevcuttur.</td></tr><tr><td>Sonikasyon banyosu</td><td>Çoklu mevcut</td><td></td><td>Temel sonikasyon banyosu yeterlidir</td></tr> <tr><td>(Mini) girdap</td><td>Çoklu mevcut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Asansörsüz dokular</td><td>Çoklu mevcut</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin (PBS)</td><td>Çoklu kullanılabilir</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windows tabanlı bilgisayar</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Izon Control Suite 2.2</td><td>İzon Bilim Ltd.</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Elektronik Tablo Yazılımı</td><td>Çoklu kullanılabilir</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

sayımı ve ayarlanabilir dirençli darbe algılama yöntemi ekstrasellüler veziküller boyutu-profil

Quantification and Size-profiling of Extracellular Vesicles Using Tunable Resistive Pulse Sensing

&#39;Microvesicles&#39; ve &#39;eksozomlann&#39; dahil Ekstrasellüler veziküller (AGH), vücut sıvıları oldukça bol. Yeni yıl AGH ilgi büyük bir artış tanık olduk. EVs koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser de dahil olmak üzere, çeşitli fizyolojik ve patolojik işlemlere, önemli roller oynadığı gösterilmiştir. Buna ek olarak, AGH ilaç verme araçları olarak, örneğin bir ilaç olarak ya da rejeneratif, terapötik maddeler olarak potansiyele sahiptir. Çünkü kendi küçük boyutu (50 1,000 nm) doğru ölçümü ve AGH boyutu profil teknik açıdan zor. Bu protokol qNano sistemi kullanılarak nasıl ayarlanabilir darbe dirençli algılama (tRPS) teknolojisini tarif EVs konsantrasyon ve boyutunu belirlemek için kullanılabilir. Nano ölçekli gözenek yoluyla transfer üzerine EVs saptanmasında kullanılır göre yöntem, nispeten hızlı bir küçük örnek hacimlerinin kullanılması yeterli ve pur gerektirmezification ve EVs konsantrasyonu. Alternatif bir yaklaşım kullanılarak açıklanmıştır normal çalışma protokolü aşağıdaki numuneleri, bilinen boyutları ve konsantrasyon polistiren boncuklar ile tutturuldu. Biyolojik akışkanlarda ölçümü sırasında doğrudan EV&#39;lerini bir ayarlama tekniği teknik engellerin üstesinden gelmek için kullanılabilir Bu gerçek zamanlı karşılaştı.

TRPS aleti kullanmak için, iletken olmayan bir küçük gözenek makinesi (Şekil 1a) bir 4 kolları üzerine yerleştirilmiş olması gerekir ve bir voltaj (Şekil 1b) esas alınmalıdır. Bir elektrik akımı temel bir kez kurulduğunda Şekil 1c&#39;de gösterildiği gibi, gözenek içinden geçen parçacıklar tarafından sebep mukavemet darbeler algılanır. AGH ultra-santrifüj ile gliyoblastoma hücre hattı U87 mg / EGFRvIII kapsamındaki hücre kültür süpernatanından saflaştırılmıştır. NP100 bir nano-gözeneklere üzerinde izole EVS (Şekil 2a) ölçümü sırasında stabil bir parçacık hızı grafiği görülmektedir. Bu kararlı parçacık hızı arsa güvenilir EV konsantrasyon ölçümü için gereklidir. 115 nm polistiren kalibrasyon boncuklarının, bir boyut dağılımı (Şekil 2b) ve EV-numunenin konsantrasyonu hesabının bir kaydı EV-örnek kayıt eşleştirilmesi (veriler gösterilmemiştir) temin edilebilir. (Figrue 3a) kesinti ve / veya dalgalanmalar sonuçlanır. Bu yanlış EV konsantrasyon tahminlerinde sonuçlanır. Bilinen konsantrasyon ve boyutta polistiren boncuklar ile numuneyi spike olarak, EV-kadar-boncuk oranı tespit edilebilir. Şekil 3b, boyut olarak 335 nm polistiren boncuklar ile hücre kültürü üst dip sonra, elde edilen sonuçları göstermektedir. İki net nüfus gözlenmektedir. Daha sonra, 0,46 nA bir blokaja yol açacak olan parçacıklar daha büyük parçacıklar polistiren boncuklar belirlenir, kararlı AGH bulunmaktadır. Polistiren boncuklara EVs oranı EVs (Tablo 1) ham konsantrasyonunu hesaplamak için kullanılır. 3c çivili polistiren taneciklerin dayanan iki popülasyonlarının boyutu tahmini göstermektedir Şekil. Nanopore kurulum kullanılan yenidenboyutunda AGH&gt; 140 nm tespiti neden olmuştur. Bu, küçük gözenek açıklığını düşürerek azaltılabilir, ancak bu aynı zamanda daha tıkanma olayları ile sonuçlanacaktır. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" width="600" /> Şekil 1: qNano alet ve çalışma modu. Aletin (A) fotoğrafı. Bir küçük gözenek bir üst sıvı hücreden bir alt sıvı ayırma hücresi, alet üzerine yerleştirilir. Sıvısı hücre koruyucu kapak ile çevre elektrik müdahalesinden korunmaktadır. (B) İllüstrasyon ayarlanabilir direnç darbe algılama (tRPS) özetleyen. Bir iletken olmayan elastik Nanopore iki akışkan hücrelerini ayıran. Bir voltaj uygulanarak, bir elektrik akımı nano-gözeneklere delinmiş gözenekten kurulur. Ekstrasellüler veziküllerin nanopore ile hareket ederken, iyonik akışı değişir ve bir direnç darbe olarak algılandı. TRPS olarak nanopore açıklık büyüklüğü aygıtının karşıt kolların arasındaki mesafeyi artırarak ya da bu mesafenin azaltılması ile Nanopore gerilmesiyle (azaltılabilir veya artırılabilir) ayarlanabilir. (C) dirençli darbeleri Açıklayıcı Örnek. Tek bir direnç darbesinin büyüklüğü parçacığın hacmine orantılıdır:. Büyük bakliyat büyük parçacıkları gösterir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig1highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 2" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" width="600" /> Şekil 2: Tane saymak-arsa ve U87-MG / EGFRvIII hücre kültürü süpernatanından izole AGH ölçüm elde boyut dağılımı genel sabit bir partikül algılama gösteren (A) Partikül sayım arsa.. Katılımı ile kısa azalmale algılama kaydın 80 ve 100 saniye arasında gözlenmiştir. Koruyucu kapağı kaydının durdurulması ve basıldıktan sonra, parçacık oranı, bundan sonra, kayıt devam edildi stabilize. (B) izole EVs boyutu dağılımı, 115 nm polistiren kalibrasyon tanelere bilinmeyen bir örneği (EVS) kalibre sonra işaretlenir. (5 nm kutu boyutu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig2highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 3," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" width="600" /> Şekil 3: Alternatif protokolü kullanılarak hücre kültür tortusu içinde EVs tRPS ölçümü. Bir biyolojik sıvıda doğrudan EV&#39;lerini ölçülürken elde edilen (A), tipik tanecik hızı çizimleri. Gözenek tıkanması parçacık algılama oranı kısa kesintileri ve dalgalanmalara neden olur. Herarsa aynı numunenin bir tekrarlanan ölçümü ifade eder. 335 nm polistiren kalibrasyon boncuklar ile hücre kültürü üst katmanını spike sonra elde edilen (B), üç adet eş büyüklüğü dağılımı grafik. En az 0.46 nA bir darbe dirençli indükleyen tüm parçacıklar EVs seçilir. (C) kirpi polistiren taneleri, numunenin bir boyut dağılımını elde etmek için kullanılabilir. (5 nm kutu boyutu). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51623/51623fig3highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Ölçme </td><td> Kalibrasyon sadece # 1 </td><td> Kalibrasyon sadece 2. </td><td> Supernatant # 1 </td><td> Supernatant # 2 </td><td> Supernatant # 3 </td></tr><tr><td> Ortalama akım (nA) </td><td> 117 </td><td> 120 </td> &lt;td&gt; 116 </td><td> 118 </td><td> 120 </td></tr><tr><td> Parçacık hızı </td><td> 172 </td><td> 194 </td><td> 250 </td><td> 246 </td><td> 196 </td></tr><tr><td> kullanılan kesme (nA) </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td><td> 0.46 </td></tr><tr><td> Toplam parçacıklar </td><td> 303 </td><td> 317 </td><td> 489 </td><td> 488 </td><td> 454 </td></tr><tr><td> Hücre dışı kesecikler </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> 213 </td><td> 215 </td><td> 213 </td></tr><tr><td> Çivili kalibrasyon boncuk </td><td> 300 </td><td> 316 </td><td> 276 </td><td> 273 </td><td> 241 </td></tr><tr><td> AGH / kalibrasyon boncuk </td><td> 0.01 </td><td> 0.003 </td><td> 0.772 </td><td> 0,788 </td><td> 0.884 </td></tr><tr><td> Örnek - arka plan </td><td></td><td></td><td> 0.765 </td><td> 0.781 </td><td> 0.877 </td></tr><tr><td> Extracelullar vezikülleri (10 7) / Ml </td><td></td><td></td><td> 7.14 </td><td> 7.29 </td><td> 8.18 </td></tr><tr><td> Örnek 2.5x seyreltilmiş </td><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Ham konsantrasyon AGH (10 7) / ml </td><td></td><td></td><td> 17.85 </td><td> 18.22 </td><td> 20.46 </td></tr></tbody></table> Tablo 1:. Alternatif protokolü kullanılarak EV konsantrasyon Örnek Hesaplama cut-off değeri kalibrasyon boncuk AGH ayırt kararlıdır. Daha sonra, EVS ve boncuk toplam sayısı alınabilir. Her ölçüm için EV-to-boncuk oranı hesaplanır. (Örneğin protein unsurlarının için) elektrolit içinde arka parçacıkların miktarı &quot;kalibrasyon taneler, sadece &#39;numunesinin tek ölçümler için, EV-kadar-boncuk oranının ortalaması alınarak hesaplanır. Her numune için, arka plan oranının elde oranı çıkartılmaktadır. Bu adjusteD oranı (: 9.33e7 / mL bu örnekte) numunede kalibrasyon boncuk konsantrasyonu ile çarpılır. EVs ham konsantrasyonunu belirlemek için, elde edilen konsantrasyon (: 2.5 Bu örnekte) toplam AGH seyreltme faktörü ile çarpılır.

Hücre dışı veziküller koagülasyon, bağışıklık karşılıklarının ve kanser ilaç uygulaması veya rejeneratif tıpta potansiyel terapötik maddeler dahil olmak üzere, fizyolojik ve patalojik sürece, önemli bir rol oynamaktadır. Bu protokol ayarlanabilir direnç darbe algılama kullanarak çeşitli sıvıların izole ve izole olmayan hücre dışı veziküllerin miktar ve boyut karakterizasyonu için yöntemler sunar.

Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Extracellular vesicles (EVs), including &#8216;microvesicles&#8217; and &#8216;exosomes&#8217;, are highly abundant in bodily fluids. Recent years have ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ayarlanabilir dirençli darbe algılaması kullanarak hücre dışı vezikülleri nicelleştirmek ve boyut profillerini çıkarmaktır. Standart yaklaşım, saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden alınan akım blokaj ölçümlerini, polistiren boncuk standartlarından alınanlarla karşılaştırmaktır. Hücre dışı vezikülleri karakterize etmenin ikinci bir yaklaşımı ise, saflaştırılmamış hücre dışı veziküller gibi karmaşık örneklerle çalışılırken kullanılan, örneğe polistiren boncuklar ekleme yöntemidir.Hücre kültürü ortamında elde edilen veriler, saflaştırılmış olsun ya da olmasın, hücre dışı veziküllerin boyutunu ve sayısını tanımlar. Bu tekniğin, western blotting veya lateks boncuklara bağlanmış hücre dışı veziküllerin akış sitometrisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, partikülleri fiziksel izolasyon veya etiketleme gereksinimi olmadan doğrudan biyolojik sıvılar içinde tanımlayabilmesidir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, hücre dışı veziküllerin boyut bakımından heterojen olması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.Daha küçük veziküller tespit edilmeye çalışıldığında, daha büyük veziküller nanoporu tıkayabilir. Çalışma koşullarına hızlıca geri dönmek için protokole bazı pratik ipuçları ve püf noktaları ekledik. Hücre dışı vezikül üretimini azaltmaya çalıştık ve hücre kültüründeki vezikül konsantrasyonunu nicelendirmek için yöntemlere ihtiyaç duyduk. Snet.Nanopartikülleri karakterize edecek yöntemler ararken TRPS ile karşılaştık ve protokollerini; SLS'lerin, hücre kültürü süpernatantlarının ve diğer biyolojik sıvıların karakterizasyonuna daha uygun hale getirmek için modifiye ettik. TRPS cihazını, üzerinde eyes on control suite yazılımı yüklü olan bir bilgisayara bağlayarak başlayın. Metin protokolünde tartışıldığı üzere, elektriksel etkileşimi minimize ettiğinizden emin olun.Şimdi, Nanogözenek (Nanopore) boyutunu seçin. 70 ila 200 nanometre boyutundaki veziküller için NP 100 en iyi seçimdir; 85 ila 300 nanometre boyutundaki veziküller için ise NP 150 kullanılabilir. NP 200, 100 ila 400 nanometre boyutundaki vezikülleri ölçmek için daha uygundur.Ardından, NP 100 ve NP 150 için tamamlayıcı polistiren kalibrasyon partiküllerini; NP 200 için ise CPC 100 kalibrasyon partiküllerini seçin. CPC 200 kalibrasyon partiküllerini kullanın. Kalibrasyon partiküllerini 30 saniye boyunca vorteksleyin.Hâlâ agregate durumdalarsa, sonikasyon uygulayın ve ardından kalibrasyon partiküllerini hedef konsantrasyona ulaşana kadar PBS ile seyreltin. Nanogözenek boyutuna bağlı olarak, final hacim en az 40 microliters olmalıdır. Şimdi, 78 microliters PBS uygulayıp hemen geri çekerek cihazın alt sıvı hücresini ıslatın.Bu işlem, nanopor altında kabarcık oluşma riskini azaltır. Ardından, Nanoporu cihazın kollarının arasına yerleştirin. İki karşıt kol arasındaki mesafeyi dijital kumpas kullanarak ölçün.Bu değeri yazılımdaki stretch (gerdirme) alanına girin ve girdikten sonra, karşıt kollar arasındaki mesafeyi kontrol eden yan tekerleği kullanarak calibrate stretch (gerdirme kalibrasyonu) seçeneğine tıklayın. Nanogözenekleri 47 mm seviyesine kadar gerdirin. İstenen boyuta ulaştığında, alt sıvı hücresine 78 µL PBS tekrar uygulayın.Üst akış hücresini nanoporun üzerine yerleştirip koruma kafesini takarak kalibrasyon işlemine başlayın. Ardından, üst akış hücresine 40 µL seyreltilmiş kalibrasyon partikülü ekleyin. Şimdi en az 0,8 kPa pozitif basınç uygulayın.Değişken basınç modülünü (VPM) kullanarak pozitif bir voltaj seçin ve açma düğmesine tıklayın. Ardından, blokajı analiz ederken gerilmeyi yavaşça azaltın. Kalibrasyon partikülleri tarafından tetiklenen olaylar.Germe azaldıkça, blokaj yüksekliği kademeli olarak artacak ve böylece sinyal-gürültü oranı iyileşecektir. Voltajı artırmak da blokaj yüksekliğini artırabilir, ancak aynı zamanda daha fazla RMS gürültüsü oluşturabilir. Sinyal izleme panelinden gözlemlendiği üzere, blokajlar arka plan seviyelerini uygun şekilde aşmaya başladığında germeyi azaltmayı durdurun.İkinci olarak, partikül oranını gözlemleyin. Ancak, bunun için daha az katı bir sınır değer vardır. Partikül oranının ideal olarak dakikada en az 100 olması gerekir.Ancak, partikül hızı dakikada 2000'den fazlaysa, numuneyi seyreltin ve cihazı yeniden kalibre edin. Bu kadar yüksek bir hız, bu gösterim için hatalı ölçümlere yol açabilir. Bir beyin tümörü hücre hattından daha önce saflaştırılmış hücre dışı veziküller karakterize edilir.Kalibrasyon partiküllerini üst akış hücresi presine yükleyerek başlayın. VPM'yi açın, basınç uygulayın ve buradan en az 500 partikül verisi kaydedin. 0.8 kilopascal basınç uygulanır.İsteğe bağlı olarak, bunu gerçekleştirmek için çoklu basınç ölçümü de yapılabilir; uygulanan basıncı artırın ve ikinci bir kalibrasyon dosyası kaydedin. Basınç artışları en az 0.2 kilopascal olmalıdır; şimdi örneği üst hücreden çıkarın ve hücreyi her yıkamada 100 microliters PBS ile üç kez yıkayın. Yıkama işlemlerinden sonra, üst sıvı hücresini tüy bırakmayan bir kağıtla silin.Sıradaki işlem olarak deney örneğini ekleyin. Baz hattı akımı, kalibrasyon partikülleri ölçülürken gözlemlenen akımın %3'ü dahilinde olmalıdır. Aksi takdirde, koruma kapağına hafifçe vurun veya çevirin, pistonu uygulayın veya nanoporu tamamen çıkarıp di su ile yıkayın.Gözlemlenen akım uygunsa, kalibrasyon partiküllerine uygulanan basınçların aynısını uygulayın. Ardından en az 500 partikülü kaydedin ve veri dosyasını kaydedin. Partikül tespitinde ani bir kesinti, temel akımda düşüş veya RMS gürültüsünde ani bir artış meydana gelirse, kaydı durdurun ve nanoporu tıkanıklıktan kurtarmayı deneyin.Daha önce yapıldığı gibi, örneği pipetle yukarı ve aşağı doğru çekip boşaltın. Koruma kapağına hafifçe vurun veya döndürün, pistonu uygulayın veya nanoporu tamamen çıkarıp DI su ile yıkayın. Bir diğer strateji ise, nanopor gerginliğini 47 milimetreye kadar artırmak ve VPM'den gelen basıncı yaklaşık beş dakika boyunca maksimize etmektir.Bu işlem aynı zamanda yazılımdaki NPO'yu UNC şeklinde devre dışı bırakabilir. Verileri analiz et (analyze data) sekmesine gidin, işlenmemiş dosyalar (unprocessed files) seçeneğine sağ tıklayarak verileri işlemeye başlayın ve dosyaları işle (process files) seçeneğini seçin. Ardından, örnek ve kalibrasyon dosyalarını eşleştirmek için örneğin yanındaki onay kutusuna tıklayın.Kalibre edilmiş sütunda, ilgili dosyaları seçin ve tamam'a tıklayın. Seçimler yapıldıktan sonra yazılım; boyut, dağılım, baz çizgisi süreleri, yarı maksimum tam genişlik ve konsantrasyon analizleri gibi farklı örnek özelliklerini görüntüleyecektir.Hazırlama aşamasında standart yöntemle aşırı tıkanıklığa yol açan biyolojik sıvılar gibi örnekler için şu yaklaşım kullanılır: hücre kültürü süpernatantını, hücre dışı vezikülleri içerecek şekilde, en az 50 µL hacminde, 300 Gs'de yedi dakika boyunca santrifüj edin. Hem örnek hem de kontrol için aynı şekilde yalnızca besiyeri içeren bir kontrol de hazırlayın. Süpernatanttan 20 µL'yi yeni tüplere aktarın ve üzerine 20 µL PBS ile mililitrede 10 milyon boncuk içeren, seyreltilmiş 335 nm polistiren boncuk stokundan 10 µL ekleyin.Şimdi cihazı, bir NP 200 Nanopore kullanarak daha önce olduğu gibi kurun ve sadece medyumdaki boncuklardan oluşan kontrol örneğini ölçün. Öncelikle, doğruluk için, boncuk olmayan küçük partiküllerin arka plan saptaması, boncuk saptamalarının %10'undan daha az olacak şekilde minimize edilmelidir. Şimdi, tekrarları kaydetmeden önce her örneği bir kez ölçün.Bu işlem, değişken nanopore koşullarını örnekler arasında dağıtacaktır. Her örnek, yalnızca kalibrasyon boncuğu içeren örneğin yeniden ölçülmesiyle toplamda üç kez ölçülmelidir. Daha sonra, veri analizi sırasında konsantrasyon hesaplamalarını yapmak için hesap tablosu yazılımı kullanın.Yazılı protokolde örnek bir hesaplama yer almaktadır. Hücre dışı veziküller, U 87 M-G-E-G-F-R-V üç hücre kültürü süpernatantından ultrasantrifüj ile saflaştırılmış ve ardından 115 nanometre kalibrasyon boncukları kullanılarak açıklanan protokol ile ölçülmüştür. Hücre dışı veziküller için bir boyut dağılımı elde edilmiştir.Hücre dışı veziküller, örneğe bir standart eklenen alternatif yaklaşım kullanılarak glioblastoma hücre kültürü süpernatandan da doğrudan nicelendirildi. İki nanopartikül popülasyonu gözlemlendi. Daha küçük olan hücre dışı veziküller ve daha büyük olan bilinen standardın varlığında, bilinen standarda dayalı boyut tahmini ile iki popülasyondan vezikül popülasyonunun 140 nanometreden büyük olduğu belirlendi.Daha küçük nanopore açıklıkları kullanılarak daha küçük hücre dışı veziküller tespit edilmiş olabilir, ancak bu durumda daha fazla tıkanma meydana gelirdi. Uzmanlaşıldıktan sonra, bu teknik analiz edilen örnek sayısına bağlı olarak bir ila dört saat arasında tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, örneklerin protokolde septal ayarlamalar gerektirebileceğini unutmamak önemlidir.Örneğin, daha büyük veziküllerden oluşan örnekler, nispeten daha yüksek gerilmede daha büyük nanoporların kullanılmasını gerektirebilir; ayrıca, nanoporu tıkayabilen hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için örneklerin santrifüj edilmesi veya filtrelenmesi ölçümleri kolaylaştırabilir. Bu videoyu izledikten sonra, TRPS kullanarak hücre dışı veziküllerin nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Hücre dışı vezikül örneğinize bağlı olarak, standart protokolü uygulayabilir veya ayarlanmış spike-in yöntemini kullanabilirsiniz.

quantification-size-profiling-extracellular-vesicles-using-tunable

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Burada tek tek nanopartiküllerin zeta potansiyelini belirlemek için kullanılabilir partikül translokasyon hızlarının ölçümü ile nanopartiküller yüzey kimyası karakterize etmek için bir dirençli darbe algılama tekniği entegre bir poliüretan ayarlanabilir Nanopore kullanımı.

Bir Ayarlanabilir Nanopore aracılığıyla Nanopartikül Translokasyon Hızları aracılığıyla Zeta Potansiyeli Belirlenmesi: Bir Örnek olarak DNA modifiye Parçacıklar kullanma

Birden mikroakışkan kanallarda parçacıkların algılama ve boyutlandırma multipleks için, kod bölmeli çoklu erişim (CDMA) ile rezistif darbe algılama (RPS) birleştiren entegre bir yüzey elektrot ağı ile mikroakışkan platformu göstermektedir.

Parçacıkların Mekansal Takip için Çoklanmış Elektronik Algılama ile mikroakışkan Platformu

Bu protokol için hızlı izole edilmesi insan tam kan üzerinden ekstraselüler veziküller ve belirli işaretleri karakterizasyonu için tam iş akışı floresans tabanlı nanopartikül izleme analizi ile açıklanmaktadır. Sunulan sonuçlar tekrarlanabilirlik yüksek düzeyde göstermek ve hücre kültür supernatants için ayarlanabilir.

İnsan kanı nanopartikül izleme analizi ile tek hücre dışı veziküller floresans tabanlı hızlı karakterizasyonu

Fare perigonadal yağ dokusundan ve insan plazmasından izole edilmiş hücre dışı veznelerin boyut dağılımını ve toplam partikül konsantrasyonu tahmin etmek için yeni bir nanopartikül izleme analiz aracının nasıl kullanılacağını gösteriyoruz.

Hücre Dışı Veziklinlerin Nicelleştirilmesi ve Boyut Tayini için Nanopartikül Takip Analizi

En yeni nesil EV karakterizasyon araçları, aynı anda birden fazla parametre arasında tek EV analizi yapabilir. Nano-akış sitometrisi, etiketleme yapmadan 45 nm'den büyük tüm biyolojik parçacıkları ölçer ve çeşitli floresan etiketleme teknikleriyle alt popülasyonların spesifik özelliklerini tanımlar.

Nano-Flow Sitometri ile Tek Hücre Dışı Vezikül Transmembran Protein Karakterizasyonu

Bu makale, hücre dışı vezikül alt kümelerinin karakterizasyonu için artan verime sahip yeni nesil multiparametrik analitik platformlar önermektedir. Yöntem, bir mikroarray biyoçipinde sıkışmış veziküler hedefleri nitelemek için Raman spektroskopisi ile birleştiğinde, atomik kuvvet mikroskobu ile metrolojik ve morfomekanik analizlerle çoklanmış biyosensing yöntemlerinin bir kombinasyonuna dayanmaktadır.

Hücre Dışı Vezikül Alt Kümelerinin Analizi için Çok Katlı Yüzey Plazmon Rezonans Görüntüleme Çipi Üzerinde Multimodal Analitik Platform

Burada sunulan, mekano-düğüm-gözenek algılama (mekano-NPS) adı verilen elektronik tabanlı bir mikroakışkan platform kullanarak tek hücreleri mekanik olarak fenotiplemek için bir yöntemdir. Bu platform, hücrelerin hem elastik hem de viskoz biyofiziksel özelliklerini ölçerken 1-10 hücre / s'nin ılımlı verimini korur.

Mekano-Düğüm-Gözenek Algılama: Çok Parametreli Tek Hücreli Viskoelastik Ölçümler için Hızlı, Etiketsiz Bir Platform

Burada, insan deneklerin gözyaşı ve tükürük gibi biyolojik sıvılarından toplanan hücre dışı veziküller (EV'ler) için karakterizasyon yöntemini gösteriyoruz. Bu yöntemde kullanılan tarayıcı, numunenin 1 μL'sinden EV'lerin fenotipini, boyutunu ve toplam partikül sayısını tespit etme yeteneğine sahiptir.

Biyolojik Sıvılardan Hücre Dışı Veziküllerin Karakterizasyonu

Burada, etiketsiz yüzey takviyeli Raman spektroskopisi (SERS) kullanılarak bireysel küçük ekstrasellüler veziküllerini (sEV) analiz etmek için bir protokol sunuyoruz; bu protokol, minimal invaziv hastalık teşhisi ve sEV'lerin terapötik teslimat araçları olarak değerlendirilmesini mümkün kılmaktadır.

Hastalık Tanısı ve Tedavilerde Bireysel SEV'lerin Yüzeye Güçlendirilmiş Raman Saçılmasına Dayalı Biyosensörleme'nin Uygulanmasını Araştırmak

Raman spektroskopisi temassız için uygun bir tekniktir, canlı hücreler, doku mühendisliği yapıları ve doğal dokuların etiket ücretsiz analizidir. Kaynak özgü spektral parmak izi oluşturulur ve çok değişkenli analiz kullanılarak analiz edilebilir.

Raman Spektroskopisi kullanarak Hücreler ve Ekstrasellüler Matriks Temassız, Etiket ücretsiz izleme

Öğrenin ekstraselüler vezikülleri ayarlanabilir dirençli darbe algılama ile sayma ve boyut profilleme yöntemini. Bu teknik biyolojik sıvılarda doğrudan ölçüm sağlar.

Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Daha fazla video keşfet