Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ayarlanabilir dirençli darbe algılama kullanarak hücre dışı veziküllerin profilini çıkarmak ve boyutlandırmaktır. Standart yaklaşım, saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden alınan akım blokaj ölçümlerini polistiren boncuk standartlarından alınanlarla karşılaştırmaktır. Hücre dışı vezikülleri karakterize etmek için ikinci bir yaklaşım, numuneyi, saflaştırılmamış hücre dışı veziküller gibi karmaşık numunelerle çalışırken kullanılan polistiren boncuklarla çivilemektir.

Hücre kültürü ortamında, elde edilen veriler, saflaştırılmış veya saflaştırılmamış olsun, hücre dışı veziküllerin boyutunu ve sayısını karakterize eder. Bu tekniğin, lateks boncuklara bağlı eski hücre dışı veziküllerin western blotlama veya akış sitometrisi gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bu yöntemin fiziksel izolasyon veya etiketlemeye ihtiyaç duymadan doğrudan biyolojik sıvılardaki partikülleri karakterize etmesidir. Genel olarak, yönteme yeni olan bireyler, hücre dışı veziküllerin boyutu heterojen olduğu için mücadele edecektir.

Daha küçük vezikülleri tespit etmeye çalışırken, daha büyük veziküller nano gözenekleri tıkayabilir. Hızlı bir şekilde uygulanabilir koşullara dönmek için protokole bazı pratik ipuçları ve püf noktaları ekledik. Hücre dışı veziküllerin üretimini azaltmaya çalıştık ve hücre kültüründeki veziküllerin konsantrasyonunu ölçmek için bir yönteme ihtiyacımız vardı. Ağ.

Nanos parçacıklarını karakterize etmek için yöntemler ararken, TRPS ile karşılaştık ve protokollerini SLES ve hücre kültürünün karakterizasyonu için daha uygun olacak şekilde değiştirdik. S süpernatantları ve diğer biyolojik sıvılar TRPS cihazını, üzerinde kontrol paketi yazılımının yüklü olduğu bir bilgisayara bağlayarak başlayın. Metin protokolünde açıklandığı gibi elektriksel paraziti en aza indirdiğinizden emin olun.

Şimdi, Nanopor boyutunu seçin. Bir NP 100, 70 ila 200 nanometre veziküller için en iyi seçimdir, oysa bir NP 150, 85 ila 300 nanometre boyutlu veziküller için kullanılabilir. Bir NP 200, 100 ila 400 nanometre vezikülleri ölçmek için daha uygundur.

Ardından NP 100 ve NP 150 için tamamlayıcı polistiren kalibrasyon partiküllerini seçin, NP 200 için CPC 100 kalibrasyon partiküllerini seçin. CPC 200 kalibrasyon partiküllerini kullanın. Kalibrasyon parçacıklarını 30 saniye boyunca vorteksleyin.

Hala toplanmışlarsa, sonikasyon kullanın ve ardından PBS'deki kalibrasyon parçacıklarını hedef konsantrasyona seyreltin. Nanopor boyutuna bağlı olarak, nihai hacim en az 40 mikrolitre olmalıdır. Şimdi 78 mikrolitre PBS uygulayarak ve hemen çıkararak cihazın alt sıvı hücresini ıslatın.

Bu, nano gözenek altında kabarcık oluşma riskini azaltır. Ardından, Nanopore'u cihazın kollarına yerleştirin. Dijital kumpaslar kullanarak iki zıt kol arasındaki mesafeyi ölçün.

Bu değeri stretch adı verilen alanın altındaki yazılıma girin ve bir kez girildikten sonra rakip kollar arasındaki mesafeyi kontrol eden yan tekerleği kullanarak calibrate stretch butonuna tıklayın. Nanoporu 47 milimetreye kadar gerin. Boyuta gerildikten sonra, 78 mikrolitre PBS'yi alt sıvı hücresine tekrar uygulayın.

Üst sıvı hücresini nano gözenek üzerine yerleştirerek ve koruyucu kafesi takarak kalibrasyon işlemine başlayın. Daha sonra üst sıvı hücresine 40 mikrolitre seyreltilmiş kalibrasyon parçacığı ekleyin. Şimdi en az 0,8 kilopaskal pozitif basınç uygulayın.

Değişken basınç modülünü veya VPM'yi kullanarak pozitif bir voltaj seçin ve aç'a tıklayın. Ardından ablukayı analiz ederken gerginliği yavaşça azaltın. Kalibrasyon parçacıklarının neden olduğu olaylar.

Esneme azaldıkça, abluka yüksekliği kademeli olarak artacak ve böylece sinyal-gürültü oranı iyileşecektir. Voltajın arttırılması abluka yüksekliğini de artırabilir, ancak aynı zamanda daha fazla RMS gürültüsü de üretebilir. Gözlemlenen blokajlar, sinyal izleme panelinden belirtildiği gibi arka plan seviyelerini uygun şekilde aştığında esnemeyi azaltmayı durdurun.

İkinci olarak, partikül oranını gözlemleyin. Ancak, bunun daha az katı bir sınırı vardır. Partikül hızı ideal olarak dakikada en az 100 olmalıdır.

Bununla birlikte, partikül hızı dakikada 2000'den büyükse, numuneyi seyreltin ve cihazı yeniden kalibre edin. Bu kadar yüksek bir oran, bu gösteri için yanlış ölçümlere yol açabilir. Bir beyin tümörü hücre hattından daha önce saflaştırılmış hücre dışı veziküller karakterize edilir.

Kalibrasyon parçacıklarını üst akışkan hücresi presine yükleyerek başlayın. Açın, ardından VPM'yi kullanarak basınç uygulayın ve buraya en az 500 parçacık veri kaydedin. 0,8 kilopaskal basınç uygulanır.

Opsiyonel olarak bunu yapmak, uygulanan basıncı artırmak ve ikinci bir kalibrasyon dosyası kaydetmek için çoklu basınç ölçümü de yapılabilir. Basınç artışları şimdi en az 0,2 kilopaskal olmalıdır, numuneyi üst hücreden çıkarın ve hücreyi yıkama başına 100 mikrolitre PBS ile üç kez yıkayın. Yıkamalardan sonra, üst sıvı hücresini tüy bırakmayan kağıtla silin.

Daha sonra deneysel örneği ekleyin. Temel akım, kalibrasyon parçacıkları ölçülürken gözlemlenen akımın %3'ü içinde olmalıdır. Değilse, koruyucu kapağa hafifçe vurun veya çevirin, pistonu uygulayın veya nanoporu tamamen çıkarın ve di su ile yıkayın.

Gözlemlenen akım iyiyse, kalibrasyon parçacıklarına uygulananla aynı basınçları uygulayın. Ardından en az 500 parçacık kaydedin ve veri dosyasını kaydedin. Parçacık algılamada ani bir kesinti, temel akımda bir düşüş veya RMS gürültüsünde ani bir artış olursa, kaydı duraklatın ve nano gözeneği açmayı deneyin.

Daha önce olduğu gibi, numuneyi yukarı ve aşağı pipetleyin. Koruyucu kapağa hafifçe vurun veya çevirin, pistonu uygulayın veya nanoporu tamamen çıkarın ve DI suyla yıkayın. Başka bir strateji, nanopor gerilmesini 47 milimetreye kadar artırmak ve VPM'den gelen basıncı yaklaşık beş dakika boyunca en üst düzeye çıkarmaktır.

Bu aynı zamanda UNC de olabilir, yazılımdaki NPO'nun fişini çekin. Verileri analiz et sekmesine gidin ve işlenmemiş dosyalar seçeneğine sağ tıklayarak verileri işlemeye başlayın ve dosyaları işle seçeneğini seçin. Ardından numune ve kalibrasyon dosyalarını birleştirmek için numunenin yanındaki onay kutusunu tıklayın.

Kalibre edilmiş sütunda, ilgili dosyaları seçin ve tamam. Seçenekler. Yazılım, boyut, dağılım, temel süreler, tam genişlik, yarı maksimumlar ve konsantrasyon analitiği gibi farklı numune özelliklerini gösterecektir.

Aşağıdaki yaklaşım, hazırlıkta standart yöntem kullanılarak aşırı tıkanmaya yol açan biyolojik sıvılar gibi numuneler için kullanılır, en az 50 mikrolitre hücre kültürünü santrifüjleyin. 300 Gs'de yedi dakika boyunca hücre dışı vezikülleri içeren süpernatant.Ayrıca hem numune hem de kontrol için aynı şekilde tek başına bir medya kontrolü hazırlayın. 20 mikrolitre süpernatanı yeni tüplere aktarın ve mililitre başına 10 milyon boncukta 20 mikrolitre PBS ve 10 mikrolitre seyreltilmiş 335 nanometre polistiren boncuk stoğu ekleyin.

Şimdi bir NP 200 Nanopore kullanarak cihazı daha önce olduğu gibi kurun ve ortamdaki sadece boncukların kontrol örneğini ölçün. İlk olarak, doğruluk için, boncuk olmayan küçük parçacıkların arka plan algılaması, boncuk algılamalarının %10'undan daha azına indirilmelidir. Şimdi, kayıt tekrarlanmadan önce her örneği bir kez ölçün.

Bu, dalgalanan nanopor koşullarını numuneler üzerine dağıtacaktır. Her numune, yalnızca kalibrasyon boncuğu numunesinin yeniden ölçülmesiyle tüm bitişte üç kez ölçülmelidir. Sonra. Veri analizi sırasında, konsantrasyon hesaplamaları yapmak için elektronik tablo yazılımı kullanın.

Yazılı protokolde örnek bir hesaplama yer almaktadır. Hücre dışı veziküller, ultrasantrifüjleme ile süpernatan olan U 87 M-G-E-G-F-R-V üç hücre kültüründen saflaştırıldı ve daha sonra 115 nanometre kalibrasyon boncukları kullanılarak tarif edilen protokol kullanılarak ölçüldü. Hücre dışı veziküller için bir boyut dağılımı elde edildi.

Hücre dışı veziküller ayrıca, numuneyi bir standartla sivri uçlu hale getiren alternatif yaklaşım kullanılarak, doğrudan glioblastoma hücre kültürü süpernatantından ölçüldü. İki nanopartikül popülasyonu gözlendi. Daha küçük hücre dışı veziküller ve bilinen daha büyük standart, bilinen standarda dayalı iki popülasyonun boyut tahmini, vezikül popülasyonunu 140 nanometreden daha büyük olarak tanımladı.

Daha küçük bir nanopor açıklığı kullanılarak daha küçük hücre dışı veziküller tespit edilmiş olabilir, ancak bir kez ustalaştıktan sonra daha fazla tıkanma olurdu. Bu teknik, analiz edilen numune sayısına bağlı olarak bir ila dört saat içinde yapılabilir. Bu prosedürü gerçekleştirirken, numunelerin protokolde septal ayarlamalar gerektirebileceğini unutmamak önemlidir.

Örneğin, daha büyük veziküllerden oluşan numuneler, nispeten büyük streçlerde daha büyük nanogözeneklerin kullanılmasını gerektirebilir ve ayrıca nano gözenekleri saatleyebilen hücresel kalıntıları gidermek için numunelerin santrifüjlenmesini filtreleyerek ölçümler kolaylaştırılabilir. Bu videoyu izledikten sonra, TRPS kullanarak hücre dışı veziküllerin nasıl karakterize edileceğini iyi anlamalısınız. Hücre dışı vezikül örneğinize bağlı olarak, standart protokolü uygulayabilir veya ayarlanmış spike in yöntemini kullanabilirsiniz.