Sayımı ve Ayarlanabilir Dirençli Darbe Algılama Yöntemi Ekstrasellüler Veziküller boyutu-profil

Aşağıdaki deneyin genel amacı, ayarlanabilir dirençli darbe algılaması kullanarak hücre dışı vezikülleri nicelleştirmek ve boyut profillerini çıkarmaktır. Standart yaklaşım, saflaştırılmış hücre dışı veziküllerden alınan akım blokaj ölçümlerini, polistiren boncuk standartlarından alınanlarla karşılaştırmaktır. Hücre dışı vezikülleri karakterize etmenin ikinci bir yaklaşımı ise, saflaştırılmamış hücre dışı veziküller gibi karmaşık örneklerle çalışılırken kullanılan, örneğe polistiren boncuklar ekleme yöntemidir.

Hücre kültürü ortamında elde edilen veriler, saflaştırılmış olsun ya da olmasın, hücre dışı veziküllerin boyutunu ve sayısını tanımlar. Bu tekniğin, western blotting veya lateks boncuklara bağlanmış hücre dışı veziküllerin akış sitometrisi gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, partikülleri fiziksel izolasyon veya etiketleme gereksinimi olmadan doğrudan biyolojik sıvılar içinde tanımlayabilmesidir. Genellikle, bu yöntemde yeni olan kişiler, hücre dışı veziküllerin boyut bakımından heterojen olması nedeniyle zorluk yaşayacaklardır.

Daha küçük veziküller tespit edilmeye çalışıldığında, daha büyük veziküller nanoporu tıkayabilir. Çalışma koşullarına hızlıca geri dönmek için protokole bazı pratik ipuçları ve püf noktaları ekledik. Hücre dışı vezikül üretimini azaltmaya çalıştık ve hücre kültüründeki vezikül konsantrasyonunu nicelendirmek için yöntemlere ihtiyaç duyduk. Snet.

Nanopartikülleri karakterize edecek yöntemler ararken TRPS ile karşılaştık ve protokollerini; SLS'lerin, hücre kültürü süpernatantlarının ve diğer biyolojik sıvıların karakterizasyonuna daha uygun hale getirmek için modifiye ettik. TRPS cihazını, üzerinde eyes on control suite yazılımı yüklü olan bir bilgisayara bağlayarak başlayın. Metin protokolünde tartışıldığı üzere, elektriksel etkileşimi minimize ettiğinizden emin olun.

Şimdi, Nanogözenek (Nanopore) boyutunu seçin. 70 ila 200 nanometre boyutundaki veziküller için NP 100 en iyi seçimdir; 85 ila 300 nanometre boyutundaki veziküller için ise NP 150 kullanılabilir. NP 200, 100 ila 400 nanometre boyutundaki vezikülleri ölçmek için daha uygundur.

Ardından, NP 100 ve NP 150 için tamamlayıcı polistiren kalibrasyon partiküllerini; NP 200 için ise CPC 100 kalibrasyon partiküllerini seçin. CPC 200 kalibrasyon partiküllerini kullanın. Kalibrasyon partiküllerini 30 saniye boyunca vorteksleyin.

Hâlâ agregate durumdalarsa, sonikasyon uygulayın ve ardından kalibrasyon partiküllerini hedef konsantrasyona ulaşana kadar PBS ile seyreltin. Nanogözenek boyutuna bağlı olarak, final hacim en az 40 microliters olmalıdır. Şimdi, 78 microliters PBS uygulayıp hemen geri çekerek cihazın alt sıvı hücresini ıslatın.

Bu işlem, nanopor altında kabarcık oluşma riskini azaltır. Ardından, Nanoporu cihazın kollarının arasına yerleştirin. İki karşıt kol arasındaki mesafeyi dijital kumpas kullanarak ölçün.

Bu değeri yazılımdaki stretch (gerdirme) alanına girin ve girdikten sonra, karşıt kollar arasındaki mesafeyi kontrol eden yan tekerleği kullanarak calibrate stretch (gerdirme kalibrasyonu) seçeneğine tıklayın. Nanogözenekleri 47 mm seviyesine kadar gerdirin. İstenen boyuta ulaştığında, alt sıvı hücresine 78 µL PBS tekrar uygulayın.

Üst akış hücresini nanoporun üzerine yerleştirip koruma kafesini takarak kalibrasyon işlemine başlayın. Ardından, üst akış hücresine 40 µL seyreltilmiş kalibrasyon partikülü ekleyin. Şimdi en az 0,8 kPa pozitif basınç uygulayın.

Değişken basınç modülünü (VPM) kullanarak pozitif bir voltaj seçin ve açma düğmesine tıklayın. Ardından, blokajı analiz ederken gerilmeyi yavaşça azaltın. Kalibrasyon partikülleri tarafından tetiklenen olaylar.

Germe azaldıkça, blokaj yüksekliği kademeli olarak artacak ve böylece sinyal-gürültü oranı iyileşecektir. Voltajı artırmak da blokaj yüksekliğini artırabilir, ancak aynı zamanda daha fazla RMS gürültüsü oluşturabilir. Sinyal izleme panelinden gözlemlendiği üzere, blokajlar arka plan seviyelerini uygun şekilde aşmaya başladığında germeyi azaltmayı durdurun.

İkinci olarak, partikül oranını gözlemleyin. Ancak, bunun için daha az katı bir sınır değer vardır. Partikül oranının ideal olarak dakikada en az 100 olması gerekir.

Ancak, partikül hızı dakikada 2000'den fazlaysa, numuneyi seyreltin ve cihazı yeniden kalibre edin. Bu kadar yüksek bir hız, bu gösterim için hatalı ölçümlere yol açabilir. Bir beyin tümörü hücre hattından daha önce saflaştırılmış hücre dışı veziküller karakterize edilir.

Kalibrasyon partiküllerini üst akış hücresi presine yükleyerek başlayın. VPM'yi açın, basınç uygulayın ve buradan en az 500 partikül verisi kaydedin. 0.8 kilopascal basınç uygulanır.

İsteğe bağlı olarak, bunu gerçekleştirmek için çoklu basınç ölçümü de yapılabilir; uygulanan basıncı artırın ve ikinci bir kalibrasyon dosyası kaydedin. Basınç artışları en az 0.2 kilopascal olmalıdır; şimdi örneği üst hücreden çıkarın ve hücreyi her yıkamada 100 microliters PBS ile üç kez yıkayın. Yıkama işlemlerinden sonra, üst sıvı hücresini tüy bırakmayan bir kağıtla silin.

Sıradaki işlem olarak deney örneğini ekleyin. Baz hattı akımı, kalibrasyon partikülleri ölçülürken gözlemlenen akımın %3'ü dahilinde olmalıdır. Aksi takdirde, koruma kapağına hafifçe vurun veya çevirin, pistonu uygulayın veya nanoporu tamamen çıkarıp di su ile yıkayın.

Gözlemlenen akım uygunsa, kalibrasyon partiküllerine uygulanan basınçların aynısını uygulayın. Ardından en az 500 partikülü kaydedin ve veri dosyasını kaydedin. Partikül tespitinde ani bir kesinti, temel akımda düşüş veya RMS gürültüsünde ani bir artış meydana gelirse, kaydı durdurun ve nanoporu tıkanıklıktan kurtarmayı deneyin.

Daha önce yapıldığı gibi, örneği pipetle yukarı ve aşağı doğru çekip boşaltın. Koruma kapağına hafifçe vurun veya döndürün, pistonu uygulayın veya nanoporu tamamen çıkarıp DI su ile yıkayın. Bir diğer strateji ise, nanopor gerginliğini 47 milimetreye kadar artırmak ve VPM'den gelen basıncı yaklaşık beş dakika boyunca maksimize etmektir.

Bu işlem aynı zamanda yazılımdaki NPO'yu UNC şeklinde devre dışı bırakabilir. Verileri analiz et (analyze data) sekmesine gidin, işlenmemiş dosyalar (unprocessed files) seçeneğine sağ tıklayarak verileri işlemeye başlayın ve dosyaları işle (process files) seçeneğini seçin. Ardından, örnek ve kalibrasyon dosyalarını eşleştirmek için örneğin yanındaki onay kutusuna tıklayın.

Kalibre edilmiş sütunda, ilgili dosyaları seçin ve tamam'a tıklayın. Seçimler yapıldıktan sonra yazılım; boyut, dağılım, baz çizgisi süreleri, yarı maksimum tam genişlik ve konsantrasyon analizleri gibi farklı örnek özelliklerini görüntüleyecektir.

Hazırlama aşamasında standart yöntemle aşırı tıkanıklığa yol açan biyolojik sıvılar gibi örnekler için şu yaklaşım kullanılır: hücre kültürü süpernatantını, hücre dışı vezikülleri içerecek şekilde, en az 50 µL hacminde, 300 Gs'de yedi dakika boyunca santrifüj edin. Hem örnek hem de kontrol için aynı şekilde yalnızca besiyeri içeren bir kontrol de hazırlayın. Süpernatanttan 20 µL'yi yeni tüplere aktarın ve üzerine 20 µL PBS ile mililitrede 10 milyon boncuk içeren, seyreltilmiş 335 nm polistiren boncuk stokundan 10 µL ekleyin.

Şimdi cihazı, bir NP 200 Nanopore kullanarak daha önce olduğu gibi kurun ve sadece medyumdaki boncuklardan oluşan kontrol örneğini ölçün. Öncelikle, doğruluk için, boncuk olmayan küçük partiküllerin arka plan saptaması, boncuk saptamalarının %10'undan daha az olacak şekilde minimize edilmelidir. Şimdi, tekrarları kaydetmeden önce her örneği bir kez ölçün.

Bu işlem, değişken nanopore koşullarını örnekler arasında dağıtacaktır. Her örnek, yalnızca kalibrasyon boncuğu içeren örneğin yeniden ölçülmesiyle toplamda üç kez ölçülmelidir. Daha sonra, veri analizi sırasında konsantrasyon hesaplamalarını yapmak için hesap tablosu yazılımı kullanın.

Yazılı protokolde örnek bir hesaplama yer almaktadır. Hücre dışı veziküller, U 87 M-G-E-G-F-R-V üç hücre kültürü süpernatantından ultrasantrifüj ile saflaştırılmış ve ardından 115 nanometre kalibrasyon boncukları kullanılarak açıklanan protokol ile ölçülmüştür. Hücre dışı veziküller için bir boyut dağılımı elde edilmiştir.

Hücre dışı veziküller, örneğe bir standart eklenen alternatif yaklaşım kullanılarak glioblastoma hücre kültürü süpernatandan da doğrudan nicelendirildi. İki nanopartikül popülasyonu gözlemlendi. Daha küçük olan hücre dışı veziküller ve daha büyük olan bilinen standardın varlığında, bilinen standarda dayalı boyut tahmini ile iki popülasyondan vezikül popülasyonunun 140 nanometreden büyük olduğu belirlendi.

Daha küçük nanopore açıklıkları kullanılarak daha küçük hücre dışı veziküller tespit edilmiş olabilir, ancak bu durumda daha fazla tıkanma meydana gelirdi. Uzmanlaşıldıktan sonra, bu teknik analiz edilen örnek sayısına bağlı olarak bir ila dört saat arasında tamamlanabilir. Bu prosedür uygulanırken, örneklerin protokolde septal ayarlamalar gerektirebileceğini unutmamak önemlidir.

Örneğin, daha büyük veziküllerden oluşan örnekler, nispeten daha yüksek gerilmede daha büyük nanoporların kullanılmasını gerektirebilir; ayrıca, nanoporu tıkayabilen hücresel kalıntıları uzaklaştırmak için örneklerin santrifüj edilmesi veya filtrelenmesi ölçümleri kolaylaştırabilir. Bu videoyu izledikten sonra, TRPS kullanarak hücre dışı veziküllerin nasıl karakterize edileceği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Hücre dışı vezikül örneğinize bağlı olarak, standart protokolü uygulayabilir veya ayarlanmış spike-in yöntemini kullanabilirsiniz.