Antikorların Kompleman Aracılı Bakterisidal Aktivitesi için Bir Serum Bakterisidal Testi

Lipopolisakkaritlere veya gram negatif bakterilerin bir dış zar bileşeni olan LPS'ye karşı monoklonal antikorlar içeren seri olarak seyreltilmiş bir serum örneği alın.

Gram negatif bakterileri tanıtın. Serum antikorları bakteriyel LPS'ye bağlanır.

Kompleman proteinleri ekleyin. C1 kompleksi, LPS'ye bağlı antikorlara bağlanarak enzimatik olarak aktif bir C1 oluşturur.

Aktive edilmiş C1, C4 ve C2'yi C3 konvertaz oluşturmak üzere parçalar, bu da C3'ü C5 konvertaz oluşturmak üzere parçalar. Konvertaz, C6 ve C7'yi işe alan C5b'yi üretmek için C5'i parçalar. Elde edilen kompleks dış zara girer ve C8 ve çoklu C9 ile birleşerek bir gözenek oluşturur.

Dış zar hasarı, iç zarın dengesini bozarak hücre parçalanmasına neden olur.

Karışımı bir agar plakasına yerleştirin ve yayın. Bakteri üremesi için kuluçkaya yatırın. Plakayı, mikrobiyal dehidrojenazlar tarafından indirgenen ve bakteri kolonilerine kırmızı bir renk veren Trifenil tetrazolyum klorür veya TTC içeren agar ile kaplayın.

Koloni sayısı, numune seyreltme ile artar, bu da daha düşük antikor konsantrasyonu ile bakterisidal aktivitenin azaldığını gösterir.

Başlamak için, test numunelerini ısıyla etkisiz hale getirmek için numuneleri 56 santigrat derecede ılık su banyosunda 30 dakika inkübe edin. A'dan G'ye kadar olan satırların 1 ila 12 numaralı sütunlarına bir tahlil plakası ve 20 mikrolitre tahlil tamponu elde edin. H satırının 1. ve 2. sütunlarına 20 mikrolitre tahlil tamponu ekleyin. Her test örneğinden 30 mikrolitreyi tahlil plakasının H satırına iki kopya halinde yükleyin.

Test numunelerinin üç katlı seri seyreltmelerini gerçekleştirmeye başlamak için, 3H ila 12H arasındaki kuyucuklardan 10 mikrolitre çıkarmak için çok kanallı bir pipet kullanın. Numuneleri G sırasındaki ilgili kuyucuklara aktarın ve numuneyi iyice karıştırmak için 8 ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Daha sonra bu kuyucuklardan 10 mikrolitre çıkarın, F sırasındaki ilgili kuyucuklara aktarın ve karıştırmak için 8 ila 10 kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Bu seri seyreltme işlemine A satırı boyunca devam edin. A sırasındaki kuyucukları karıştırdıktan sonra, 3A'dan 12A'ya kadar olan kuyulardan 10 mikrolitreyi çıkarın ve atın, böylece tüm kuyucuklardaki nihai hacim 20 mikrolitre olur.

Dondurulmuş hedef bakteri stoğundan bir şişe alın ve oda sıcaklığında çözdürün. Daha sonra, bakterileri önceden belirlenmiş optimal seyreltme faktörüne göre 20 ml'lik tahlil tamponunda seyreltin. Çok kanallı bir pipet kullanarak, tahlil plakasının her bir oyuğuna 10 mikrolitre seyreltilmiş bakteri ekleyin.

Bir şişe donmuş bebek tavşan tamamlayıcısı ve bir şişe donmuş ısıyla etkisiz hale getirilmiş BRC alın. Şişeleri oda sıcaklığına çözmek için soğuk akan su kullanın. Ardından, 100 mikrolitre ısı ve ısıyla etkisiz hale getirilmiş BRC'yi 400 mikrolitre tahlil tamponu ile karıştırın. Bu %20 ısıyla inaktive edilmiş BRC çözeltisinden 50 mikrolitreyi sütun 1'deki tüm kuyucuklara ekleyin. 1 mililitre doğal BRC'yi 4 mililitre tahlil tamponu ile karıştırın. Bu %20'lik karışımdan 50 mikrolitre 2'den 12'ye kadar olan sütunlardaki tüm kuyucuklara ekleyin. Tahlil plakasını nazikçe karıştırmak için plakayı 10 ila 15 saniye boyunca bir plaka çalkalayıcıya yerleştirin.

Tahlil plakasını mikrobiyolojik bir inkübatörde iki saat inkübe edin. Bu arada, kapakları iki LB agar plakasından çıkarın ve plakaları kuruması için 40 ila 60 dakika boyunca biyolojik bir güvenlik kabinine yüzü yukarı bakacak şekilde yerleştirin. İnkübasyon tamamlandığında, tahlil plakasını ıslak buza aktarın ve reaksiyonu durdurmak için 10 ila 20 dakika inkübe edin. 12 kanallı bir pipet kullanarak, H sırasındaki kuyucukları karıştırın ve reaksiyon karışımının 10 mikrolitresini bir LBA plakasının dibine yerleştirin. Plakayı hemen eğin ve lekelerin yaklaşık 1,5 ila 2 santimetre akmasına izin verin.

G, F ve E satırları için bu prosedürü tekrarlayın ve bunları önceki satırın üzerinde bulun. Çözelti LBA plakalarına emilene kadar LBA plakalarını oda sıcaklığında inkübe edin. Ardından, kapakları plakaların üzerine koyun ve gece boyunca inkübe etmek için baş aşağı mikrobiyolojik bir inkübatöre aktarın.

Ertesi gün, mililitre TTC başına 100 mikrogram ve her LBA plakasına% 0.1 sodyum azid içeren 55 santigrat derecede 25 ml kaplama agar ekleyin. Hayatta kalan bakterilerin kırmızı bir renk geliştirmesine izin vermek için 37 santigrat derecede iki saat inkübe edin. Ardından, plakaların fotoğrafını çekmek için bir dijital kamera kullanın. Görüntüleri bir bilgisayara aktarın ve görüntüleri metin protokolünde belirtildiği gibi analiz etmek için NIST'in entegre koloni numaralandırma yazılımını kullanın.