Name: Optimizasyon ve Kullanımı Agrobacterium aracılı Geçici Protein Üretimi Nicotiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-19T14:00:00.000+00:00
Duration: 23 min 21 s
Description: Öğrenin, Nicotiana bitkilerinde Agrobacterium vakum infiltrasyonu ile geçici rekombinant protein üretimini optimize etme yöntemini. Bu teknik, aşı antijenleri ve terapötik proteinler için ölçeklenebilir bir üretim sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma Moleküler Biyoteknoloji, Ibio, Inc ve Savunma İleri Araştırma Projeleri Ajansı (hibe # HDTRA1-07-C-0054) için Fraunhofer ABD Merkezi tarafından desteklenmiştir. Yazarlar Dr tarafından cömert hediyeler kabul. Biyolojik Bilimler Bölümü, Purdue Üniversitesi (Agrobacterium tumefaciens) ve Büyük Ölçekli Biyoloji Corp Wayne Fitzmaurice&#39;nin (N. excelsiana tohum) yanı sıra, ABD Nicotiana Koleksiyonu, North Carolina State University (N. yonga tohumlar Jennifer Nicholson Stanton Gelvin .) Yazarlar bitkiler ve mükemmel teknik yardım sağlamak için Margaret Shillingford ve Christopher Hull teşekkür ederim. Yazarlar ayrıca Dr teşekkür ederim. Editoryal yardım için Stephen Streatfield ve Natasha Kushnir.

1.. Bitki Yetiştirme Sonraki agroinfiltration için biz iki vahşi-tip Nicotiana türleri kapalı tesislerde taşyünü üzerine hydroponically yetiştirilen (N. benthamiana ve N. yonga) ve melez (N. excelsiana) değerlendirildi. <ol><li> Bir bitki gübre çözeltisine taşyünü döşeme bekletin. </li><li> Doğal tipte N. tohumları ekmek benthamiana, N. talaş ve N. besin excelsiana (N. excelsior × N. benthamiana&#39;nın melez) taşyünü yüzeyi ıslatılır. </li><li> Için kontrol edilen koşullar altında (24 ° C ve% 40-65 bağıl nem) altında tohumlardan bitkilerin ve (130-150 μE m aydınlatılması ile 14 saat ışık ve 10 saat karanlık, -2 sec-1) uzun bir gün değerindeki fotoperiod büyümek N. 4-5 hafta ve N. benthamiana excelsiana ve N. 5-6 hafta excelsior. </li></ol> Agroinfiltrat için Vektörlerin 2. İnşaatıiyon <ol><li> Influenza virüsü (HAC1) en A/California/04/2009 suşundan sentetik bir raportör geni (yeşil flüoresan protein [GFP]), tam uzunlukta hemagglutinin (HA) ekleyin ve yeniden tasarlanmış likenaz enzim (LicKM) 18 ayrı olarak içine başlatmak vektör pBID4-GFP, pBID4-HAC1 sırasıyla pBID4-LicKM, 18,32,41,47 elde etmek 18 (TMV-tabanlı vektör) pBID4. </li><li> A. elektro hücrelerine 10-50 GFP taşıma pBID4 arasında ng veya HAC1 tanıtılması A. elektro hücrelerine GV3101 ırkına ve LicKM tumefaciens turnefaciens gen MicroPulser elektroporatörü ile GV3101, C58C1, GLA4404, At06, AT10, At77 ve A4 suşları. </li><li> Aksi belirtilmedikçe, infiltrasyon deneyleri için dönüştürülmüş Agrobacteria&#39;yı kullanın. </li></ol> 3.. Nicotiana Bitkiler içine Agrobakterinin İnfiltrasyon Vakum <ol><li> A. büyüyecek tumefaciens LB ortamı, YEB Med (O / N), gece boyunca suşlarıamonyum ya da AB ortamı 200-250 rpm&#39;de çalkalanarak 28 ° C&#39;de Kanamisin 50 mg / L ile takviye edilmiştir. </li><li> 4.000 × LB veya YEB ya da AB yetiştirilen 0,5 veya santrifüj Agrobacterium hücreleri, 600 nm&#39;de bir optik yoğunluğa (600) için Milli-Q su içinde Agrobacteria&#39;yı seyreltin 4 ° C&#39;de 10 dakika boyunca g, 0.5 A 600 indüksiyon ortamına (1x MS tuzu, 10 mM MES, 200 uM asetosiringon,% 2 sukroz [MMA]) içinde yeniden askıya ve 1-3 için oda sıcaklığında karışmaya hr, aksi kaydetti. </li><li> Agrobacterium süspansiyonu içinde hava Nicotiana bitki dokuları daldırılması ve 30 ya da 60 saniye boyunca bir 50-400 mbar vakum uygulanarak bir vakum odası içinde bitkiler sızmak. Optimal infiltrasyon rutin olarak 60 saniye boyunca 50-100 mbar&#39;da uygulanır. </li><li> Vakum bozuldu sonra, vakum odasından bitkiler kaldırmak su içinde durulama ve önceden infiltrasyon büyüme için kullanılan aynı yetiştirme koşulları altında 5-7 gün için büyümeye. </li><li> Etkinliğini test etmek içinAgrobacterium vir geni, asetosiringon, farklı konsantrasyonlarda (0, 100, 200 ya da 400 uM) indükleyici kimyasal sızma tampon maddesi içinde süspansiyon haline getirildi Agrobacteria (1x MS, 10 mM MES,% 2 glukoz) çözeltisine ilave edildi. Vir geni, glukoz (0, 1, 2 veya% 4), farklı yüzdelerde indüksiyonu üzerinde monosakkaridin etki için nüfuz etme tampon maddesi (1x MS, 10 mM MES, 200 uM asetosiringon) içinde süspansiyon haline getirilmiş Agrobacterium ilave edildi. N. adım 3.3 ve 3.4), yukarıda belirtildiği gibi benthamiana bitkileri infiltre edilmiştir. </li><li> Agrobacterium laboratuar A 600 0.5. N&#39;ye Milli-Q su içinde seyreltilmiştir GV3101, C58C1 ve LBA4404 ve vahşi tip soyları A4, At06, AT10 ve At77 pBID4-LicKM vektörü barındıran suşları benthamiana bitkileri adımları 3.3 ve 3.4 &#39;de, yukarıda belirtildiği gibi, her bir suş ile infiltre edilmiştir. </li></ol> Viral susturma Bastırıcı boyunca 4. Co-agroinfiltration Prosedür <ol><li> Mix 01:01 de GFP geni ve domates çalılık büyümeyi durdurucu virüs (TBSV) viral susturma bastırıcı P19 taşıyan Milli-Q su içinde sulandırılmış GV3101 Agrobacterium kültürleri, 02:01, 03:01 ve 04:01 oranları. N. sızmak yukarıda tarif edildiği gibi benthamiana bitkileri. </li><li> N. sızmak İki Milli-Q su ile seyreltilmiş Agrobacterium GV3101 kültürlerin bir karışımı ile benthamiana bitkileri: pBID4-HAC1 plazmid taşıyan birinci ve susturma baskılayıcılar birini taşıyan ikinci - TBSV veya Citrus tristeza virüsü p23 p19, pCassp plazmide ( pCassp19) ve 35S promoteri oranının sırasıyla 04:01 (PGR-P23), altında PGR ikili plasmid içinde. </li></ol> 5. Western Blot Analizi <ol><li> N. rastgele yaprak örnekleri toplamak benthamiana, N. talaş veya N. excelsiana 4-7 dpi&#39;de bitki ve ince bir toz halinde sıvı azot içinde toz haline. </li><li> % 0.5 Triton 1x PBS tampon maddesinin üç sayılarınıX-100, her bir örnek için. </li><li> Yavaşça 4 ° C&#39;de 15 dakika boyunca sallayın ekstre örnekleri </li><li> 5 dakika için özü Spin ve temiz bir Eppendorf tüpüne toplam çözünür protein toplar. </li><li> 1x PBS ekstraksiyon tamponu içerisinde uygun bir seyreltme (1:100 01:50) ile özü seyreltilir ve 5 x numune tamponu (250 mM Tris-HCI [pH 6.8],% 10 SDS,% 0.5 bromofenol mavisi,% 50 gliserol ekleyin nihai konsantrasyon 1 x v / v, ve 500 mM DTT). </li><li> 5 dakika için kaynatılır örnekleri. </li><li> 10% SDS-PAGE ile ayrı proteinler, Immobilon-P Transfer membranı üzerine transfer ve% 0.5 I-blok ile bloke eder. </li><li> 1:5,000 da poliklonal tavşan anti-GFP antiserumu kullanarak HAC1 1 saat boyunca bloke etme çözeltisi içinde 1:1,000 de fare anti-poli-histidin GFP monoklonal antikor kullanılarak tespit eder. </li><li> Birincil Antikor etiketleme işleminden sonra, 10 dakika 1 x PBST-20 ile her biri için membranlar üç defa yıkamak ve 1:5,000 da konjüge-a turp peroksidaz (HRP) bağlı anti-tavşan antikoru ya da HRP-konjügatı ile inkübe1 GFP ve HAC1 tespiti için saat, sırasıyla 1:10,000 d anti-fare antikoru. </li><li> SuperSignal West Pico Chemiluminescent alt-tabakası kullanılarak Western blot işleyin. </li><li> Protein bant yoğunluğu analiz ve bant kalibre miktarda elde etmek GeneTools Yazılımını kullanın. </li></ol> Protein üretimi: (örnek kalibre miktarı x seyreltme) /, yüklü olan örnek miktarı) = 4 mg / kg x. Denklem: Protein üretimi (P), Kalibre miktar (C), numune (D) seyreltilmesi ve yüklenen Numune miktarı (S). 6.. Zimogramı Assay <ol><li> Toplayın pBID4-LicKM-sızmış N. benthamiana rasgele doku örnekleri alındı. </li><li> Western blot analizi için yukarıda tarif edilen ile aynı yöntem kullanılarak ekstrakte proteinleri ve daha sonra% 0.1 lichenan 10% SDS-PAGE ile analiz jeller dahildir. </li><li> Elektroforezisten sonra, 100 mM Tris-HCI [pH 8.0] ve% 0.1 Triton X (yıkama tampon maddesi içinde 10 dakika her biri için köpükler iki kez yıkayın-100) Ve daha sonra 1 saat boyunca 65 ° C &#39;de yıkama tamponu içinde inkübe edilir. </li><li> İnkübasyondan sonra, yıkama tamponu atmak ve oda sıcaklığında 5 dakika boyunca% 0.5 Congo kırmızısı ile jeller leke. </li><li> 10 dakika her biri için Milli-Q su içinde köpükler üç kez yıkayın ve likenaz aktivitesi görselleştirmek için 1 M NaCI ekleyin. Saflaştırılmış protein bakteriyel likenaz enzim aktivitesi için bir pozitif kontrol olarak kullanıldı. </li></ol> 7. GFP Görüntüleme <ol><li> Bir elle tutulan uzun dalga boylu bir UV lambası kullanılarak bütün geçici olarak transforme edilmiş bitkilerde GFP floresans algılama görsel yapın. </li><li> Fotoğraf geçici bir Sarı 8 üzerinden bir dijital kamera ile bitkiler dönüştürülmüş, 52 filtresi (pozlama süresi 15 saniye) ES. </li><li> Western Blot görüntüleri elde edilir bir GeneGnome üzerinde GeneSnap yazılımı kullanarak saflaştınldı ve GFP standardına dayalı bir kalibrasyon eğrisi ile, GeneTools yazılımını kullanarak analiz sonuçlarını ölçmek. </li><li> Purifi göre bir kalibrasyon eğrisi kullanılarak HAC1 proteinini ölçmekİnfluenza virüsünün A/Indonesia/05/05 gerginlik ed HAC standart protein. </li><li> 3-4 ortalama değerlerini hesapla Tüm deneyler için çoğaltır. </li></ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Bu çalışmada, fırlatma vektörünü taşıyan Agrobacterium suşları kullanılarak seçilebilir Nicotiana türlerinde rutin geçici protein üretimi için basit bir protokol agroinfiltration geliştirdik. Buna ek olarak, bizim geçici bir bitki ekspresyon sisteminde en yüksek bir araya getiren protein üretim seviyesini elde etmek için uygun koşullar belirledik. Seyreltilmiş A. Vakum infiltrasyon N. içine fırlatma vektör pBID4 barındıran GV3101 ırkına tumefaciens benthamiana, N. excelsiana ve N. talaş gibi Alfalfa mozaik virüsü barındıran GV3101 ile infiltre Pisum sativum gibi diğer bitki türlerine göre 7 dpi olan hedef protein üretiminin yüksek seviyeleri ile sonuçlanmıştır - ya da salatalık mozaik 35S promotörün kontrolü altında GFP raportör geni ifade virüsü-esaslı vektörler 41 ya da Lactuca sativa, Solanum LyCOA suşu C58C1 ile infiltre persicum ve Arabidopsis thaliana beta-glukuronidaz raportör geni 57. N. taşıma tumefaciens ve N. benthamiana excelsiana% 90-95 sızma verimliliği ile, 30-60 saniye boyunca 50 mbar&#39;daki sızmak vakum kolay oldu. Yaprak alanının geri kalan% 5-10, çünkü vakum uygulanması sırasında Agrobacterium süspansiyonu yüzeyinde yaprakların bir yüzer infiltre edilmiş değildi. Fırlatma vektör hücreden hücreye hareket 18 için yeteneğine sahip olduğu için, geçici protein birikimi 7 dpi&#39;de tüm yaprak hem de yaprak sapı oluşur. PBID4 ekspresyon vektörü hücreden hücreye hareket edebilmektedir, ancak, sistemik 18 taşımak için değil, çünkü 10 dpi anda, tahmin edilen GFP üretim biraz daha düşük olmuştur; Bu nedenle, yeni çıkan yaprak vektörü içermeyen ve hedef üretimine katkıda bulunmazlar. Buna ek olarak, yeniden birleştirici proteinin bozulması fazla zaman mBugün 10 dpi düşük protein seviyesine katkıda bulunur. Bizim sonuçlar A&#39;nmkidir infiltrasyon N. geçici protein üretiminin turnefaciens gerginlik GV3101 aracılı yüksek seviyede benthamina. Bundan başka, hedef proteini likenaz için N-terminal, C-terminal veya iç füzyonları (LicKM), β-1 ,3-1 ,4-glukanaz Clostridium thermocellum bir termostabil enzim ve birçok hedef için termostabilite kazandıran olarak tasarlanmış olabilir protein füzyon 18. N. Sızma A ile benthamiana yaprak kıvrılma, yaprak sapı uzama, ve saç: hafif ya da ciddi semptomlar ortaya çıkar genini barındıran vahşi tip suşu (AT6, AT10 ve at77) tumefaciens. Patolojik semptomlar N gözlendi Bazı genler GV3101 suşları pBID4 içine yerleştirilir ve laboratuvara dönüşmüş ise benthamina, boş pBID4 vektörü barındıran laboratuvar GV3101 ırkına ile sızmış, C58C1 veya LBA4404&#39;tü hafif nekrotik yanıtları ve yaprak elicitedkloroz / yaprakların infiltre bölgelerinde semptomları sararma. Vahşi tip Agrobacterium veya solanaceous bitkilerde devreden suşlarının neden olduğu nekrotik semptomlar daha önce 56,57 bildirilmiştir. Nekrotik tepki tip III sekresyon sisteminde, Tip IV salgı sistemi ile bitki hücresine aktarılır bakteriyel proteinler ve / ya da flagellin&#39;in 58-60 duyarlılık hastalık oluşturma faktörlerinin neden olabilir. Bu heterolog proteinlerin üretimi de geçici patojenik ortaya çıkarabilir ve infiltre bitkide, hipersensitif bir cevap bırakır bulduk. Birçok araştırmacı, dengeli bir şekilde dönüştürülmüş bitkiler 28,57 ile karşılaştırıldığında geçici protein üretiminin 5-20 kat daha yüksek seviyelere kadar üretilen bitki ikili vektörleri ile, farklı bitki türleri bu agroinfiltration bildirdi. Bizim veri gösteriyor ki N. benthamiana GV3101 için bildirilen GFP verim benzer bir GFP arasında pBID4-GFP geçici olarak ifade edilen yüksek düzeyde barındıran ile infiltreN. benthamiana Agrobacteria&#39;ı PiCh-GFPSYS viral vektör (toplam çözünen proteinin% 80) 44 taşıma ile sızmış. Bizim başlatmak vektörü kullanılarak Agroinfiltration termo protein LicKM yüksek üretimi ile sonuçlanmıştır, standart bir ikili plasmid 18 ile gözlenenden daha yüksek, 50-kat. A. enfeksiyon test etmek için turnefaciens ve fırlatma vektör istikrar, N. biri düz sızmış benthamiana pBID4-GFP plazmid GV3101 aynı Milli-Q su ile seyreltilmiş kültür kullanılarak 8 saat boyunca her saat. Bizim veri GV3101 gerginlik verimli, en az 8 saat ve pBID4 (başlatma vektörü) için enfektif olduğunu gösterdi 8 saat süren infiltrasyonu sırasında çok kararlı. -80 ° C&#39;de saklanır fırlatma vektör pBID4-HAC1 (hücre bankası) barındıran GV3101 soyunun gliserol stoku geçici prote değişiklik olmadan üç yıl boyunca çok stabil olduğu gösterilmiştirSüzülmüş bitkilerin üretimde. Optimal koşullar ve 35 ile 42 gün sonra ekim altında yetiştirilir N. benthamiana bitkiler vakum infiltrasyon dolayımlı geçici gen ifadesi 40 için uygun olmuştur. (3-4 haftalık), genç bitkiler için hücre süspansiyonu yüzey ve bir vakum uygulanarak mekanik etkilerinden doku hasarı üzerinde yüzen yaprak tamamen nüfuz edilemez. 45 gün, N. daha büyük tesislerde benthamiana kullanılan en iyi ışık koşulları altında, aşama vidalama, geçici ekspresyon seviyesi düşüktür. Düşük molekül ağırlıklı bileşikler, fenolik (asetosiringon) ve monosaccharaides (glikoz) 55,61 tumefaciens A&#39;da vir genlerin neden olduğu bilinmektedir. Ayrıca, N. infiltrasyonu 50-600 uM konsantrasyonlarda asetosiringon varlığında, ikili vektör pCAMBIA (GFP) ile benthamiana hafif geçici artış gösterildiGen ekspresyonu 40. Biz 3 saat MMA pBID4-GFP barındıran GV3101 kültürlere bu bileşikleri ekleyerek sisteme acetosyringone ve glikozun farklı konsantrasyonlarının etkisi okudu ve GFP hiçbir fark bulunamadı. İlginç bir şekilde, pBID4-GFP barındıran ve 0.5 &#39;lik bir A 600 için Milli-Q su içinde seyreltildi ve vir gen indüksiyonu olmadan nüfuz GV3101 kültürler neden kültürleri ile infiltre gibi GFP ile aynı miktarda ifade edilmiştir. A. tumefaciens vir gen (ler), potansiyel bitki fenolik bileşikler (asetosiringon ve sinapinik asit) ve yaprak dokusunda mevcut bitki monosaccharaides (glikoz ve fruktoz) neden olabilir. Bu nedenle, eksojen vir geninin indükleyicilerin varlığında veya yokluğunda, GFP ifade benzer düzeylerde bitki hücrelerinde GFP-ifade başlatmak vektörün çoğaltma sırasında mevcut sitoplazmik vir geninin indükleyicilerin etkisinin bir sonucu olabilir spekülasyon. N. benthamiana geçici protein üretimi için bir model 49 ana olarak kullanılmıştır. Bununla birlikte, N. benthamiana &#39;in nispeten düşük biyokütle verim rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimi için bir uygulama engellemektedir. Optimum ana geçici, yüksek bir ifade seviyesi, serada kolay büyüme birleştirmek ve Agrobacterium infiltrasyon 2 duyarlı olmalıdır. Alternatif bir ana seçmek için, bir melez incelemeleri Nicotiana&#39;da (N. benthamiana ve N. Excelsior), iki farklı vahşi-tip türler sızmış ve A. ile excelsiana (N. excelsior × N. benthamiana) pBID4-GFP plazmid GV3101 ırkına tumefaciens. Bu üç tür arasında, GFP ekspresyon düzeyinin N. biraz daha yüksekti benthamina. N. talaş bitkiler, kendi kösele yapraklara vakum agroinfiltration güçlüğü gösterdi ve N. excelsianaüretilen, yaklaşık olarak aynı yetiştirme koşulları altında daha fazla biyo-kütle, iki kat. 7 dpi GFP geçici üretim N. nispeten benzer ve N. benthamiana excelsiana. Bu nedenle, N. excelsiana yeniden birleştirici protein üretimi için daha uygun bir ev sahibi olabilir. Agrobacterium-aracılı geçici protein üretim geni bitki virüsü kökenli 62 bastırıcıları susturma ko-ekspresyonu ile aşılabilir PTGS 26 ile sınırlıdır. Geçici protein üretimi yukarıda infiltre dokularda 34&#39;te PTGS inhibe TBSV of p19 proteini varlığında, 50-kat artırılabilir gösterilmiştir. Çalışmamızda, biz ayrı lansman vektörü pBID4-HAC1 ile birlikte sızmış iki viral susturulması bastırıcılarının (p19 ve p23) etkisi değerlendirildi. Bu susturma bastırıcılarının ko-infiltrasyon HAC1 sadece hafif bir artış ile, HAC1 geçici ekspresyonu üzerinde çok az etkiye sahip görünüyorduco-infiltre p23 ya da p19 varlığında protein birikimi (% 15-25). Pozitif protein üretimini etkiler için, susturma bastırıcılar, özellikle hedeflenen bitki türleri ve viral vektör 63 için geçerli olmak üzere seçilebilir gerekebilir. TMV RNA helikaz susturma aktivitesi 64,65 arasında bir bastırma sahiptir. PBID4-HAC1 ile p23 veya p19&#39;un ko-infiltrasyonu GFP hiçbir artış ya da geçici HAC1 protein üretiminde hafif bir artışa neden olduğu gibi, bizim veri bu gözlemi doğrulamaktadır. Sonuç olarak, değiştirilebilir ve optimize edilmiş bitki ve Agrobacterium büyüme koşulları ve vakum infiltrasyon verimliliğini iyileştirilmiştir. Bu teknoloji bir kaç saat içinde bitki materyali yüzlerce kilogram büyümek ve sızmak için bize sağladı. Biz başarıyla geçerli İyi Üretim Uygulamaları (cGMP) koşullar altında endüstriyel ölçeklerde yüksek verimli aşı üretimi için tesis geçici ifade tekniği otomatik. Abo Daha fazla bilgi içinut otomasyonu ve cGMP koşullar altında alt-birim aşı adayları da dahil olmak üzere yeniden birleştirici proteinlerin üretimi için bitki geçici protein üretim sisteminin kullanımı, okuyucu web olarak adlandırılır <a href="http://fhcmb.org/">www.fhcmb.org/</a> .

Bitkiler şimdi heterolog rekombinant biyofarmasötikler ve endüstriyel proteinleri 1-3 üretmek için güvenli, güvenilir, ölçeklenebilir ve ucuz platformu olarak tanınan ve mikrobiyal ve hayvan hücre ekspresyon sistemleri üzerinde 4 önemli avantajlara sahiptir. Bitkiler monte Multimerik antikorlar 5-7 gibi translasyon sonrası modifikasyonlar, düzgün katlanmış proteinleri ifade edebiliyoruz. Çeşitli bitkisel kaynaklı rekombinant ilaç proteinlerinin klinik değerlendirme 8. geçiyor. Bu non-Hodgkin lenfoma 9, hemagglutinin bazlı pandemik ve mevsimsel influenza aşısı adayları 10,11 (Cummings ve diğerleri., Vaccine sunulan), anti-yüzey antijen Streptococcus I tedavisi için hastaya özgü rekombinant idiotip aşılar (scFv) gibi / diş çürüklerinin tedavisi 12, 13 ve diyabet tedavisi için insan insülini için II antikor. Bundan başka, insan recoGaucher hastalığında enzim replasman tedavisi için mbinant glikoserebrosidaz İsrail ve ABD&#39;de onaylandı ve ABD 14,15 dışındaki Genişletilmiş Erişim Programı kapsamında sağlanır. Heterolog proteinlerin kararlı şekilde dönüştürülmüş (Transjenik veya transplastomik) ya da geçici olarak transforme edilmiş bitkilerde üretilebilir. Geçici protein ifadesi ve üretimi birikimi 16 elde etmek için kısa bir zaman dilimi içeren transjenik bitkilerde, üretim üzerinde çeşitli avantajlar sunar ve bitki dokuları 4 içine bakteri ikili vektörler ya da rekombinant bitki viral vektörleri sokulması ile elde edilebilir. En gelişmiş geçici ekspresyon sistemi, bitki virüsleri ve ikili plazmid bileşenlere ve agroinfiltration 17,18 tarafından teslim &#39;başlatmak vektörleri&#39; kullanımına dayanmaktadır. Tütün mozaik virüsü (TMV) dayalı bir fırlatma vektör Agroinfiltration başarıyla laboratuvarda uygulandı, insan papilloma virüsü 19, Yersinia pestis 20 gibi patojenlere karşı aşı antijenlerinin üretilmesi için büyütülebilir, influenza A 21,22, Bacillus anthracis 23 virüs ve N. çiçek hastalığı virüsü 24 benthamiana yaprak. Agrobacterium aracılı geçici sentezleme aynı zamanda birden fazla protein 2,25-27 eş zamanlı üretimi için gelecek vaat eden bir yöntemdir. Örneğin, bitki, geçici ifade sistemleri, tümör spesifik rekombinant antikor 28,29, epidermal büyüme faktörü reseptörü 30 karşı glikosile edilmiş bir rekombinant antikor ve şarbon koruyucu bir antijen 31,32 için özel bir monoklonal antikor üretmek için kullanılmıştır. Bir hedef genin ve gelişmiş hedef protein ekspresyonu 33,34 gen susturma sonuç süpresör Nicotiana benthamiana bitkilerinin Co-infiltrasyonu. Agroinfiltration düzgün Introdu için yaygın bir yöntemdirbitkiye ilgi konusu bir geni barındıran cing bakteriler 35-37 dokular. Bozulmamış bitki içinde geçici gen ekspresyonu yaprak için Agrobacterium vakum infiltrasyonu transgenik bitkiler 38-41 oluşturmak için gerek kalmadan yabancı proteinlerin üretimi için hızlı, ölçeklenebilir ve kullanışlı bir yöntemdir. Vakum agroinfiltration sırasında, bitkiler baş aşağı çevirdi ve üstü kısımları Agrobacterium süspansiyon batık. Daha sonra vakum gazlar stoma yoluyla yaprak arası boşluklarından tahliye neden uygulanır. Yaprak içine Agrobacterium süspansiyonunun infüzyon vakum sonuç hızlı yeniden basınçlandırma aşağıdaki serbest bırakma. Agrobacteria&#39;nın vakum infiltrasyonu sonra, bitkiler yetiştirilir ve hedef ekspresyon izlenir. Hedef en yüksek ifade seviyeleri tipik olarak 2-3 gün sonra ekspresyon seviyesi tipik olarak azaltarak üzerine bir başlangıç ​​vektörü ile bir ikili vektör ve 4-7 dpi ile infiltrasyon (dpi) sonrası gözlenenses 17,18,42-45. Agrobacterium tumefaciens protein üretimi için bir bitkiye ilgi konusu bir genin sağlanması için en yaygın olarak kullanılan bir araçtır. Agroinfiltration N. derece iyi çalıştığını benthamiana ama nispeten zayıf Arabidopsis thaliana 46 de dahil olmak üzere pek çok diğer bitkiler içinde. Bu çalışmada, 5-6 haftalık N geçici protein üretimi için basit, etkin ve ekonomik bir yöntem geliştirdi benthamiana A kullanılarak infiltrasyonu Tumefaciens. Agroinfiltration tekniğin endüstriyel ölçekleme en büyük dezavantajı &#39;hasat bakteri ve 4&#39;-hidroksi-3 ihtiva eden bir ortam içinde bakteri pelet yeniden süspansiyon santrifüj olup, 5&#39;-dimetoksiasetofenon (asetosiringon), monosakkaritler, ve 2 - (N-morfolino) -etansülfonik asit (MES) vir genlerinin indüksiyonu için tampon. Biz Agrobakteriyi optimize ederek bu sorunların üstesinden gelmek mümkün olmuştur </em&gt; AB ortamı (minimal ortamı) içinde büyüme doğrudan Milli-Q su içinde ve infiltrasyon süresini ve koşullarının kontrol ile inceltilir. Ayrıca vahşi tipli tütün ana türleri N. hedef protein üretimini karşılaştırmıştır ve N. benthamiana Excelsior, hem de melez N. excelsiana.

<table><tbody><tr><td>Nicotiana benthamiana</td><td>Tütün Germplazm Koleksiyonu, Mahsul Bilimi Bölümü, Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi</td><td>PI 555478 TW16</td><td>Sızma</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsior</td><td>Tütün Germplazm Koleksiyonu, Mahsul Bilimi Bölümü, Kuzey Carolina Eyalet Üniversitesi</td><td>PI 555685 TW47</td><td>Sızma</td></tr><tr><td>Nicotiana excelsiana</td><td>Dr. Wayne Fitzmaurice, Büyük Ölçekli Biyoloji Şirketi, Vacaville, CA</td><td>LSBC EBA 042304.02</td><td>Sızma</td></tr><tr><td>Vakumlu kızak</td><td>Abbas, Ashland, MA</td><td>Özel yapım</td><td>Bitki sızması</td></tr><tr><td>Rockwool</td><td>Grodan Inc., Ontario, Kanada</td><td>AO 50/40</td><td>Bitki yetiştirmek için hidroponik ortam</td></tr><tr><td>2- ( N -Morpholino) etansülfonik asit</td><td>Acros Organics, Thermo Fisher Scientific, NJ</td><td>172595000</td><td>Tampon</td></tr><tr><td>Murashige & Skoog tuzu (MS tuzu)</td><td>Fito Teknoloji Laboratuvarı</td><td>M524</td><td>Doku kültürü ortamı</td></tr><tr><td>Asetosiringon</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>D134406-5G</td><td>Agrobacterium indüksiyon</td></tr><tr><td>İmmobilon-P transfer membranı</td><td>Millipore, Billerica, MA</td><td>IPVH00010</td><td>Batı blotlama</td></tr><tr><td>I-blok</td><td>Uygulamalı Biyosistemler, Foster City, CA</td><td>T2015</td><td>Batı böpleme</td></tr><tr><td>Tavşan poliklonal anti-GFP antiserum&nbsp;</td><td>Washington Biyoteknoloji, Baltimore, MD</td><td></td><td>Batı lekeleme</td></tr><tr><td>Fare anti&ndash; poli-histidin monoklonal antikoru</td><td>Qiagen GmbH, Hilden</td><td>34670</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz konjuge anti-tavşan antikoru&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>111-035-003</td><td>Batı lekeleme</td></tr><tr><td>Yaban turpu peroksidaz konjuge anti-fare antikoru</td><td>Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA</td><td>115-035-003</td><td>Batı blotting</td></tr><tr><td>SuperSignal&reg; West Pico kemilüminesan substrat</td><td>Thermo Scientific Pierce, Rockford, IL</td><td>34078</td><td>Batı lekeleme</td></tr><tr><td>Lichenan (1-3: 1-4-beta-D-glukan)</td> <td>Megazyme, Bray, Co. Wicklow, İrlanda</td><td>P-LICHN</td><td>Likenaz Aktivitesi</td></tr><tr><td>Kongo Kırmızı&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO</td><td>C6277</td><td>Jel boyama</td></tr><tr><td>Dijital kamera&nbsp;</td><td>Olympus, Center Valley, PA</td><td>C-8080</td><td>Kemilüminesans görüntüleme</td></tr><tr><td>GeneGnome</td><td>Syngene, Frederick, MD</td><td></td><td>Kemilüminesans görüntüleme&nbsp;</td></tr><tr><td>GFP standardı&nbsp;</td><td>Evde</td><td></td> yapılan <td>Kemilüminesans görüntüleme&nbsp;</td></tr><tr><td>Bitki gübre çözeltisi</td><td>Griffin Sera Fidanlık Malzemeleri, Newark, DE</td><td>67-23-20</td><td>Bitki yetiştirme</td></tr><tr><td>Likenaz Standardı</td><td>Evde</td><td></td> saflaştırılmış <td>Western blotting</td></tr><tr><td>MicroPulser Elektroporatör</td><td>BioRad, Hercules, CA</td><td>165-2100</td><td>Agrobacterium transformasyonu &nbsp;</td></tr></tbody></table>

optimizasyon ve kullanımı<em&gt; agrobacterium</emin&gt; aracılı geçici protein Üretimi<em&gt; nicotiana</em

Optimization and Utilization of Agrobacterium-mediated Transient Protein Production in Nicotiana

Bitkilerde Agrobacterium aracılı geçici protein üretim kısa bir süre içinde aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için umut verici bir yaklaşımdır. Ancak, bu teknoloji sadece şimdi üstesinden ediliyor büyütmek için büyük ölçekli üretim gibi birçok teknolojik engellerin uygulanacak başlıyor. Burada, Agrobacteria başlatmak vektörleri taşıyan Nicotiana bitkiler vakum infiltrasyon göre endüstriyel ölçekli geçici protein üretimi için basit ve tekrarlanabilir bir yöntem ortaya koymaktadır. AB ortamı içinde Agrobacterium yetiştirme optimizasyonu sızma sürecinin basitleştirilmesi, Milli-Q su içinde bakteri kültürüne doğrudan seyreltme sağlar. Nicotiana, N., üç test edilmiş türler arasında, excelsiana (N. excelsior × N. benthamiana) nedeniyle sızma kolaylığı en umut verici ev sahibi olarak seçildi, yüksek muhabiri protein üretimi düzeyi, ve yaklaşık iki-fkontrol edilen çevre koşulları altında eski yüksek biyokütle üretimi. Agrobacterium örneğin asetosiringon ve monosakkarit gibi kimyasal madde kullanarak pBID4-GFP (Tütün mozaik virüsü-esaslı) barındıran indüksiyonu protein üretim seviyesi üzerinde herhangi bir etkisi olmamıştır. 30 ya da 60 saniye için 50-100 mbar altında infiltratif bitki bitki yaprak dokularının yaklaşık% 95 infiltrasyonu ile sonuçlanmıştır. Agrobacterium GV3101 ırkına laboratuar ile infiltrasyon Agrobacteria laboratuar suşları ve LBA4404 C58C1 ve vahşi tip Agrobacteria at77 ve A4, AT10, AT6 suşları ile karşılaştırıldığında en yüksek protein üretimi göstermiştir. N. bir viral RNA susturma bastırıcı, p23 ya da p19, ve Co-sentezleme benthamiana hedef proteinin (influenza virüsü hemaglutinin) önceki birikimi ve üretim artışı (% 15-25) ile sonuçlanmıştır.

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Optimizasyon ve Kullanımı<em&gt; Agrobacterium</emIn&gt; aracılı Geçici Protein Üretimi<em&gt; Nicotiana</em

Agrobacterium-mediated transient protein production in plants is a promising approach to produce vaccine antigens and therapeutic proteins within a short ...

Bu prosedürün genel amacı, agro infiltrasyon tekniği kullanılarak bitki tabanlı bir sistemde geçici rekombinant protein üretimi için basit, verimli ve ölçeklenebilir bir yöntem geliştirmektir. Bu, öncelikle bitki büyüme koşullarının optimize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, agrobacterium'un bitki virüsü bileşenlerini ve binary plazmitleri birleştiren launch vektörleri ile transforme edilmesi ve ardından transforme edilmiş agrobacterium'un agro deneylerinde kullanılmak üzere kültüre edilmesiyle tamamlanır.Agrobacterium infiltrasyonu sırasında, bitkiler ters çevrilir ve havada kalan kısımları bir agrobacterium süspansiyonuna daldırılır. Ardından, yaprak dokularındaki hücreler arası boşluklardan havanın tahliye edilmesini sağlayan bir vakum uygulanır. Vakumun serbest bırakılmasını takiben gerçekleşen hızlı yeniden basınçlandırma, agrobacterium süspansiyonunun yapraklara infüzyonuna yol açar.Nihayetinde, infiltre edilen bitkilerdeki rekombinant protein üretimini göstermek için immunoblotlama ve floresans analizleri kullanılır. Bu tekniğin manuel infiltrasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, vakum infiltrasyon yönteminin aşılar ve terapötik proteinler dahil olmak üzere rekombinant proteinlerin endüstriyel üretimi için ölçeklendirilebilir olmasıdır. Bu yöntem, bitki biyoteknolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve bitkilerin ticari rekombinant protein üretimi için alternatif bir platform olarak kullanımını daha da kolaylaştırabilir.Toprakta yetişen bitkilerde agrofiltrasyonun ölçeğini büyütmenin zor olduğunu fark ettiğimizde bu yöntem için ilk fikri geliştirdik. Birkaç nedenden dolayı toprak; virüsler, bakteriler ve nematodlar gibi unsurlar içerir; ayrıca toprak içeriği ve sulama suyu partiden partiye ve mevsimden mevsime farklılık gösterir ve toprak depolama sırasında zamanla bozulur. Dahası, toprakta yetişen bitkilerin ters çevrilmesi, infiltrasyon sırasında agrobacterium kültürüne istenmeyen toprak damlamalarına yol açabilirdi.Bu prosedürü, bitki biyolojisi ve mühendislik laboratuvarından kıdemli araştırma asistanı Rebecca Snow ile laboratuvarımdan araştırma asistanları olan Emma Gut Robin Lobe ve Adam Trevor gerçekleştirecekler. Bu çalışma, bitki büyümesinin tekdüzeliğini sağlamak ve bitki yetiştirme için toprak kullanımına bağlı karmaşıklıkları ortadan kaldırmak amacıyla hidroponik bitki büyüme ortamı ve besin çözeltisi kullanmaktadır.Bu prosedüre başlamak için, kaya yünü plakalarını beş dakika boyunca bitki gübresi çözeltisinde bekletin ve tohumları, besin emdirilmiş kaya yünü yüzeyine manuel olarak ekin. Bu çalışmada Cedar üç Nico Oceana türü değerlendirilecektir: iki yabani tür olan Nico Oceana, Benham Ana ve Nico Oceana Excelsior ile Benham, Ana ve Excelsior'un hibriti olan Nico Oceana Excela. Tohumlardan çıkan bitkileri, kontrollü koşullar altında ve uzun gün fotoperiyodunda, hidroponik kaskad sisteminde yetiştirin.Nico Oceana, Bentham Miana ve Nico Oceana Excela için dört ila beş hafta, Nico Oceana Excelsior için ise beş ila altı hafta. Bu deneyde kullanılan Agrobacterium tumor Fasion suşları, beraberindeki makalede açıklandığı üzere uygun taşıyıcı vektörlerle transforme edilmiştir. Bu demonstrasyon amacıyla beş farklı transforme agrobacterium suşu kullanılmıştır.Reporter yeşil floresan protein (GFP) geni taşıyan GV 3 1 0 1, domates çalı yanıklığı virüsü P 19 susturma baskılayıcı viral genini taşıyan GV 3 1 0 1 ve modifiye liyaz veya lick KM taşıyıcı protein genini taşıyan T 10 GV 3 1 0 1 agrobacterium suşlarını, litre başına 50 mg kanamisin eklenmiş LB ortamında, 28 °C'de 200 ila 250 RPM sarsıntıyla gece boyunca büyütün. Ertesi gün, geçici protein üretimi için birden fazla agrobacterium suşu kullanmanın fizibilitesini incelemek amacıyla istenen deneyler için agrobacterium süspansiyonlarını hazırlayın; PBI dört lick km vektörünü barındıran bir laboratuvar suşu ve iki yaban tipi suşu, milli Q su ile 600 nm'de 0,5 optik yoğunluğa gelecek şekilde seyreltin.İnfiltrasyon öncesinde agrobacterium virülans genlerini indüklemenin gerekliliğini araştırmak için, öncelikle LB ortamında büyütülen P bid 4G FP vektörü taşıyan agrobacterium kültürlerini 4 °C'de 10 dakika boyunca 4,000 ×g'de santrifüjleyin. Ardından, 600 nanometrede 0,5 optik yoğunluğa ulaşana kadar MMA indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca karıştırın; asetil konun geçici protein üretimini artırıp artırmadığını test etmek için, LB ortamında gece boyunca büyütülen PBI 4G FP vektörü taşıyan bir agrobacterium kültürünü santrifüjleyin ve 1X ms tuzu, 10 millimolar MES ve %2 glikoz içeren infiltrasyon tamponunda yeniden süspanse edin.Hücre süspansiyonunu dört kaba bölün. Her bir agrobacterium süspansiyonuna farklı konsantrasyonlarda aseto kon ekleyin ve oda sıcaklığında üç saat boyunca inkübe edin. Viral bir susturma baskılayıcısının ko-infiltrasyonunun geçici GFP protein üretimi üzerindeki etkisini test etmek için karıştırın.GFP geni taşıyan, milli-Q su ile seyreltilmiş agrobacterium kültürü ile viral susturma baskılayıcı P19 taşıyan kültürün dörtte bir oranında karıştırılması, bitkilerin vakum infiltrasyon işlemi sırasında gösterilecektir. Bitkileri vakumla infiltre etmek için vakum basıncının ve infiltrasyon süresinin kontrol edilmesi kritik öneme sahiptir. İlk olarak, hazırlanan agrobacterium süspansiyonunu vakum odasının içindeki bir kaba aktarın.Ardından bitkiyi seyreltilmiş agrobacterium içinde ters çevirin ve 30 veya 60 saniye boyunca 50 ila 400 milibar vakum uygulayın. Optimal infiltrasyon rutin olarak 60 saniye boyunca 50 ila 100 milibar arasında uygulanır. Vakum kaldırıldıktan sonra bitkileri vakum odasından çıkarın, suyla durulayın ve ön filtrasyon büyümesinde kullanılan aynı büyüme koşulları altında beş ila yedi gün boyunca büyütün.Western analizi için numuneler hazırlamak amacıyla, öncelikle infiltrasyondan dört ila yedi gün sonra (DPI), Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior veya Nico Oceana Excela bitkilerinden rastgele yaprak örnekleri toplayın ve yaprak numunelerini sıvı azot içerisinde ince bir toz haline gelene kadar pulverize edin. Her numuneye, %0,5 Triton X 100 içeren bir hacmin üç katı kadar 1X PBS tamponu ekleyin ve numuneyi bir eppendorf tüpüne aktarın. Ekstraksiyon yapılan numuneleri, 4 °C'de 15 dakika boyunca hafifçe sallayın veya rotasyona tabi tutun.Ekstraktı beş dakika boyunca santrifüjleyin ve toplam çözünür proteini temiz bir einor tüpüne toplayın. Ekstraktları 1X PBS ekstraksiyon tamponu ile uygun bir dilüsyona seyreltin ve final konsantrasyonu 1X olacak şekilde 5X örnek tamponu ekleyin. Proteinleri SDS-PAGE ile ayırmadan önce örnekleri beş dakika boyunca kaynatın.Proteinler hareketsiz bir P transfer membranına aktarıldıktan sonra, bloklama solüsyonu içerisinde 1:5.000 oranında seyreltilmiş tavşan poliklonal anti GFP antiserumu kullanılarak GFP tespiti yapılır. Membranlar 1X PBST 20 ile üç kez yıkandıktan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallanarak inkübe edilir. GFP tespiti için, 1:5.000 oranında seyreltilmiş horseradish peroksidaz konjuge anti-tavşan antikor ile bir saat boyunca inkübe edilir.Ardından, western blotlar işlenir ve proteinlere karşılık gelen bant yoğunlukları beraberindeki makalede açıklandığı şekilde analiz edilir. Geçici olarak transforme edilmiş tüm bitkilerde GFP floresansının görsel tespiti, el tipi uzun dalga boylu bir UV lamba kullanılarak gerçekleştirilir; geçici olarak transforme edilmiş bitkileri sarı sekiz ES 52 filtresi üzerinden fotoğraflamak için bir dijital kamera ve 15 saniyelik bir pozlama süresi kullanın. Western blot analizlerinden görüntüleri, bir genom üzerindeki gene snapped yazılımını kullanarak elde edin.Sonuçları, saflaştırılmış bir GFP standardına dayalı bir kalibrasyon eğrisi ile gen aracı yazılımını kullanarak nicelleştirin; bitki büyümesi ve biyokütle birikimi için optimal koşulları belirlemek amacıyla Nick Oceana Bentham Miana, ticari olarak satılan gübrelerle ıslatılmış Rockwell plakalarında yetiştirilmiştir. Fosforun varlığı, %4,8 fosfor içeren bir gübre çözeltisinde veya %0 fosfor içeren bir gübre çözeltisinde büyüyen bu altı haftalık bitkilerin gösterdiği üzere, NICO Oceana Bentham tohumlarının çimlenmesi ve büyümesi için kritiktir.Agrobacterium büyüme ve infiltrasyon ortamlarının bitki sağlığı ve protein üretimi üzerindeki etkileri, Nicotiana hamana bitkilerindeki GFP üretimi karşılaştırılarak incelenmiştir. Bitkilere, üç farklı ortamda büyütülen agrobacterium kültürleri içeren PBI 4G FP ile vakum infiltrasyonu uygulanmıştır. YEB veya LB ortamlarında gece boyunca büyütülen YEB, AB ve LB kültürleri düşük hızda santrifüjlenip MMA indüksiyon ortamında yeniden süspande edilmiş veya YEB, LB veya AB ortamlarında gece boyunca büyütüldükten sonra, Milli Q su ile bir e beşe veya bir e ona doğrudan seyreltilmiştir; bu western blot sonucunda gösterildiği üzere, YEB, LB veya AB ortamlarında büyütülen ve Milli Q su ile seyreltilen agrobacterium kültürleri ile infiltre edilen bitkiler, santrifüjlenip MMA içinde yeniden süspande edilen kültürlere kıyasla ortalama GFP üretiminde anlamlı bir fark göstermemiştir.Bu nedenle, bitki infiltrasyonu için agrobacterium kültürlerini seyreltmek amacıyla milli Q su kullanılması önerilmektedir ve sonraki deneylerde 600 nanometrede 0,5 optik yoğunluğa ulaşmak için rutin olarak kullanılmıştır. Ardından, agrobacterium hücre süspansiyon yoğunluğunun ve zaman seyrinin hedef ekspresyon üzerindeki etkileri incelenmiştir. PBI 4G FP taşıyan agrobacterium'un dört farklı hücre süspansiyon yoğunluğu değerlendirilmiş ve yaprak örnekleri, western blot analizi için infiltrasyondan sonraki dördüncü, yedinci ve 10. günlerde (DPI) toplanmıştır; 4. DPI'da, farklı agrobacterium hücre süspansiyon yoğunluklarıyla infiltre edilen bitkiler arasında GFP floresansında belirgin farklar görülmüştür, 0,05'lik bir 600 değerinde GFP ekspresyonu gözlemlenmemiştir, 7. DPI'da GFP.Hücre süspansiyonu ile infiltre edilen bitkilerde floresans benzerlik göstermiştir. 1.0, 0.5 ve 0.1 yoğunluklarda benzerlik görülürken, 10 DPI'da A 600 değeri 0.05 olan infiltre edilmiş bitkilerde floresans daha düşük kalmıştır. Geçici protein üretimi için mevcut agrobacterium suşlarının çeşitliliğini artırmak amacıyla dört farklı hücre süspansiyon yoğunluğundan herhangi biriyle infiltre edilen bitkiler arasında GFP üretimi açısından bir fark gözlemlenmemiştir.Nicotiana benthamiana bitkileri, KBI4lickkm vektörünü taşıyan yedi farklı agrobacterium suşu ile vakum infiltrasyonuna tabi tutulmuştur. İnfiltre edilen yapraklar 7 DPI'da toplanmış ve kinaz ekspresyon seviyesi Western blot ile tahmin edilmiştir. Bu grafikte gösterildiği üzere, en yüksek liyaz üretimi seviyesine, küçük farklarla GV3110, 1A4 ve LBA4404 suşları ile ulaşılmıştır.En düşük ekspresyon düzeyi C58C1 ile görülürken, orta düzeyde lyase üretimi AT77, AT06 ve AT10 suşları ile sağlanmıştır; lyase enzimatik aktivitesi XMO Graham testi kullanılarak gösterilmiştir. Saflaştırılmış bakteriyel lyase proteini, enzim aktivitesi için pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Nicotiana benthamiana bitkilerinin A4 ve AT77 yaban tipi agrobacterium suşları ile infiltre edildiğinde, 7. DPI'da bodurluk, petiole uzaması ve yaprak kıvrılması gibi patolojik semptomlar göstermesi dikkat çekicidir.T 10 suşu ile infiltre edilen nicotiana benham bitkilerinde semptomlar hafif seyretmiştir. Laboratuvar suşu GV 3 1 0 1 ile infiltre edilen Nico Oceana Benham bitkilerinde herhangi bir semptom gözlemlenmemiştir. Yabani tip türlerdeki bitki biyokütle üretiminin karşılaştırılması, aynı büyüme koşulları altında Nico Oceana Excela'dan elde edilebilen en yüksek yaprak biyokütlesinin, Nico Oceana'ya kıyasla yaklaşık iki kat daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur.Benham protein üretimi, PBI 4G F-P-G-F-P taşıyan GV 3 1 0 1 agrobacterium suşu ile infiltre edilmiş Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior ve Nico Oceana Excela örneklerinde incelenmiştir. GFP akümülasyonu, infiltre edilmiş tüm yapraklarda 7 DPI'da değerlendirilmiştir. UV ışığı altında GFP ekspresyonunun görsel incelemesi, Nico Oceana Hamana ve Nico Oceana Excela'da GFP'nin homojen bir dağılım sergilediğini, Nico Oceana Excelsior'da ise yaprak alanının tamamının infiltre edilmesindeki zorluk nedeniyle dağılımın heterojen olduğunu göstermiştir. Bu infiltre edilmiş yapraklarda 7 DPI'daki GFP akümülasyonunun Western blot analizi, GFP seviyesinin Nico Oceana Hamana'da, Nico Oceana Excela ve Nico Oceana Excelsior'a göre daha yüksek olduğunu, Nico Oceana'da ise protein üretim seviyesinin düşük olduğunu ortaya koymuştur.Excelsior, toplanan yapraktaki düzensiz infiltrasyondan ve birikmiş GFP'nin düzensiz dağılımından kaynaklanmaktadır. Vakum basıncının yapraklar üzerindeki etkisini test etmek için, Nico Oceana Benham bitkileri; 400, 200, 100 veya 50 millibar vakum basınçlarında ve 30 veya 60 saniyelik vakum tutma sürelerinde, PBI 4G FP taşıyan GV 3 1 0 1 agrobacterium suşu ile infiltre edilmiştir. 5, 100 ve 200 millibar vakum basınçları 30 veya 60 saniye boyunca uygulandığında, GFP üretiminde herhangi bir fark ve bitki sağlığı üzerinde hafif veya hiç zararlı etki gözlemlenmemiştir.Vakum süresinin hedef ekspresyon üzerindeki etkisi, PBI 4G FP taşıyan GV 3 1 0 1'in 0,5 A 600 değerindeki süspansiyonu ile sekiz saat boyunca her saat başı bir Nico Oceana Benham bitki tepsisinin infiltre edilmesiyle değerlendirilmiştir. Bu temsili sonuçta gösterildiği üzere, aynı agrobacterium kültürü kullanıldığında GFP üretim seviyesi sekiz saate kadar olan tüm zaman noktalarında benzerlik göstermiştir; bu durum, bu süre zarfında agrobacterium'un tek zincirli DNA gönderme yeteneğini koruduğunu göstermektedir. Birçok kimyasalın ve monosakkaritin çeşitli bitki türlerinde geçici protein üretimini artırdığı bildirilmiştir.Bu çalışma ayrıca farklı konsantrasyonlardaki asetosiringon ve glukozun, PBI 4G FP taşıyan GV 3 1 0 1 agrobacterium suşu ile infiltre edilmiş Nicotiana benthamiana bitkilerindeki geçici GFP protein üretimi üzerindeki etkisini değerlendirmiştir. Agrobakteriler YEB besiyerinde gece boyunca büyütülmüş, santrifüj edilmiş ve belirtilen konsantrasyonlarda asetosiringon içeren %2 glukozlu MMA içerisinde veya belirtilen konsantrasyonlarda glukoz içeren 200 µM asetofenonlu MMA içerisinde 0,5 OD₆₀₀ değerine resüspande edilmiştir. Burada gösterildiği üzere, bu bileşiklerin test edilen konsantrasyonlarının hiçbiri, indüksiyon besiyerinin asetofenon veya glukoz içermediği kontrol grubuyla karşılaştırıldığında GFP protein üretiminde anlamlı bir artışa neden olmamıştır.Ardından, bir susturma baskılayıcısının beraber infiltrasyonunun Nicotiana benthamiana yapraklarında GFP ve HAC1 genlerinin geçici ekspresyonu üzerindeki etkisi incelendi. İnfiltrasyon öncesinde, PBI 4GFP ve domates kıvırcık lekeli virüsünün viral susturma baskılayıcısı P19'u taşıyan Agrobacterium GV3101 kültürleri sırasıyla 1:1, 2:1, 3:1 ve 4:1 oranlarında karıştırıldı. 7 DPI'daki Western blot analizi sonuçlarının gösterdiği üzere, P19'un varlığı, Agrobacterium süspansiyonlarının hiçbir oranında Nicotiana benthamiana'da GFP üretimini artırmamış veya azaltmamıştır.Ek olarak, iki viral gen susturma baskılayıcısı olan P 23 ve P 19'un HAC one için transkripsiyon sonrası gen susturulmasının önlenmesi üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Launch vektörü PBI four HAC one taşıyan agrobacterium'un POS'u ile iki viral susturma baskılayıcı plazmidinden biri, sırasıyla dörtte bir oranında karıştırılmış ve Nicotiana Bentham Miana'ya birlikte infiltre edilmiştir. İnfiltre edilen yaprak örnekleri 3 ila 8 DPI arasında toplanmıştır.Bu grafik, Western blot analizi ile belirlenen üç deneyden elde edilen ortalama HAC one ekspresyon seviyelerini göstermektedir. Nico Oceana Benham'ın P 23 veya P 19 ile birlikte ko-infiltrasyonu, 60 pi süresinde susturma baskılayıcısı kullanılmamasına kıyasla HAC one üretiminde bir artışla sonuçlanmıştır. Bu durum, P 23 ve P 19'un bu sistemde etkili olduğunu göstermektedir.Susturma baskılayıcısının varlığında ve yokluğunda, HAC one protein üretim seviyesinin 7 DPI'da azalmaya başladığı da gözlemlenmiştir. Bu durum, launch vektörü ile infiltre edilen Nico Oceana Benham Miana'daki geçici protein üretimindeki azalma zamanlamasının hedefe özgü olduğunu göstermektedir. Son olarak, Agrobacterium hücre bankasının stabilitesi, protein birikimini değerlendirmek amacıyla nicotiana benham bitkilerinin aynı Agrobacterium hücre bankası partisiyle infiltre edilmesiyle her yıl değerlendirilmektedir.Bu temsili sonuçlar, HA one protein üretiminin üç yılı aşkın süredir oldukça stabil olduğunu göstermektedir. Nicotiana benam bitkilerindeki ortalama HAC one üretimi 651 ± 49.4 mg/kg'dır. Bu videoyu izledikten sonra; subunit aşıların, theo protein antikorlarının ve diyagnostik antijenlerin üretimi için kullanılabilecek olan rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimine yönelik agro infiltrasyon tekniğinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.Bu prosedürü uygularken; bitki çaprazlamasının hidroponik olarak kontrol edilmesinin, canlı agrobakterilerin kullanılmasının, vakum basıncı ve süresinin kontrol altında tutulmasının ve protein ekspresyon aracının izlenmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Uzmanlaşıldığında, kontrollü koşullar altında düzgün bir şekilde yürütüldüğü takdirde agro filtrasyon tekniği 24 saat içinde tamamlanabilir.

optimization-utilization-agrobacterium-mediated-transient-protein

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bitkiler Geçerli ifade paradigmalar göre daha daha fazla, ölçeklenebilir bir maliyet-etkin ve emniyetli olan, bir ticari bir ölçekte ilgili sayısız farmasötik bir proteinlerin bölgesinin üretimi için bir Roman sistem mü tavsiye edeceksiniz. Bu çalışmada, biz içeren hedef-gen tanıtmak için bir basit ve kullanışlı, henüz ölçeklenebilir bir yaklaşım...

Rekombinant Proteinlerin Yüksek-düzey Geçici İfade için Bitkiler Verimli Agroinfiltration

Agroinfiltrasyon ve PVX agroinfection, bitkilerdeki genlerin geçici ektopik ekspresyonu için rutin fonksiyonel tahlillerdir. Bu yöntemler, efektoromik stratejilerde (hızlı direnç ve avirulence gen keşfi) etkili tahlillerdir ve moleküler bitki patolojisinde modern araştırmalar için çok önemlidir. Tesislerde sağlam yüksek verimli fonksiyonel analiz talebini karşılarlar.

Patates ve Nicotiana benthamiana'da Agroinfiltrasyon ve PVX Agroinfection

In vivo protein komplekslerinin oluşumu bimoleküler floresan tamamlanmasıyla görselleştirilebilir. Etkileşim ortakları floresan etiketler tamamlayıcı bölümlerine bağlı ve geçici olarak tütün yaprakları olarak ifade edilen iki protein arasında yakın üzerine yeniden flüoresan sinyal elde edilir.

Tütün protoplastlarında ve Yapraklar Bimoleküler Floresan tamamlama tarafından Visualized protein-protein etkileşimleri

Bu çalışmada, hedef insan rekombinant proteininin farklı üretim platformlarındaki ekspresyonu karşılaştırıldı. Geleneksel fermentör bazlı kültürlere ve bitkilere odaklandık, her bir sistemin kurulumunu açıkladık ve rapor edilen sonuçlara dayanarak her platform için doğal sınırları ve avantajları vurguladık.

Bakteriler, Böcek Hücreleri ve Bitki Sistemleri: Rekombinant Protein Farklı Biofactories İfade Karşılaştırmalı Analizi

Bitki hücreler arası bağlantıları, plasmodesmata (Pd), Fizyoloji ve bitki-virüs etkileşimleri bitki merkezi rol oynarlar. Kritik Pd taşıma olarak proteinler Pd için doğrudan sinyalleri sıralama. Ancak, bu DNA dizileri hakkında bilgimizi henüz emekleme aşamasında olduğunu. Pd yerelleştirme sinyalleri Pd hedeflenmiş proteinler tanımlamak için bir strateji tanımlarlar.

Proteinlerin içinde Planta serilerinde Plasmodesmal yerelleştirme tanımlaması

Bu el yazması luciferase etkinlik ölçümü temel protein-protein etkileşimleri belirlenmesi için kolay ve hızlı deneysel bir işlem açıklanır.

Luciferase tamamlayıcı Imaging tahlil Nicotiana benthamiana yaprakları Protein-protein etkileşim Dynamics geçici belirlenmesi için

Geçici Contegra ifade Nicotiana benthamiana yaprakları biyosentetik enzimlerin 2,3-oxidosqualene yeni yüksek değerli triterpen ürünleri doğru endojen malzemeleri yönlendirebilirsiniz. Burada olduğunu hızlı (5 gün) hazırlık-ölçekli üretim triterpeneler ve bu güçlü bitki tabanlı platformu kullanan analogları için detaylı bir protokol açıklanan.

Partiye Hazırlık bir ölçekte triterpen üretim için geçici Nicotiana Benthamiana ifadede bırakır

Burada Üretmek ve Escherichia coli veya Nicotiana benthamianabiyosentetik enzimlerin kombinatoryal ekspresyonu ile diterpenoid metabolitleri arındırıcı için kolay kullanılan protokoller salıyoruz , kromatografik ürün takip Arıtma. Ortaya çıkan metabolitler moleküler yapı karakterizasyonu, enzim fonksiyonel çalışmaları ve biyoaktivite testleri gibi çeşitli çalışmalar için uygundur.

Diterpenoid Doğal Ürünlerin Enzimatik Üretimi ve Saflaştırılması için Özelleştirilebilir Bir Yaklaşım

Burada ifade, çıkarma ve rekombinant insan IgG arınma için basit bir yöntem Nicotiana benthamianaGFP erimiş açıklar. Bu protokol, kolon kromatografisi kullanan çok sayıda proteinin saflaştırılması ve görselleştirilmesi için genişletilebilir. Ayrıca protokol, proje tabanlı keşif ler sağlayan, şahsenn ve sanal üniversite öğretim laboratuvarına uyarlanabilir.

Nicotiana benthamiana'da Geçici Olarak Ifade Edilen IgG Füzyon Proteinlerinin Üretimi

Burada, BiFC tabanlı FRET-FLIM test tarafından floresan etiketli proteinler kullanarak üç protein ortağı arasındaki üçlü kompleks oluşumunu görselleştirmek için bir yöntem sunuyoruz. Bu yöntem, protein-proteinetkileşim komplekslerini vivo olarak incelemek için değerlidir.

BiFC-FRET-FLIM Tahlilinde MADS Kutusu Transkripsiyon Faktörünün İki Monomeri ile Kalsiyum Sensör Proteini Arasındaki Üçlü Etkileşimin Belirlenmesi

Floresan rezonans enerji transferi (FRET), canlı hücrelerdeki protein etkileşimlerini tespit etmek için kullanılan bir görüntüleme tekniğidir. Burada, histon modifiye edici enzimlerin, bitki dokularındaki gen ekspresyonunun epigenetik düzenlenmesi için hedef promotörlere onları işe alan transkripsiyon faktörleri ile ilişkisini incelemek için bir FRET protokolü sunulmaktadır.

Histon Modifiye Edici Enzimler ve Transkripsiyon Faktörleri Arasındaki Etkileşimlerin in vivo Floresan Rezonans Enerji Transferi ile İncelenmesi

Öğrenin, Nicotiana bitkilerinde Agrobacterium vakum infiltrasyonu ile geçici rekombinant protein üretimini optimize etme yöntemini. Bu teknik, aşı antijenleri ve terapötik proteinler için ölçeklenebilir bir üretim sağlar.

Optimizasyon ve Kullanımı

Daha fazla video keşfet