Optimizasyon ve Kullanımı

Bu prosedürün genel amacı, agro infiltrasyon tekniği kullanılarak bitki tabanlı bir sistemde geçici rekombinant protein üretimi için basit, verimli ve ölçeklenebilir bir yöntem geliştirmektir. Bu, öncelikle bitki büyüme koşullarının optimize edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, agrobacterium'un bitki virüsü bileşenlerini ve binary plazmitleri birleştiren launch vektörleri ile transforme edilmesi ve ardından transforme edilmiş agrobacterium'un agro deneylerinde kullanılmak üzere kültüre edilmesiyle tamamlanır.

Agrobacterium infiltrasyonu sırasında, bitkiler ters çevrilir ve havada kalan kısımları bir agrobacterium süspansiyonuna daldırılır. Ardından, yaprak dokularındaki hücreler arası boşluklardan havanın tahliye edilmesini sağlayan bir vakum uygulanır. Vakumun serbest bırakılmasını takiben gerçekleşen hızlı yeniden basınçlandırma, agrobacterium süspansiyonunun yapraklara infüzyonuna yol açar.

Nihayetinde, infiltre edilen bitkilerdeki rekombinant protein üretimini göstermek için immunoblotlama ve floresans analizleri kullanılır. Bu tekniğin manuel infiltrasyon gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, vakum infiltrasyon yönteminin aşılar ve terapötik proteinler dahil olmak üzere rekombinant proteinlerin endüstriyel üretimi için ölçeklendirilebilir olmasıdır. Bu yöntem, bitki biyoteknolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve bitkilerin ticari rekombinant protein üretimi için alternatif bir platform olarak kullanımını daha da kolaylaştırabilir.

Toprakta yetişen bitkilerde agrofiltrasyonun ölçeğini büyütmenin zor olduğunu fark ettiğimizde bu yöntem için ilk fikri geliştirdik. Birkaç nedenden dolayı toprak; virüsler, bakteriler ve nematodlar gibi unsurlar içerir; ayrıca toprak içeriği ve sulama suyu partiden partiye ve mevsimden mevsime farklılık gösterir ve toprak depolama sırasında zamanla bozulur. Dahası, toprakta yetişen bitkilerin ters çevrilmesi, infiltrasyon sırasında agrobacterium kültürüne istenmeyen toprak damlamalarına yol açabilirdi.

Bu prosedürü, bitki biyolojisi ve mühendislik laboratuvarından kıdemli araştırma asistanı Rebecca Snow ile laboratuvarımdan araştırma asistanları olan Emma Gut Robin Lobe ve Adam Trevor gerçekleştirecekler. Bu çalışma, bitki büyümesinin tekdüzeliğini sağlamak ve bitki yetiştirme için toprak kullanımına bağlı karmaşıklıkları ortadan kaldırmak amacıyla hidroponik bitki büyüme ortamı ve besin çözeltisi kullanmaktadır.

Bu prosedüre başlamak için, kaya yünü plakalarını beş dakika boyunca bitki gübresi çözeltisinde bekletin ve tohumları, besin emdirilmiş kaya yünü yüzeyine manuel olarak ekin. Bu çalışmada Cedar üç Nico Oceana türü değerlendirilecektir: iki yabani tür olan Nico Oceana, Benham Ana ve Nico Oceana Excelsior ile Benham, Ana ve Excelsior'un hibriti olan Nico Oceana Excela. Tohumlardan çıkan bitkileri, kontrollü koşullar altında ve uzun gün fotoperiyodunda, hidroponik kaskad sisteminde yetiştirin.

Nico Oceana, Bentham Miana ve Nico Oceana Excela için dört ila beş hafta, Nico Oceana Excelsior için ise beş ila altı hafta. Bu deneyde kullanılan Agrobacterium tumor Fasion suşları, beraberindeki makalede açıklandığı üzere uygun taşıyıcı vektörlerle transforme edilmiştir. Bu demonstrasyon amacıyla beş farklı transforme agrobacterium suşu kullanılmıştır.

Reporter yeşil floresan protein (GFP) geni taşıyan GV 3 1 0 1, domates çalı yanıklığı virüsü P 19 susturma baskılayıcı viral genini taşıyan GV 3 1 0 1 ve modifiye liyaz veya lick KM taşıyıcı protein genini taşıyan T 10 GV 3 1 0 1 agrobacterium suşlarını, litre başına 50 mg kanamisin eklenmiş LB ortamında, 28 °C'de 200 ila 250 RPM sarsıntıyla gece boyunca büyütün. Ertesi gün, geçici protein üretimi için birden fazla agrobacterium suşu kullanmanın fizibilitesini incelemek amacıyla istenen deneyler için agrobacterium süspansiyonlarını hazırlayın; PBI dört lick km vektörünü barındıran bir laboratuvar suşu ve iki yaban tipi suşu, milli Q su ile 600 nm'de 0,5 optik yoğunluğa gelecek şekilde seyreltin.

İnfiltrasyon öncesinde agrobacterium virülans genlerini indüklemenin gerekliliğini araştırmak için, öncelikle LB ortamında büyütülen P bid 4G FP vektörü taşıyan agrobacterium kültürlerini 4 °C'de 10 dakika boyunca 4,000 ×g'de santrifüjleyin. Ardından, 600 nanometrede 0,5 optik yoğunluğa ulaşana kadar MMA indüksiyon ortamında yeniden süspanse edin ve oda sıcaklığında iki saat boyunca karıştırın; asetil konun geçici protein üretimini artırıp artırmadığını test etmek için, LB ortamında gece boyunca büyütülen PBI 4G FP vektörü taşıyan bir agrobacterium kültürünü santrifüjleyin ve 1X ms tuzu, 10 millimolar MES ve %2 glikoz içeren infiltrasyon tamponunda yeniden süspanse edin.

Hücre süspansiyonunu dört kaba bölün. Her bir agrobacterium süspansiyonuna farklı konsantrasyonlarda aseto kon ekleyin ve oda sıcaklığında üç saat boyunca inkübe edin. Viral bir susturma baskılayıcısının ko-infiltrasyonunun geçici GFP protein üretimi üzerindeki etkisini test etmek için karıştırın.

GFP geni taşıyan, milli-Q su ile seyreltilmiş agrobacterium kültürü ile viral susturma baskılayıcı P19 taşıyan kültürün dörtte bir oranında karıştırılması, bitkilerin vakum infiltrasyon işlemi sırasında gösterilecektir. Bitkileri vakumla infiltre etmek için vakum basıncının ve infiltrasyon süresinin kontrol edilmesi kritik öneme sahiptir. İlk olarak, hazırlanan agrobacterium süspansiyonunu vakum odasının içindeki bir kaba aktarın.

Ardından bitkiyi seyreltilmiş agrobacterium içinde ters çevirin ve 30 veya 60 saniye boyunca 50 ila 400 milibar vakum uygulayın. Optimal infiltrasyon rutin olarak 60 saniye boyunca 50 ila 100 milibar arasında uygulanır. Vakum kaldırıldıktan sonra bitkileri vakum odasından çıkarın, suyla durulayın ve ön filtrasyon büyümesinde kullanılan aynı büyüme koşulları altında beş ila yedi gün boyunca büyütün.

Western analizi için numuneler hazırlamak amacıyla, öncelikle infiltrasyondan dört ila yedi gün sonra (DPI), Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior veya Nico Oceana Excela bitkilerinden rastgele yaprak örnekleri toplayın ve yaprak numunelerini sıvı azot içerisinde ince bir toz haline gelene kadar pulverize edin. Her numuneye, %0,5 Triton X 100 içeren bir hacmin üç katı kadar 1X PBS tamponu ekleyin ve numuneyi bir eppendorf tüpüne aktarın. Ekstraksiyon yapılan numuneleri, 4 °C'de 15 dakika boyunca hafifçe sallayın veya rotasyona tabi tutun.

Ekstraktı beş dakika boyunca santrifüjleyin ve toplam çözünür proteini temiz bir einor tüpüne toplayın. Ekstraktları 1X PBS ekstraksiyon tamponu ile uygun bir dilüsyona seyreltin ve final konsantrasyonu 1X olacak şekilde 5X örnek tamponu ekleyin. Proteinleri SDS-PAGE ile ayırmadan önce örnekleri beş dakika boyunca kaynatın.

Proteinler hareketsiz bir P transfer membranına aktarıldıktan sonra, bloklama solüsyonu içerisinde 1:5.000 oranında seyreltilmiş tavşan poliklonal anti GFP antiserumu kullanılarak GFP tespiti yapılır. Membranlar 1X PBST 20 ile üç kez yıkandıktan sonra, oda sıcaklığında bir saat boyunca hafifçe sallanarak inkübe edilir. GFP tespiti için, 1:5.000 oranında seyreltilmiş horseradish peroksidaz konjuge anti-tavşan antikor ile bir saat boyunca inkübe edilir.

Ardından, western blotlar işlenir ve proteinlere karşılık gelen bant yoğunlukları beraberindeki makalede açıklandığı şekilde analiz edilir. Geçici olarak transforme edilmiş tüm bitkilerde GFP floresansının görsel tespiti, el tipi uzun dalga boylu bir UV lamba kullanılarak gerçekleştirilir; geçici olarak transforme edilmiş bitkileri sarı sekiz ES 52 filtresi üzerinden fotoğraflamak için bir dijital kamera ve 15 saniyelik bir pozlama süresi kullanın. Western blot analizlerinden görüntüleri, bir genom üzerindeki gene snapped yazılımını kullanarak elde edin.

Sonuçları, saflaştırılmış bir GFP standardına dayalı bir kalibrasyon eğrisi ile gen aracı yazılımını kullanarak nicelleştirin; bitki büyümesi ve biyokütle birikimi için optimal koşulları belirlemek amacıyla Nick Oceana Bentham Miana, ticari olarak satılan gübrelerle ıslatılmış Rockwell plakalarında yetiştirilmiştir. Fosforun varlığı, %4,8 fosfor içeren bir gübre çözeltisinde veya %0 fosfor içeren bir gübre çözeltisinde büyüyen bu altı haftalık bitkilerin gösterdiği üzere, NICO Oceana Bentham tohumlarının çimlenmesi ve büyümesi için kritiktir.

Agrobacterium büyüme ve infiltrasyon ortamlarının bitki sağlığı ve protein üretimi üzerindeki etkileri, Nicotiana hamana bitkilerindeki GFP üretimi karşılaştırılarak incelenmiştir. Bitkilere, üç farklı ortamda büyütülen agrobacterium kültürleri içeren PBI 4G FP ile vakum infiltrasyonu uygulanmıştır. YEB veya LB ortamlarında gece boyunca büyütülen YEB, AB ve LB kültürleri düşük hızda santrifüjlenip MMA indüksiyon ortamında yeniden süspande edilmiş veya YEB, LB veya AB ortamlarında gece boyunca büyütüldükten sonra, Milli Q su ile bir e beşe veya bir e ona doğrudan seyreltilmiştir; bu western blot sonucunda gösterildiği üzere, YEB, LB veya AB ortamlarında büyütülen ve Milli Q su ile seyreltilen agrobacterium kültürleri ile infiltre edilen bitkiler, santrifüjlenip MMA içinde yeniden süspande edilen kültürlere kıyasla ortalama GFP üretiminde anlamlı bir fark göstermemiştir.

Bu nedenle, bitki infiltrasyonu için agrobacterium kültürlerini seyreltmek amacıyla milli Q su kullanılması önerilmektedir ve sonraki deneylerde 600 nanometrede 0,5 optik yoğunluğa ulaşmak için rutin olarak kullanılmıştır. Ardından, agrobacterium hücre süspansiyon yoğunluğunun ve zaman seyrinin hedef ekspresyon üzerindeki etkileri incelenmiştir. PBI 4G FP taşıyan agrobacterium'un dört farklı hücre süspansiyon yoğunluğu değerlendirilmiş ve yaprak örnekleri, western blot analizi için infiltrasyondan sonraki dördüncü, yedinci ve 10. günlerde (DPI) toplanmıştır; 4. DPI'da, farklı agrobacterium hücre süspansiyon yoğunluklarıyla infiltre edilen bitkiler arasında GFP floresansında belirgin farklar görülmüştür, 0,05'lik bir 600 değerinde GFP ekspresyonu gözlemlenmemiştir, 7. DPI'da GFP.

Hücre süspansiyonu ile infiltre edilen bitkilerde floresans benzerlik göstermiştir. 1.0, 0.5 ve 0.1 yoğunluklarda benzerlik görülürken, 10 DPI'da A 600 değeri 0.05 olan infiltre edilmiş bitkilerde floresans daha düşük kalmıştır. Geçici protein üretimi için mevcut agrobacterium suşlarının çeşitliliğini artırmak amacıyla dört farklı hücre süspansiyon yoğunluğundan herhangi biriyle infiltre edilen bitkiler arasında GFP üretimi açısından bir fark gözlemlenmemiştir.

Nicotiana benthamiana bitkileri, KBI4lickkm vektörünü taşıyan yedi farklı agrobacterium suşu ile vakum infiltrasyonuna tabi tutulmuştur. İnfiltre edilen yapraklar 7 DPI'da toplanmış ve kinaz ekspresyon seviyesi Western blot ile tahmin edilmiştir. Bu grafikte gösterildiği üzere, en yüksek liyaz üretimi seviyesine, küçük farklarla GV3110, 1A4 ve LBA4404 suşları ile ulaşılmıştır.

En düşük ekspresyon düzeyi C58C1 ile görülürken, orta düzeyde lyase üretimi AT77, AT06 ve AT10 suşları ile sağlanmıştır; lyase enzimatik aktivitesi XMO Graham testi kullanılarak gösterilmiştir. Saflaştırılmış bakteriyel lyase proteini, enzim aktivitesi için pozitif kontrol olarak kullanılmıştır. Nicotiana benthamiana bitkilerinin A4 ve AT77 yaban tipi agrobacterium suşları ile infiltre edildiğinde, 7. DPI'da bodurluk, petiole uzaması ve yaprak kıvrılması gibi patolojik semptomlar göstermesi dikkat çekicidir.

T 10 suşu ile infiltre edilen nicotiana benham bitkilerinde semptomlar hafif seyretmiştir. Laboratuvar suşu GV 3 1 0 1 ile infiltre edilen Nico Oceana Benham bitkilerinde herhangi bir semptom gözlemlenmemiştir. Yabani tip türlerdeki bitki biyokütle üretiminin karşılaştırılması, aynı büyüme koşulları altında Nico Oceana Excela'dan elde edilebilen en yüksek yaprak biyokütlesinin, Nico Oceana'ya kıyasla yaklaşık iki kat daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur.

Benham protein üretimi, PBI 4G F-P-G-F-P taşıyan GV 3 1 0 1 agrobacterium suşu ile infiltre edilmiş Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior ve Nico Oceana Excela örneklerinde incelenmiştir. GFP akümülasyonu, infiltre edilmiş tüm yapraklarda 7 DPI'da değerlendirilmiştir. UV ışığı altında GFP ekspresyonunun görsel incelemesi, Nico Oceana Hamana ve Nico Oceana Excela'da GFP'nin homojen bir dağılım sergilediğini, Nico Oceana Excelsior'da ise yaprak alanının tamamının infiltre edilmesindeki zorluk nedeniyle dağılımın heterojen olduğunu göstermiştir. Bu infiltre edilmiş yapraklarda 7 DPI'daki GFP akümülasyonunun Western blot analizi, GFP seviyesinin Nico Oceana Hamana'da, Nico Oceana Excela ve Nico Oceana Excelsior'a göre daha yüksek olduğunu, Nico Oceana'da ise protein üretim seviyesinin düşük olduğunu ortaya koymuştur.

Excelsior, toplanan yapraktaki düzensiz infiltrasyondan ve birikmiş GFP'nin düzensiz dağılımından kaynaklanmaktadır. Vakum basıncının yapraklar üzerindeki etkisini test etmek için, Nico Oceana Benham bitkileri; 400, 200, 100 veya 50 millibar vakum basınçlarında ve 30 veya 60 saniyelik vakum tutma sürelerinde, PBI 4G FP taşıyan GV 3 1 0 1 agrobacterium suşu ile infiltre edilmiştir. 5, 100 ve 200 millibar vakum basınçları 30 veya 60 saniye boyunca uygulandığında, GFP üretiminde herhangi bir fark ve bitki sağlığı üzerinde hafif veya hiç zararlı etki gözlemlenmemiştir.

Vakum süresinin hedef ekspresyon üzerindeki etkisi, PBI 4G FP taşıyan GV 3 1 0 1'in 0,5 A 600 değerindeki süspansiyonu ile sekiz saat boyunca her saat başı bir Nico Oceana Benham bitki tepsisinin infiltre edilmesiyle değerlendirilmiştir. Bu temsili sonuçta gösterildiği üzere, aynı agrobacterium kültürü kullanıldığında GFP üretim seviyesi sekiz saate kadar olan tüm zaman noktalarında benzerlik göstermiştir; bu durum, bu süre zarfında agrobacterium'un tek zincirli DNA gönderme yeteneğini koruduğunu göstermektedir. Birçok kimyasalın ve monosakkaritin çeşitli bitki türlerinde geçici protein üretimini artırdığı bildirilmiştir.

Bu çalışma ayrıca farklı konsantrasyonlardaki asetosiringon ve glukozun, PBI 4G FP taşıyan GV 3 1 0 1 agrobacterium suşu ile infiltre edilmiş Nicotiana benthamiana bitkilerindeki geçici GFP protein üretimi üzerindeki etkisini değerlendirmiştir. Agrobakteriler YEB besiyerinde gece boyunca büyütülmüş, santrifüj edilmiş ve belirtilen konsantrasyonlarda asetosiringon içeren %2 glukozlu MMA içerisinde veya belirtilen konsantrasyonlarda glukoz içeren 200 µM asetofenonlu MMA içerisinde 0,5 OD₆₀₀ değerine resüspande edilmiştir. Burada gösterildiği üzere, bu bileşiklerin test edilen konsantrasyonlarının hiçbiri, indüksiyon besiyerinin asetofenon veya glukoz içermediği kontrol grubuyla karşılaştırıldığında GFP protein üretiminde anlamlı bir artışa neden olmamıştır.

Ardından, bir susturma baskılayıcısının beraber infiltrasyonunun Nicotiana benthamiana yapraklarında GFP ve HAC1 genlerinin geçici ekspresyonu üzerindeki etkisi incelendi. İnfiltrasyon öncesinde, PBI 4GFP ve domates kıvırcık lekeli virüsünün viral susturma baskılayıcısı P19'u taşıyan Agrobacterium GV3101 kültürleri sırasıyla 1:1, 2:1, 3:1 ve 4:1 oranlarında karıştırıldı. 7 DPI'daki Western blot analizi sonuçlarının gösterdiği üzere, P19'un varlığı, Agrobacterium süspansiyonlarının hiçbir oranında Nicotiana benthamiana'da GFP üretimini artırmamış veya azaltmamıştır.

Ek olarak, iki viral gen susturma baskılayıcısı olan P 23 ve P 19'un HAC one için transkripsiyon sonrası gen susturulmasının önlenmesi üzerindeki etkisi araştırılmıştır. Launch vektörü PBI four HAC one taşıyan agrobacterium'un POS'u ile iki viral susturma baskılayıcı plazmidinden biri, sırasıyla dörtte bir oranında karıştırılmış ve Nicotiana Bentham Miana'ya birlikte infiltre edilmiştir. İnfiltre edilen yaprak örnekleri 3 ila 8 DPI arasında toplanmıştır.

Bu grafik, Western blot analizi ile belirlenen üç deneyden elde edilen ortalama HAC one ekspresyon seviyelerini göstermektedir. Nico Oceana Benham'ın P 23 veya P 19 ile birlikte ko-infiltrasyonu, 60 pi süresinde susturma baskılayıcısı kullanılmamasına kıyasla HAC one üretiminde bir artışla sonuçlanmıştır. Bu durum, P 23 ve P 19'un bu sistemde etkili olduğunu göstermektedir.

Susturma baskılayıcısının varlığında ve yokluğunda, HAC one protein üretim seviyesinin 7 DPI'da azalmaya başladığı da gözlemlenmiştir. Bu durum, launch vektörü ile infiltre edilen Nico Oceana Benham Miana'daki geçici protein üretimindeki azalma zamanlamasının hedefe özgü olduğunu göstermektedir. Son olarak, Agrobacterium hücre bankasının stabilitesi, protein birikimini değerlendirmek amacıyla nicotiana benham bitkilerinin aynı Agrobacterium hücre bankası partisiyle infiltre edilmesiyle her yıl değerlendirilmektedir.

Bu temsili sonuçlar, HA one protein üretiminin üç yılı aşkın süredir oldukça stabil olduğunu göstermektedir. Nicotiana benam bitkilerindeki ortalama HAC one üretimi 651 ± 49.4 mg/kg'dır. Bu videoyu izledikten sonra; subunit aşıların, theo protein antikorlarının ve diyagnostik antijenlerin üretimi için kullanılabilecek olan rekombinant proteinlerin büyük ölçekli üretimine yönelik agro infiltrasyon tekniğinin nasıl uygulanacağı konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

Bu prosedürü uygularken; bitki çaprazlamasının hidroponik olarak kontrol edilmesinin, canlı agrobakterilerin kullanılmasının, vakum basıncı ve süresinin kontrol altında tutulmasının ve protein ekspresyon aracının izlenmesinin önemli olduğunu unutmamak gerekir. Uzmanlaşıldığında, kontrollü koşullar altında düzgün bir şekilde yürütüldüğü takdirde agro filtrasyon tekniği 24 saat içinde tamamlanabilir.