Optimizasyon ve Kullanımı Agrobacterium aracılı Geçici Protein Üretimi Nicotiana

Agrobacteria (Tütün mozaik virüsü-esaslı) aşı antijenleri ve terapötik proteinleri üretmek için hızlı ve ekonomik bir yaklaşımdır başlatmak vektörleri taşıma ile vakum infiltrasyonu göre Nicotiana bitkilerinde geçici protein üretimi. Biz prosedürü basitleştirilmiş ve bakteri yetiştirme koşulları optimize konak türlerin seçimi, ve RNA susturulması bastırıcılara ko-tanıtarak hedef birikimini geliştirdi.

Bu prosedürün genel amacı, tarımsal sızma tekniğini kullanarak bitki bazlı bir sistemde geçici rekombinant protein üretimi için basit, verimli ve ölçeklenebilir bir yöntem geliştirmektir. Bu, önce bitki büyüme koşullarını optimize ederek gerçekleştirilir. İkinci adım, agrobakteriyi bitki virüslerinin ve ikili plazmitlerin bileşenlerini birleştiren fırlatma vektörleri ile dönüştürmek ve ardından dönüştürülmüş agrobakteriyi agro deneylerde kullanılmak üzere kültürlemektir.

Agrobakteri sızması sırasında, bitkiler baş aşağı çevrilir ve hava parçaları bir agrobakteri süspansiyonuna batırılır. Daha sonra bir vakum uygulanır ve yaprak dokularındaki hücreler arası boşluklardan havanın boşaltılmasına neden olur. Vakumun serbest bırakılmasını takiben St Rapid yeniden basınçlandırma sayesinde, agrobacterium süspansiyonunun yapraklara infüzyonu ile sonuçlanır.

Sonuç olarak, sızan bitkilerde rekombinant protein üretimini göstermek için immünoblotlama ve floresan testleri kullanılır. Bu tekniğin manuel sızma gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, vakum sızma yönteminin, aşılar ve terapötik proteinler dahil olmak üzere rekombinant proteinlerin endüstriyel üretimi için ölçeklendirilebilmesidir. Bu yöntem, bitki biyoteknolojisindeki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve bitkilerin ticari rekombinant protein üretimi için alternatif bir platform olarak kullanımını daha da kolaylaştırabilir.

Bu yöntem için ilk olarak, toprak yetiştiren bitkilerde tarımsal filtrasyonu artırmanın zor olduğunu öğrendiğimizde aklımıza geldi. Çeşitli nedenlerden dolayı toprak, virüsler, bakteriler, nematodlar gibi uchin içerir ve buna ek olarak, toprak içeriği ve sulama suyu partiden partiye ve mevsimden mevsime değişir ve toprak depolamada zamanla yumurtalanır. Ayrıca, toprakta büyüyen bitkilerin ters çevrilmesi, sızma sırasında toprağın agrobakteri kültürüne istenmeyen şekilde damlamasına neden olacaktır.

Bu prosedürü gösteren, bitki biyolojisi ve mühendislik laboratuvarından kıdemli bir araştırma görevlisi olan Rebecca Snow ve Emma Gut Robin Lobe olacak. O, o ve laboratuvarımda araştırma görevlisi olan Adam Trevor. Bu çalışma, bitki büyümesinin homojenliğini sağlamak ve bitki yetiştiriciliği için toprak kullanımıyla ilgili karmaşıklıkları ortadan kaldırmak için hidroponik bitki büyüme ortamı ve besin çözeltisi kullanmaktadır.

Bu işleme başlamak için, taş yünü levhalarını bir bitki gübre çözeltisinde beş dakika bekletin, besinle ıslatılmış taş yünü yüzeyine manuel olarak tohum ekin. Bu çalışmada Sedir kullanılarak üç Nico Oceana türü, iki yabani tür olan Nico Oceana, Benham Ana ve Nico Oceana Excelsior ve Nico Oceana adlı bir Benham, Ana ve Excelsior melezi değerlendirilecektir. Excela, kontrollü koşullar altında tohumlardan bitkiler yetiştirir ve hidroponik kaskad bir sistemde uzun bir gün fotoğraf periyodu içinde büyür.

Nico Oceana, Bentham Miana ve Nico Oceana Excela dört ila beş hafta ve Nico Oceana Excelsior beş ila altı hafta boyunca. Bu deneyde kullanılan Agrobacterium tümör Fasion suşları, ekteki el yazmasında açıklandığı gibi uygun fırlatma vektörleri ile dönüştürülmüştür. Bu demonstrasyonun amaçları doğrultusunda, beş dönüştürülmüş agrobacterium suşu kullanılmaktadır.

GV 3 1 0 1, bir raportör yeşil floresan proteini veya GFP geni GV 3 1 0 1 taşıyan, domates çalı dublör virüsü P 19'un susturucu baskılayıcısının viral genini taşıyan ve A dört GV 3 1 0 1 ve bir T 10. Bir taşıyıcı proteinin genini taşıyan, modifiye edilmiş bir KM veya yalama, LB ortamında gece boyunca agrobacterium suşlarını büyütür, ertesi gün 200 ila 250 RPM'de çalkalanarak 28 santigrat derecede litre başına 50 miligram kutu misin ile desteklenir. Geçici protein üretimi için birden fazla agrobakteri suşu kullanmanın fizibilitesini incelemek için istenen deneyler için agrobakteri süspansiyonları hazırlayın, bir laboratuvar suşunu ve iki vahşi tip suşu seyreltin, PBI dört yalama km vektörünü mili Q suyunda 600 nanometrede 0.5'lik bir optik yoğunluğa kadar barındırın.

İnfiltrasyondan önce agrobacterium virülans genlerinin indüklenmesinin gerekliliğini araştırmak için, önce dört santigrat derecede 10 dakika boyunca LB ortamında 4.000 kez G'de büyütülen P bid 4G FP vektörünü taşıyan agrobakteri kültürlerini santrifüjleyin. Daha sonra, MMA indüksiyon ortamında 600 nanometre 0.5'lik bir optik yoğunluğa yeniden süspanse edin ve asetil konisinin geçici protein üretimini, santrifüjü ve agrobakteri kültürünü geliştirip geliştirmediğini test etmek için oda sıcaklığında iki saat karıştırın. LB ortamında gece boyunca büyütülen PBI 4G FP vektörünün taşınması ve bir X ms tuzu 10 milimolar, MES ve% 2 glikoz içeren infiltrasyon tamponunda yeniden süspanse edilmesi.

Hücre süspansiyonunu dört kaba bölün. Agrobacterium süspansiyonlarının her birine farklı bir konsantrasyonda aseto konisi ekleyin ve oda sıcaklığında üç saat inkübe edin. Bir viral susturucu baskılayıcının ko-infiltrasyonunun geçici GFP protein üretim karışımı üzerindeki etkisini test etmek.

GFP genini taşıyan bir mili Q su seyreltilmiş agrobakteri kültürü ve viral susturucu P 19'u dört ila bir oranında taşıyan bir kültür Bitkilerin vakum infiltrasyonu sırasında, gösterilecektir. Sonraki, vakum basıncını ve sızma tesislerini vakumlamak için sızma süresini kontrol etmek için kritik öneme sahiptir. İlk olarak, hazırlanan agrobacterium süspansiyonunu vakum odasının içindeki bir kaba aktarın.

Daha sonra bitkiyi seyreltilmiş agrobakteri içinde baş aşağı çevirin ve 30 veya 60 saniye boyunca 50 ila 400 milibar vakum uygulayın. Optimal sızma rutin olarak 60 saniye boyunca 50 ila 100 milibarda uygulanır. Vakum kırıldıktan sonra, bitkileri vakum odasından çıkarın, suyla durulayın ve ön filtrasyon büyümesi için kullanılan aynı büyüme koşulları altında beş ila yedi gün boyunca büyütün.

Numuneleri Western analizine hazırlamak için, önce infiltrasyondan dört ila yedi gün sonra Nico Oceana, Benham Miana, Nico Oceana Excelsior veya Nico Oceana Excela bitkilerinden rastgele yaprak örnekleri toplayın veya yaprak örneklerini sıvı nitrojen içinde ince bir toz haline getirin. Her numuneye %0,5 Triton X 100 içeren üç hacim bir XPBS tamponu ekleyin ve numuneyi bir einor tüpüne aktarın. Ekstrakte edilen numuneleri dört santigrat derecede 15 dakika boyunca hafifçe sallayın veya döndürün.

Ekstraktı beş dakika boyunca döndürün ve toplam çözünür proteini temiz bir einor tüpüne toplayın. Ekstraktları bir XPBS ekstraksiyon tamponunda uygun bir seyreltmeye seyreltin ve son bir X konsantrasyonuna beş x numune tamponu ekleyin. Proteinleri SDS sayfasına göre ayırmadan önce numuneleri beş dakika kaynatın.

Proteinler hareketsiz bir P transfer membranına aktarıldıktan sonra ve bloke edici çözeltide bir ila 5.000 seyreltmede tavşan poliklonal anti GFP antiserumu kullanarak GFP'yi tespit edin. Membranları bir X-P-B-S-T 20 ile üç kez yıkadıktan sonra hafifçe sallayarak oda sıcaklığında bir saat inkübe edin. At turpu peroksidaz konjuge anti kuduz antikoru ile inkübe edin, GFP tespiti için bir saat boyunca bir ila 5.000 arasında bir seyreltme ekleyin.

Daha sonra, batı lekeleri işlenir ve proteinlere karşılık gelen bant yoğunlukları, beraberindeki el yazmasında açıklandığı gibi analiz edilir. Geçici olarak dönüştürülmüş bitkilerde GFP floresansının görsel olarak algılanması, elde taşınan uzun dalga boylu bir UV lambası, bir dijital kamera ve sarı sekiz ES 52 filtresi aracılığıyla geçici olarak dönüştürülmüş bitkileri fotoğraflamak için 15 saniyelik bir pozlama süresi kullanılarak gerçekleştirilir. Bir genom üzerinde gen yakalama yazılımını kullanarak western blot analizlerinden görüntüler elde edin.

Saflaştırılmış bir GFP standardına dayalı bir kalibrasyon eğrisine sahip gen aracı yazılımını kullanarak sonuçları nicelleştirin, Nick Oceana Bentham Miana, bitki büyümesi ve biyokütle birikimi için en uygun koşulları belirlemek için ticari olarak mevcut gübrelere batırılmış Rockwell plakaları üzerinde yetiştirildi. Fosforun varlığı, NICO Oceana'nın çimlenmesini ve büyümesini sağlamak için kritik öneme sahiptir. Bentham tohumları, bu altı haftalık bitkilerin gösterdiği gibi, ya %4.8 fosfor içeren bir gübre çözeltisinde ya da %0 fosfor içeren bir gübre çözeltisinde yetişir.

Agrobakteri büyümesi ve infiltrasyon ortamının bitki sağlığı ve protein üretimi üzerindeki etkileri, nikotiana içindeki GFP üretimi karşılaştırılarak incelenmiştir. Hamana bitkileri, üç farklı ortamda yetiştirilen agrobakteri kültürlerini barındıran PBI 4G FP ile vakumla sızmıştır. YEB veya LB ortamında gece boyunca büyütülen YEB AB ve LB kültürleri, düşük hızda santrifüjlendi ve MMA indüksiyon ortamında yeniden süspanse edildi veya gece boyunca YEB LB veya AB ortamında büyütüldü ve bu western blot sonucunda gösterildiği gibi Milli Q suyu ile doğrudan bir ila beş veya bir ila 10 oranında seyreltildi, YEB LB veya AB ortamında yetiştirilen ve Milli Q. Su ile seyreltilen bitkiler önemli bir fark göstermedi MMA'da santrifüjlenen ve yeniden süspanse edilen kültürlerden ortalama GFP üretiminde.

Bu nedenle, bitki infiltrasyonu için agrobakteri kültürlerinin seyreltilmesi için milli Q suyu önerilir ve 600 nanometrede 0.5'lik bir optik yoğunluk elde etmek için sonraki deneylerde rutin olarak kullanılmıştır. Daha sonra, agrobakteri hücre süspansiyon yoğunluğu ve zaman seyrinin hedef ekspresyon üzerindeki etkileri incelenmiştir. PBI 4G FP taşıyan agrobakterinin dört farklı hücre süspansiyon yoğunluğu değerlendirildi ve dört DPI'da western blot analizi için infiltrasyon veya DPI'den dört, yedi ve 10 gün sonra yaprak örnekleri toplandı, agrobakterinin farklı hücre süspansiyon yoğunlukları ile sızan bitkiler arasında GFP floresansında gözle görülür farklılıklar vardı yedi D-P-I-G-F-P'de 0.05'in 600'ünde GFP ekspresyonu gözlenmedi.

Floresan, hücre süspansiyonunda sızan bitkilerde benzerdi. Yoğunlukları 601.0 0.5 ve 0.1 idi, ancak 10 DPI'da kontrast olarak 0.05 A 600'de daha düşük implantlar infiltre edildi. Geçici protein üretimi için mevcut agrobacterium suşlarının çeşitliliğini artırmak için dört hücre süspansiyon yoğunluğundan herhangi biri ile sızan bitkiler arasında GFP üretiminde herhangi bir fark gözlenmemiştir.

Nicotiana Benham miana bitkileri, dört yalama km KBI vektörünü barındıran yedi farklı agro bakteri türü ile vakumla sızdı. Sızan yapraklar yedi DPI'da toplandı ve kinaz ekspresyon seviyesi Western blot ile tahmin edildi. Bu grafikte gösterildiği gibi, en yüksek liaz üretimi seviyesi GV 3 1 10, 1 A dört ve LBA 4 4 0 4 suşları ile küçük farklarla elde edilmiştir.

En düşük ekspresyon seviyesi C ile iken, beş, sekiz, C, bir ara liyaz üretimi, bir T 77, A T, sıfır altı suşları ile elde edildi ve bir T 10 liyaz enzimatik aktivitesi bir XMO Graham testi kullanılarak gösterildi. Saflaştırılmış bakteriyel liyaz proteini, enzim aktivitesi için pozitif bir kontrol olarak kullanıldı. A dört ve A T yedi yedi yabani tip agrobacterium suşları ile sızan nicotiana Benham miana bitkilerinin yedi DPI'da bodurluk, evcil hayvan uzaması ve kıvrılma ve yaprak kıvrılması gibi patolojik semptomlar gösterdiğini belirtmek ilginçtir.

T 10 suşunda yabani tip ile sızan nicotiana benham bitkilerinde semptomlar hafifti. GV 3 1 0 1 laboratuvar suşu ile sızan Nico Oceana Benham bitkilerinde herhangi bir semptom gözlenmedi. Yabani tip türlerde bitki biyokütle üretiminin karşılaştırılması, aynı büyüme koşulları altında, Nico Oceana Excela'dan üretilebilecek en yüksek yaprak biyokütlesinin, Nico Oceana'ya kıyasla yaklaşık iki kat daha yüksek olduğunu ortaya koymuştur.

Benham protein üretimi, agrobacterium suşu ile infiltre edilen Nico Oceana Benham, Nico Oceana Excelsior ve Nico Oceana Excela'da incelendi. GV 3 1 0 1 PBI 4G F-P-G-F-P birikimi içeren bütün sızmış yapraklarda yedi DPI olarak değerlendirildi. UV ışığı altında GFP ekspresyonunun görsel incelemesi, Nico Oceana Hamana ve Nico Oceana Excela'da eşit bir GFP dağılımı ve Nico Oceana Excelsior'da Nico Oceana Excelsior'un tüm yaprak alanına sızma zorluğu nedeniyle eşit olmayan bir dağılım gösterdi Bu sızmış yapraklarda yedi DPI'da GFP birikiminin Western blot analizi, GFP seviyesinin Nico Oceana Hamana'da Nico Oceana Excela ve Nico'ya göre daha yüksek olduğunu gösterdi Oceana Excelsior, Nico Oceana'daki düşük protein üretimi seviyesidir.

Excelsior, toplanan yaprakta eşit olmayan sızma ve biriken GFP'nin eşit olmayan dağılımından kaynaklanır. Vakum basıncının yapraklar üzerindeki etkisini test etmek için, Nico Oceana Benham bitkilerine, 30 veya 60 saniyelik bir vakum tutma süresinde 400, 200, 100 veya 50 milibar vakum basınçları altında PBI 4G FP içeren GV 3 1 0 1 agrobacterium suşu ile sızmıştır. 30 veya 60 saniye boyunca 5, 100 ve 200 milibarlık vakum basınçları uygulandığında GFP üretiminde hiçbir fark gözlenmedi ve bitki sağlığı üzerinde hafif veya hiç zararlı etki gözlenmedi.

Vakum süresinin hedef ekspresyon üzerindeki etkisi, sekiz saat boyunca PBI 4G FP barındıran bir A 600 / 0.5 GV 3 1 0 1 ile her saat bir Nico Oceana Benham bitkisinin bir dairesine sızarak değerlendirildi. Bu temsili sonuçta gösterildiği gibi aynı agrobakteri kültüründe, GFP üretim seviyesi her zaman benzerdi, sekiz saate kadar işaret ediyor, bu da bu süre zarfında agrobakterinin tek bir sarmallı DNA'yı başlatma yeteneğini koruduğunu gösteriyor. Birçok kimyasal ve monosakkaritin çeşitli bitki türlerinde geçici protein üretimini arttırdığı bildirilmiştir.

Bu çalışma aynı zamanda farklı aseto, krinon ve glikoz konsantrasyonlarının etkisini de değerlendirdi. Nico Oceana Benham'da geçici GFP proteini üretimi üzerine Ana, PBI 4G FP'yi barındıran agrobacterium suşu, GV 3 1 0 1 ile sızdı. Agro bakteriler YEB ortamında gece boyunca büyütüldü, santrifüjlendi ve belirtilen konsantrasyonlarda asetil seron ile% 2 glikoz içeren MMA'da veya belirtilen konsantrasyonlarda glikoz ile 200 mikromolar asetofenon içeren MMA'da 0.5'in 600'üne yeniden süspanse edildi. Burada gösterildiği gibi, bu bileşiklerin test edilen konsantrasyonlarının hiçbiri, indüksiyon ortamının asetofenon veya glikoz içermediği kontrole kıyasla GFP protein üretiminde önemli bir artışa neden olmamıştır.

Daha sonra, bir susturucu baskılayıcının birlikte infiltrasyonunun Nico Oceana'daki GFP ve HAC bir genlerinin geçici ekspresyonu üzerindeki etkisi. Benham yaprakları, infiltrasyondan önce agrobakteri GV'den önce incelendi, PBI 4G FP içeren üç bir on bir kültür ve domates gür dublör virüsünün viral susturucu baskılayıcı P 19'u sırasıyla bire bir, ikiye bir, üçe bir ve dörde bir oranlarında karıştırıldı. Yedi DPI'da Western blot analizinin sonuçlarıyla belirtildiği gibi, P 19'un varlığı, agrobacterium süspansiyonlarının ikisinin herhangi bir oranında nicotiana Benham Miana'da GFP üretimini artırmadı veya azaltmadı.

Ek olarak, iki viral gen susturucu baskılayıcı P 23 ve P 19'un HAC için transkripsiyon sonrası gen susturmanın önlenmesi üzerindeki etkisi araştırıldı. Fırlatma vektörünü taşıyan agrobakteri POSI, dört HAC, bir ve iki viral susturucu baskılayıcı plazmitten biri sırasıyla dörde bir oranında karıştırıldı ve Nicotiana Bentham Miana'ya birlikte sızdı. Sızan yaprak örnekleri üç ila sekiz DPI arasında toplandı.

Bu grafik, Western blot analizi ile belirlenen üç deneyden elde edilen bir ifadenin ortalama HAC seviyelerini göstermektedir. Nico Oceana Benham'ın P 23 veya P 19 ile birlikte sızması, 60 pi'de susturucu baskılayıcı kullanılmamasına kıyasla HAC bir üretiminde bir artışa neden oldu. Bu, P 23 ve P 19'un bu sistemde verimli olduğunu göstermektedir.

Ayrıca, susturucu bir baskılayıcının hem varlığında hem de yokluğunda, HAC bir protein üretim seviyesinin yedi DPI'da düşmeye başladığı gözlenmiştir. Bu, fırlatma vektörü ile sızan Nico Oceana Benham Miana'daki geçici protein üretimindeki düşüşün zamanlamasının hedefe özgü olduğunu göstermektedir. Son olarak, Agrobacterium hücre Bankası'nın stabilitesi, protein birikimini değerlendirmek için her yıl Agrobacterium hücre bankasının aynı partisi ile nicotiana benham bitkilerine sızarak değerlendirilir.

Bu temsili sonuçlar, HA bir protein üretiminin üç yıldan fazla bir süredir çok kararlı olduğunu göstermektedir. Nicotiana benam bitkilerinde ortalama HAC bir üretimi kilogram başına 651 artı veya eksi 49.4 miligramdır. Bu videoyu izledikten sonra, alt birim aşı, teo protein antikorları ve tanısal antijenlerin üretiminde kullanılabilecek büyük ölçekli rekombinant proteinlerin üretimi için agro infiltrasyon tekniğinin nasıl uygulanacağını iyi anlamış olmalısınız.

Bu prosedürü denerken, bitkinin çaprazlamasını hidroponik olarak kontrol etmeyi, canlı agro bakterileri kullanmayı, vakum basıncını ve asyonunu kontrol etmeyi ve protein ekspresyonunun aracını izlemeyi unutmamak önemlidir. Bir kez ustalaştıktan sonra, tarımsal filtrasyon tekniği, kontrollü koşullar altında uygun şekilde gerçekleştirilirse 24 saat içinde yapılabilir.