Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.

Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.

Bu yöntem, patojenik bakterilerin bitki hücrelerine salgılanan efektör adı verilen proteinleri kullanarak konakçı bitki hücrelerinin optimal durumunu nasıl bozabileceği gibi bitki-mikrop etkileşimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bakteriyel efektör proteinin, doğal ekspresyon sistemi kullanılarak bakteri hücresinde eksprese edilmesi ve daha sonra bakteri tip III salgılama sistemi yoluyla bitki hücresine verilmesidir. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi Nicotiana benthamiana ve Arabidopsis thaliana bitkilerini hazırlayın.

Daha sonra, sfGFP11 etiketine kaynaşmış plazmit taşıyan ve efektör genini Pseudomonas syringae pathovar domates CUCPB5500 suşuna dönüştürmek için standart elektroporasyon kullanın. En uygun zaman noktası ve ekspresyon seviyesi veya sfGFP'nin yeniden yapılandırılması, gerçekten efektör proteininize bağlıdır. Aşılama veya gözlem koşullarını optimize etmenizi öneririz.

Dönüştürülmüş bakteri hücrelerini King's B Agar plakalarının yüzeyine nazikçe yayın. Daha sonra plakaları iki gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, bir bakteri kolonisini, vektör için uygun bir antibiyotik ile King's B sıvı ortamına aşılayın.

200 rpm'de çalkalayarak gece boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, aşılanmış ortama otoklavlanmış gliserol ekleyin% 50'lik bir nihai konsantrasyona kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, plazmidi metin protokolünde belirtildiği gibi Agrobacterium tumefaciens suşu GV3101 hücrelerine dönüştürün.

Hücreleri iki gün boyunca 28 santigrat derecede takviye edilmiş LB Agar ortamında büyütün. LB Agar ortamından tek bir koloni kullanarak, 5 mililitre takviye edilmiş sıvı LB ortamını aşılayın. Ardından, hücreleri gece boyunca 200 rpm'de çalkalayarak 28 santigrat derecede büyütün.

Bundan sonra, hücreleri hasat etmek için 3000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve peleti 1 mililitre taze yapılmış sızma tamponunda tekrar süspanse edin. Bir spektrofotometre kullanarak, 600 nanometrelik bir absorbansta optik yoğunluk değerini ölçerek Agrobacterium hücrelerinin miktarını belirleyin.

Ardından, bakteri hücrelerinin OD 600'ünü 0.5'e ayarlamak için sızma tamponu kullanın. Kültürü oda sıcaklığında bir ila beş saat boyunca yumuşak bir külbütör üzerinde bırakın. Yapraklara sızmak için, her yaprağın ortasına bir delik açmak için 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.

500 mikrolitre Agrobacterium süspansiyonunu yaprağın adaksiyal tarafına dikkatlice enjekte etmek için iğnesiz 1 mililitrelik bir şırınga kullanın. Kalan bakteri süspansiyonunu yapraklardan silin ve sızan bölgenin sınırını işaretleyin. Sızan bitkileri iki gün boyunca 25 santigrat derece ve% 60 nemde bir büyüme odasında tutun.

Dönüştürülmüş Pseudomonas suşunu gliserol stoğundan King's B Agar ortamına uygun antibiyotikle sürün. İki gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Mannitol glutamat sıvı ortamında bir Pseudomonas hücresi halkasını aşılayın.

Kültürü gece boyunca 28 santigrat derecede 200 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. Bundan sonra, hücreleri hasat etmek için 3000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve peleti 10 milimolar magnezyum klorür çözeltisinde tekrar süspanse edin.

Ardından, optik yoğunluğu Nicotiana benthamiana yaprakları için 0,02'ye ve Arabidopsis yaprakları için 0,002'ye ayarlayın. Nicotiana benthamiana yaprakları için, Pseudomonas süspansiyonunu Agrobacterium'un iki gün önce sızdığı aynı alana sızın. Transgenik Arabidopsis için, Pseudomonas süspansiyonunu dört haftalık kısa gündüz yetişen iki yaprağa sızdırın.

Son olarak, Pseudomonas ile aşılanmış yapraklar için bir yaprak diski kesin. Pseudomonas'ın sızmasından sonraki belirli zaman noktalarında, tek bir bitkiden iki, iki santimetre kare yaprak diskini görüntülemek için konfokal bir lazer tarama sistemi kullanın. Yara ile öldürülen ölü hücreleri önlemek için hücreleri sızma deliğinden uzakta gözlemleyin.

Bakterilerden translokasyonlu efektörler sadece çok küçük miktarlarda bulunur. Bu nedenle, bir floresan sinyalini algılamak için lazer gücünü artırabilir ve bir floresan emisyonu elde edebilirsiniz. Bununla birlikte, bitki hücrelerinden gelen otofloresandan yanlış sinyal yakalamaktan kaçınmak için aşırı güç vermeyin.

Bu çalışmada, bakteriler tarafından konakçı hücrelere salgılanan efektörleri izlemek için floresan protein bazlı bir yaklaşım kullanılmıştır. Enfeksiyondan üç saat sonra bir Nicotiana benthamiana yaprağının konfokal lazer taraması burada gösterilmektedir. Sadece AvrB ile optimize edilmiş sfGFP eksprese eden hücreler herhangi bir floresan sinyali göstermezler.

Bununla birlikte, AvrB, sfGFP11 içeren enfekte hücrelerden GFP sinyalleri görülür. Bu, AvrB sfGFP11 kompleksinin sitozolde optimize edilmiş sfGFP ile sulandırıldığını ve daha sonra plazma zarına yer değiştirdiğini doğrular. Bu prosedürü denerken, bitki materyallerini sağlıklı tutmayı ve aktif hücreler için taze bakteri kültürü hazırlamayı unutmamak önemlidir.

Bu prosedürü takiben, bitki bağışıklık tepkileri sırasında bitki hücrelerindeki bakteri efektör proteinlerinin yanlış translasyon modifikasyonunu anlamak için reçine kan analizi gibi diğer yöntemler önerilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, enfekte olmuş bitki hücrelerinde tip III efektör dağıtımını nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bitki materyalleri ve bakteri kültürleri, laboratuvarınızın biyolojik olarak tehlikeli atık kriterlerine göre atılmalıdır ve KKD'nizi giymeyi unutmayın.