Split yeşil flüoresan Protein sistemi effectors görselleştirmek için bakteri enfeksiyonu sırasında teslim.
24 Mayıs 2018
Floresan protein temelli yaklaşımlar konak hücrelere bakteriler tarafından salgılanan effectors izlemek için zor olan. Bu tip III salgı sistemi ve floresan proteinler arasındaki uyumsuzluk kaynaklanmaktadır. Burada, bir en iyi duruma getirilmiş split superfolder GFP sistemi ana bitki hücre bakteriler tarafından salgılanan effectors görselleştirme için kullanılır.
Bu yöntem, patojenik bakterilerin bitki hücrelerine salgılanan efektör adı verilen proteinleri kullanarak konakçı bitki hücrelerinin optimal durumunu nasıl bozabileceği gibi bitki-mikrop etkileşimi alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin ana avantajı, bakteriyel efektör proteinin, doğal ekspresyon sistemi kullanılarak bakteri hücresinde eksprese edilmesi ve daha sonra bakteri tip III salgılama sistemi yoluyla bitki hücresine verilmesidir. Bu prosedüre başlamak için, metin protokolünde belirtildiği gibi Nicotiana benthamiana ve Arabidopsis thaliana bitkilerini hazırlayın.
Daha sonra, sfGFP11 etiketine kaynaşmış plazmit taşıyan ve efektör genini Pseudomonas syringae pathovar domates CUCPB5500 suşuna dönüştürmek için standart elektroporasyon kullanın. En uygun zaman noktası ve ekspresyon seviyesi veya sfGFP'nin yeniden yapılandırılması, gerçekten efektör proteininize bağlıdır. Aşılama veya gözlem koşullarını optimize etmenizi öneririz.
Dönüştürülmüş bakteri hücrelerini King's B Agar plakalarının yüzeyine nazikçe yayın. Daha sonra plakaları iki gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Bundan sonra, bir bakteri kolonisini, vektör için uygun bir antibiyotik ile King's B sıvı ortamına aşılayın.
200 rpm'de çalkalayarak gece boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Ertesi gün, aşılanmış ortama otoklavlanmış gliserol ekleyin% 50'lik bir nihai konsantrasyona kadar negatif 80 santigrat derecede saklayın. Başlamak için, plazmidi metin protokolünde belirtildiği gibi Agrobacterium tumefaciens suşu GV3101 hücrelerine dönüştürün.
Hücreleri iki gün boyunca 28 santigrat derecede takviye edilmiş LB Agar ortamında büyütün. LB Agar ortamından tek bir koloni kullanarak, 5 mililitre takviye edilmiş sıvı LB ortamını aşılayın. Ardından, hücreleri gece boyunca 200 rpm'de çalkalayarak 28 santigrat derecede büyütün.
Bundan sonra, hücreleri hasat etmek için 3000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve peleti 1 mililitre taze yapılmış sızma tamponunda tekrar süspanse edin. Bir spektrofotometre kullanarak, 600 nanometrelik bir absorbansta optik yoğunluk değerini ölçerek Agrobacterium hücrelerinin miktarını belirleyin.
Ardından, bakteri hücrelerinin OD 600'ünü 0.5'e ayarlamak için sızma tamponu kullanın. Kültürü oda sıcaklığında bir ila beş saat boyunca yumuşak bir külbütör üzerinde bırakın. Yapraklara sızmak için, her yaprağın ortasına bir delik açmak için 10 mikrolitrelik pipet ucu kullanın.
500 mikrolitre Agrobacterium süspansiyonunu yaprağın adaksiyal tarafına dikkatlice enjekte etmek için iğnesiz 1 mililitrelik bir şırınga kullanın. Kalan bakteri süspansiyonunu yapraklardan silin ve sızan bölgenin sınırını işaretleyin. Sızan bitkileri iki gün boyunca 25 santigrat derece ve% 60 nemde bir büyüme odasında tutun.
Dönüştürülmüş Pseudomonas suşunu gliserol stoğundan King's B Agar ortamına uygun antibiyotikle sürün. İki gün boyunca 28 santigrat derecede inkübe edin. Mannitol glutamat sıvı ortamında bir Pseudomonas hücresi halkasını aşılayın.
Kültürü gece boyunca 28 santigrat derecede 200 rpm'de çalkalayarak inkübe edin. Bundan sonra, hücreleri hasat etmek için 3000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Süpernatanı dökün ve peleti 10 milimolar magnezyum klorür çözeltisinde tekrar süspanse edin.
Ardından, optik yoğunluğu Nicotiana benthamiana yaprakları için 0,02'ye ve Arabidopsis yaprakları için 0,002'ye ayarlayın. Nicotiana benthamiana yaprakları için, Pseudomonas süspansiyonunu Agrobacterium'un iki gün önce sızdığı aynı alana sızın. Transgenik Arabidopsis için, Pseudomonas süspansiyonunu dört haftalık kısa gündüz yetişen iki yaprağa sızdırın.
Son olarak, Pseudomonas ile aşılanmış yapraklar için bir yaprak diski kesin. Pseudomonas'ın sızmasından sonraki belirli zaman noktalarında, tek bir bitkiden iki, iki santimetre kare yaprak diskini görüntülemek için konfokal bir lazer tarama sistemi kullanın. Yara ile öldürülen ölü hücreleri önlemek için hücreleri sızma deliğinden uzakta gözlemleyin.
Bakterilerden translokasyonlu efektörler sadece çok küçük miktarlarda bulunur. Bu nedenle, bir floresan sinyalini algılamak için lazer gücünü artırabilir ve bir floresan emisyonu elde edebilirsiniz. Bununla birlikte, bitki hücrelerinden gelen otofloresandan yanlış sinyal yakalamaktan kaçınmak için aşırı güç vermeyin.
Bu çalışmada, bakteriler tarafından konakçı hücrelere salgılanan efektörleri izlemek için floresan protein bazlı bir yaklaşım kullanılmıştır. Enfeksiyondan üç saat sonra bir Nicotiana benthamiana yaprağının konfokal lazer taraması burada gösterilmektedir. Sadece AvrB ile optimize edilmiş sfGFP eksprese eden hücreler herhangi bir floresan sinyali göstermezler.
Bununla birlikte, AvrB, sfGFP11 içeren enfekte hücrelerden GFP sinyalleri görülür. Bu, AvrB sfGFP11 kompleksinin sitozolde optimize edilmiş sfGFP ile sulandırıldığını ve daha sonra plazma zarına yer değiştirdiğini doğrular. Bu prosedürü denerken, bitki materyallerini sağlıklı tutmayı ve aktif hücreler için taze bakteri kültürü hazırlamayı unutmamak önemlidir.
Bu prosedürü takiben, bitki bağışıklık tepkileri sırasında bitki hücrelerindeki bakteri efektör proteinlerinin yanlış translasyon modifikasyonunu anlamak için reçine kan analizi gibi diğer yöntemler önerilebilir. Bu videoyu izledikten sonra, enfekte olmuş bitki hücrelerinde tip III efektör dağıtımını nasıl görselleştireceğinizi iyi anlamış olmalısınız. Bitki materyalleri ve bakteri kültürleri, laboratuvarınızın biyolojik olarak tehlikeli atık kriterlerine göre atılmalıdır ve KKD'nizi giymeyi unutmayın.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu çalışma, konak bitki hücrelerine salgılanan bakteriyel efektörleri görselleştirmek için optimize edilmiş bir bölünmüş süperklasör GFP sistemi sunmaktadır. Bu yöntem, floresan protein uyumluluğu ve tip-III salgılama sistemi ile ilgili zorlukları ele almaktadır.
Çalışmanın Ana Bileşenleri
Bilim Alanı
- Bitki-mikrop etkileşimleri
- Patojenik bakteriler
- Floresan protein görselleştirme
Arka Plan
- Patojenik bakteriler, konak bitki hücrelerini manipüle etmek için efektörler salgılar.
- Geleneksel floresan protein yöntemleri, uyumluluk sorunlarıyla karşı karşıyadır.
- Tip-III salgılama sistemi, efektör tesliminde kritik öneme sahiptir.
- Görselleştirme tekniklerinin optimize edilmesi araştırma için gereklidir.
Çalışmanın Amacı
- Bitki hücrelerinde bakteriyel efektörleri görselleştirmek için güvenilir bir yöntem geliştirmek.
- Bitki-mikrop etkileşimlerinin anlaşılmasını geliştirmek.
- Alandaki araştırmacılar için bir protokol sağlamak.
Kullanılan Yöntemler
- Nicotiana benthamiana ve Arabidopsis thaliana bitkilerinin hazırlanması.
- Efektör genlerini taşıyan plazmitlerin transformasyonu için elektroporasyon.
- Efektörlerin görselleştirilmesi için sfGFP11 etiketi kullanımı.
- Efektör proteinlerine göre inokülasyon ve gözlem koşullarının optimize edilmesi.
Ana Sonuçlar
- Konak hücrelerde bakteriyel efektörlerin başarılı görselleştirilmesi.
- Bölünmüş süperklasör GFP sisteminin uyumluluğunun gösterilmesi.
- Optimal sonuçlar için zamanlama ve ekspresyon seviyeleri hakkında içgörüler sağlanması.
- Bitki-mikrop etkileşimlerinde gelecekteki araştırmalar için bir protokol oluşturulması.
Sonuçlar
- Optimize edilmiş bölünmüş süperklasör GFP sistemi, efektörlerin çalışılmasını sağlamak için etkilidir.
- Bu yöntem, bitki-patojen etkileşimlerinde araştırmayı ilerletebilir.
- Daha fazla optimizasyon, görselleştirme sonuçlarını iyileştirebilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Visualizing effector protein delivery from bacterial pathogens into host cells is critical for understanding virulence mechanisms and identifying therapeutic targets in plant-microbe interactions. The split sfGFP system enables direct observation of translocated effectors via the native type III secretion system, overcoming fluorescent protein compatibility barriers. This approach supports target validation by confirming subcellular localization and dynamics of pathogen-derived proteins in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing effector translocation and host compartmentalization in real time.
- Operational Value: Uses native bacterial expression and secretion systems to preserve effector functionality and avoid artifacts from heterologous expression.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts at specific organelles, supporting assay standardization for effector localization studies.
- Operational Value: Compatible with confocal imaging platforms, allowing scalable screening of effector variants or mutants across plant models.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Provides disease-relevant system insights into effector targeting of plasma membrane and cytosol, informing mechanistic de-risking of virulence factors.
- Operational Value: Establishes a reproducible workflow from bacterial culture to plant infection and imaging, enabling cross-functional collaboration between microbiology and plant biology teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where effector delivery and host targeting must be confirmed prior to lead identification or mechanistic screening campaigns.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of effector function by linking secretion to subcellular localization in live plant cells.
- Screening: Enables assay readiness through standardized reconstitution of split GFP upon effector delivery, providing a binary readout of translocation success.
- Analytics: Generates spatially resolved fluorescence signals that allow comparison of effector variants or mutants in planta.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating effector activity in a native host context, supporting biomarker-aligned pathway analysis.
- Enterprise Reuse: Platform can be adapted to other effector-organelle pairs by swapping sfGFP11-effector and organelle-targeted sfGFP1-10OPT constructs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in effector functionality by confirming delivery and localization without reliance on surrogate systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized bacterial preparation, infiltration, and imaging conditions across laboratories.
- Strategic Value: Reduces biological risk in target selection by validating effector behavior in a native infection model.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization of effector-targeted strategies by confirming subcellular activity in planta.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial genetics, plant infiltration, and confocal microscopy.
- Dependent on fluorescence detection instrumentation and spectral separation capabilities to distinguish signal from plant autofluorescence.
- Necessitates cross-team standardization of bacterial culture conditions, OD adjustment, and infiltration timing for reproducible results.
- Must account for variation in effector expression, stability, and secretion efficiency across different pathogen strains and host species.
- Limited by low effector translocation levels, requiring optimization of laser power and gain to avoid false signals while maintaining sensitivity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
0:49
Preparation of Plant Materials and Pseudomonas Culture
2:09
Transient Expression of Organelle-targeted sfGFP1-10OPT in N. benthamiana
3:58
Inoculation of Pseudomonas and Observation of sfGFP Signal via Confocal Microscopy
5:46
Results: Split Superfolder Fluorescent Protein System: A Useful Tool to Examine the Dynamics of Effectors in Host Plants
6:32
Conclusion
