Kanser Hücre Invasion Uygulama ile Tümör Stromal mikroçevresinin Doku Mühendisliği

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, tümör hücresi invazyonunu değerlendirmek için fibroblastlardan doğal bir matriks oluşturmaktır. Bu işlem, öncelikle doğal matriks oluşturmak amacıyla fibroblastların plastik üzerinde sorbik asit ile zenginleştirilmiş bir ortamda büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, doğal matriks plastik büyüme yüzeyinden ayrılır ve serbest bırakılır; ardından bu matriks tümör hücreleri ile ekilir ve belirli bir süre sonra hava-sıvı arayüzüne kaldırılır.

Bu 3D kültürler, tümör hücresi invazyonunun histolojik analizi için hasat edilir. Nihayetinde, doğal fibroblast matriksinin tümör hücresi invazyonu üzerindeki etkileri immünohistokimyasal analiz ile değerlendirilebilir. Dolayısıyla, tipik 3D kültürler oluşturmak için bu tekniğin avantajı, türler arası tip 1 kolajen gibi sentetik veya yabancı substratlar olmadan, fibroblastların kendileri tarafından üretilen doğal matriksi değerlendirebilmemizdir. Altı kuyucuklu plakalardaki her kuyucuğa, taze hazırlanmış IC acid ile desteklenmiş fibroblast besiyerinde 200.000 fibroblast ekerek başlayın.

Hücreleri her iki ila üç günde bir, iki ila beş mililitre taze besiyeri ile besleyin. Altı haftanın sonunda, çıplak gözle görülebilen ve hücre dışı matrise gömülü kalın bir hücre tabakası oluşacaktır. Kullanılan hücrelere bağlı olarak, görünür matris daha erken veya daha geç oluşabilir ve burada görüldüğü gibi kaptan ayrılmaya başlayabilir.

Bu tabakayı doku kültürü plağından ayırmak için, matrisin çevresini bir mililitrelik bir mikropipet ucuyla nazikçe kazıyın ve ardından matrisin kenarlarını kuyucuğun merkezine doğru itin. Hücreler ve doğal matris plaka yüzeyinden kolayca ayrılmalı ve artık besiyerinde yüzüyor olmalıdır. Kendi üzerine katlanmasını önlemek için doğal matrisi besiyeri içinde yayın.

Çekme kuvveti ve doğal yeniden şekillenme nedeniyle, iki ila üç günde bir besiyerini değiştirmeye devam ederek yerli matrisin beş gün boyunca yüzmesini ve yeniden şekillenmesini sağlayın. Matris önemli ölçüde büzülecek ve daha küçük ancak daha kalın bir yerli matrise dönüşecektir; bu aşamadan sonra invazyon analizi için kullanıma hazır hale gelecektir.

İnvazyon deneyi için, önce küt uçlu pens kullanarak doğal matrisi nazikçe bir naylon ağa aktarın. Matris ağın üzerine yerleştirildiğinde, bir mililitrelik mikropipet ucu ve küt uçlu pens kullanarak matrisi mümkün olduğunca düz duracak şekilde nazikçe yayın.

Ardından, matris başına bir adet steril klonal silindirin bir ucuna az miktarda Vazelin sürün. Daha sonra, doğal matris ile klonal halkalar arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için silindirleri Vazelinli kısımları aşağı gelecek şekilde doğal matrislerin üzerine yerleştirin. Şimdi silindirlere, carat site büyüme ortamında bulunan 250,000 kutanöz skuamöz hücreli karsinom veya SCC hücresi ekleyin.

Kutanöz SCC hücreleri doğal matris üzerine yerleştikten sonra silindirleri çıkarın; ardından naylon ağlı doğal matrisi ve kutanöz SEC hücrelerini hava-sıvı ara yüzüne ve bükülmüş paslanmaz çelik tel örgü desteğin üzerine kaldırın. Sonra olarak, ortam seviyesi doğal matrisin altına değene kadar, sorbik asit ile desteklenmiş Keratinosit büyüme besiyeri ekleyin; besiyerini iki ila üç günde bir değiştirin ve kutanöz SCC hücrelerinin ekiminden sonraki 7. ve 14. günlerde hasat yapın. Bu teknik, tümör hücrelerinin farklı 3D stromal ortamlar altındaki invaziv davranışlarının incelenmesi ve karşılaştırılması olasılığını ortaya koymaktadır.

Bu görüntülerde görüldüğü üzere, sağ panellerdeki doğal matrisleri aşırı eksprese eden C seven hücrelerinde, sol panellerdeki C seven eksik RDEB kontrollerine kıyasla RDEB kütanöz SCC keratinositlerinin invazyonu önemli ölçüde yavaşlamıştır. Bu tekniğin geliştirilmesi, araştırmacıların fibroblastlar tarafından üretilen Doğal Matrisin, invazyon gibi tümör hücresi süreçleri üzerindeki etkisini doğrudan değerlendirmesine olanak sağlamıştır.