Kanser Hücre Invasion Uygulama ile Tümör Stromal mikroçevresinin Doku Mühendisliği

Aşağıdaki prosedürün genel amacı, tümör hücresi istilasını değerlendirmek için fibroblastlardan doğal bir matris oluşturmaktır. Bu, ilk olarak, doğal matrisi oluşturmak için sorbik asitle zenginleştirilmiş bir ortamda plastik üzerinde fibroblastların büyütülmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, doğal matris plastik yetiştirme yüzeyinden ayrılır ve serbest bırakılır ve daha sonra bu matris tümör hücreleri ile tohumlanır ve sabit bir süre sonra hava sıvı arayüzüne kaldırılır.

Bu 3D kültürler, tümör hücresi istilasının histolojik analizi için toplanır. Sonuç olarak, doğal fibroblast matriksinin tümör hücre invazyonu üzerindeki etkileri immünohistolojik analiz ile değerlendirilebilir. Bu nedenle, 3D tipik kültürler oluşturmak için bu tekniğin avantajı, fibroblastların kendileri tarafından üretilen doğal matrisi, çapraz türler gibi sentetik veya yabancı substratların yokluğunda değerlendirebilmemizdir. tip bir kollajen Taze hazırlanmış IC asit ile desteklenmiş fiberblast ortamında altı oyuklu plakada kuyu başına 200.000 fibroblast tohumlayarak başlayın.

İki fosfat, hücreleri her iki ila üç günde bir iki ila beş mililitre taze ortamla yeniden düzenler. Altı haftanın sonunda çıplak gözle görülebilen hücre dışı matriks içine gömülü kalın bir hücre tabakası oluşacaktır. Kullanılan hücrelere bağlı olarak, görünür matris er ya da geç oluşabilir ve burada görüldüğü gibi çanaktan ayrılmaya başlayabilir.

Bu tabakayı doku kültürü plakasından çıkarmak için, matrisin çevresini bir mililitrelik mikro pipet ucuyla nazikçe kazıyın ve ardından matrisin kenarlarını kuyunun merkezine doğru itin. Hücreler ve doğal matris, plaka yüzeyinden kolayca ayrılmalı ve şimdi ortamda yüzüyor olmalıdır. Kendi içine katlanmasını önlemek için yerel matrisi ortamın içine yayın.

Yerel matrisin beş gün boyunca yüzmesine ve yeniden şekillenmesine izin verin, çekme mukavemeti ve içsel yeniden şekillenme nedeniyle ortamı her iki ila üç günde bir değiştirmeye devam edin. Matris büyük ölçüde büzülecek ve daha küçük ama daha kalın bir yerel matrise indirgenecek ve bu sırada kullanılmaya hazır olacaktır. İstila tahlili için.

İstila tahlili için. İlk olarak, doğal matrisi nazikçe bir naylon ağa aktarmak için kör forseps kullanın. Ağa girdikten sonra, matrisi mümkün olduğunca düz duracak şekilde nazikçe yaymak için bir mililitrelik mikro pipet ucu ve künt forseps kullanın.

Daha sonra, matris başına bir steril klonal silindirin bir ucuna az miktarda Vazelin sürün. Ardından, doğal matris ile klonal halkalar arasında sıkı bir sızdırmazlık sağlamak için silindirleri Vazelin tarafı aşağı bakacak şekilde yerel matrislerin üzerine yerleştirin. Şimdi silindirlere karat bölgesi büyüme ortamında 250.000 kutanöz skuamöz hücreli karsinom veya SCC hücresi ekleyin.

Kutanöz SCC hücreleri doğal matris üzerine yerleştikten sonra, silindirleri çıkarın, ardından naylon ağ doğal matrisi ve kutanöz SEC hücrelerini hava sıvı arayüzüne ve bükülmüş bir paslanmaz çelik tel örgü desteğine kaldırın. Son olarak, ortam seviyesi doğal matrisin dibine değene kadar sorbik asit ile takviye edilmiş Keratinosit büyüme ortamını ekleyin, ortamı her iki ila üç günde bir değiştirin ve kutanöz SCC hücrelerinin tohumlanmasından yedi ve 14 gün sonra hasat edin. Bu teknik, farklı 3D stromal ortamlar altında tümör hücrelerinin invaziv davranışını inceleme ve karşılaştırma olasılığını açar.

Bu görüntülerde görüldüğü gibi, RDEB kutanöz SCC keratinositlerinin invazyonu, sol panellerdeki C yedi eksik RDEB kontrollerine kıyasla, sağ panellerde doğal matrisleri eksprese etmeye göre C yedide önemli ölçüde gecikmiştir. Bu tekniğin geliştirilmesi, araştırmacıların fibroblastlar tarafından üretilen Native Matrix'in invazyon gibi tümör hücresi süreçleri üzerindeki etkisini doğrudan değerlendirmelerini sağlamıştır.