Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Bu prosedürün genel amacı, hazır proteomik kullanarak kütle spektrometresi ile numuneler arasındaki birçok proteinin konsantrasyonlarını karşılaştırmaktır. Bu, peptit karışımları oluşturmak için önce her numuneden proteinin sindirilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, iki numune karıştırılır ve karışık numunedeki peptitler fraksiyonlanır ve tuzdan arındırılır.

Daha sonra, karışık numune daha sonra kütle spektrometresi ile analiz edilir. Son olarak, peptitler, MS iki spektrumunun numunelerdeki tüm potansiyel peptitlerin bir hedef tuzak veri tabanıyla karşılaştırılmasıyla tanımlanır ve numuneler arasındaki nispi peptit bolluğu ölçülür. Sonuç olarak, hazır proteomik, karmaşık numuneler arasındaki birçok proteinin nispi bolluğunun ölçülmesini sağlar.

İndirgeyici demetilasyonun iLite gibi kararlı izotop etiketleme için diğer yöntemlere göre temel avantajları, hazırın belirli bir trois veya sentetik bir ortam gerektirmeyen hızlı, ucuz ve doğru bir yöntem olmasıdır, yani hemen hemen her tür numuneye uygulanabilir. Başlamak için, proteinleri çökeltmek için hücreleri yatıştırmak için sonikasyon veya bir Fransız presi kullanarak bir miligram hücresel protein ve 500 mikrolitre hazırlayın. Dört hacim proteine bir hacim tri klorotik asit ekleyin ve 10 dakika buz üzerinde soğutun.

Dört santigrat derecede beş dakika boyunca 12.000 Gs'de santrifüjleyin ve süpernatanı çıkarın. Sonra Resus'a bir mililitre buz gibi soğuk aseton kullanın. İkinci kez döndürmeden önce peleti askıya alın.

Snat'ı aspire ettikten sonra, proteinleri denatüre etmek ve boya sülfür bağlarını azaltmak için peleti 56 santigrat derece ısı bloğunda kurutun. Yeniden kullanmak için 500 mikrolitre denatüre etme ve redüksiyon tamponu kullanın. Proteinleri mililitre başına yaklaşık iki miligrama yeniden süspanse edin.

Proteinleri 56 santigrat derecede 30 dakika, ardından oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Alkilat içermeyen sülfür gruplarının yanına, 500 mikrolitre proteine 25 mikrolitre taze hazırlanmış 0.3 molar IDO asetamid ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika inkübe edin. İnkübasyondan sonra, 10 mikrolitre üç milimolar DTT ekleyerek reaksiyonu söndürün.

TCA çökelmesini takiben alkillenmiş proteinleri sindirmek için alkillenmiş proteinleri eksi 80 santigrat derecede saklayın, proteini yeniden süspanse etmek için 50 milimolar heis pH 8.2'de bir molar üre kullanın. Mikrolitre başına iki mikrogram konsantrasyonda su içinde bir Lysol, endo proteinaz veya ly C stok çözeltisi hazırlayın ve enzimi, mikrolitre başına 10 nanogramlık bir nihai konsantrasyonda sindirilmiş proteine ekleyin, numuneler oda sıcaklığında altı saat veya gece boyunca bırakılır. 40 mikrolitre 50 milimolar asetik asit içinde 20 mikrogram sıralama dereceli tripsin askıya alın ve liz sindirim reaksiyonuna beş mikrolitre ekleyin.

Alkillenmiş proteinlere 37 santigrat derecede altı saat inkübe edin. % 0.5'lik bir nihai konsantrasyona tri Flor, asetik asit veya TFA ekleyin% Bir ekstraksiyon manifolduna bir C 18 sütunu takın. Ardından sütunu ıslatmak için altı mililitre aseto nitril veya bir CN kullanın.

Daha sonra, mümkün olan en yüksek akış hızıyla, sütunu dengelemek için altı mililitre% 0.1 TFA kullanmadan önce sütunu yıkamak için altı mililitre% 80 CN% 0.1 TFA kullanın, vakum basıncını durdurun ve 500 mikrogram peptit yükleyin dakikada yaklaşık bir mililitre akış hızında kolona peptitler. Peptitler kolona bağlandıktan sonra, vakumu yeniden başlatın ve mümkün olan en yüksek akış hızıyla,% 0.1 TFA ve ardından onko, indirgeyici, dim metilasyon veya hazır etiketleme yapmak için kolonu yıkamak için üç mililitre sitrik asit tamponu kullanın. Kimyasal bir kaputun altında, her biri 12 mililitre hafif ve ağır hazır tamponlar Tom Methylate peptid içermez.

Bir araç, dakikada bir mililitrelik bir akış hızında kolona 10 mililitre hafif veya ağır hazır tampon ekleyin. İkinci bir 10 mililitre alikot uyguladıktan sonra. Etiketlemeyi sağlamak için altı mililitre %0,1 TFA, ardından bir mililitre %0,5 asetik asit kullanın.

Proteinleri ayrıştırmak için sütunu yıkamak için, vakumu durdurun ve dakikada 0,5 mililitrelik bir akış hızında bir CN %0,5 asetik aside bir mililitre %40 uygulayın. Daha sonra istenirse beş mililitrelik bir şırınga ile bir mililitre %80 CN %0.5 asetik asit elute ekleyin. Ağır ve hafif etiketli peptit numunelerinin bire bir oranını karıştırın ve hem hem de hafif etiketlemenin etkili olduğundan emin olmak için kütle spektrometresi ile nicelleştirin, peptit karışımını önce bir C 18 HPLC kolonuna uygulayarak fraksiyonlayın.

Daha sonra, sütunu beş dakika boyunca yıkamak için% 5 bir CN kullandıktan sonra, peptitleri eşit fraksiyonlarda çıkarmak için 60 dakika boyunca% 35 ila% 35 CN'lik bir gradyan kullanın. 96 oyuklu bir plakada, ardından bir dakika boyunca% 90 A CN. Dört dakikalık ek bir %90A CN'den sonra, sütunu yeniden dengelemek için %5 A CN kullanın.

Daha sonra fraksiyonları aşağıdaki şekilde vakum santrifüjü ile birleştirin. Çözücüyü birleşik fraksiyonlardan çıkarın. Daha sonra Resus'a 130 mikrolitre bir molar üre% 0.5 TFA kullanın.

Peptitleri aşağıdaki fraksiyonlardan askıya alın ve yeniden askıya alınan fraksiyonlar üzerinde ekstraksiyon yapmak, durdurmak ve devam ettirmek için fraksiyon setini eksi 20 santigrat derecede saklayın. 200 mikrolitrelik pipet uçlarından C 18 kademeli uçlu mikro kolonları, iç çapı 1,07 milimetre olan iki adet C 18 disk kullanarak paketleyin. Aşama uçlarını mikro santrifüj tüplerine yerleştirin ve 130 mikrolitre metanol ekleyin ve sıkın.

Daha sonra, uçları dengelemek için 130 mikrolitre %0.1 TFA kullandıktan sonra tekrar döndürmeden önce 130 mikrolitre %80 CN %0.5 asetik asit ekleyin, peptit karışımını uçlara aktarın ve yıkayın. Önce 130 mikrolitre %0.1 TFA, ardından 40 mikrolitre %0.1 TFA ile. Daha sonra peptitleri elüte etmek için 40 mikrolitre% 0.5 asetik asit.

İlk olarak, bir CN% 0.5 asetik aside 20 mikrolitre% 40 ekleyin. Daha sonra 20 mikrolitre% 80 CN% 0.5 asetik asit. Mikro kılcal sıvı kromatografisi gerçekleştirmek için HTE'leri ve vakumlu filtratı kurumaya bırakın.

Tandem kütle spektrometresi veya LCMMS, proteinleri mikrolitre başına yaklaşık bir mikrogram konsantrasyona yeniden süspanse etmek için% 5 formik asit,% 5 A CN kullanarak başlar. 100 mikrometreye 20 santimetre C 18 üzerine yaklaşık bir mikrogram peptit uygulayın. Ters fazlı HPLC kolonu ve dakikada yaklaşık 300 nanolitre akış hızında 0.1 %25 formik asit içinde %altı ila 22 oranında bir CN gradyanı kullanılarak elüte, 75 ila 100 dakika boyunca uygulanır.

Yüksek çözünürlüklü ve yüksek kütle doğruluğuna sahip bir kütle spektrometresi kullanın ve Ms.Ms Spectra ham dosyalarını SE quest gibi bir algoritma ile teorik bir veri tabanına karşılaştırarak numunedeki peptitleri tanımlayın, burada gösterilen parametreleri kullanarak gerçek ve ters yönelimlerde açık okuma çerçeveleri veri tabanı ile peptitleri hedef tuzak gibi bir yöntemle %1 yanlış keşif oranına filtreleyin. Tanımlanan peptitleri ölçmek için, MS bir ekstrakte edilmiş iyon kromatogramının ağır ve hafif çiftlerinin alanlarını hesaplayın ve peptit sinyal-gürültü oranları, yalnızca ortalama sinyal-gürültü oranı beşin üzerinde olduğunda peptit çiftlerini içerir. İki numunedeki bir peptidin nispi bolluğunu, aynı peptidin ağır ve hafif versiyonlarının MS bir tepe alanlarının oranı olarak ölçün, nispi protein bolluklarını, %1'lik bir peptit yanlış keşif oranına filtrelendiğinde proteindeki tüm peptitler için medyan MS bir tepe alan oranı olarak hesaplayın.

11.194 benzersiz peptit dizisi içeren ağır ve hafif etiketli kültürlerden elde edilen bir c fito fermenti karışımının hazır etiketleme verimliliği %98 idi. Fraksiyone edilmemiş viser protein lizat benzer şekilde analiz edildi. Protein ekspresyonu farklılıkları, ağır ve hafif numunelerin çok çeşitli karıştırma oranlarında karıştırılma oranlarını tekrarlanabilir bir şekilde yansıtır. Spesifik olarak, proteinlerin% 99'unun fo değişimi, bir ila 10 ve 10 ila bir örnekteki bire bir karışık numuneler için 1.6'dan daha küçüktü.

Proteinlerin% 99'u beklenen oranın 3.8 katı içindeydi ve bire bir karışımdan daha uzak bir mesafede standart sapmada bir artış olduğunu gösteriyordu. Hazır etiketleme Clostridium phyto ferment proteomuna uygulandığında, 2000'den fazla protein, glikoz protein katında büyüyen replikat kültürler için iki katlı seviyelerde ölçülen %94 protein ile ölçüldü. Yinelenen kültür çiftleri için yapılan değişiklikler de yüksek oranda korelasyon gösterdi.

Bu deneyler birlikte, Ready proteomics'in karmaşık numuneler arasındaki protein ekspresyon farklılıklarını ölçmek için doğru ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu desteklemektedir. Bu teknik hemen hemen her tür numuneye uygulanabildiğinden, proteomik alanındaki araştırmacıların yeni mikroplar, balıklar ve memeli hücreleri de dahil olmak üzere her türlü numunedeki prote ekspresyon değişikliklerini keşfetmelerinin yolunu açtı.