Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Bu prosedürün genel amacı, ready proteomics kullanarak kütle spektrometrisi aracılığıyla birçok proteinin konsantrasyonlarını örnekler arasında karşılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle her örnekteki proteinin sindirilerek peptit karışımlarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, iki örnek karıştırılır ve karışım örneğindeki peptitler fraksiyonlara ayrılarak tuzdan arındırılır.

Ardından, karışımlı numune kütle spektrometrisi ile analiz edilir. Son olarak, MS iki spektrumları numunelerdeki tüm potansiyel peptidlerden oluşan bir hedef-tuzak (target-decoy) veri tabanıyla karşılaştırılarak peptidlerin kimliği belirlenir ve numuneler arasındaki peptidlerin göreceli bolluğu miktarla belirlenir. Nihayetinde, hazır proteomik, karmaşık numuneler arasında birçok proteinin göreceli bolluğunun miktar tayinine olanak sağlar.

Redüktif demetilasyonun iLite gibi diğer stabil izotop işaretleme yöntemlerine göre temel avantajı; hızlı, ucuz ve doğru bir yöntem olması ve spesifik besiyerleri veya sentetik bir ortam gerektirmemesidir; bu da neredeyse her türlü örneğe uygulanabileceği anlamına gelir. Başlamak için, hücreleri parçalamak ve proteinleri çöktürmek amacıyla sonikasyon veya French press kullanarak bir miligram hücresel protein ve 500 µL hazırlayın. Dört hacim proteine bir hacim trikloroasetik asit ekleyin ve 10 dakika boyunca buz üzerinde soğutun.

4 °C'de beş dakika boyunca 12,000 Gs'de santrifüjleyin ve süpernatantı uzaklaştırın. Ardından, pelletle ikinci kez santrifüj yapmadan önce, pelleti yeniden süspande etmek için 1 mL buz gibi soğuk aseton kullanın.

Süpernatant aspire edildikten sonra, proteinleri denatüre etmek ve boya sülfit bağlarını azaltmak için peleti 56 °C'lik bir ısı bloğunda kurutun. Yeniden süspansiyon için 500 µL denatürasyon ve redüksiyon tamponu kullanın. Proteinleri yaklaşık 2 mg/mL konsantrasyona gelecek şekilde yeniden süspanse edin.

Proteinleri 56 °C'de 30 dakika, ardından oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edin. Daha sonra, serbest sülfid gruplarını alkilleştirmek için, 500 µL proteine suda taze hazırlanmış 0,3 M IDO asetamidden 25 µL ekleyin ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika inkübe edin. İnkübasyonun ardından, 10 µL 3 mM DTT ekleyerek reaksiyonu durdurun.

Alkilleştirilmiş proteinleri -80 °C'de saklayın; TCA çöktürmesini takiben alkilleştirilmiş proteinleri sindirmek için proteinleri yeniden süspande etmek amacıyla 50 mM HEPES pH 8.2 içerisinde 1 M üre kullanın. Su içerisinde 2 µg/µL konsantrasyonunda Lys-C endoproteinaz stok çözeltisi hazırlayın ve enzimi sindirilen proteine 10 ng/µL nihai konsantrasyonda ekleyin; örnekleri oda sıcaklığında altı saat veya gece boyunca bekletin. Sekanslama saflığındaki 20 µg tripsini 40 µL 50 mM asetik asit içerisinde süspande edin ve Lys-C sindirim reaksiyonuna beş µL ekleyin.

Alkilleştirilmiş proteinler için 37 °C'de altı saat inkübe edin. Son konsantrasyonu 0.5% olacak şekilde trifloroasetik asit veya TFA ekleyin. Bir ekstraksiyon manifolduna C 18 kolon takın. Ardından kolonu ıslatmak için altı mililitre asetonitril veya ACN kullanın.

Ardından, mümkün olan en yüksek akış hızıyla, kolonu yıkamak için altı mililitre %80 a CN 0,1%TFA kullanın; ardından kolonu dengelemek için altı mililitre 0,1%TFA kullanın, vakum basıncını durdurun ve yaklaşık dakika başına bir mililitre akış hızında 500 mikrogram peptidi kolona yükleyin. Peptitler kolona bağlandığında, vakumu yeniden başlatın ve onco, redüktif, dim metilasyon veya hazır etiketleme işlemlerini gerçekleştirmek amacıyla kolonu yıkamak için mümkün olan en yüksek akış hızıyla önce 0,1%TFA, ardından üç mililitre sitrik asit tamponu kullanın. Bir kimyasal çeker ocak altında, peptitsiz metilasyon için 12'şer mililitre hafif ve ağır hazır tamponlar hazırlayın.

A aşamasında, kolona bir mililitre/dakika akış hızında 10 mililitre hafif veya ağır hazır tampon ekleyin. İkinci bir 10 mililitrelik alikotu uyguladıktan sonra, etiketlemeyi sağlamak için önce altı mililitre %0,1 TFA, ardından bir mililitre %0,5 asetik asit kullanın.

Proteinleri elüe etmek için kolonu yıkamak üzere vakumu durdurun ve 0,5 mililitre/dakika akış hızında 1 mL %40 aCN 0,5% asetik asit uygulayın. Ardından, istenirse beş mililitrelik bir şırınga ile 1 mL %80 aCN 0,5% asetik asit ekleyerek elüye edin. Ağır ve hafif işaretli peptit örneklerini bire bir oranda karıştırın ve hem ağır hem de hafif işaretlemenin etkili olduğunu doğrulamak için kütle spektrometresi ile miktar tayini yapın; ardından peptit karışımını önce bir C 18 HPLC kolonuna uygulayarak fraksiyonlara ayırın.

Ardından, kolonu beş dakika boyunca %5 a CN ile yıkadıktan sonra, peptidleri eşit fraksiyonlar halinde elüe etmek için 60 dakika boyunca %5'ten %35'e bir a CN gradyanı uygulayın. Bir 96 kuyucuklu plakada, bunu bir dakika boyunca %90 A CN ile takip edin. Ek dört dakikalık %90 A CN uygulamasının ardından, kolonu yeniden dengelemek için %5 a CN kullanın.

Ardından fraksiyonları vakum santrifüjü ile şu şekilde birleştirin. Birleştirilen fraksiyonlardaki çözücüyü uzaklaştırın. Daha sonra resüspansiyon için 130 µL 1 M üre %0,5 TFA kullanın.

Aşağıdaki fraksiyonlardaki peptitleri süspande edin ve resüspande edilen fraksiyonlar üzerinde kesikli ekstraksiyon (stop and go extraction) gerçekleştirmek için fraksiyon setini -20 °C'de saklayın. 200 µL'lik pipet uçlarını, bunları doldurmak için 1,07 mm iç çaplı iki adet C 18 disk kullanarak C 18 stage tip mikro kolonlar haline getirin. Stage tip'leri mikro santrifüj tüplerine yerleştirin, 130 µL metanol ekleyin ve santrifüjleyin.

Ardından, uçları dengelemek için 130 µL %0.1 TFA kullandıktan sonra, peptit karışımını uçlara aktarın ve yıkayın; önce 130 µL %0.1 TFA, ardından 40 µL %0.1 TFA ile. Daha sonra tekrar santrifüj etmeden önce 130 µL %80 CN %0.5 asetik asit ekleyin. Son olarak peptitleri elüye etmek için 40 µL %0.5 asetik asit kullanın.

Öncelikle, %0,5 asetik asit içeren CN'ye 20 µL %40 ekleyin. Ardından %0,5 asetik asit içeren CN'ye 20 µL %80 ekleyin. Mikro kapiler sıvı kromatografisi gerçekleştirmek için IIT'leri birleştirin ve vakumlu filtrasyonla kurutun.

Tandem kütle spektrometrisi veya L-C-M-S-M-S, proteinleri yaklaşık bir microgram per microliter konsantrasyona yeniden çözmek için %5 formic acid ve %5 A CN kullanılarak başlatılır. Yaklaşık bir microgram peptit, 100 micrometer by 20 centimeter C 18 ters faz HPLC kolonuna uygulanır ve yaklaşık 300 nanoliters per minute akış hızında, 75 ila 100 dakika boyunca uygulanan, 0.1 %25 formic acid içinde %6 ila %22 A CN gradyanı kullanılarak elüe edilir.

Yüksek çözünürlüğe ve yüksek kütle doğruluğuna sahip bir kütle spektrometresi kullanın ve Ms.Ms Spektra ham dosyalarını, gerçek ve ters yönelimlerdeki açık okuma çerçeveleri veritabanıyla birlikte, burada gösterilen parametreleri kullanarak SE quest gibi bir algoritma ile teorik bir veritabanıyla karşılaştırarak örnekteki peptitleri tanımlayın; peptitleri target decoy gibi bir yöntemle %1'lik bir yanlış keşif oranıyla filtreleyin. Tanımlanan peptitleri miktarlandırmak için, MS birle çekilmiş iyon kromatogramlarının ağır ve hafif çiftlerinin alanlarını ve peptit sinyal-gürültü oranlarını hesaplayın; yalnızca ortalama sinyal-gürültü oranları beşin üzerinde olan peptit çiftlerini dahil edin. Bir peptidin iki örnekteki göreli bolluğunu, aynı peptidin ağır ve hafif versiyonlarının MS bir pik alanlarının oranı olarak miktarlandırın; göreli protein bolluklarını, %1 peptit yanlış keşif oranına göre filtrelendiğinde, proteindeki tüm peptitler için medyan MS bir pik alanı oranı olarak hesaplayın.

Ağır ve hafif işaretli kültürlerden elde edilen ve 11.194 benzersiz peptit dizisi içeren c phyto ferment karışımının etiketleme verimliliği %98 olarak belirlenmiştir. Fraksiyona ayrılmamış visier protein lizatı da benzer şekilde analiz edilmiştir. Protein ekspresyon farkları, geniş bir karıştırma oranları aralığında, ağır ve hafif örneklerin karıştırılma oranlarını tekrarlanabilir şekilde yansıtmaktadır. Özellikle, bir-birle karıştırılan örneklerde, bire on ve ona bir karıştırılan örneklerdeki proteinlerin %99'unun kat izleği (fold change) 1,6'dan daha düşük çıkmıştır.

Proteinlerin %99'u, bire bir karışımdan uzaklaştıkça standart sapmada artış görülmekle birlikte, beklenen oranın 3,8 katı dahilindeydi. Hazır etiketleme Clostridium phyto ferment proteomuna uygulandığında, glikoz protein katında büyüyen replika kültürler için %94 proteini iki kat düzeyinde ölçülmek üzere 2000'den fazla protein nicelendirildi. Kültürlerin çift kopyaları için meydana gelen değişimler de yüksek korelasyon gösterdi.

Bu deneylerin tamamı, Ready proteomiğinin karmaşık örnekler arasındaki protein ekspresyon farklarını nicelendirmek için doğru ve tekrarlanabilir bir yöntem olduğunu desteklemektedir. Bu teknik neredeyse her türlü örneğe uygulanabildiği için, proteomik alanındaki araştırmacıların yeni mikroplar, balıklar ve memeli hücreleri dahil olmak üzere her türlü örnekte protein ekspresyon değişikliklerini keşfetmesinin önünü açmıştır.