Name: Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-07-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Öğrenin indirgeyici dimetilasyon ile kütle spektrometrisi kullanarak protein konsantrasyonlarını karşılaştırma yöntemini. Bu hızlı ve uygun maliyetli teknik karmaşık örneklerde nicel proteomik analizi sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yardım ve rehberlik için SP Gygi ve GM Church'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, ACT'ye bir CNRS başkanı tarafından desteklenmiştir.

NOT: Bu yöntem daha önce 12 tarif edilmiştir. 1.. Protein İzolasyonu Tercihen, French pres, boncuk dayak veya sonikasyon gibi fiziksel yöntemlerle, yokedici hücreler tarafından hücre protein 1 mg hazırlayın. Enzim kütle spektrometresi ölçümleri bulandırabilir çünkü lizozim-aracılı hücre parçalanmasını önlemek. Proteinlerin 2. TCA Yağış Proteinlerini çöktürmek için 10 dakika süre ile buz üzerinde 4 hacim protein ve soğuk 1 hacim trikloroasetik asit (TCA) ilave edin. Santrifüj, 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 12,000 x g ve supernatant çıkarın. 4 ° C&#39;de 5 dakika boyunca 12,000 xg&#39;de buz soğukluğunda aseton ve santrifüj 1 ml pelletini Süpernatantı ve 15 dakika boyunca pelet kurumaya bankta tüp ters. -80 ° C&#39;de saklayın protein granül 3.. Doğasını Proteinler ve disülfıt bağlarını azaltır Reproteinler askıya 500 ul denatürasyon ve indirgeme tamponu içinde ~ 2 mg / ml (50 mM HEPES pH 8.5, 5 mM DTT, 4 M üre ya da 3 ya da% SDS) için. İsteğe bağlı olarak, tampon maddesi içinde bir proteaz inhibitörü içerir. Oda sıcaklığında 10 dakika süre ile 56 ° C&#39;de 30 dakika boyunca inkübe edin proteinleri. 4. Aklylate Ücretsiz Sülfhidril Gruplar geri dönüşü olmayan disülfit bağ oluşumu bozacak Taze su içinde 0.3 M iodoasetamid hazırlayın. DİKKAT! Iodoacetamide son derece zehirlidir. 500 ul protein için 25 ul 0.3 M iodoasetamid (15 mM nihai konsantrasyon) ilave edin ve oda sıcaklığında karanlıkta 20 dakika boyunca inkübe edin. 300 mM DTT (5 mM DTT nihai konsantrasyon) ve 10 ul kadar iyodoasetamid eklenerek söndürülür. -80 ° C&#39;de saklayın alkile proteinleri 5.. Protein Sindirim TCA proteinleri çökeltmek (aşama 2&#39;de tarif edildiği gibi) ve 50 mM HEPES (pH 8.2), 1 ml, 1 M üre içinde tekrar süspansiyon. Lisil endoprotein bir stok solüsyonu hazırlayın2 ug / ul &#39;lik bir konsantrasyonda ve protein solüsyonuna 5 ul ekle suda ase (Lys-C). Oda sıcaklığında 16 saat boyunca karışımın inkübe edin. Nihai Lys-C konsantrasyonu, 10 ng / ml ve protein-to-lysC oranı (a / a) 1/200 ile 1/50 olduğu olduğundan emin olun. , 50 mM asetik asit, 40 ul içinde 20 ug tripsin dizileme gradlı yeniden süspanse Lys-C ile sindirilmiş 5 ul (10 ug tripsin) ekleyin ve 37 ° C de 6 saat inkübe Tripsin için kullanıldığı gibi Lys-C için aynı proteaz konsantrasyon ve proteaz-to-protein oranları kullanın. 6.. Ters-faz peptid Ekstraksiyon <ol><li> % 0.5 &#39;lik bir nihai konsantrasyona (pH ≈ 2), trifluoroasetik asit (TFA) eklenmesi ile peptidleri asitlendirilir. Bir ekstre manifolduna Bir C 18 sütunu takın. Peptidlerin yükleme ve elüsyon dışında tüm adımlar için mümkün olan en yüksek akış hızı kullanın. </li><li> 6 ml asetonitril (ACN) ile ıslak kolon. 6 ml% 80 ACN,% 0.1 TFA ile kolondan yıkanır, daha sonra 6 ml% 0.1 TFA ile dengeye getirin. Izin vermeyinadımlar arasında kuru çalıştırmak için sütun. </li><li> Vakum basıncı durdurmak ve yaklaşık olarak 1 ml / dk &#39;lık bir akış hızında kolona 500 ug peptidlerin yükleyin. Peptidler, kolon, yeniden vakum bağlanmıştır ve sonra, (0.09 M sitrik asit, 0.23 M Na 2 HPO 4, pH 5.5), sitrik asit tamponu, 3 ml ile, 6 ml% 0.1 TFA ile yıkayınız sonra. Not: Yüksek miktarda etiketli peptid edilebilir, ancak bağlama kapasitesi C18 kolon, en azından örnek kaybını önlemek için peptid miktarına göre iki kat daha yüksek olması gerekir. </li></ol> 7. On-kolonu İndirgemeli dimetilasyonu tarafından Peptit Etiketleme (Redi Etiketleme) Hidrojen siyanür Etiketleme işlemi sırasında düşük bir konsantrasyonda serbest olarak kimyasal bir başlık altında bu adımı gerçekleştirin. <ol><li> Peptid serbest aminler metillenmesi &quot;hafif&quot; ve &quot;ağır&quot; Redi tampon 12 ml hazırlayın. Işık Redi tamponu% 0.8 formaldehit ve inci hidrojeni taşıyan 0.12 M sodyumsiyanoborhidrid oluşursitrik asit tampon maddesi içinde EIR doğal izotopik dağılımları. Ağır Redi tamponu% 0.8 döteryumlu formaldehit ve sitrik asit tampon maddesi içinde 0.12 M döteryumlu sodyum siyanoborohidrid oluşur. </li><li> 1 ml / dakika akış hızında, peptid ihtiva eden sütunlar 10 ml hafif ya da ağır Redi tampon ya da eklenmesi ile peptidleri ihtiva eden bir sütun inkübe edin ve tam etiketleme sağlamak için tekrarlayın. Yıkama 6 ml% 0.1 TFA ile kolon ve daha sonra 1 ml% 0.5 asetik asit ile. </li><li> Vakum durdurmak ve yaklaşık olarak 0.5 ml / dk &#39;lık bir akış oranı kullanılarak, daha sonra 1 ml% 80 ACN ile% 0.5 asetik asit 1 ml% 40 ACN,% 0.5 asetik asit ile ilk işaretli peptidlerin elüsyonu. Eğer istenirse, ağır ve hafif örnekler karıştırma önce kütle spektrometresi ile bireysel örneklerin etiketleme verimliliği ölçmek (&quot;Temsilci Sonuçları&quot; bakın). Kütle spektrometresi ile belirlenebilir 1:1 ağır ve hafif-etiketli peptid örnekleri karıştırın. </li></ol> Temel pH Ters Faz (BPRP) kromatografi &lt;8. Ayrı Peptide Karışım/ P&gt; Temel pH bağımsız bir şekilde, proteom kapsamını arttırmak için LC-MS/MS ile analiz edilir çok sayıda kısmın içine peptid karışımını ayırmak için aşama (BPRP) kromatografisi. <ol><li> 10 mM amonyum bikarbonat (pH 8) içinde artan ACN konsantrasyon gradyanı uygulanarak bir C18-HPLC kolonu üzerinde peptit karışımının fraksiyonlanması. 5 dakika için% 5 (v / v) ACN ile başlayın, 60 dakika içinde,% 35 ACN artması ve daha sonra 1 dakika içinde% 90 ACN. 9 dakika boyunca yeniden dengeye sütun için% 5 ACN indirgeme önce, 4 dakika boyunca% 90 ACN saklayın. 96 oyuklu bir plaka (H12 için A1) eşit hacimde 96 fraksiyonları toplayın. Peptidler kolonu (burada tarif edilen koşullar için 10-70 dakika) kapalı elüsyon ise 220 nm&#39;de bir UV detektör kullanılarak fraksiyonasyon izleyin. </li><li> Kuyu A2, C2, E2, ve G2 (fraksiyon A2) için ve buna bağlı olarak için, kuyular, B1, D1, F1 ve H1 (fraksiyon B1) için, kuyu A1, C1, E1 ve G1 (fraksiyon A1) ikinci kısımları birleştiriniz Geri kalan kısımlar. Solvent çıkarınbir vakum santrifüj kullanılarak t. Fraksiyonlardan peptitler tekrar A1, B2, A3, B4, A5, B6, A7, B8, A9, B10, A11 ve B12 1 M urea/0.5% TFA 130 ul ve aşama 9&#39;da tarif edildiği gibi StageTips kullanılarak arındırmak. Mağazası fraksiyonlar B1, A2, B3, A4, B5, A6, B7, A8, B9, A10, B11, ve -20 ° C de A12 </li></ol> 9. Stop and Go Ekstraksiyon tarafından Arındırmak peptidler (StageTips) 1.07 mm iç çapı (ID) ile iki C18 diskler ile 200 ul pipet uçları ambalaj ile C18-StageTip 7 microcolumns hazırlayın. Eppendorf tüpleri içine Sahne ipuçları koydu. 130 | il metanol, daha sonra 130 ul% 80 ACN,% 0.5 asetik asit ile ipuçları yıkamak için, bir mikro santrifüj kullanın. 130 ul% 0.1 TFA ile StageTips dengelenmesi. StageTips peptit karışımı aktarın ve 40 ul,% 0.5 asetik asit, daha sonra 40 ul% 0.1 TFA, daha sonra 130 ul% 0.1 TFA ile yıkayın. 20 ul% 40 ACN,% 0.5 asetik asit, daha sonra 20 ul% 80 ACN,% 0.5 asetik asit ile ilk Peptidlerin elüsyonu. Kombine eluatlar and vakumla süzme ile kuru. 10. Microcapillary LC-MS/MS <ol><li> , Yaklaşık 1 ug / ul &#39;lik bir konsantrasyona 1-5 ul,% 5 formik asit,% 5 ACN peptitler çözülür. On ~ 1 ug peptidler gidermek bir 100 um x C18-ters 0.125% formik asit içinde% 6-22 ACN gradyanı ile faz HPLC kolonu ~ 300 nl / dk &#39;lık bir akış oranında, 75 veya 100 dakikalık bir süre içinde tatbik 20 cm. </li><li> Bir LTQ Orbitrap Velos 12 veya kütle spektrometresi, yüksek çözünürlük ve yüksek kütle doğruluğu sağlayarak benzer sıvı kromatografisi-kütle spektrometresi platformunu kullanarak peptidler tanımlayın. Orbitrap analizörü edinilen tam bir MS tarama (60.000 çözünürlük) ile veri-bağımlı modunda kütle spektrometresi çalıştırın. Tam MS spektrum tespit 20 en bol bulunan iyonlar için lineer iyon kapanı MS / MS spektrumunu üretir. MS / MS için 1 x 10 tam MS için 6 ve 2000 için otomatik kazanç kontrolü (AGC) hedefleri ayarlayın. 1000 msn maksimum iyon birikimi kez ayarlayabilirsinizMS ve MS / MS için 150 msn için. 20-60 sn MS / MS uzak seçimden parçalanmış peptid öncüsü iyonları dışlamak. </li></ol> 11. MS / MS Veri Toplama Bu parametreleri (Tablo 1) kullanılarak bu SEQUEST 8 gibi bir algoritma ile bir teorik veritabanı MS / MS spektrumları RAW dosyaları karşılaştırarak peptidler tanımlamak. Tablo 1. Peptit Veritabanı Arama Parametreleri. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="600"><tbody><tr height="19"><td height="19" rowspan="3" style="height:19px;" width="180"> Genel Parametreler </td><td> kadar 2 ile tam triptik sindirim bölünmelere kaçırdı </td></tr><tr height="19"><td> 25 ppm öncül iyon tolerans </td></tr><tr height="19"><td> 1.0 Da fragman iyonu tolerans </td></tr><tr height="35"><td height="35" rowspan="2" style="height:36px;"> Statik Değişiklikler </strong&gt; </td><td> Sistein, carboxyamidomethylation üzerinde 57,02146 Da </td></tr><tr height="19"><td> Lisin ve peptid N-terminalinde on 28,03130 Da, hafif dimetilasyonu etiket </td></tr><tr height="19"><td height="19" rowspan="2" style="height:19px;"> Dinamik Değişiklikler </td><td> Metiyonin, oksidasyonu üzerindeki 15,99491 Da </td></tr><tr height="19"><td> Lisin ve peptid N-terminalinde, ağır dimetilasyonu etikette 6,03766 Da </td></tr></tbody></table><ol><li> Fiili ve ters yönlerde açık okuma çerçevelerinin bir veri tabanı kullanılarak bu tür hedef yem 9 strateji olarak bir yöntem ile,% 1 yanlış keşif oranına filtre peptidler. </li></ol> 12. Peptide Kantitasyonu Hesaplayın MS1 ağır ve hafif çiftlerinin alanlar iyon kromatogramları (MS1 pik alanları) ekstre edilmiş ve peptid sinyal-gürültü (S / N) oranları 10. Peptid çiftleri içerir yalnızca onların ortalama sinyal-noise oranı beş üzerindedir. Aynı peptid (MS1 tepe alanı oranı) ağır ve hafif versiyonlarının MS1 ​​pik alanlarının oranı olarak, iki örnekteki nispi bir peptidin bolluk ölçmek. Proteinin tüm peptidler için ortalama MS1 tepe alanı oranı olarak görece protein zengindi hesaplayın.

<ol><li>Washburn, M. P., Ulaszek, R., Deciu, C., Schieltz, D. M., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+quantitative+proteomic+data+generated+via+multidimensional+protein+identification+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Analysis of quantitative proteomic data generated via multidimensional protein identification technology.</a> Analytical chemistry. 74 (7), 1650-1657 (2002).</li>
<li>Ong, S. -E., Blagoev, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Gygi, S. P., Rist, B., Gerber, S. A., Turecek, F., Gelb, M. H., Aebersold, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+complex+protein+mixtures+using+isotope-coded+affinity+tags%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of complex protein mixtures using isotope-coded affinity tags.</a> Nature biotechnology. 17 (10), 994-999 (1999).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+cellular+proteomics%3A+MCP%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Molecular & cellular proteomics: MCP. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Hsu, J. -L., Huang, S. -Y., Chow, N. -H., Chen, S. -H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable-isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Stable-isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Analytical Chemistry. 75 (24), 6843-6852 (2003).</li>
<li>Chick, J. M., Haynes, P. A., Molloy, M. P., Bjellqvist, B., Baker, M. S., Len, A. C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+the+rat+liver+membrane+proteome+using+peptide+immobilized+pH+gradient+isoelectric+focusing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">Characterization of the rat liver membrane proteome using peptide immobilized pH gradient isoelectric focusing.</a> Journal of Proteome Research. 7 (3), 1036-1045 (2008).</li>
<li>Rappsilber, J., Ishihama, Y., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stop+and+go+extraction+tips+for+matrix-assisted+laser+desorption%2Fionization%2C+nanoelectrospray%2C+and+LC%2FMS+sample+pretreatment+in+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Stop and go extraction tips for matrix-assisted laser desorption/ionization, nanoelectrospray, and LC/MS sample pretreatment in proteomics.</a> Analytical chemistry. 75 (3), 663-670 (2003).</li>
<li>Eng, J. K., McCormack, A. L., Yates III, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+approach+to+correlate+tandem+mass+spectral+data+of+peptides+with+amino+acid+sequences+in+a+protein+database%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Society+for+Mass+Spectrometry%22%5BJournal%5D)">An approach to correlate tandem mass spectral data of peptides with amino acid sequences in a protein database.</a> Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 5 (11), 976-989 (1994).</li>
<li>Elias, J. E., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Target-decoy+search+strategy+for+increased+confidence+in+large-scale+protein+identifications+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Target-decoy search strategy for increased confidence in large-scale protein identifications by mass spectrometry.</a> Nature methods. 4 (3), 207-214 (2007).</li>
<li>Bakalarski, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+peptide+abundance+and+dynamic+range+on+stable-isotope-based+quantitative+proteomic+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Proteome+Research%22%5BJournal%5D)">The impact of peptide abundance and dynamic range on stable-isotope-based quantitative proteomic analyses.</a> Journal of Proteome Research. 7 (11), 4756-4765 (2008).</li>
<li>Wilson-Grady, J. T., Haas, W., Gygi, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+comparison+of+the+fasted+and+re-fed+mouse+liver+phosphoproteomes+using+lower+pH+reductive+dimethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif.%29%22%5BJournal%5D)">Quantitative comparison of the fasted and re-fed mouse liver phosphoproteomes using lower pH reductive dimethylation.</a> Methods (San Diego, Calif.). , (2013).</li>
<li>Tolonen, A. C., Haas, W., Chilaka, A. C., Aach, J., Gygi, S. P., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteome-wide+systems+analysis+of+a+cellulosic+biofuel-producing+microbe%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Systems+Biology%22%5BJournal%5D)">Proteome-wide systems analysis of a cellulosic biofuel-producing microbe.</a> Molecular Systems Biology. 7, 461 (2011).</li>
<li>Tolonen, A. C., Chilaka, A. C., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+inactivation+in+Clostridium+phytofermentans+shows+that+cellulose+degradation+requires+the+family+9+hydrolase+Cphy3367%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Targeted gene inactivation in Clostridium phytofermentans shows that cellulose degradation requires the family 9 hydrolase Cphy3367.</a> Molecular Microbiology. 74 (6), 1300-1313 (2009).</li>
<li>Munoz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+quantitative+proteomes+of+human-induced+pluripotent+stem+cells+and+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+systems+biology%22%5BJournal%5D)">The quantitative proteomes of human-induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells.</a> Molecular systems biology. 7, 550 (2011).</li>
<li>Kovanich, D., Cappadona, S., Raijmakers, R., Mohammed, S., Scholten, A., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+stable+isotope+dimethyl+labeling+in+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+bioanalytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Applications of stable isotope dimethyl labeling in quantitative proteomics.</a> Analytical and bioanalytical chemistry. 404 (4), 991-1009 (2012).</li>
<li>McAlister, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increasing+the+multiplexing+capacity+of+TMTs+using+reporter+ion+isotopologues+with+isobaric+masses%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+chemistry%22%5BJournal%5D)">Increasing the multiplexing capacity of TMTs using reporter ion isotopologues with isobaric masses.</a> Analytical chemistry. 84 (17), 7469-7478 (2012).</li>
<li>Boersema, P. J., Aye, T. T., Van Veen, T. A. B., Heck, A. J. R., Mohammed, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triplex+protein+quantification+based+on+stable+isotope+labeling+by+peptide+dimethylation+applied+to+cell+and+tissue+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Triplex protein quantification based on stable isotope labeling by peptide dimethylation applied to cell and tissue lysates.</a> Proteomics. 8 (22), 4624-4632 (2008).</li>
<li>Wu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Five-plex+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+communications+%28Cambridge%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Five-plex isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Chemical communications (Cambridge, England). , (2014).</li>
<li>Boersema, P. J., Raijmakers, R., Lemeer, S., Mohammed, S., Heck, A. J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+peptide+stable+isotope+dimethyl+labeling+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Multiplex peptide stable isotope dimethyl labeling for quantitative proteomics.</a> Nature Protocols. 4 (4), 484-494 (2009).</li>
<li>She, Y. -M., Rosu-Myles, M., Walrond, L., Cyr, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+protein+isoforms+in+mesenchymal+stem+cells+by+reductive+dimethylation+of+lysines+in+intact+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantification of protein isoforms in mesenchymal stem cells by reductive dimethylation of lysines in intact proteins.</a> Proteomics. 12 (3), 369-379 (2012).</li>
<li>Chen, S. -H., Chen, C. -R., Chen, S. -H., Li, D. -T., Hsu, J. -L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+N%28%CE%B1%29-acetylated+Peptide+Enrichment+Following+Dimethyl+Labeling+and+SCX%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+proteome+research%22%5BJournal%5D)">Improved N(α)-acetylated Peptide Enrichment Following Dimethyl Labeling and SCX.</a> Journal of proteome research. 12 (7), 3277-3287 (2013).</li>
<li>Sun, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capture+and+Dimethyl+Labeling+of+Glycopeptides+on+Hydrazide+Beads+for+Quantitative+Glycoproteomics+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Capture and Dimethyl Labeling of Glycopeptides on Hydrazide Beads for Quantitative Glycoproteomics Analysis.</a> Analytical Chemistry. 84 (20), 8452-8456 (2012).</li>
</ol>

Yazarlar herhangi bir mali çıkarlarını ya da diğer ilgi çatışmalarını beyan.

Yüksek ucuz etiketleme reaktifleri (reaktif numune başına 1 dolardan daha az maliyeti), hızlı reaksiyon hızı (~ 10 dk), yan ürünlerin yokluğu: Birkaç puan nicel Proteomikte için cazip bir yöntem indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) kullanılarak peptidlerin kararlı izotop etiketleme yapmak tekrarlanabilirliği (Şekil 3, 4), sabit reaksiyon ürünleri, bir proteaz kullanma yeteneği ve işaretli peptidlerin yüksek iyonlaşma verim. Bir sentetik ortam üzerinde spesifik amino asit oksotrofilerinin veya büy...

Karmaşık numuneler arasında birçok proteinin konsantrasyonu farklılıklarını ölçme proteomikteki merkezi bir sorundur. Giderek, bu farklı izotopik etiketler, her numune proteinlerin etiketleme örnekleri birleştirilmesi ve konsantrasyon farkları ölçmek için kütle spektrometresi kullanılarak yapılmaktadır. Çeşitli yöntemler, protein ve peptid kararlı izotopik etiketleme için vardır. ICAT 3, 4 iTRAQ ve indirgeme dimetilasyonu 5 protein ekstraksiyonu ve sindirim sonra izotop etiketleri ekleme ise 15 N etiketleme 1 ve SILAC 2, in vivo olarak metabolik izotopik etiketler tanıtmak. Bu yöntemler arasında, indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) numune hemen hemen her tür protein konsantrasyonu farklılıkları ölçmek için ucuz, tekrarlanabilir bir yöntem olarak popülerlik kazanıyor. Redi etiketleme düşürülür bir Schiff bazı oluşturmak üzere formaldehit ile reaksiyona sokulmasını içerir peptidlerisiyanoborohidrit. Bu reaksiyon, N-termini ve lisin yan zincirleri ve monomethylates N-terminal prolinler on serbest amino grupları dimethylates. Burada açıklanan protokol döteryumlu formaldehit ve siyanoborohidrit (Şekil 1) kullanılarak bir &quot;ağır&quot; etiketli doğal izotopik dağıtım ve örnek 2 hidrojen atomuna sahip reaktifler kullanılarak bir &quot;ışık&quot; etiketi ile örnek 1 &#39;de peptidler metile. Işık ve bir kütle spektrometresi kullanılarak, iki form arasında ayırt etmek için kullanılır ağır biçimleri arasında, 6,0377 Da&#39;lık bir kütle farkı, bir peptit sonuçlarına her dimetile amino grubudur. Özel olarak, nispi bolluk peptid ışığın MS1 ​​ekstre iyon kromatogram alanlarında oranında (MS1 alan doruk olan oranı) ve her bir peptit iyon çifti için ağır bir versiyonu olarak nicelendirilir. Bir proteinin nispi bolluk, proteinin tüm peptidler arasında orta MS1 tepe alanı oranı olarak hesaplanır. Bu yazıda, davranış için sağlam bir protokol açıklarters-faz peptid katı faz ekstraksiyonu, kolon Redi etiketleme, peptid fraksiyonasyon bazik pH fazı (BPRP) kromatografi tersine ve StageTips kullanarak peptid karışımları saflaştırılmasını (Şekil 2) içerir LC-MS/MS ile Redi etiketleme deneyleri ing . Biz kantitatif Proteomikte için Redi etiketleme kullanmanın avantajları ve sınırlamaları tartışmak.

<table><tbody><tr><td>Trikloroasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9159</td><td>protein çökeltme</td></tr><tr><td>Aseton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650501</td><td>protein çökeltme</td></tr><tr><td>Sodyum dodesil sülfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71736</td><td>denatüre, protein</td></tr><tr><td>Sodyum hidroksit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8045</td><td>denatüre eder, protein</td></tr><tr><td>DL-Dithiothreitol'ü</td> <td>azaltırSigma-Aldrich</td><td>43816</td><td>denatüre, azaltma, alkilat</td></tr><tr><td>proteini Proteaz İnhibitörü Komple Mini Kokteyl</td><td>Roche</td><td>4693124001</td><td>denatüre, proteini azaltır</td></tr><tr><td>İyodoasetamid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6125</td><td>alkilat proteini</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7523</td><td>yeniden süspanse, ekstrakte etme, etiketleme proteini</td></tr><tr><td>Kalsiyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td>proteini yeniden süspanse</td></tr> etmek<tr><td>Lizil Endoproteaz</td><td>Wako Kimyasalları</td><td>129-02541</td><td>protein sindirimi</td></tr><tr><td>Sıralama sınıfı tripsin</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td>protein sindirimi</td></tr><tr><td>Asetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320099</td><td>protein sindirimi</td></tr><tr><td>Trifloroasetik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>299537</td><td>Ters fazlı peptit ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>tC18 Sep-Pak C18 kartuşları</td><td>Sular</td><td>WAT054960</td><td>Ters fazlı peptit ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Ekstraksiyon manifoldu</td><td>Sular</td><td>WAT200609</td><td>Ters fazlı peptit ekstraksiyonu</td></tr><tr><td>Asetonitril</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>14261</td><td>çeşitli</td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>252549" ışık" peptit etiketleme</td></tr><tr><td>Siyanoborohidrit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71435</td> <td>" ışık" peptit etiketleme</td></tr><tr><td>Döteryumlu formaldehit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>492620</td> <td>" ağır" peptit etiketleme</td></tr><tr><td>Sodyum siyanoborodeüride</td><td>CDN izotopları</td><td>D-1797</td> <td>" ağır" peptit etiketleme</td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M3671</td><td>peptit etiketleme</td></tr><tr><td>C18-HPLC sütunu (4.6 x 250 mm, 5 & m partikül boyutu)</td> <td>Agilent</td><td>770450-902</td><td>bazik pH ters faz kromatografisi</td></tr><tr><td>Formik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>399388</td><td>çeşitli</td></tr><tr><td>C18 Empore Diskleri</td><td>3M</td><td>14-386-3&nbsp;</td><td>AŞAMA ipuçları</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>494437</td><td>STAGE ipuçları</td></tr></tbody></table>

kararlı İzotop etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma sayısal proteomiks

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi kullanılarak örnekler arasında protein ekspresyon farklılıkları ölçmek için bir yöntemdir. Redi etiketleme her bir serbest amin için iki metil grubu eklemek için düzenli olarak (ışık) veya formaldehid ve sodyum siyanoborohidrid döteryumlanmış (ağır) formları kullanılarak gerçekleştirilir. Burada Redi etiketleme ve kompleks protein karışımları kantitatif karşılaştırılması için sağlam bir protokol göstermektedir. Karşılaştırma için Protein örnekleri hafif ya da ağır metil etiketler, karıştırılmış ve LC-MS/MS ile ko-analiz ya da taşımak için etiketli peptidler içine sindirilir. Bağıl protein bolluğu tam MS spektrumları elde oluşturucu peptidin ağır ve hafif olarak işaretlenmiş versiyonlarının iyon kromatogram tepe alanlarının karşılaştırılması ile nicelendirilir. Burada tarif edilen yöntem örnek ters-fazlı, katı faz ekstraksiyonu ile hazırlama, peptidlerin üzerinde kolon Redi etiketleme, bazik pH rev tarafından peptid içerir fraksiyonasyonersed faz (BPRP) kromatografi ve StageTip peptid saflaştırma. Biz kararlı izotop birleşme için diğer yöntemlere göre Redi etiketleme avantajları ve sınırlamaları tartışmak. Biz örnek hemen hemen her tür protein zengindi karşılaştırmak için, hızlı, ucuz ve doğru yöntem olarak Redi etiketleme kullanarak yeni uygulamalarını vurgulayın.

Biz Saccharomyces cerevisiae kullanılarak doğruluk, kesinlik ve Redi etiketleme tekrarlanabilirliği değerlendirildi ve Clostridium tüm hücre lizatlarını phytofermentans. Önce C bir karışımı Redi etiketleme verimliliği sayılabilir selüloz (ağır etiketli, H) ve glukoz (açık etiketli, L) kültürler protein lizatları phytofermentans. Bir% 1 peptit yanlış keşif orana süzüldü, bu örnek, bir% 98 verimle Redi etiketleme 11194 benzersiz peptid dizilerini ihtiva etmiştir. Kesirlenmemiş ...

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

Bu prosedürün genel amacı, ready proteomics kullanarak kütle spektrometrisi aracılığıyla birçok proteinin konsantrasyonlarını örnekler arasında karşılaştırmaktır. Bu işlem, öncelikle her örnekteki proteinin sindirilerek peptit karışımlarının oluşturulmasıyla gerçekleştirilir. Ardından, iki örnek karıştırılır ve karışım örneğindeki peptitler fraksiyonlara ayrılarak tuzdan arındırılır.Ardından, karışımlı numune kütle spektrometrisi ile analiz edilir. Son olarak, MS iki spektrumları numunelerdeki tüm potansiyel peptidlerden oluşan bir hedef-tuzak (target-decoy) veri tabanıyla karşılaştırılarak peptidlerin kimliği belirlenir ve numuneler arasındaki peptidlerin göreceli bolluğu miktarla belirlenir. Nihayetinde, hazır proteomik, karmaşık numuneler arasında birçok proteinin göreceli bolluğunun miktar tayinine olanak sağlar.Redüktif demetilasyonun iLite gibi diğer stabil izotop işaretleme yöntemlerine göre temel avantajı; hızlı, ucuz ve doğru bir yöntem olması ve spesifik besiyerleri veya sentetik bir ortam gerektirmemesidir; bu da neredeyse her türlü örneğe uygulanabileceği anlamına gelir. Başlamak için, hücreleri parçalamak ve proteinleri çöktürmek amacıyla sonikasyon veya French press k

quantitative-proteomics-using-reductive-dimethylation-for-stable

Research

JoVE Journal

Chemistry

Kimya

13 C-izotop etiketleme çeşitli türleri için mikroorganizmaların hücre merkezi metabolizma belirlenmesi için yararlı bir tekniktir. Hücreleri belirli bir substrat ile etiketli kültüre edildikten sonra, GC-MS ölçüm aminoasittir benzersiz etiketleme desen dayalı işlevsel metabolik yollar ortaya çıkarabilir.

Sayesinde Metabolik Pathway Onay ve Keşif 13</supAminoasittir> C-etiketleme

Hücreleri stres koşullarına karşılaştığınızda Reaktif oksijen türlerinin seviyesi yükselir. Burada, 3'-3 'diaminobenzidin lekelenmesi örneğin yanı sıra redoks proteom profil cysTMT etiketleme ve kütle spektrometrisi...

İzotop Etiketleme kütle spektrometresi kullanarak Tiyol Redoks Proteom profil

İndirgeyici olarak 13C-metillenmiş N-terminal lizinin α- ve ε-dimetilamin nükleer manyetik rezonans sinyallerini atamak için iki yöntem açıklanmıştır. Bir yöntem, indirgeyici metilasyon reaksiyonunun pH ile indüklenen seçiciliğini kullanır ve diğeri, N-terminal lizini seçici olarak uzaklaştırmak için aminopeptidaz kullanır.

İndirgeyici Olarak Metillenmiş Proteinler Üzerindeki 13C-Dimetil N-terminal Amin'in NMR Rezonanslarını Belirleme Yöntemleri

Bu protokol, seçilen reaksiyon izleme kullanılarak karmaşık biyolojik numuneler içindeki hedef proteinlerin mutlak miktar tayini testlerinin nasıl gerçekleştirileceğini açıklar. Fare makrofaj kemotaksisi sinyal yolunun proteinlerini doğru bir şekilde ölçmek için kullanıldı. Hedef peptit seçimi, tahlil geliştirme ve kalitatif ve kantitatif tahliller ayrıntılı olarak açıklanmaktadır.

Mutlak Protein Niceleme Kütle Spektrometresi İzleme Seçilen Tepki

Kombine ön-madde izotopik etiketleme ve izobarik etiketleme (cPILOT) izobarik etiketlerin örnek çoğullama kabiliyetini arttıran bir sayısal proteomik stratejisidir. Bu protokol bir Alzheimer hastalığı fare modeli ve vahşi tipli kontrollerden dokulara cPILOT uygulanmasını tarif etmektedir.

Geliştirilmiş Numune Kombine Öncül İzotop Etiketleme ve Isobaric Etiketlemeyi Kullanma Dokuların çoğullama (cPILOT)

Biz doğru bir şekilde sıvı Kromatografi yüksek çözünürlüklü bir Kütle Spektrometre için arabirim ile proteinler ile izobarik etiketleme, geniş ayırma, Biyoinformatik araçlarını ve kalite kontrol adımları birlikte quantitate için bir protokol mevcut.

Derin Proteom izobarik etiketleme, kapsamlı sıvı Kromatografi, kütle spektrometresi ve yazılım destekli miktar tarafından profil oluşturma

Burada, siteye özgü protein asetilasyon ve/veya succinylation İskan izni (stoichiometry) sonra sunulan değişiklikler için endojen değişiklikler ratiometric analizi ile tüm bir Proteom, tarafsız miktar mevcut nicel kimyasal asilasyonu kararlı izotop etiketli anhidritler kullanarak. Hassas verileri bağımsız edinme kütle spektrometresi ile birlikte, doğru site doluluk ölçümler elde edilir.

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Açıklanan protokol, iki yaklaşım kullanarak doku örneklerinin optimize edilmiş bir nicel proteomik analizini sağlar: etiket bazlı ve etiketsiz nicellik. Etiket tabanlı yaklaşımlar proteinlerin daha doğru nicelliği avantajına sahipken, etiketsiz bir yaklaşım daha uygun maliyetlidir ve bir kohorttan yüzlerce örneği analiz etmek için kullanılır.

Doku Örneklerinin Kütle Spektrometresi Bazlı Av Tüfeği Proteomik Kapsamlı İş Akışı

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Protein tiol oksidasyonunun normal fizyolojik ve patofizyolojik koşullar altında önemli etkileri vardır. Reçine destekli yakalama, izobarik etiketleme ve kütle spektrometrisini kullanan, proteinlerin geri dönüşümlü olarak oksitlenmiş sistein kalıntılarının bölgeye özgü tanımlanmasını ve nicelleştirilmesini sağlayan kantitatif bir redoks proteomik yönteminin ayrıntılarını açıklıyoruz.

Reçine Destekli Yakalama, Protein Thiol Oksidasyonunun Çoklanmış Niceliği için İzobarik Tandem Kütle Etiketi Etiketleme ile Birleştirildiğinde

Bu makalede, ölüm sonrası bozulmayı önleyen endojen peptitleri korumak için ısı inaktivasyonuna dayanan bir örnek hazırlama yöntemi ve ardından izotopik etiketleme artı LC-MS kullanarak göreli nicelik açıklanmaktadır.

Peptidomik Çalışmalar için Aminlerin Indirgeyici Metilasyonunu Kullanarak Numune Hazırlama ve Göreli Nicellik

Öğrenin indirgeyici dimetilasyon ile kütle spektrometrisi kullanarak protein konsantrasyonlarını karşılaştırma yöntemini. Bu hızlı ve uygun maliyetli teknik karmaşık örneklerde nicel proteomik analizi sağlar.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Daha fazla video keşfet