Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar
4 Nisan 2018
Burada, siteye özgü protein asetilasyon ve/veya succinylation İskan izni (stoichiometry) sonra sunulan değişiklikler için endojen değişiklikler ratiometric analizi ile tüm bir Proteom, tarafsız miktar mevcut nicel kimyasal asilasyonu kararlı izotop etiketli anhidritler kullanarak. Hassas verileri bağımsız edinme kütle spektrometresi ile birlikte, doğru site doluluk ölçümler elde edilir.
Bu yeni iş akışının genel amacı, belirli asetilasyon bölgelerinde protein translasyon sonrası modifikasyonların doluluğunu veya stokiyometrisini belirlemektir. Bu yeni kütle spektrometrik iş akışı, daha yüksek düzeyde niceleme hassasiyeti sağlar. Bu yöntem, lizin asetilasyonu veya süksinilasyon bölgeleri gibi translasyon sonrası modifikasyon yoluyla tersinir protein regülasyonu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve en yüksek oranda modifiye edilmiştir ve protein fonksiyonunu değiştirebilir. Bu tekniğin temel avantajı, lizin asetilasyonu ve süksinilasyon ve süksinilasyonun bölge düzeyinde stokiyometrisinin doğru bir şekilde belirlenmesi ve yöntemin çoklu lizin kalıntısı olan peptitlerden stokiyometriyi belirleyebilmesidir. Bu teknik oldukça önemlidir, çünkü boyutsuz bir nispi bolluk değişimini ölçmek yerine asetilasyon ve süksinilasyon stokiyometrisini veya modifiye edilmiş ve değiştirilmemiş oranı ortaya çıkarır. Bu yöntem için ilk olarak, stokiyometri analizi için veriden bağımsız edinimler ve MS2 tabanlı niceleme kullanmanın ölçüm doğruluğunu büyük ölçüde artıracağını fark ettiğimde aklıma geldi. 100'lük üç kopya hazırlayın
Genel Bakış
Bu çalışma, proteinlerin post-translasyonel modifikasyonlarını, özellikle asetilasyon ve süksinilasyonu nicelleştirmek için yeni bir kütle spektrometri iş akışı sunmaktadır. Yöntem, bu modifikasyonların bölgeye özgü doluluk oranını veya stokiyometrisini belirleyerek ölçüm doğruluğunu artırmaktadır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Biyokimya
- Kütle Spektrometrisi
- Proteomik
Arka Plan
- Translasyon sonrası modifikasyonlar, protein fonksiyonunda kritik bir rol oynar.
- Asetilasyon ve süksinilasyonun anlaşılması, geri dönüşümlü protein regülasyonunun incelenmesi için hayati önem taşır.
- Geleneksel yöntemler, bu modifikasyonların miktar tayininde hassasiyetten yoksun olabilir.
- Bu çalışma, stokyometri ölçümlerinin doğruluğunu artırmayı amaçlamaktadır.
Çalışmanın Amacı
- Protein asetilasyonu ve süksinilasyonunun doğru miktarda belirlenmesi için bir iş akışı geliştirmek.
- Hangi lizin bölgelerinin en fazla modifiye edildiğini ve bunların protein fonksiyonu üzerindeki etkisini belirlemek.
- Birden fazla lizin kalıntısı içeren peptidleri analiz edebilen bir yöntem sunmak.
Kullanılan Yöntemler
- Endojen modifikasyonların rasyometrik analizi.
- Stabil izotopla işaretlenmiş anhidritler kullanılarak kantitatif kimyasal asetilasyon.
- Veriden bağımsız kazanımlı (data-independent acquisition) kütle spektrometrisi.
- Doğruluk için çoklu tekrarların hazırlanması.
Temel Sonuçlar
- Yöntem, bölge düzeyinde stokiyometrinin hassas bir şekilde belirlenmesine olanak tanır.
- Modifiye olmuş ve modifiye olmamış lizin kalıntılarının oranını ortaya koyar.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla daha yüksek ölçüm doğruluğu sağlar.
- Protein fonksiyonunu etkileyen temel asetilasyon ve süksinilasyon bölgelerini tanımlar.
Sonuçlar
- Bu iş akışı, protein modifikasyonlarının kantifikasyonunu önemli ölçüde artırır.
- Asetilasyon ve süksinilasyon yoluyla protein fonksiyonunun düzenlenmesine dair öngörüler sağlar.
- Bu teknik, geniş bir proteomik çalışma yelpazesinde uygulanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Saheye özgü lizin asetilasyonu ve süksinilasyonu stokiyometrisinin doğru nicelendirilmesi, ilaç hedef yollarındaki tersinir protein regülasyonunu anlamak için kritik olan translasyon sonrası modifikasyon doluluk oranının kesin bir şekilde değerlendirilmesine olanak tanır. Bu yöntem, biyolojik olarak ilgili asilasyon bölgelerini arka plan gürültüsünden ayırarak hedef doğrulamayı destekler ve modifikasyon seviyelerinin proteom genelinde tarafsız bir şekilde ölçülmesini sağlar. Göreceli bolluk değişimleri yerine stokiyometrik veriler sunarak, erken keşif aşamasındaki mekanistik risk azaltma süreçlerinde öngörüsel güveni artırır.
Biyofarma Ar-Ge'sinde Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Belirli lizin kalıntılarındaki asetilasyon ve süksinilasyon doluluk oranlarını nicelleştirerek terapötik hipotezlerin sorgulanmasına olanak tanır.
- Operasyonel Değer: Modifikasyon stokiyometrisinin hassas ölçümü aracılığıyla biyolojik risklerin azaltılmasını destekleyerek, protein aktivitesi üzerindeki fonksiyonel etkileri netleştirir.
- Öngörücü Değer: Hangi modifiye bölgelerin fonksiyonu değiştirme olasılığının en yüksek olduğunu belirleyerek hedef güvenilirliğini artırır ve portföy önceliklendirmesine yardımcı olur.
Tarama ve Analiz Geliştirme
- Analiz Hazırlığı: Saha düzeyinde asetilasyon doluluk verileri sağlayarak, doğrulanmış biyolojik sistemleri sonraki iş akışları için hazırlar.
- Kantitatif Çıktı: Analiz standardizasyonuna uygun, doğru ve girişimlerin azaltıldığı bir kantifikasyon sağlamak için DIA-MS'den elde edilen fragman iyon pik alanlarını kullanır.
- Ölçeklenebilirlik: Asetilasyon ve süksinilasyonun tekrarlanabilir, multipleks kapasiteli proteomik analizi aracılığıyla tarama hazırlığını kolaylaştırır.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Translasyonel Süreklilik: Hastalıkla ilişkili açilasyon bölgelerini belirleyerek, keşif aşamasındaki modifikasyon profillemesini preklinik doğrulama ile birbirine bağlar.
- Mekanistik Risk Azaltma: Birden fazla lizin kalıntısı içeren peptitlerden stokiyometriyi belirleyerek bölgeye özgü çözünürlüğe olanak tanır ve böylece öngörücü değere odaklanır.
- Risk Ayarlı İlerleme: Hangi lizin modifikasyonlarının fonksiyonel olarak anlamlı, hangilerinin stokastik olduğunu ortaya çıkararak go/no-go (devam/tamam) kararlarını destekler.
İş Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntem, erken hedef doğrulamadan öncü bileşik tanımlamaya kadar olan keşif sürekliliğine entegre olarak, mekanistik anlayışı ve bileşiklerin protein fonksiyonu üzerindeki etkilerini aydınlatan stokiyometrik asetilasyon ve süksinilasyon verileri sağlar.
- Keşif Biyolojisi: Pertürbasyonlara yanıt olarak bölgeye özgü modifikasyon doluluğunu nicelendirerek hipotez testlerini ve yolak açıklığa kavuşturma süreçlerini destekler.
- Tarama: Proteomik örnekler genelinde modifikasyon seviyelerinin standardize edilmiş, kantitatif ölçümü aracılığıyla analiz hazırlığı sağlar.
- Analitik: Modifikasyon durumlarının doğru karşılaştırılmasına olanak tanıyan DIA-MS fragman iyon kantifikasyonu yoluyla kesin stokiyometri ölçümleri sunar.
- Translasyonel Araştırma: Biyobelirteç veya mekanistik okumalar olarak hizmet edebilecek yüksek doluluğa sahip asilasyon bölgelerini tanımlayarak preklinik süreklilikle bağ kurar.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Projeler ve hedef sınıfları genelinde tutarlı PTM profillemesi için yeniden kullanılabilir bir proteomik yetkinlik olarak işlev görür.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Asetilasyon ve süksinilasyonun doğru bölge düzeyindeki stokiyometrisi aracılığıyla öngörücü güven sağlayarak hedef doğrulamadaki mekanistik belirsizliği azaltır.
- Operasyonel Değer: DIA-MS ve Skyline tabanlı kantifikasyon yoluyla standardizasyon ve tekrarlanabilirlik sağlayarak teknik değişkenliği minimize eder.
- Stratejik Değer: Yüksek doluluk oranına sahip ve fonksiyonel olarak ilgili modifikasyon bölgelerini belirleyerek devam/dur kararlarını iyileştirir ve geç aşama biyolojik riskini azaltır.
- Portföy Etkisi: Modifikasyon kaynaklı fonksiyonel kanıtlara dayalı olarak hedeflerin risk ayarlı önceliklendirmesini sağlar.
Uygulama Hususları
- Kütle spektrometrisi tabanlı proteomik ve PTM zenginleştirme tekniklerinde uzmanlık gerektirir.
- Hassas fragman iyonu kantifikasyonu için DIA uyumlu enstrümantasyona ve spektral kütüphane oluşturulmasına bağımlıdır.
- Tekrarlanabilirlik için numune hazırlama ve kimyasal asetilasyon protokollerinin ekipler arası standardizasyonunu gerektirir.
- İş akışının farklı model sistemlere veya doku tiplerine uygulanmasında adaptasyon değerlendirmeleri içerir.
- Karmaşık karışımlarda peptid saptanabilirliği ve lizin kalıntısı erişilebilirliği ile ilgili pratik sınırlamalar içerir.
Biyofarma SSS
Chapters in this video
0:04
Title
1:18
Quantitatively Acetylate and/or Succinylate Proteins Using Isotope-labeled Acetic or Succinic Anhydride
3:48
Digest Reacted Protein Samples Using Glu-C Endoproteinase
6:27
Fractionate Peptides Using Offline Basic-pH Reversed Phase HPLC
8:15
Example Data Analysis Tutorial
10:28
Results: Succinylation Stoichiometry Ratio Calculation of Pre-succinylated BSA
11:13
Conclusion
