Name: Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 49 s
Description: Keşfedin, veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanarak protein lizin asetilasyon ve süksinilasyon stoichiometry miktarını nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, site düzeyinde modifikasyon oranını hassas şekilde ölçer.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu eser NIH Ulusal diyabet Enstitüsü tarafından desteklenen ve sindirim ve böbrek hastalıkları NIH-NIDDK hibe R24 DK085610 (PI: E. Verdin). JGM NIH T32 arkadaş grubu tarafından desteklenen (T32 AG000266, PI: J. Campisi). Yazarlar NIH destek araçları hibe Buck Enstitüsü'nde TripleTOF 6600 sistem için paylaşılan kabul (1S10 OD016281, PI: BW Gibson).

1. kantitatif Acetylate ve/veya Succinylate proteinler izotop etiketli kullanarak asetik veya süksinik anhidrit
<ol><li>Sığır serum albumin (BSA) protein örneği paralel, 1 µg/µL (100 µL toplamı), konsantrasyon, 100 µg 3 çoğaltır hazırlamak üre ve triethylammonium bikarbonat (TEAB) çözüm (8 M üre, 200 mM TEAB, pH 8) kullanarak. Not: Amin ücretsiz tampon kullanmak önemlidir. BSA, kantitatif succinylated BSA, burada temsilcisi sonuçları bölümünde kullanılan protein örnekleri vardır ve bunların BSA verimli örnekleri ile karışımları tanımlanan succinylation doluluk % 0, % 1, % 10, % 50 ve % 100, sırasıyla (her örnek hazırlanacak 3 çoğaltır içinde). Bu iletişim kuralı da protein lysates Escherichia coli üzerinden kullanılarak yapılmıştır ve karaciğer4fare. Protokolü de diğer hücre veya doku lysates uygulanabilir.</li>
	<li>250 mM dithiothreitol (DTT) 20 mM DTT son bir konsantrasyon ulaşmak ve ajitasyon 1400 rpm'de 30 dk 37 ° C'de örnekle kuluçkaya 8 µL ile 100 µL BSA örneği (100 µg) azaltın.</li>
	<li>40 mM iodoacetamide son bir konsantrasyon ulaşmak ve örnek, oda sıcaklığında 30 dakika karanlıkta kuluçkaya 200 mM iodoacetamide 21,6 µL azaltılmış BSA örnekle alkylate. Not: Bu önemlidir fazla 2 x tüm protein thiols azalma sağlamak için DTT konsantrasyon iodoacetamide konsantrasyon biraz olması alkylated.</li>
	<li>
Asetik anhidrit -d6 (Adım 1.4.1) veya kimyasal (nicel) asetilasyon veya succinylation örnekleri için gerekli süksinik anhidrit -d4 (Adım 1.4.2) hazırlanması ile devam edin.
	<ol>
<li>Sulu asetik anhidrit -d6 çözüm molekül ağırlığı (108.13 g/mol) ve yoğunluk (25 ° c 1.143 g/mL) 1 g aliquot Derişim (M) belirlemek. Not: Asetik anhidrit -d6 başına-asetilasyon için örneklerin kullanılan bir 10.57 M çözüm verimli 875 µL birimindeki 9,248 µmol 1 g pakette.</li>
		<li>5 M çözüm süksinik anhidrit -d4 hidroliz reaktif önlemek için susuz DMSO hemen önce reaksiyon toz çözülerek hazırlayın. Süksinik anhidrit -d4 5 M çözüm elde etmek için susuz DMSO 461 µL ' 0,24 g geçiyoruz.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Asetik anhidrit -d6 (6 µL 10.57 M çözeltinin) veya süksinik anhidrit -d4 (5 M çözeltinin 12 µL) 60 µmol sırasıyla ekleyerek kantitatif kimyasal asetilasyon veya succinylation gerçekleştirmek ve kuluçkaya Örnek 4 ° c üzerinde bir girdap Mikser 20 dk için. Not: anhidritler Asitlik nedeniyle, protein çökelti. 1.6. adımda açıklandığı gibi ayarlayın ve dikkat edin.</li>
	<li>10 µL 7,25 M NaOH pH O-asilasyonu yan ürünlerden ortadan kaldırmak için 8 ~ artırmak için kuluçka sonra ekleyin. Kısaca girdap ve onay edindiği 1 µL tarafından örnek pH pH kağıt üzerinde. Not: 7,25 M NaOH pH 8 ulaşmak için fazla 10 µL eklemek gerekli olabilir. Ayrıca, potansiyel olarak zarlarını proteinler yeniden dağıtılması.</li>
	<li>Başı asilasyonu ve pH ayarlama adımları 1,5 ve 1,6 toplam üç kez tekrarlayın. PH değerleri denetleyin ve temel çözüm tekrarlama eklendi hacmi unutmayın. Çalışmaları hızla sırasında belgili tanımlık yukarıda kimyasal asilasyonu adımlar anhidritler hidrolize ve reaktivite kaybetmek çünkü.</li>
	<li>Nihai etiketleme tepki ve pH ayarlaması sonrası, 10 µL % 50 hydroxylamine çözüm O-asilasyonu yan reaksiyonlar dönmek için ekleyin.</li>
</ol>2. Özet Glu-C Endoproteinase kullanarak Protein örnekleri tepki gösterdi.
<ol><li>Üre konsantrasyon 0.8 M 50 mM TEAB, pH 8 istimal için sulandırmak ve örnek birimleri normalleştirmek.</li>
	<li>1:50, endoproteinase Glu-C ekleyerek protein örnekleri sindirmek proteaz substrat protein oranı (w/w) ve ajitasyon 1400 rpm'de 37 ° C'de gecede örnekleriyle kuluçkaya.</li>
	<li>Acidify ve protein sindirimi örnekleri hacimce % 1'e formik asit ekleyerek gidermek.</li>
	<li>
Lipofilik hidrofilik denge katı fazlı ayıklama kartuşları kullanarak örnekleri desalt. Örnek, en fazla 5 mg malzeme kartuş4,18başına başına bir 30 mg jelleştirici kartuş kullanın. Not: Bu desalting süreci boyunca ıslak kartuş içinde jelleştirici tutmak önemlidir. Gerektiğinde, solvent veya örnek kartuşu ile geçirilmesi yavaşlatmak için vakum pompası kapatın.<ol>
<li>24-bağlantı noktası cam blok vakum manifold üzerinde bağlantı noktaları içine kartuşunu/kartuşlarını takın ve vakum pompası üzerinde açın. Şapkalı kullanılmayan bağlantı noktalarına bırakın. Bir veya iki bağlantı noktası un kepli gerekirse üzerinde vakum göstergesi düşük basıncı korumak için bırakın.</li>
		<li>Islak her kartuş iki kez ile 800 µL % 80 Asetonitril (ACN)/0.2% formik acid/19.8% su. Solvent düzeyi 2-3 mm jelleştirici seviyesinden korumuş. Manifold vakum ölçerde 16,9-67.7 kPa (5-20 Hg) okur emin olun.</li>
		<li>Her kartuş üç kez ile 800 µL %0,2 formik asit suda equilibrate. Manifold vakum ölçerde 16,9-67.7 kPa (5-20 Hg) okur emin olun.</li>
		<li>Kartuş için peptid örnekleri yükleyin. Manifold vakum ölçerde 6.77 – 8,47 kPa (2-2.5 Hg), okur ve akış hızı 1 mL/dk aşmaz olun.</li>
		<li>Her kartuş üç kez 800 µL %0,2 formik asit su ile yıkayın. Manifold vakum ölçerde 16,9-67.7 kPa (5-20 Hg) okur emin olun.</li>
		<li>Kartuşu vakum manifold--dan ve 1.5 mL microtube razı.</li>
		<li>Peptidler 800 µL % 80 ACN/0.2% formik acid/19.8% su ile bir kez elute ve solvent ile kuluçkaya izin jelleştirici 2-3 dakika için.</li>
		<li>Bir pipet itme solvent kartuş içinde jelleştirici katmanı yoluyla için kullanın. İçin 400 µL % 80 elüsyon ikinci ACN/0.2% formik acid/19.8% su aynı 1.5 mL microtube tekrarlayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Eluate (sabit aralıklarla oranı-de 268 x g) vakum Santrifüjü 3 h için genellikle tarafından kuru. Not: gerekirse, kurutulmuş eluate örnekleri ayırma ile devam etmek için hazır kadar-20 ° C'de donmuş muhafaza edilebilir.</li>
</ol>3. fractionate kullanarak çevrimdışı Basic-pH ters faz HPLC peptidler
<ol><li>(Bölüm 1 ve 2'de açıklandığı gibi hazırlanmış) Glu-C sindirilmiş örnekleri ve acylated başına 200 µL (su, pH 10 10 mM amonyum formiat) arabelleği A yeniden askıya yılında, örnek üzerinde bir girdap karıştırıcı 4 ° C'de 10 dakika karıştırın ve santrifüj kapasitesi 17.500 x g Oda, 10 min için de te Sıcaklık. Not: Elde edilen peptid örnek yüksek pH ayrılık19,20tarafından şeker çevrimdışı hazırdır.</li>
	<li>Çevrimdışı HPLC ayırma yöntemine bağlı olarak araç ve kullanılan yazılım programı. Aşağıdaki yöntemi bir çift dalga boyunda UV dedektörü, bir Otomatik Örnekleyici, kesir toplayıcı ve pH 10'in tolerans göstereceği C18 sütun (4.6 mm x 250 mm, 5 µm partikül büyüklüğü) gibi ikili HPLC pompa sistemi için özeldir.</li>
	<li>Kesir başına 2.1 min için her 40 kesirleri toplamak ve dört final havuza alınan kesirler4' te sonuçlanan her 4. Fraksiyonun, birleştirmek. Havuza alınan kesirler daha çok sayıda örnek karmaşıklık pahasına kütle spektrometresi veri koleksiyon zaman daha da azaltmak için kullanılabilir.</li>
	<li>Bir lyophilizer havuza alınan kesirler kuru, Kuru peptid örnekleri 1 ml su P ACN ve %1 formik asit yeniden askıya alma ve daha küçük bir örnek kaba transfer. (Sabit aralıklarla oranı-de 268 x g) vakum Santrifüjü genellikle 1 h için üzerinden transfer edilen örnek kuru. Not: Amonyum Format düşük buhar basıncı tam kurutma zor yapabilirsiniz. Kuruduktan sonra amonyum formiat tuz önemli miktarda tuz çökelti kalır, katı faz ayıklama işlemini yineleyin.</li>
	<li>Örnekleri %0,2 formik asit dizin oluşturulmuş saklama süresi (IRT) peptid standart karışımı ile suda 20 µL yeniden askıya. Not: Örnekleri kütle spektrometresi göre analiz için hazırsınız.</li>
</ol>4. DIA analiz fraksiyonlara peptid örnekleri
<ol><li>
Kitle spektrometrik aletler kullanılabilir göre ayarlanabilir bir DIA LC-MS/MS yöntemi kullanarak örnekleri analiz. Analiz online bağlı bir dik quadrupole uçuş saat (QqTOF) Kütle Spektrometre için nano-LC 2D HPLC sistemi kullanılarak gerçekleştirildi.
	<ol>
<li>Peptid karışımları C18 ön sütun çip aktarılır böylece araç yazılım programı (6 mm C18-CL çip, 3 µm x 200 µm 300 Å) ve 2 µL/dk desalting için yükleme solvent (H2O/0.1% formik asit) ile 10 dakika yıkayın.</li>
		<li>Chromatographically 75 µm x 15 cm C18-CL yonga üzerinde peptidler ayırmak (3 µm, 300 Å) 300 nL/2s degrade kullanarak min tipik (ve LC-sistem özel) akış hızında sulu ve ACN solvent arabelleği4.</li>
		<li>Kütle aralığı windows değişken genişlikte (5-90 m/z) Q1 quadrupole artımlı adımları çarpışma hücreye tam kitle aralığında (m/z 400-1250) geçirildiği bir değişken penceresi DIA yöntemi oluşturur. Not: Döngü süresi 3.2 s 45 ms birikimi süresi her 64 tarama alanı kesimleri21,22ardından 250 ms habercisi iyon tarama içerir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Paralel bir analiz örnekleri DDA MS tarafından ve bina spektral kütüphaneleri kullanarak peptidler tanımlamak veya alternatif olarak, peptidler-ebilmek var olmak identified doğrudan kullanarak tüm teknik adımları veri işleme işlemlerini yürüten PIQED yazılım23, DIA verilerden, kimlik ve ithal etmek içine Skyline sonraki miktar için.</li>
</ol>5. örnek veri analizi eğitimi
<ol><li>
Skyline (http://proteome.gs.washington.edu/software/skyline) yazılım ve PanoramaWeb hesabı (https://panoramaweb.org) oluşturun. Not: Skyline kullanımı veri ile açıklayan detaylı eğitim için lütfen (https://skyline.ms/wiki/home/software/Skyline/page.view?name=tutorials) bakın. Diğer yazılım algoritmaları yerine DIA satın almalar, açık tarama alanı24, tarama alanı 2.0 eklenti PeakView25ve Spectronaut26içine hafif ve ağır parça iyon en yüksek alanlarda ayıklamak için kullanılabilir.<ol>
<li>Skyline veri dosyası succinylated BSA temsilcisi sonuçları (şekil 3) için Panorama--dan halk için download: https://panoramaweb.org/labkey/JoVEsuccBSA.url. Panorama Web sayfasında "Hedef MS çalışır" masaya gidin ve sağ üst köşesindeki Yükle bağlantısını seçerek sky.zip dosyasını indirin. Karşıdan yüklenen .zip klasöre ayıklamak ve manzarası içinde açmak için skyline.sky dosyasını çift tıklayın. Peptid parçası iyon hedef ağacı (sol paneli) ve hafif succinylation (doğru panelleri) tanımlanmış yüzdeleri üzerinden dört chromatograms kontrol edin.</li>
		<li>"Görünüm" menüsünü seçin, gidin "tepe alanları | «««Çoğaltma"karşılaştırma. Çubuk grafikler içeren "En yüksek alanlarda – çoğaltmak karşılaştırma" paneli pencerenin sağ tarafında görüntülenir. Tepe alanları panelinde sağ tıklatın ve seçin "geçişler | Hangi parçası iyon pik alanı seçili parça iyon için gösterir tek". Son olarak, "En yüksek bölgeler" panelini sağ tıklatın ve seçin "sipariş | Belge".</li>
		<li>Pencerenin sol tarafında hedef ağacı panelinde sağ tıklatın peptid "E.LCKVASLRE. T | Oranları | Işık/ağır ağır iyon sinyal üzerinde ışık iyon sinyal oranı hesaplayan Oneheavy". Not: Bu site doluluk stoichiometry oranı Light/(Heavy+Light) olarak aynı değil.</li>
		<li>Hedef ağaç şimdi ışık parçası iyonları sağa oranları L/H raporları dikkat edin.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
"İlgi asilasyonu sitesi içeren farklılaşma parçası iyonları" belirlemek. Not: şekil 3' te gösterildiği gibi bu tam örnek yer ayırt iyonları y7 (en yüksek sırada yer), y8, b3ve b4belirlenmiştir. Sigara ayırt parçası iyonlarının oranı 1 hedef ağacında göstermek olduğunu fark.<ol>
<li>Sol panelde hedef ağaçtaki altında 588.30 ++ peptid E.LCKVASLRE bir alt düğümü. T, y7 parçası iyon ayırt tıklayın K [y7 ]-902.49 + (rank1) [5] Artan pik yüksekliği ve alan dikkat edin.</li>
		<li>Sol panelde hedef ağaçtaki altında 588.30 ++ peptid E.LCKVASLRE bir alt düğümü. T, y5 sigara ayırt parçası iyon tıklayın bir [y5 ] – 575.31 + (sırası 6) [1]. Tepe alanları ve y5 parça iyon chromatograms tüm örnekleri için aynı aralıkta kalır gözlemlemek.</li>
		<li>Hedef ağacı paneli yoluyla diğer insanlar (1'den farklı oran) ayırt ve sigara-ayırt (1 oranı) parçası iyonları ve değişiklikleri ve desenler bar grafik ve chromatograms tepe bölgesinde dikkat edin.</li>
		<li>(Ek ayrıntılar da Meyer ve ark. için bkz: stoichiometry hesaplamak için ayırt iyonları hafif ve ağır çiftlerini tam tepe alanları belirlemek 4). tıkırtı üstünde "görünümü | Belge Kılavuzu"ve belge ızgarası çıkacaktır. Top belge ızgarası sol, tıkırtı üstünde "sayısı | Geçiş sonuçları"peptit dizisi, öncü mz, gibi parçası iyon bilgilerle bir çok sütunlu tablo görmek için çoğaltma adı, vb
</li>
		<li>"Tekrar"Gösterim"Belge kılavuzunu tıklatıp"Görünümü Görünümü Özelleştir penceresi açmak için Düzenle"seçerek pivot için" rapor biçimini değiştirin. "Görünümü Özelleştir" penceresinin sol alt köşesinde, "Pivot çoğaltmak adı" denetleyin ve Görünümü Özelleştir penceresini kapatmak için "Ok" seçin. Şimdi "Belge ızgarası: geçiş sonuçları" tablo penceresi adı çoğaltmak, tutma zamanı, alan, arka plan gruplandırmak yeniden ayarladı, en yüksek sırası sütunları tarafından çoğaltmak gözlemlemek (% 1, % 10, % 50, % 100 succinylation).</li>
		<li>Peptid "E.LCKVASLRE. T""Belge ızgarası: geçiş sonuç"tablosundaki bulmak"Öncü Mz"sütunu,"Parçası iyon"sütun ve 1pct_light_sw1 alanı (% 1 succinylation) sütun. Gözlemlemek bu peptid, ışık için iki öncü iyonları (öncü Mz, 588.30 ilk 8 satır) ve ağır (590.32 son 8 satırlarda, öncü Mz) vardır.</li>
		<li>"Parçası iyon" sütununda, ışık ve ağır habercisi iyonları için karşılık gelen y8 parçası iyon için iki satır bulun. 1pct_light_sw1 alan sütun aynı satırları, y8 alanlar ışık (15,820) ve ağır (1,426,461) için kayıt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bu en yüksek alan değerleri kullanarak hesaplamak succinylation stoichiometry veya oranı, aşağıdaki formüle göre değiştiren ve 0,01 veya hafif succinylation bu tanımlanan oranda eşleşen % 1 succinylation bir stoichiometry oranı elde etmek karışımı: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57209/57209eq1.jpg">
</li>
	<li>Stoichiometry oranı için % 10 succinylation y8 ayırt parçası iyon en yüksek alan değerleri 10pct_light_sw1 alan sütunu, 144,953 (ışık) ve 1,188,041 (ağır), 0,10 veya % 10 succinylation bir oranı elde etmek için kullanarak hesaplayın.</li>
	<li>Y8 ayırt parçası iyon en yüksek alan değerleri 100pct_light_sw1 alan sütunu, 954,513 (ışık) ve 16,407 (ağır), 0,98 veya % 98'i succinylation bir oranı elde etmek için kullanarak 0 succinylation stoichiometry oranını hesaplamak.</li>
	<li>Benzer şekilde, b3 ayırt parçası iyon en yüksek alan değerleri 1pct_light_sw1 alan sütunu, 55,697 (ışık) ve 3,149,119 (ağır), 0.01 veya % 1'succinylation bir oranı elde etmek için kullanarak %1 succinylation stoichiometry oranını hesaplamak.</li>
	<li>Tüm ayırt edici parçası iyonları için formül kullanarak stoichiometry oranı hesaplamalar devam lizin succinylation stoichiometry değerler 1, 10, 50 ve 0 succinylation karışımlar için elde etmek için y ve b iyonları,.</li>
</ol>

<ol><li>Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+growing+landscape+of+lysine+acetylation+links+metabolism+and+cell+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).</li>
<li>Verdin, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((50+years+of+protein+acetylation%3A+from+gene+regulation+to+epigenetics%2C+metabolism+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">50 years of protein acetylation: from gene regulation to epigenetics, metabolism and beyond.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (4), 258-264 (2015).</li>
<li>Choudhary, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+acetylation+targets+protein+complexes+and+co-regulates+major+cellular+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lysine acetylation targets protein complexes and co-regulates major cellular functions.</a> Science. 325 (5942), 834-840 (2009).</li>
<li>Meyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+Lysine+Acetylation+and+Succinylation+Stoichiometry+in+Proteins+Using+Mass+Spectrometric+Data-Independent+Acquisitions+%28SWATH%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Quantification of Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry in Proteins Using Mass Spectrometric Data-Independent Acquisitions (SWATH).</a> J Am Soc Mass Spectrom. 27 (11), 1758-1771 (2016).</li>
<li>Hirschey, M. D., Zhao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+Regulation+by+Lysine+Malonylation%2C+Succinylation%2C+and+Glutarylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Metabolic Regulation by Lysine Malonylation, Succinylation, and Glutarylation.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2308-2315 (2015).</li>
<li>Still, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mitochondrial+acetylation+dynamics+highlights+prominent+sites+of+metabolic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Quantification of mitochondrial acetylation dynamics highlights prominent sites of metabolic regulation.</a> J Biol Chem. 288 (36), 26209-26219 (2013).</li>
<li>Wagner, G. R., Payne, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+and+enzyme-independent+N%CE%B5-acetylation+and+N%CE%B5-succinylation+of+proteins+in+the+chemical+conditions+of+the+mitochondrial+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Widespread and enzyme-independent Nε-acetylation and Nε-succinylation of proteins in the chemical conditions of the mitochondrial matrix.</a> J Biol Chem. 288 (40), 29036-29045 (2013).</li>
<li>He, W., Newman, J. C., Wang, M. Z., Ho, L., Verdin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+sirtuins%3A+regulators+of+protein+acylation+and+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial sirtuins: regulators of protein acylation and metabolism.</a> Trends Endocrinol Metab. 23 (9), 467-476 (2012).</li>
<li>Castano-Cerezo, S., Bernal, V., Rohrig, T., Termeer, S., Canovas, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+acetate+metabolism+in+Escherichia+coli+BL21+by+protein+N%28epsilon%29-lysine+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Microbiol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Regulation of acetate metabolism in Escherichia coli BL21 by protein N(epsilon)-lysine acetylation.</a> Appl Microbiol Biotechnol. 99 (8), 3533-3545 (2015).</li>
<li>Zhang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+Acetylation+is+a+Highly+Abundant+and+Evolutionarily+Conserved+Modification+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Lysine Acetylation is a Highly Abundant and Evolutionarily Conserved Modification in Escherichia coli.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (2), 215-225 (2009).</li>
<li>Kuhn, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((kinetic+and+proteomic+characterization+of+acetyl+phosphate-dependent+bacterial+protein+acetylation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">kinetic and proteomic characterization of acetyl phosphate-dependent bacterial protein acetylation.</a> PLoS One. 9 (4), e94816(2014).</li>
<li>Baeza, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+site-specific+lysine+acetylation+in+an+entire+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of site-specific lysine acetylation in an entire proteome.</a> J Biol Chem. 289 (31), 21326-21338 (2014).</li>
<li>Zhou, T., Chung, Y. H., Chen, J., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-Specific+Identification+of+Lysine+Acetylation+Stoichiometries+in+Mammalian+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">Site-Specific Identification of Lysine Acetylation Stoichiometries in Mammalian Cells.</a> J Proteome Res. 15 (3), 1103-1113 (2016).</li>
<li>Nakayasu, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+determine+lysine+acetylation+stoichiometries%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Proteomics%22%5BJournal%5D)">A method to determine lysine acetylation stoichiometries.</a> Int J Proteomics. 2014, 730725(2014).</li>
<li>Rardin, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MS1+Peptide+Ion+Intensity+Chromatograms+in+MS2+%28SWATH%29+Data+Independent+Acquisitions.+Improving+Post+Acquisition+Analysis+of+Proteomic+Experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">MS1 Peptide Ion Intensity Chromatograms in MS2 (SWATH) Data Independent Acquisitions. Improving Post Acquisition Analysis of Proteomic Experiments.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2405-2419 (2015).</li>
<li>Gillet, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+data+extraction+of+the+MS%2FMS+spectra+generated+by+data-independent+acquisition%3A+a+new+concept+for+consistent+and+accurate+proteome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis.</a> Mol Cell Proteomics. 11 (6), (2012).</li>
<li>MacLean, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skyline%3A+an+open+source+document+editor+for+creating+and+analyzing+targeted+proteomics+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Skyline: an open source document editor for creating and analyzing targeted proteomics experiments.</a> Bioinformatics. 26 (7), 966-968 (2010).</li>
<li>Addona, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-site+assessment+of+the+precision+and+reproducibility+of+multiple+reaction+monitoring-based+measurements+of+proteins+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multi-site assessment of the precision and reproducibility of multiple reaction monitoring-based measurements of proteins in plasma.</a> Nat Biotechnol. 27 (7), 633-641 (2009).</li>
<li>Svinkina, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep%2C+Quantitative+Coverage+of+the+Lysine+Acetylome+Using+Novel+Anti-acetyl-lysine+Antibodies+and+an+Optimized+Proteomic+Workflow%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Deep, Quantitative Coverage of the Lysine Acetylome Using Novel Anti-acetyl-lysine Antibodies and an Optimized Proteomic Workflow.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (9), 2429-2440 (2015).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversed-phase+chromatography+with+multiple+fraction+concatenation+strategy+for+proteome+profiling+of+human+MCF10A+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Reversed-phase chromatography with multiple fraction concatenation strategy for proteome profiling of human MCF10A cells.</a> Proteomics. 11 (10), 2019-2026 (2011).</li>
<li>Schilling, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+acetylation+dynamics+in+response+to+carbon+overflow+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Protein acetylation dynamics in response to carbon overflow in Escherichia coli.</a> Mol Microbiol. 98 (5), 847-863 (2015).</li>
<li>Schilling, B., Gibson, B. W., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+High-Quality+SWATH+Acquisition+Data+for+Label-free+Quantitative+Proteomics+Studies+Using+TripleTOF+Mass+Spectrometers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Generation of High-Quality SWATH Acquisition Data for Label-free Quantitative Proteomics Studies Using TripleTOF Mass Spectrometers.</a> Methods Mol Biol. 1550, 223-233 (2017).</li>
<li>Meyer, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PIQED%3A+automated+identification+and+quantification+of+protein+modifications+from+DIA-MS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">PIQED: automated identification and quantification of protein modifications from DIA-MS data.</a> Nat Methods. 14 (7), 646-647 (2017).</li>
<li>Rost, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OpenSWATH+enables+automated%2C+targeted+analysis+of+data-independent+acquisition+MS+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">OpenSWATH enables automated, targeted analysis of data-independent acquisition MS data.</a> Nat Biotechnol. 32 (3), 219-223 (2014).</li>
<li>Lambert, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+differential+interactomes+by+affinity+purification+coupled+with+data-independent+mass+spectrometry+acquisition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Mapping differential interactomes by affinity purification coupled with data-independent mass spectrometry acquisition.</a> Nat Methods. 10 (12), 1239-1245 (2013).</li>
<li>Bruderer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extending+the+limits+of+quantitative+proteome+profiling+with+data-independent+acquisition+and+application+to+acetaminophen-treated+three-dimensional+liver+microtissues%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Extending the limits of quantitative proteome profiling with data-independent acquisition and application to acetaminophen-treated three-dimensional liver microtissues.</a> Mol Cell Proteomics. 14 (5), 1400-1410 (2015).</li>
<li>Weinert, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+Quantification+of+Site-specific+Acetylation+Stoichiometry+Reveals+the+Impact+of+Sirtuin+Deacetylase+CobB+on+the+E.+coli+Acetylome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Accurate Quantification of Site-specific Acetylation Stoichiometry Reveals the Impact of Sirtuin Deacetylase CobB on the E. coli Acetylome.</a> Mol Cell Proteomics. 16 (5), 759-769 (2017).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa gerek yok.

Bu iletişim kuralı bir roman ve siteye özgü lizin asetilasyon ve tüm bir Proteom uygulanabilir succinylation doluluk ölçmek için bir yöntem sağlar. Ölçüm endojen ışık peptidler ve eksojen ağır peptidler, ikincisi olan vardır oluşturulan vitro proteinlerin kantitatif kimyasal asilasyonu deuterated asetik anhidrit -d6 ile kullanarak bu yöntemi kullanır veya süksinik anhidrit -d4 (şekil 1). Benzer yöntemleri istikrarlı izotopik yerli değiştirilmemiş lizin artıkları etiketleme kullanılan ve site doluluk miktar ya da habercisi salt iyon12 veya parça iyonları DDA satın almalar13,14temel gerçekleştirilen. Bu iletişim kuralı birkaç adım asilasyonu etkinliğini artırmak için numune hazırlama sırasında uygular ve kimyasal succinylation için etiketleme uzanır. DIA satın almalar kullanarak veri koleksiyon habercisi iyon ve MS2 parçası böylece parçası iyon etkileşimler azaltarak tüm tespit kitle aralığında, iyon yoğunluklarda alır. Analiz ve miktar manzarası ve şirket içinde geliştirilen özel komut dosyaları üzerinden birden fazla lizin kalıntı ve bir sitede birden fazla asilasyonu içeren peptidler için site doluluk hesaplamasına izin.
Yakından takip edilmesi gereken bu protokol örnek hazırlama aşamasında çeşitli kritik adımlar vardır. Tüm iletişim kuralı tüm lizin artıkları verimli kimyasal modifikasyonu dayanıyor beri bu adımı son derece önemlidir. Amin içeren arabellek veya kirletici moleküllerin lysate proteini içerisinde kaçınılması gerekir bu yüzden anhidritler ücretsiz aminler ile tepki. Ayrıca kimyasal asilasyonu adımı sırasında reaksiyon karışımı pH geri pH 8 her anhidrit reaktif ile üç incubations sonra bu tepkime karışımı acidifies ve O-asilasyonu yan-reaksiyonlar oluşabilir gibi ayarlanır emin olun. Ayrıca, seyreltme karışımı 8 M üre içeren tepki için en uygun aralığındaysa pH 0, 8 M üre önce sindirim ve kontrol etrafında endoproteinase Glu-c en uygun etkinlik için önemlidir Başka bir anahtar, bizim iletişim kuralı veri toplama adım ve hangi DDA veri örnekleme tutarsızlıkları üstesinden gelir ve miktar MS2 parçası iyon düzeyinde için izin veren bir DIA iş akışı, giriş bileşenidir. DIA metodoloji bir ana avantajı olan genellikle ne zaman (önceki yayın bazıları olarak) MS1 habercisi iyon sinyal miktarının çok daha eğilimli ve sorunlu etkileşimler azalmadır.
İş akışı için birkaç değişiklik son derece karmaşık örnekleri hazırlarken yapılabilir. Sonra çevrimdışı basic-pH ters faz HPLC ayırma LC/MS. Ayrıca tarafından Kromatografik degradeler artık bu can da elde havuza alınan örnekleri karmaşıklığı düşürmek için azalmıştır havuza alınmış kesirler sayısı sırasında kullanılan daha iyi peptid ayrılması için izin vermek için satın alma. Alternatif olarak, birden çok proteaz i ciddi peptidler büyük çeşitli üretmek ve protein lizin artıkları kapsamını artırmak için örnekleri sindirmek için kullanılabilir. Deneme çalışır ve en iyi duruma getirme ticari BSA asetilasyon veya succinylation belirli oranlarda içeren kullanarak yapılabilir.
Bu iletişim kuralı için bir sınırlama potansiyel olarak hafif sitesi doluluk tahmindi nedeniyle metilasyonu veya ubiquitination, vb, aynı site4gibi diğer lizin değişiklikleri kayıp olduğunu. Hafif ve ağır asil değişiklikler, L/(L+H), en yüksek alanlardan hesaplanan site doluluk değişiklik bir lisin sitede Toplam düzeyini yalnızca endojen 'ışık' asilasyonu (L) oluşur duymadığını ve kimyasal olarak 'ağır' etiketli asilasyonu (H). Ancak, bir site içinde vivo , gerçek toplam asilasyonu doluluk asetilasyon ve/veya succinylation ötesinde diğer değişiklikleri içerebilir. Ayrıca, bildirilen izotopik saflık satın alınan reaktifler asetik anhidrit -d6 (% 99) ve süksinik anhidrit -d4 (> % 98'i) için ilâ %2 (succinyl) veya % 1'i (asetil) küçük bir tahmindi katkıda bulunabilir endojen asilasyonu düzey4. Birlikte, bu hafif overestimations az % 1 sitesine miktarının zorluk eklemek doluluk. Büyük bereket farklılıklar arasında tam kimyasal olarak acylated peptidler ve yerel acylated peptidler de özellikle düşük endojen acylated peptidler27için potansiyel site doluluk miktar hataları katkıda bulunur. Weinert ve arktarafından yeni bir çalışma. 27 tam acetylated peptidler arasındaki farklar azaldı bereket miktar hata27azaltabilir buldu.
Bu protokolü kullanarak toplanan stoichiometry quantifications önemli asilasyonu mutagenesis ilgi belirli sitelerin site yönettiği gibi biyolojik izleme denemeleri için belirli bir protein ve form hipotezler etkin noktalar saptamak. Bu iletişim kuralı da protein yapısal kararlılık dolaylı ya da ince etkiler sarfetmek ve hücresel ortamlar lokalize düşük asilasyonu stoichiometry siteleri kombine etkileri ortaya. Ayrıca, asetilasyon ve succinylation ve asetilasyon ötesinde diğer olası lizin asilasyonu değişiklikleri ölçmek için bu iletişim kurallarını uygulanması benzersiz dinamik asilasyonu etkileri altında farklı proteinler üzerinde anlayışlar sunacak biyolojik koşullar.

NƐ- asilasyonu protein lizin kalıntılarının protein işlevinin önemli bir düzenleyicisidir. Lizin asetilasyon ve diğer acylations, succinylation, malonylation ve glutarylation, gibi metabolizma, hücre sinyallemesi ve diğer hücresel süreçler1,2,3,4 düzenleyen düşünülmektedir , ve metabolik bozukluklar5' te vardır. Çok sayıda çalışma bulduk lizin asil değişiklikler memeli dokularda farklı koşullar altında büyük kat değişiklikleri meydana ve hücre hatları5,6,7,8 gibi bakteri9,10,11, ancak, bu göreli kat değişiklikleri değiştiren toplam protein oranının ilgili bilgiler sağlar. Ölçümleri asilasyonu sitesi İskan izni kıt12,13,14, alaka rağmen vardır ve bu tür çalışmalar için ihtiyaç göreli kat daha fazla detay sağladıkları olarak raporlama çalışmaları değiştirin. Örneğin, 10 kat bir değişiklik bir site doluluk artış 0,01 den % 0.1, 1-%10 veya hatta 10-%100 için temsil edebilir. Doğru stoichiometry ölçümleri asilasyonu biyolojik önemi yorumlamak ve etkisi protein yapısal, büyüklüğü ile ilgili tahmin etmek için gerekli olan ve muhtemelen, fonksiyonel değişiklikler.
Site doluluk ölçmek için bir önceki yöntem ağır kararlı izotop kimyasal ile karşılaştırıldığında eksojen endojen "ışık" asetilasyon arasındaki oran ölçmek için kütle spektrometresi ardından değiştirilmemiş lizin kalıntılarının etiketleme kullanır, kimyasal olarak etiketli "ağır" asetil-lizin habercisi iyon yoğunluklarda12kullanarak. Zhou ve arktarafından yeni bir çalışma daha. Ayrıca tam bir kimyasal asetilasyon proteinler bütün değiştirilmemiş lizin kalıntılarının kararlı izotop etiketleme ile çalışan ama tarafından ölçülen parça iyon yoğunluklarda kullanılan lizin asetilasyon stoichiometry değerlendirmek için benzer bir yaklaşım 13 açıklanan DDA. Nakayasu ve ark. 14 benzer bir DDA yaklaşım kullanılan, ancak bunun yerine hafif ve ağır asetil-lizin immonium iyonlarının oranı miktar için kullanılan. Parça iyonları üzerinde temel miktar immonium veya sıra iyonları (MS2), bozulmamış peptid habercisi iyonları (MS1) işleme için karşılaştırıldığında daha az Sinyal parazit türleri çoğu durumlarda sonuçlarında. Ancak, miktar parçası iyonlar DDA tarafından oluşturulan MS/MS spectra dan rassal örnekleme eksiklikler, nerede yüksek-bereket habercisi iyonları MS/MS için seçilmesi ve bu nedenle bir önyargılı ve eksik örnekleme için neden olasılığı daha yüksektir muzdarip öncü iyonları.
Bu yeni iş akışı4 (Resim 1) kavramsal olarak kararlı izotop yaklaşım aslında Baeza ve arktarafından geliştirilmiş etiketleme kimyasal kullanır. 12, ancak iş akışı daha sonra birleştiğinde DIA ile her iki öncü toplamak için ve birden çok parça iyon zenginliği tespit kitle üzerinde doğru stoichiometry hesaplamalar sağlayan15,16 Aralık.
Tepe alanları ilgi asilasyonu sitesi içeren iyonları parçası veya 'parçası iyonları ayırt', asilasyonu sitesi doluluk (Şekil 2) ölçmek için kullanılır. Değişiklik içermeyen parçası iyonları aynı hafif ve ağır m/z değerleri olan ve peptid kimlik için ancak miktar için kullanılır. Manzarası yazılım17 habercisi ve parça pik alanları için kullanılır. Etkileşimler parçası iyonları bazılarında ortaya çıkarsa bir verilen asilasyonu site içeren birden çok parça iyonları varlığı esneklik sağlar. Veri görselleştirme manzarası içinde ışık ağır parça iyon oranları eleştirel incelenmesi için izin verir. El ile veri analizi ek olarak, şirket içinde StiochiolyzeR (https://github.com/GibsonLab/StoichiolyzeR), yazılı bir açık kaynak R paketi, hangi DIA toplanan habercisi iyon ve parça iyon verileri kullanır ve quantifies geliştirilmiştir birden çok lizin artıkları, öncü salt iyon yoğunluk ölçümleri4ile mümkün değil bir özellik içeren peptidler üzerinden siteye özgü asilasyonu stoichiometry.
Bu iletişim kuralı da endoproteinase Glu-C, C-terminal bölünme, glutamik ve aspartik asit artıkları gibi ikinci kez çok büyük oluşturmak ve potansiyel olarak çarpma tripsin veya Arg-C proteaz, kullanmak yerine, belirli kullanımını gösterir acylated proteolitik peptidler kaynaklanan tripsin bölünme acylated lizin artıkları, engelledi. Yordam etiketleme kimyasal da süksinik anhidrit (şekil 1), böylece succinylation stoichiometry succinylation miktar etkinleştirme kullanımını içerecek şekilde genişletildi. Numune hazırlama, peptid ayırma pH, çevrimdışı, temel tarafından uygulanması için iyileştirmelerine ek olarak daha fazla peptidler ayrılması ters faz (bRP) miktar etkileşimler, daha iyi de-evrişim izin azalmıştır Bütün Proteom örneklerinde asilasyonu stoichiometry. Birlikte, bu yöntem ve özellikleri çeşitli avantajlar vurgular: (1) verimlilik artışı kimyasal asilasyonu; (2) protein succinylation stoichiometry yanı sıra asetilasyon ölçümü; ve (3) geliştirilmiş miktar doğruluk. Geliştirilmiş miktar azalan etkileşimler parçası iyon sinyalleri DDA habercisi sinyal yanı sıra devre dışı peptid ön ayırma uygulanması bRP tarafından karşılaştırıldığında DIA kaynaklanmaktadır.

<table><tbody><tr><td>sulu asetik anhidrit-d6</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td><td>175641-1G</td><td>%1 izotopik saflıkta</td></tr><tr><td>süksinik anhidrit-d4</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td><td>293741</td><td>%2 izotopik saflık</td></tr><tr><td>dizileme sınıfı endoproteinaz Glu-C</td><td>Roche, Indianapolis, IN, ABD (Sigma aracılığıyla)</td><td>10791156001</td><td>1:50 proteaz / substrat protein oranı (wt:wt)</td></tr><tr><td>Oasis HLB Katı Faz Ekstraksiyonu (SPE) kartuşları</td><td>Waters Corp., Milford, MA, ABD</td><td>WAT</td><td></td></tr> 094225 <tr><td>HPLC asetonitril</td><td>Burdick ve Jackson, Muskegon, MI, ABD</td><td>BJAH015-4</td><td></td></tr><tr><td>HPLC sınıfı su</td><td>Burdick ve Jackson, Muskegon, MI, ABD</td><td>BJAH365-4</td><td></td></tr><tr><td>iyodoasetamid</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td><td>I1149-25G</td><td></td></tr><tr><td>ditiyotreitol (DTT)</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td> Kütle spesifikasyonu için <td>D9779-5G</td><td></td></tr><tr><td>FLUKA formik asit (FA)</td><td>Thomas Scientific, İsveçli, NJ, ABD</td><td>C988C27</td> <td>~% 98</td></tr> <tr><td>üre</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>PI29700</td><td></td></tr><tr><td>sığır serum albümini (BSA)</td> <td>Pierce, Rockford, IL, ABD</td><td>88341</td><td></td></tr><tr><td>trietilamonyum bikarbonat (TEAB)</td> <td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td><td>T7408-100ML</td><td></td></tr><tr><td>susuz dimetil sülfoksit (DMSO)</td> <td>Alfa Aesar, Tewksbury, MA, ABD</td><td>43998</td><td></td></tr><tr><td>sodyum hidroksit (NaOH)</td> <td>EMDMillipore, Burlington, MA, ABD</td><td>SX0590</td><td></td></tr><tr><td>Suda% 50 hidroksilamin çözeltisi</td><td>Sigma Aldrich, St. Louis, MO, ABD</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS sınıfı su</td><td>Burdick ve Jackson, Muskegon, MI, ABD</td><td>BJLC365-4</td><td></td></tr><tr><td>LC-MS asetonitril</td><td>Burdick ve Jackson, Muskegon, MI, ABD</td><td>BJLC015-4</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Themomixer Kompakt</td><td>Eppendorf AG, Hamburg, Almanya</td><td>T1317-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Savant SPD131DDA SpeedVac Konsantratör</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ABD</td><td>SPD131DDA-115</td><td></td></tr><tr><td>Waters 1525 ikili HPLC pompa sistemi</td><td>Waters Corp., Milford, MA, ABD</td><td>WAT022939</td><td></td></tr><tr><td>Waters 2487 Çift Dalga Boylu UV dedektörü</td><td>Waters Corp., Milford, MA, ABD</td><td>WAT081110</td><td></td></tr><tr><td>Waters 717plus Otomatik Numune Alma</td><td>Cihazı Waters Corp., Milford, MA, ABD</td><td>WAT022939</td><td></td></tr><tr><td>Suları Fraksiyon Toplayıcı III</td><td>Waters Corp., Milford, MA, ABD</td><td>186001878</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Zorbax 300C18 sütununu genişletin</td><td>Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, ABD</td><td>770995-902</td><td></td></tr><tr><td>Labconco Dondurarak Kurutma Sistemi Serbest Bölge 4.5 Liyofilizatör</td><td>Labconco, Kansas City MO, ABD</td><td>7751000</td><td></td></tr><tr><td>indekslenmiş tutma süresi (iRT) normalizasyon peptit standardı</td><td>Biognosys AG, Schlieren, Zürih, İsviçre</td><td>Ki-3002-2</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Plus nano-LC 2D HPLC sistemi</td><td>Sciex LLC, Eksigent Division, Framingham, MA, ABD</td><td>model # 845</td><td></td></tr><tr><td>ortogonal dört kutuplu uçuş süresi (QqTOF) TripleTOF 5600 kütle spektrometresi</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, ABD</td><td>teklif başına</td><td></td></tr><tr><td>ortogonal dört kutuplu uçuş süresi (QqTOF) TripleTOF 6600 kütle spektrometresi</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, ABD</td><td>teklif</td><td></td></tr> <tr><td>başınaC18 ön kolon çipi (200 &mu; m & zamanlar; 6 mm ChromXP C18-CL çip, 3 & m, 300 &aring;)</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, ABD</td><td>804-00006</td><td></td></tr><tr><td>SWATH 2.0 eklentisi PeakView 2.2'ye</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, ABD</td><td>yazılım indirme Sciex</td><td></td></tr><tr><td>Spectronaut</td><td>Biognosys AG, Schlieren, Zürih, İsviçre</td><td>Sw-3001</td><td></td></tr><tr><td>C18-CL çip (75 ve mikro; m x 15 cm ChromXP, 3 & m, 300 &aring;)</td><td>Sciex LLC, Framingham, MA, ABD</td><td>804-00001</td><td></td></tr></tbody></table>

siteye özel protein lizin asetilasyon ve succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak stoichiometry miktar

Quantification of Site-specific Protein Lysine Acetylation and Succinylation Stoichiometry Using Data-independent Acquisition Mass Spectrometry

NƐ- asilasyonu tarafından protein lizin kalıntılarının translasyonel modifikasyon (PTM) dinamik olarak protein işlevler, örneğin, enzimatik aktivite değiştirerek veya etkileşimlerin arabuluculuk düzenleyen yapısal değişiklikler neden olmaktadır. Siteye özel protein asilasyonu doluluk veya stoichiometry, kesin miktar fonksiyonel sonuçları genel alt düzey stoichiometry ve belirli lizin bireysel üst düzey asilasyonu stoichiometry anlamak için gerekli artıkları. Diğer gruplar peptid habercisi izotoplar endojen, doğal bereket asilasyonu üzerinden oranını karşılaştırarak lizin asetilasyon stoichiometry ölçümü bildirdin ve eksojen, ağır izotop etiketli asilasyonu tanıttı sonra nicel kararlı izotop etiketli asetik anhidrit kullanarak proteinlerin kimyasal asetilasyon. Bu iletişim kuralı da dahil olmak üzere çeşitli iyileştirmeler featuring en iyi duruma getirilmiş bir yaklaşım açıklar: artan (1) kimyasal asilasyonu verimlilik, (2) protein succinylation yanı sıra asetilasyon ölçmek için yetenek ve (3) geliştirilmiş nedeniyle nicel doğruluğu azaltılmış etkileşimler habercisi iyon sinyal veri bağımlı edinme (DDA) yerine parçası iyon miktar üzerinden veri bağımsız satın almalar (DIA) kullanarak. Miktar parçası iyonları alanlarından ayıklanan tepe kullanımını da benzersiz olarak site düzeyinde asilasyonu stoichiometry proteolitik peptidler habercisi iyon kullanarak mümkün değil birden fazla lizin kalıntı içeren gelen farklılaşma etkinleştirir miktar için sinyalleri. Veri görselleştirme manzarası, bir açık kaynak nicel proteomik ortam içinde uygun veri denetim ve inceleme için sağlar. Birlikte, bu iş akışını siteye özgü lizin asetilasyon ve succinylation İskan izni ortaya çıkarmak ve biyolojik olarak ilgili asilasyonu siteleri öncelik bir tüm Proteom, tarafsız, kesin ve doğru miktar sunmaktadır.

Veri toplama sonra ayırt MS2 parçası iyonları proteolitik acylated peptidler tespit edildi, daha sonra ayıklanan iyon chromatograms (XIC) manzarası ve karşılık gelen ışık işlenmiş olan ve ağır pik alanları edildi verildi son olarak site doluluk hesaplamak için kullanılır. Şekil 2A nasıl habercisi-iyon XIC Mayıs kavramsal bir örnek gösterir her iki hafif ve ağır peptid sinyali featuring görünür ve iyon XICs renk kodlaması ile ilgili parça örneği şekil 2B sunar (kırmızı = hafif; mavi ağır = ) lizin asilasyonu değişiklikler içeren parçası iyonları differentiating için.
Şekil 3 ışık/ağır succinylated 1, 10, 50, ya da % 100 ve succinylation doluluk bunların belirlenmesi şirket içinde oluşturulan BSA önceden tanımlanmış oranları analiz yukarıda açıklandığı gibi bir doluluk deneyden kaynaklanan verileri gösterir. DIA doluluk veri manzarası alma peptid dizileri ve parça iyonlar hem hafif ve ağır habercisi iyonları (şekil 3A) için görüntüleme hedef ağacının kolay görselleştirme sağlar. DIA-MS her tanımlanmış succinylated BSA oranı verilerinden ortaya immanently ışık ağır y7 iyon, tanımlanan peptid-spectra maçı sıralaması en yüksek ayırt parçası iyon oranı göreceli farklılıklar (kırmızı ile gösterilen Şekil 3B). Şekil 4 burada pre-succinylated BSA oluşan succinylation yüzdeleri doluluk giriş proteinin doğruladı MS2 doluluk hesaplama üzerinden işlenmiş sonuçlarının bir özetini gösterir. Ölçülen lizin succinylation doluluk ticari pre-succinylated BSA, succinylated tanımlı oranlarda (örneğin, 0, 1, 10, 50 ve 0) elde edilen 20 proteolitik succinylated peptidler için Tablo 2' de gösterilmiştir. Beher-in 20 proteolitik BSA peptidler, en yüksek sırada yer, MS2 ayırt parçası iyon lizin succinylation (Ksucc) yapı, L/(L+H) % olarak hesaplamak için kullanılan. Genel olarak, MS2 tabanlı miktar asilasyonu doluluk düşük stoichiometries, bile belirlemede çok iyi doğruluk gösterdi.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig1.jpg"> Şekil 1: Stoichiometry iş akışı. (A)proteinler değiştirilmemiş lizin artıkları acetylate asetik anhidritd6 ile üç kez inkübe. Sonraki, acetylated protein endoproteinase Glu-C, basic-pH ters faz Kromatografi kullanarak proteolitik peptidler HPLC ayırma tarafından takip ile sindirilir. Son olarak, peptidler LC-MS tarafından analiz edilir değişken habercisi pencere genişlikleri ile DIA kullanarak. (B) aynı iş akışı (A), ağır asilasyonu reaktif dışında açıklandığı gibi succinylation stoichiometry süksinik anhidrit -d4için değiştirilir belirlemek için kullanılır. Meyer ve arkadapte şekil. 4 (J. olduğumu SoC kitle Spectrom., açık seçim). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig2.jpg"> Şekil 2: olası veri elde örneği ve stoichiometry hesaplamalar. (A)ışık (L) ve ağır (H) MS1 habercisi iyonları acetylated lizin farklı 3 kütle birimi tarafından içererek. XICs kırmızı ve mavi, sırasıyla belirtilen hafif ve ağır izotopik zarflar için oluşturulur. (B) miktar üzerinden parça iyon XICs DIA alımları üzerinden 'asetilasyon site içeren hafif ve ağır parça iyonları ayırt' kullanarak gerkçekleştirilen MS2 kırmızı ve mavi belirtti. Ortak parçası iyonları noktalı siyah görüntülenir ve sitenin değişiklik içermez. Meyer ve arkadapte şekil. 4 (J. olduğumu SoC kitle Spectrom., açık seçim). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig3.jpg"> Şekil 3: succinylated proteolitik BSA peptid farklı doluluk düzeyinde manzarası görselleştirme. (A)manzarası hedef proteolitik peptid gösterilen ağaç LCKsuccVASLRE ve, kaynaklanan parçası iyonları. (B) manzarası parçası iyon chromatograms succinylation İskan izni değişen düzeylerde ayıklanır. En yüksek sırada yer ayırt iyon, y7, 1, 10, 50 ve 0 pre-succinylated BSA (şirket içinde oluşturulan) giriş yüzdesini birleştiriliyor tepe alanında artırır. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57209/57209fig4.jpg"> Şekil 4: BSA asilasyonu stoichiometry ve pre-succinylated BSA değerlendirilmesi. Beş farklı BSA örnek tanımlanmış oranlarda ağır değişiklik (örn., 0, 1, 10, 50 ve 0) MS2 doluluk belirlenmesi için tabi tutuldu. 20 succinylated BSA peptidler için site doluluk beş farklı BSA örnek hafif değişiklik (örneğin, 0, 1, 10, 50 ve 0) tanımlanmış oranlarda için en yüksek sırada yer ayırt parçası iyonları üzerinden tespit. 20 succinyl peptidler dağıtım kutusu bıyık arsa görüntüler, değerlerdir peptidler % 50'si üzerinden 'kutusunda' (için % 75 persentil % 25. yüzde birlik), üst bıyık % 75 persentil değerleri en fazla (% 100) ve alt bıyık gösterir % 25 yüzdelik değerler en az (% 0. yüzdebirlik). (J. olduğumu SoC kitle Spectrom., açık seçim). Miktar ölçümler Tablo 2' de bulunabilir. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57209/57209fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Zaman (dakika)</td>
			<td>% A</td>
			<td>% B</td>
		</tr>
<tr>
<td>0,00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>7,27</td>
			<td>92</td>
			<td>8</td>
		</tr>
<tr>
<td>45,27</td>
			<td>73</td>
			<td>27</td>
		</tr>
<tr>
<td>49.27</td>
			<td>69</td>
			<td>31</td>
		</tr>
<tr>
<td>65.27</td>
			<td>61</td>
			<td>39</td>
		</tr>
<tr>
<td>72.27</td>
			<td>40</td>
			<td>60</td>
		</tr>
<tr>
<td>80,00</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>85.00</td>
			<td>10</td>
			<td>90</td>
		</tr>
<tr>
<td>86,00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td>120,00</td>
			<td>100</td>
			<td>0</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Akış hızı: 0.7 mL/dk</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3">Arabellek A: 10 mM amonyum formiat su, pH 10</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="3"></td></tr><tr><td colspan="3"></td></tr></tbody></table><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

Burada, siteye özgü protein asetilasyon ve/veya succinylation İskan izni (stoichiometry) sonra sunulan değişiklikler için endojen değişiklikler ratiometric analizi ile tüm bir Proteom, tarafsız miktar mevcut nicel kimyasal asilasyonu kararlı izotop etiketli anhidritler kullanarak. Hassas verileri bağımsız edinme kütle spektrometresi ile birlikte, doğru site doluluk ölçümler elde edilir.

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Post-translational modification (PTM) of protein lysine residues by N&#400;-acylation induces structural changes that can dynamically regulate protein ...

Bu yeni iş akışının genel amacı, belirli asetilasyon bölgelerinde protein translasyon sonrası modifikasyonların doluluğunu veya stokiyometrisini belirlemektir. Bu yeni kütle spektrometrik iş akışı, daha yüksek düzeyde niceleme hassasiyeti sağlar. Bu yöntem, lizin asetilasyonu veya süksinilasyon bölgeleri gibi translasyon sonrası modifikasyon yoluyla tersinir protein regülasyonu ile ilgili temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir ve en yüksek oranda modifiye edilmiştir ve protein fonksiyonunu değiştirebilir. Bu tekniğin temel avantajı, lizin asetilasyonu ve süksinilasyon ve süksinilasyonun bölge düzeyinde stokiyometrisinin doğru bir şekilde belirlenmesi ve yöntemin çoklu lizin kalıntısı olan peptitlerden stokiyometriyi belirleyebilmesidir. Bu teknik oldukça önemlidir, çünkü boyutsuz bir nispi bolluk değişimini ölçmek yerine asetilasyon ve süksinilasyon stokiyometrisini veya modifiye edilmiş ve değiştirilmemiş oranı ortaya çıkarır. Bu yöntem için ilk olarak, stokiyometri analizi için veriden bağımsız edinimler ve MS2 tabanlı niceleme kullanmanın ölçüm doğruluğunu büyük ölçüde artıracağını fark ettiğimde aklıma geldi. 100'lük üç kopya hazırlayın

quantification-site-specific-protein-lysine-acetylation-succinylation

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Biz lisin metilasyon değişiklikleri ölçmek için MALDI kütle spektrometresi ve indirgeyici metilasyon kimya kullanmak için bir yöntem sunuyoruz.

Lizin demetilaz Faaliyet Kantitatif Ölçümler MassSQUIRM Uygulaması

Yerli birleştirerek ve yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi ile kromatin imunopresipitasyon çapraz bağlanmasıyla, ChroP yaklaşım histon modifikasyonları, çeşitleri ve fonksiyonel olarak farklı kromatin etki de synergizing olmayan histonic proteinlerin kompozit proteomik mimarisini incelemek için olanak sağlar.

ChroP Yaklaşım Kromatin Odağı özgü Proteomic Manzaralar teşrih Chip ve Kütle Spektrometre birleştirir

Indirgeyici dimetilasyonu (Redi etiketleme) tarafından peptidlerin kararlı izotop etiketleme doğru kütle spektrometresi tabanlı nicel Proteomikte için hızlı, ucuz bir stratejidir. Burada, hemen hemen her tür örnek uygulanabilir Redi yaklaşım kullanılarak protein karışımlarının hazırlanması ve analizi için güçlü bir yöntem ortaya koymaktadır.

Kararlı İzotop Etiketleme için indirgeyici dimetilasyonu kullanma Sayısal Proteomiks

Bu protokol, proteinlerin sirtuinler için spesifik deasetilasyon substratları olarak rolünü belirlemek ve translasyon sonrası bir modifikasyon olarak tersinir - lizin asetilasyonunun rolünü daha fazla incelemek için in vitro ve in vivo deasetilasyon testlerini yürütmek için gerekli adımları açıklar.

Deasilasyon Tahliller Sirtuins arasında karşılıklı etkileşim (SIRT2) ve Özgül Protein yüzeylerde Unravel için

Bu protokol, kütle spektrometrisi (MS) ile histon post-translasyonel modifikasyonları karakterize etmek için tamamen entegre bir iş akışı özetlenmektedir. iş akışı nano-akış sıvı kromatografi ve veri analizi için talimatları kullanarak hücre kültürlerinde veya dokular, histon türetilmesi ve sindirim, MS analizi gelen histon arınma içerir. 3 gün - protokol 2 içinde tamamlanması için tasarlanmıştır.

Histon Ekstraksiyon Gönderen Data Analizi: Aşağıdan yukarıya Kütle Spektrometre kullanarak histon post-translasyonel modifikasyonlar Analizi için komple iş akışı

Genetik kod genişleme biyolojik süreçler, protein asetilasyon dahil olmak üzere geniş bir çalışma için güçlü bir araç olarak hizmet vermektedir. Burada biz homojen oluşturmak için bu teknik yararlanma facile bir protokol proteinler, Escherichia coli hücreleri belirli sitelerdeki acetylated göstermek.

Escherichia Coli proteinler Site-Specifically oluşturmak için Facile iletişim kuralı Acetylated

Kompleks biyolojik örneklerden her yerde bulunan proteinlerden kaynaklanan diGly peptidlerin arıtılmı, saptanması ve tanımlanması için bir yöntem salıyoruz. Sunulan yöntem çoğaltılabilir, sağlam ve ubiquitinome analizinin derinliği düzeyine göre yayınlanmış yöntemleri geride bırakır.

Peptit Zenginleştirme ve Kütle Spektrometresi ile Protein Ubiquitinasyon Sitelerinin Saptanması

Bu iş akışı, nicel küresel proteomik analiz için aynı anda birden fazla protein çeviri sonrası modifikasyonun (PtM) zaman ve maliyet-etkin zenginleşmesinin performansını açıklar. Protokol, ptm çapraz konuşmasına biyolojik kavrayışlar kazandırmak için birden fazla konjuge antikorla peptid düzeyinde PTM zenginleştirme, ardından da veri bağımsız iktisap kütle spektrometresi analizini kullanmaktadır.

Niceleme ve Site Yerelleştirmesi Için İki Çeviri Sonrası Modifikasyonun Eşzamanlı Affinity Zenginleştirmesi

Acyl-RAC (Acyl-Reçin Destekli Yakalama), çeşitli biyolojik örneklerde sistein kalıntılarının (S-aylasyon) geri dönüşümlü lipid modifikasyonunu tespit etmek için son derece hassas, güvenilir ve kolay bir yöntemdir.

Acyl-Reşin Destekli Yakalama ile Protein S-Acylation Tespiti

Protein Arginin ( R ) -metilasyonu, çoklu biyolojik yolları düzenleyen geniş çaplı bir translasyonel sonrası modifikasyondur. Kütle spektrometresi, modifiye peptid zenginleştirme için biyokimyasal yaklaşımlarla birleştirildiğinde, R-metil-proteomun küresel profilini çıkarmak için en iyi teknolojidir. İnsan hücrelerinde küresel R-metilasyonun yüksek güvenilirlikle tanımlanması için tasarlanan iş akışı burada açıklanmaktadır.

Global ve Yüksek Güvenilirlikli Protein R-Metilasyon Analizi için Kütle Spektrometrisine Dayalı Proteomik Yaklaşım

Keşfedin, veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanarak protein lizin asetilasyon ve süksinilasyon stoichiometry miktarını nasıl belirleyeceğinizi. Bu yöntem, site düzeyinde modifikasyon oranını hassas şekilde ölçer.

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar (Video) | JoVE Journal

Siteye özel Protein lizin asetilasyon ve Succinylation veri bağımsız edinme kütle spektrometresi kullanılarak Stoichiometry miktar

Daha fazla video keşfet