Aerosolize Lipopolisakarid kullanma Yaratma Pulmoner nötrofilisi için bir yöntem

Bu prosedürün genel amacı, aerosol haline getirilmiş LPS'ye maruz kalarak tutarlı ve tekrarlanabilir hava yolu nötrofilisi oluşturmaktır. Bu, önce salin içinde süspanse edilmiş LPS'nin bir maruz kalma odasına bağlı bir nebülizöre yüklenmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra fareler aerosol haline getirilmiş LPS'ye maruz bırakılır ve daha sonra bronkoalveoler lavaj toplanır ve lavajdaki enflamatuar hücreler numaralandırılır.

Son olarak, akciğer dokusu, gömme ve kesitleme ve immünohistokimyasal analiz için resmi olarak sabitlenir. Sonuç olarak, bronkoalveoler lavajın toplam ve diferansiyel hücre sayıları, akciğerlere nötrofil alımını değerlendirmek için kullanılabilir. Bu tekniğin intratrakeal LPS uygulaması gibi mevcut yöntemlere göre başlıca avantajları, aerosol haline getirilmiş LPS'nin akciğerler boyunca eşit dağılımı, performans kolaylığı ve başarılı uygulama için gereken minimum eğitimdir. Uygun KKD kullanarak ve havalandırmalı bir seviye içinde bir LPS aerosolü oluşturmak için iki biyolojik tehlike başlığı, bir nebülizöre kırmızı bir giriş yerleştirerek ve ardından nebulizatörü tarafından sağlanan boru ile basınçlı oda havasına bağlayarak başlayın. Üretici.

Ardından, nebulizatörün çıkışını bir kütle akış ölçere bağlamak için bir hava filtresi kullanın ve ardından kütle akış ölçeri bir elektrik kaynağına bağlayın. Basıncı bir ila iki barda tutarak hava akışını dakikada beş litreye ayarlayın ve ardından kütle akış ölçeri çıkarın ve hava akışını kesin. Daha sonra, nebulizatörün çıkışını, çıkarılabilir kapaklarla donatılmış 2 1 50 x 1 63 x 2 0 5 milimetre pleksiglas kutulara bağlı 15,9 milimetrelik bir çatallanma tüpüne bağlayın.

Basınç oluşumunu önlemek için her kutunun girişe karşı tarafında beş milimetrelik bir delik bulunmalıdır. Şimdi her kutuya en fazla beş fare yerleştirin ve kapakları kapatın. Ardından nebulizatörü açın.

Ek parçayı, yalnızca tuzlu su veya tuzlu su aracında çözülmüş dört ila sekiz mililitre LPS ile doldurun ve girişi hava kaynağına yeniden bağlayın. Hayvanların sürekli izlenmesi ve aerosolizasyon sırasında hava beslemesinin nebulizatörün girişine sıkıca sabitlendiğinden emin olarak aerosolün kapalı pleksiglas kutulara akmasına izin verin. 10 dakika sonra, hava beslemesini kesin ve hayvanları iki dakika daha pleksiglas kutularda bırakın.

Ardından kapakları açın. Aerosolün dağılmasına ve farelerin deney son noktasında kafeslerine geri dönmesine izin verin Sırayla her hayvan için, önce toraksı ortaya çıkarmak için tek bir ön arka kesim yapmak için makas kullanın. Daha sonra, göğüs kafesini sternumun ön ucundan kaldırın ve herhangi bir akciğer dokusunu kesmeden diyaframı en ventral noktadan delin

Daha sonra ön arka yönde çenenin altında buluşan iki kesi ile göğüs kafesini açın. Göğüs kafesi açıldıktan sonra, nazikçe ayırmak için forseps kullanın ve gırtlağın altındaki trakeayı kesin. Şimdi trakeayı kaldırın ve akciğer loblarını göğüs boşluğuna bağlayan bağları kesin.

Daha sonra akciğerleri ve trakeayı nazikçe yukarı ve yağ ve kalp dokusundan uzaklaştırın ve bir parça şırınga ambalaj kağıdına yerleştirin. Ardından, trakeaya 0.965 milimetrelik bir polietilen tüp yerleştirin ve bir dizi ipek iplikle sabitleyin. Çoklu lobu da ipek iplikle bağlayın ve ardından polietilen tüpe 23 gauge bir iğne yerleştirin.

Daha sonra bronkoalveoler lavajı toplamak için, steril PBS adı verilen 250 mikrolitre buzu tek loba yavaşça enjekte etmek için bir mililitrelik bir şırınga kullanın ve akciğerlere ve çalışma tezgahının yüzeyine 30 kez dikkatlice vurmak için sıvıyı yavaşça şırıngaya geri çekin ve işlemi 200 mikrolitre taze PBS ile tekrarladıktan sonra bir tüpte toplayın, Bronkoalveoler lavajı daha sonra analiz etmek için buz üzerine yerleştirin. Akciğer dokusunu histolojik analiz için sabitlemek için çoklu lobu çıkarın ve oturtun. Kuru buz üzerinde dondurun.

Lobu eksi 80 santigrat derecede saklayın. Dokuyu histolojik analiz için sabitlemek için, piston olmadan 60 mililitrelik bir şırıngayı metal bir destek standına monte edin, tek lobu beş dakika boyunca formalin ile şişirin. Daha sonra iğneyi ayırın ve polietilen tüp ile birlikte trakeadan çıkarmak için ipek ipliği çekin.

Aynı anda trakeayı kapatmak ve akciğerdeki basıncı korumak. Daha sonra, lobu dört santigrat derecede 24 saat boyunca Formin'e batırın. Ertesi gün, sabit dokuyu her seferinde en az 20 dakika boyunca üç kez% 70 etanol ile yıkayın.

Susuz dokuyu para filme gömdükten sonra, lobu dört ila beş mikronluk bölümlere kesin ve histolojik değerlendirme için bölümleri hematin ve eoin ile boyayın. Sadece araçla üretilen bir aerosole maruz kalan farelerin bronkoalveoler lavaj sıvısındaki toplam hücre sayısı tipik olarak 200.000 hücre civarında veya altındadır. Hücreler, sadece birkaç lenfosit içeren ve nötrofil içermeyen %95 ila %100 mononükleer hücrelerden oluşur.

Fareler, aerosol haline getirilmiş mililitre başına bir miligram ile zorlandı. LPS. Bununla birlikte, bronkoalveoler lavaj sıvısında artmış bir toplam hücre sayısı sergiler, tipik olarak altı saat sonra 500.000'den fazla hücre, hücre infiltratları 24 saat sonra yüksek kalır ve hücre profili nötrofillerin baskınlığına doğru kaydırılır. Benzer bir inflamatuar hücre profili ve pulmoner nötrofili, mililitre LPS'de beş miligram nebulizasyon ile de gözlenir.

Nötrofiller, altı ve 24 saatlik LPS tehdidinden sonra epitel submukozasında ve ayrıca iletken hava yollarını ve kan damarlarını çevreleyen boşluklarda gözlendi, ancak kontrol altında değildi. Tuzlu su ile tedavi edilmiş fareler. LPS meydan okuyan farelerin bronkoalveoler lavaj sıvısındaki toplam protein içeriği, saline maruz kalan farelere kıyasla artar ve LPS ile zorlanan farelerde de nötrofil kemoterapi çekici kemokinler c, XCL one ve C XCL iki'nin ekspresyonu artar.

Bu yöntem, LP'lerin neden olduğu akciğer iltihabı hakkında bilgi sağlayabilir. Aerosol haline getirilmiş buhar birçok farklı zorluğu ortaya çıkaracak şekilde uyarlanabildiğinden, bakteriyel veya viral enfeksiyonlar gibi diğer hastalık modellerine de uygulanabilir.