Farelerde Deneysel Bakteriyel Pnömoni İndüksiyonunun ve fenotipleme bir Non-invaziv ve Teknik Olmayan yoğun Yöntem

Bu deneysel protokolün genel amacı, farelerde bakteriyel pnömoniyi indüklemek için invaziv olmayan ve teknik olarak yoğun olmayan bir prosedür sağlamak ve ardından akciğerlerde in vivo konak savunma yanıtının ölçülmesini sağlamaktır. Bu yöntem, bulaşıcı hastalık ve immünoloji alanlarında, enfeksiyona karşı konakçı yanıtını kontrol eden genler ve moleküler yollar hakkındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu akciğer enfeksiyonu yönteminin en büyük avantajı teknik basitliğidir.

Bu, pulmoner prosedürlerde çok az uzmanlığa sahip laboratuvarların bile pulmoner doğuştan gelen bağışıklık tepkisini incelemesine izin verir. Biyogüvenlik seviyesi iki bir tesiste, bir gliserol K.pneumoniae stoğunu çözün ve bir mililitre bakteriyi 50 mililitre Triptik Soya Suyu içeren 500 mililitrelik bir kültür şişesine aktarın. Süspansiyon kültürünü gece boyunca 37 santigrat derece ve 200 ila 225 RPM'de inkübe edin.

Ertesi sabah, bakteri kültürünün bir ila beş mililitresini 50 mililitre Triptik Soya Suyu içeren yeni bir şişede seyreltin ve kültürü, günlük fazı elde etmek için 2,5 saat daha çalkalayıcıda 37 santigrat derecede inkübe edin. İkinci inkübasyonun sonunda, ikinci kültürden bir mililitre bakteriyi santrifüjleme için 1.5 mililitrelik bir tüpe aktarın. Paleti bozmadan süpernatanı çıkarın ve bakterileri üç ayrı yıkama için bir mililitre steril tuzlu su içinde nazikçe yeniden süspanse edin.

Üçüncü yıkamadan sonra, bakterileri başka bir mililitre steril tuzlu su içinde yeniden süspanse edin ve inokulumun günlük olarak seri dilüsyonlarını ayarlayın. Yıkanmış K.pneumoniae'nin OD600'ünü belirlemek için tek kullanımlık küvetlerde bir ila 10 ve bir ila 100 seyreltmenin bir mililitresini iki kez ölçün. 1.0'lık bir OD600, kabaca mililitre başına dört ila yedi çarpı 10 ila sekizinci CFU'ya eşdeğerdir.

Her seyreltmedeki bakteri konsantrasyonunu hesapladıktan sonra, istenen aşı CFU dozunu sekiz ila 12 haftalık alıcı hayvan başına 50 ila 60 mikrolitre steril salin içinde yeniden süspanse edin. Bakterileri hayvanlara vermek için, dozlama aşısını bir P200 pipet ucuna çekin ve anestezi uygulanmış fareyi, eğimli bir Pleksiglas levhanın mandalları arasına gerilmiş bir lastik banttan maksiller kesici dişler tarafından asılı yarı yaslanmış sırtüstü pozisyona yerleştirin. Bir çift künt, çıkıntısız forseps kullanarak, dili nazikçe yana doğru çekin ve dile veya oral farenkse travma indüklemekten kaçınmaya dikkat ederek dozu hayvanın ağız boşluğuna bırakın.

Dili geri çekerek, ev iki ila üç kez nefes alana kadar burnu eldivenli bir parmakla nazikçe kapatın. Ağız boşluğunda sıvı görünmediğinde, fare iyileşirken burun deliklerinin tıkanmasını önlemek için fareyi aşılama tahtasından sırtüstü pozisyonda kafesine aktarın. Sternumun hemen altında uzunlamasına bir kesim yapın.

Daha sonra, sternumu forseps ile kaldırarak, diyaframı çentikleyerek akciğerin göğüs boşluğuna geri düşmesine izin verin. Damar sisteminin her iki yanındaki göğüs boşluğundan ve boynun içinden yukarı doğru insizyona devam edin. Trakea göründüğünde, boynun ortasından dikkatlice kesin ve çevredeki damar sistemine zarar vermemek için dokuyu yanlara doğru itin.

Şimdi trakeayı baştan yaklaşık dörtte bir oranında aşağı doğru çentikleyin ve bir mililitre PBS ile önceden yüklenmiş bir mililitrelik şırıngaya bağlı bir kanülü kaudally olarak trakeaya yerleştirin. Hacmi yavaşça akciğerlere itin ve tüm lobların şişmesine izin verin. Daha sonra şırınga ile hacmi geri çekin ve toplanan yıkamaları 15 mililitrelik bir tüpte buz üzerinde bir araya getirin.

Uygun deneysel son noktada, kanı sol ventrikülden toplayın ve pıhtılaşmayı önlemek için heparinize bir tüpe aktarın. Daha sonra tüm akciğer loblarını beş mililitre PBS içeren 15 mililitrelik bir tüpte ve dalağı iki mililitre PBS içeren 15 mililitrelik bir tüpte hasat edin. Daha sonra, dokuları buz üzerinde yumuşatmak için numune başına bireysel, tek kullanımlık homojenizatörler kullanın ve ardından doku bulamaçlarının seri seyreltmesini sağlayın.

Seyreltmeleri iki parça halinde tek bir TSA plakasının ayrı taraflarına yerleştirin ve numunelerin kısa bir süre kurumasını bekleyin. Daha sonra plakaları ters çevirin ve numuneleri gece boyunca statik 37 santigrat derece inkübatörde kültürleyin, bakteri kolonilerinin plakanın her iki tarafından ve ertesi sabah her seyreltmeden ortalamasını alın. K.pneumoniae'nin 2000 CFU'sunda, fareler tipik olarak enfeksiyondan 12 ila 24 saat sonra klinik semptomlar göstermeye başlar.

48 ila 72 saat içinde, hayvanların çoğu, tipik olarak ortalama yüzde 20 kilo kaybından önce gelen hastalık ve morbidite semptomları sergiler. Bununla birlikte, bir LD50 dozu, deney grubu içinde hem nispeten artmış hem de azalmış sağkalımın saptanmasına izin verir ve daha uzun süreli çalışmalar için tercih edilebilir. K.pneumoniae ile alt solunum yolu enfeksiyonu, enfeksiyondan sonraki altı saat içinde hava yoluna güçlü bir lökosit akışı ile karakterizedir, bu 24 saat ile zirve yapar ve çoğunlukla nötrofiller tarafından temsil edilir.

Sitokinler, K.pneumoniae ile enfeksiyondan 24 ve 48 saat sonra bronkoalveoler lavaj sıvısında tespit edilebilir ve bakteri istilasına yanıt olarak akciğer mikroçevresi ve bağışıklığın kendi kendine işe alımı hakkında bilgi sağlar. Akciğer, kan ve dalaktaki bakteri yükü de enfeksiyondan 24 ila 48 saat sonra önemli ölçüde artar. Bir kez ustalaştıktan sonra, akciğer enfeksiyonunun orofaringeal aspirasyon yöntemi, uygun şekilde yapılırsa fare başına sadece bir ila iki dakika içinde yapılabilir.

Bu prosedürü denerken, aşırı aspirasyon hacmi kullanmamayı unutmamak önemlidir. 50 ila 60 mikrolitrelik bir hacim tipik olarak sekiz ila 12 haftalık bir fare için iyi çalışır. Bu prosedürü takiben, patojen klirensindeki immün yanıtın ölçülmesine izin vermek için akciğer ve periferik dokular üzerinde çeşitli yöntemler uygulanabilir.

Bu videoyu izledikten sonra, orofaringeal patojen iletimi yoluyla deneysel bakteriyel pnömoninin nasıl indükleneceğini ve farelerde patojen yükünün nasıl belirleneceğini iyi anlamış olmalısınız. Mikroplarla çalışmanın tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü hazırlarken her zaman temel BSL-2 önlemlerinin ve uygulamalarının alınması gerektiğini unutmayın.