Name: Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama Drosophila Dokular Yerinde (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 10 s
Description: Öğrenin Drosophila melanogaster dokularında sonikasyon destekli immünofloresan boyama yöntemini. Bu teknik, diseksiyon gerektirmeden protein lokalizasyonunu görselleştirerek gelişim biyolojisi araştırmalarını kolaylaştırır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Biz nazik Vasa ve Trafik Jam antikorlar temin Ruth Lehman ve Dorthea Godt minnettarız. Biz NICHD himayesinde geliştirilen ve Iowa Üniversitesi tarafından tutulan sağlanan hisse senetleri ve Gelişim Çalışmaları Hibridoma Bankası korumak için Indiana Üniversitesi Bloomington Stok Merkezi&#39;ni kabul etmek istiyorum. Biz onların tavsiye ve destek için Wawersik laboratuar tüm üyelerine teşekkür ederim. Bu çalışma Monroe Scholars Program Grant ve NSF (AF ve LB) (MW) IOS0823151 hibe ile finanse edildi.

Bir Toplama Cage 1. Hazırlık <ol><li> CO 2 genç, bereketli sinekler uyutmak. Bir kafese sineklere aktarın. Optimal verim elde 4 yaşı 2-7 gün arasında değişen 100-120 yetişkin sinekler kullanmak için: erkeklerin kadın 1 oranında. Sinekler uygun bir alışma dönemi Veren, ~ 24 saat tespiti için numune alınması öncesinde. 48 saat alışma dönemi - kafes bakire kadın ile kuruldu ise, erkeklere bir kullanımı 36 evlendirdi. </li><li> Kafesin açık ucunda, kafesin açıklığın üzerine merkezi maya hamur bir bozuk para büyüklüğünde damla ile önceden hazırlanmış bir elma suyu agar plaka yerleştirin. Sonra, bant ile sabitleyin. Elma suyu agar plaka ve Parafilm ile kafesi arasında kavşak mühür. </li><li> Baz olarak elma suyu agar plakası ile ikincil bir kap içinde kafes yerleştirin ve deney ile belirlendiği gibi sineklerin uygun bir zaman süresi için, belirli bir sıcaklıkta yeniden sağlar. Not: Örnek toplama kez wideğişir ll. Geç aşama embriyolar erken / L1 larvaları toplamak, örneğin, (17-24 saat), sinekler 25 ° C&#39;de 17 saat boyunca önce numune yaşlanmaya karşı 25 ° C&#39;de 7 saat boyunca elma sulu agar tabakları üzerinde yumurta bırakmaya izin verir. Benzer şekilde, orta-geç birinci değişim safhasındaki larva toplanması için (36-48 sa) sinekler 25 ° C&#39;de 36 saat boyunca önce numune yaşlanmaya 25 ° C&#39;de 12 saat boyunca yumurta bırakmaya izin verir. </li><li> Süre tamamlandıktan sonra sinek anestezi olmadan uzakta elma suyu agar plaka damla böylece, bir masanın üzerine kafes dokunun. Çabuk maya hamur bir damla içeren bir taze, kullanılmış bir plaka değiştirin. Bant ve parafilm ile taze bir tabak Güvenli ve üs olarak elma suyu agar plaka ile kafesi saklayın. </li><li> Dikkatlice bir metal spatula ile kullanılan plaka maya damla çıkarın. Deneysel gerekirse Yer kullanılan elma suyu plaka üzerinde kapak ve yaş embriyolar koydu izin verir. Not: numuneler, yaşlanma, levhalar 25 ° C&#39;de muhafaza edilebilir, daha yüksek sıcaklıklar Experimenta olmadıkçaLly gerekli. Yukarıda açıklanan koleksiyonu için embriyolar yaş için nasıl örnekler (1.3 adım için nota bakınız). Yaşlanmayı örnek önce maya hamur çıkarılması mayaya tarama ve altında agar kesiliyor larvaları önlemek için yapılır. Kalan elma suyu agar ve maya yapıştırma kalıntı larva büyümesi için besin sağlar. Maya hamur direkt olarak belirtilen embriyolar maya hamur çıkarılması ile kaybolur da, bu kayıp boyama verimini azaltır numunede maya ve agar tortu tercih edilir. Bir maya macun kaldırmak için seçmek, maya, bir boya fırçası ile karıştırılmış Fosfat Tamponu, Triton X-100 (PBTx) ile sıvılaştırılmış ve daha sonra önce tespit üzere bir hücre filtresinden ile numuneden uzaklaştırılabilir. </li></ol> 2. Sabitleme <ol><li> Elma suyu ağan plakası üzerine döşenmiş embriyolar Arzu edilen zaman noktasında yaş arası sonra, dikkatli bir şekilde th örneği almak için Fosfat Tamponu, Triton X-100 (PBTx) bir eriyiği ile ıslatılır, küçük bir fırça kullanıne plakası. Not: Eski larva hareketlidir ve kapağın iç kısmına tarayabilir. Bu örnek, bir fırça ile uzaklaştırılarak elde edilmiş benzer şekilde elde edilebilir. </li><li> Bir hücre süzgeç iç bakan sırt karşı örnek yüklü fırça silin. Ardından, süzgeç duvarları ve PBTx çözüm içeren bir bücür şişe fırça durulayın. PBTx çözümü yakalamak için süzgeç altında bir petri kapağı yerleştirin. </li><li> Tüm numune filtresine transfer edilmesinden sonra, örgü kapalı numune yükseltmek için yeterli miktarda süzgeçten PBTx dökün. Daha sonra, süzgeç kaldırın ve bir sıvı atık kabına petri dökünüz. </li><li> Tekrarlayın Adım 2.3 üç kez maya kaldırmak ve numune ile birlikte aktarılmış olabilir atık uçmak. </li><li> Örgü larvalarını yükseltmek için yeterli% 50 çamaşır suyu içine süzgeçten (NaOCI) / su (GKD 2 O) çözeltisi dökün. Larvaları 5 dakika boyunca solüsyon içinde bekletin. Ardından, süzgeç kaldırın ve t dökmeko bir sıvı atık kabına petri içerikleri. Not: - koryonik membran kaldırmak amacıyla 22 sa Bleach sadece 0 yaş embriyonik örnekleri gereklidir. Büyük örnekler için çamaşır suyu uygulaması atlanabilir, ancak dahil zararlı değildir. Ihmal isteniyorsa, PBTx, bu aşamada ağartıcı değiştirin. Seyreltilmiş ağartıcı çözelti hazırlama, 24 saat içinde kullanılmalıdır. </li><li> Örgü kapalı örneği yükseltmek için süzgeç içine yeterince PBTx dökerek PBTx ile süzgeç örnek yıkayın. Örnek 3 dakika boyunca solüsyon içinde bekletin. Daha sonra, süzgeç kaldırın ve bir sıvı atık kabına petri dökünüz. </li><li> Tekrarlayın Adım 2.6 beş kez. </li><li> Hücre süzgecinden kuru alt Dab, daha sonra bir fırça ile PEMS çözeltisinin 1.75 ml&#39;sini ihtiva eden bir parıltı şişesine içine örnek aktarmak. </li><li> Bir havalandırılan bir duman başlığı içinde çalışan% 37 formaldehit ve 250 ul sintilasyon şişesine reaktif dereceli heptan 8 ml ekleyin. <br/&gt; Not: Formaldehit ve heptan tehlikelidir. 3.3 - Güvenlik amaçları için, bir havalandırmalı davlumbaz çalışmak ve adımlar 2.9 uygun eldiven giymeye devam. </li><li> Şişe 200 rpm&#39;de ve 20 dakika için de benzer bir orta hızda çalkalanır izin verin. </li><li> Önceki sulu fazın çıkarmadan sintilasyon şişesine 10 ml metanol eklenir ve şişe 1 dakika boyunca 500 rpm&#39;de sallamak kuvvetli bir şekilde izin verir. Not: Metanol tehlikelidir. Havalandırılan bir davlumbaz çalışmak ve uygun eldiven giymeye devam. </li><li> Kaputu bir sıvı atık kabına üzerinde bir hücre süzgeç içine içeriğini dökün hemen sallantýyý şişe çıkarın ve. Şişeye ilave metanol ekleyin ve bütün numune kaldırıldı temin etmek için önemli bir hücre süzgecinden çalıştırın. Not: Hücre süzgeçler yavaş boşalabilir. Bu sorunu çözmek için, daha hızlı bir şekilde süzgecinden çözelti çekmek için bir hücre süzgecinden altına laboratuar doku dokunun. Metanol, formaldehit, ve heptan &#39;dır olmalıdırkurumsal kurallarına göre uygun bertaraf kadar uygun bir atık kaplarda saklanır. </li><li> Laboratuar doku kullanılarak hücre süzgecinden kuru alt metanol ve daha sonra 0.5 ml ihtiva eden 1.5 ml mikrosantrifüj tüpüne süzgecinden yakalanan örnek aktarmak için bir fırça kullanılır. Not: Birden fazla ışıma flakon kullanımda ise, tam adımlar 2.12 ve bir seferde 2.13 bir şişe hücre süzgeçler üzerinde kurumasını örnek önlemek için. </li><li> Örnek mikrosantrifüj tüpüne eklenmiştir sonra, bir pipetle, metanolün çıkması. Emin örnek tüpün dibine yerleşmiştir. </li><li> Tüpe metanol yaklaşık 0,5 ml ilave etmek suretiyle mikrosantrifüj tüpü içinde örnek durulayın. Bundan sonra da dinlendirilir, bir pipet ile metanolün çıkması için numune bekleyin. </li><li> Adım 15 tekrar üç kez. </li><li> Bir tüpe metanol içinde 0.5 ml ilave edilir, ve daha sonra kaydetmek daha sonra kullanılmak üzere -20 ° C sıcaklıkta dondurucuya. </li></ol> 3. Rehidrasyon ve immün için Numune Hazırlama <ol><li> Tüp içinde örnek bırakarak bir pipet ile mikrosantrifüj tüpü ve metanol çıkarın. Uygun bertaraf zamanına kadar uygun bir atık konteynerine Mağaza metanol atık. , Sonikasyon verimliliğini artırmak için numunenin en fazla 3 mm, 1.5 ml mikrosantrifüj tüpü altındaki yerleşmiş kullanın: edin. Aşırı numunesi yukarıda adım rehidrasyon başlamadan önce bir pipet ile ayrı bir tüpe aktarılır. Temiz bir jilet ile pipet kesme pipet tıkanmasını önlemek için de kullanılabilir. </li><li> 3 dakika boyunca tüp ve kaya için% 50 metanol / Fosfat Tampon Tween, (PBTw) çözeltisi 1.0 ml ilave edilir. </li><li> Uygun atık kabına metanol çözüm çıkarın ve iki kez PBTw 1.0 ul ile yıkayın. Her durulama sonra, numune, bir pipet ile ortadan kaldırılmasından önce PBTw oturmasına izin verin. </li><li> Sığır Serumu Albümini / Fosfat Tamponlu Tween (BBTw) 1,0 ml ilave edilir ve şişe kaya karıştırın. Bir rocker 3 dakika sonra, SAMP sağlarle yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için. </li><li> Tekrarlayın Adım Son yıkamadan sonra, numune kaybetmeden mümkün olduğu kadar BBTw kaldırmak için dikkat 3.4 iki kere verilir. </li><li> Tüpe BBTw 0.5 ml ilave edilir ve buz üzerinde tüp yerleştirin. </li></ol> Örnek 4. Sonikasyon <ol><li> 10% maksimum genlik için sonikator ayarlayın ve 2 sn sabit sonikasyonun bir çalışma süresini tayin. Not: Bu ayarlar Malzeme ve Ekipmanları Tablo belirtilen sonikatöre özgü ve farklı sonicators için optimizasyon gerektirebilir. </li><li> Önceki örnek, sonikasyon işlemine, prob temizlemek için deiyonize su ve çalıştırma sonikatör ile dolu bir 50 ml&#39;lik konik bir tüp içine prob ucunu yerleştirerek sonikatör probu temizleyin. Koşudan sonra laboratuvar dokusu ile kuru Sonikatör prob. </li><li> Bu numune üzerinde yaklaşık 3-4 mm konumlandığı şekilde numuneyi içeren mikrosantrifüj tüpü içine daldırın ve sonikasyon probu başlar. </li><li> M çıkarınicrocentrifuge boru sonikasyon ısı dağılımı ve örnek mikrosantrifüj tüp dibinde biriken izin vermek için en az 30 saniye boyunca buz üzerine yerleştirin ve. </li><li> Tekrar 4.3 ve işlenen numune yaşına göre gerektiğinde 4.4 adımları. Not: Optimum Sonication örnek hacmi için, Sonikasyon gerekmez daha genç 17 saat embriyolar, ancak bu saat 17 ila 24 (/ 17 aşama, erken-L1) iki sonikasyon gerektirir. Larva arası 24-36 (erken / orta-L1), 36-48, (orta /-L1 geç) 48 - 60 (erken / orta-L2), 60-72 (orta / geç-L2), 72-84 ( )-L3 erken, 84-96 (erken / orta-L3), 96-108 (orta / geç-L3) hr gerektiren 5, 9, 11, 13, sırasıyla 15, 18 ve 22 sonikasyon. Sonication kez daha hazırlanması için tartışma bakın. </li><li> BBTw iki kez 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile BBTw kapalı çizim önce yerleşmek için izin. </li><li> Flakon ve kaya BBTw 1.0 ml ekleyin. Rocker 3 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için izin verir. &lt;/ Li&gt; <li> Tekrarlayın Adım 4.7 iki kez. </li></ol> 5. immün <ol><li> Mikrosantrifüj tüpüne BBTw içinde seyreltilmiş,% 5, normal serumu ilave ederek örnek bloke eder. 1 saat boyunca sallanan sonra bloğunu çıkarın. Not: İkincil antikorlar uretıldığı türleri normal serum kullanın. </li><li> % 5 normal serumu / BBTw konsantrasyonu çözelti içinde çalışan mülk birincil antikorlar seyreltilir. </li><li> 4 ° C&#39;de ya da (yaklaşık 22 ° C oda sıcaklığında en azından 3 saat için primer antikor çözeltisi O kaya örnek / K. Not: Antikor inkübasyon süreleri ve sıcaklıklar değişebilir. O / N, oda sıcaklığında, 4 ° C&#39;de inkübasyon ya da 3 saat tipik olarak yeterlidir. Bununla birlikte, iki günlük bir inkübasyon süresi, daha eski numune ya da düşük affiniteli primer antikorlar ile kullanıldığında, boyama kalitesini artırabilir. Daha uzun bekletme tipik olarak 4 ° C&#39;de gerçekleştirilir. Sekonder antikor (5.10) kullanıldığında benzer sonuçlar elde edilmektedir gerekir. </li><li> Örnek yerleşmek için izin vermikrofüj tüpün alt. Pipet ile primer antikorlar kapalı çizin. Arzu edildiği takdirde yeniden kullanım için antikorlar kaydedin. </li><li> Iki BBTw 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile BBTw kapalı çizim önce yerleşmek için izin. </li><li> Flakon ve kaya BBTw 1.0 ml ekleyin. Rocker 3 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile BBTw kaldırmak için izin verir. </li><li> Tekrarlayın Adım 5.6 beş kez. </li><li> Mikrosantrifüj tüpüne% 5 normal serumu / BBTw çözeltisi eklenerek Blok örneği. 1 saat 30 dakika boyunca sallanan sonra blok çıkarın. Bu ilave bir bloke etme adım gerekli değildir, ancak özel antikorlar için boyama kalitesini iyileştirebilir: edin. </li><li> % 5 normal serumu / BBTw konsantrasyonu çözelti içinde çalışan mülk sekonder antikorlar seyreltilir. </li><li> Işığa maruz kalma nedeniyle solmasını azaltmak için bir alüminyum folyo içinde mikrosantrifüj tüpü sarın. 4 ° C&#39;de 12 saat 48 için ikincil bir antikor ya da çözelti içinde, oda sıcaklığında (yaklaşık 22 ° C&#39;de en az 3 saat boyunca Kaya örneği. </li><li> Örnek mikrofuge&#39;de tüpünün dibine yerleşmek için izin ver. Pipet ile ikincil antikorlar kapalı çizin. </li><li> Iki PBTw 1.0 ml ile durulayın. Her durulama sonra numune bir pipet ile PBTw kapalı çizmeden önce yerleşmek için izin. </li><li> Flakon ve kaya PBTw 1.0 ml ekleyin. Kızağa üzerinde 5 dakika sonra, numune yerleşmek ve pipet ile PBTw kaldırmaktır. </li><li> Tekrarlayın Adım 5.13 üç kez. </li><li> İSTEĞE BAĞLI: 1,000 PBTw in: DAPI 1 seyreltilmiş ekleyin. Kaya örnek 3 dakika için alüminyum folyoya sarılmıştır; daha sonra bir pipet ile DAPI çözeltisi çıkarın. Örnek pipetle PBTw çıkarmadan önce çökmesine izin verdikten, PBTw 1.0 ml ile beş kez çalkalayın. </li><li> -20 ° C&#39;de mikrosantrifüj tüpüne ve saklamak için 1,4-diazabisiklo [2.2.2] oktan (DABCO) çözeltisi 100 ul - 80 ekleyin. Not: Başka bir gliserol tabanlı bir anti-solmaya madde için ikame edilebilir. </li></ol> 6. Analiz <ol><li> DABKO / p-phen 10 ul - slaytlar üzerine numuneyi monte etmeden önce, ekstra 5 ekleylenediamine (PPD) mikrosantrifüj tüpüne antifade çözüm. Not: Örnek diseksiyonu olmadan slaytlar eklenebilir. Bir slayta eklenen Numune hacmi kapak kayma boyutuna göre değişir. Slayt üzerine örnek pipetlerken, pipet ucu numune kesme önlemek için bir jilet kullanarak kesilebilir. Bu kolay analiz için satırları örnek sıraya genellikle faydalıdır. Ilave madde olarak antifade DSD eklenmesi gerekli olmayabilir, ancak örnekler uzun süreli saklandığı takdirde, ışıkla önleyebilir. </li><li> Yavaşça numune üzerinde cam kapak kayma yerleştirin. Sonra, yerde güvenli kapak kayma oje kullanarak. </li><li> Görünüm floresan mikroskopi kullanılarak örnek monte edilmiş. </li></ol>

<ol><li>Moore, L. A., Broihier, H. T., Van Doren, M., Lunsford, L. B., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+controlling+germ+cell+migration+and+embryonic+gonad+formation+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of genes controlling germ cell migration and embryonic gonad formation in Drosophila.</a> Development. 125, 667-678 (1998).</li>
<li>Rothwell, W. F., Sullivan, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRothwell%2C+WF+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. 141-157 (2000).</li>
<li>Jenkins, A. B., McCaffery, J. M., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+E-cadherin+is+essential+for+proper+germ+cell-soma+interaction+during+gonad+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila E-cadherin is essential for proper germ cell-soma interaction during gonad morphogenesis.</a> Development. 130, 4417-4426 (2003).</li>
<li>Ashburner, M., Golic, K., Hawley, R. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila%3A+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila: A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 6 122-205 (2005).</li>
<li>Blair, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBlair%2C+SS+%22Drosophila+Protocols%22">Drosophila Protocols</a>. Sullivan, W., Ashburner, M., Hawley, R. S. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Ch. 10 159-173 (2000).</li>
<li>Patel, N. Drosophila melanogaster: Practical Uses in Cell and Molecular Biology. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatel%2C+N+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. Goldstei, L. S. B., Fryberg, E. A. , Academic Press. Vol. 44 445-487 (1994).</li>
<li>Maimon, I., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+staining+of+Drosophila+larval+ovaries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and staining of Drosophila larval ovaries.</a> J Vis Exp. , (2011).</li>
<li>Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+male+germline+stem+cell+niche+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of the male germline stem cell niche in Drosophila.</a> Dev Biol. 294, 92-103 (2006).</li>
<li>Sheng, X. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jak-STAT+regulation+of+male+germline+stem+cell+establishment+during+Drosophila+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Jak-STAT regulation of male germline stem cell establishment during Drosophila embryogenesis.</a> Dev Biol. 334, 335-344 (2009).</li>
<li>Sinden, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jak-STAT+regulation+of+cyst+stem+cell+development+in+the+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Jak-STAT regulation of cyst stem cell development in the Drosophila testis.</a> Dev Biol. 372, 5-16 (2012).</li>
<li>DeFalco, T., Camara, N., Le Bras, S., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonautonomous+sex+determination+controls+sexually+dimorphic+development+of+the+Drosophila+gonad%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Nonautonomous sex determination controls sexually dimorphic development of the Drosophila gonad.</a> Dev Cell. 14, 275-286 (2008).</li>
<li>Jemc, J. C., Milutinovich, A. B., Weyers, J. J., Takeda, Y., Van Doren, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((raw+Functions+through+JNK+signaling+and+cadherin-based+adhesion+to+regulate+Drosophila+gonad+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">raw Functions through JNK signaling and cadherin-based adhesion to regulate Drosophila gonad morphogenesis.</a> Dev Biol. 367, 114-125 (2012).</li>
<li>Fuller, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFuller%2C+M+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 71-147 (1993).</li>
<li>Cuevas, M., Matunis, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+stem+cell+niche%3A+Lessons+from+Drosophila+testis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The stem cell niche: Lessons from Drosophila testis.</a> Development. 138, 2861-2869 (2011).</li>
<li>Williamson, A., Lehmann, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germ+cell+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Germ cell development in Drosophila.</a> Annu Rev Cell Dev Biol. 12, 365-391 (1996).</li>
<li>Jemc, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Somatic+gonadal+cells%3A+the+supporting+cast+for+the+germline%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Somatic gonadal cells: the supporting cast for the germline.</a> Genesis. 49, 753-775 (2011).</li>
<li>Spradling, A. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpradling%2C+AC+%22The+Development+of+Drosophila+melanogaster%22">The Development of Drosophila melanogaster</a>. Bat, M., Martinez Arias, A. , Cold Spring Harbor Press. Vol. I 1-70 (1993).</li>
<li>Eliazer, S., Buszczak, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+a+niche%3A+studies+from+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Finding a niche: studies from the Drosophila ovary.</a> Stem Cell Res Ther. 2, 45(2011).</li>
<li>Sahut-Barnola, I., Godt, D., Laski, F. A., Couderc, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+ovary+morphogenesis%3A+Analysis+of+terminal+filament+formation+and+identification+of+a+gene+required+for+this+process%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila ovary morphogenesis: Analysis of terminal filament formation and identification of a gene required for this process.</a> Developmental Biology. 170, 127-135 (1995).</li>
<li>Godt, D., Laski, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cell+rearrangement+and+cell+recruitment+in+Drosophila+ovary+morphogenesis+and+the+requirement+of+bric+a+brac%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cell rearrangement and cell recruitment in Drosophila ovary morphogenesis and the requirement of bric a brac.</a> Development. 121, 173-187 (1995).</li>
<li>Gancz, D., Lengil, T., Gilboa, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinated+regulation+of+niche+and+stem+cell+precursors+by+hormonal+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinated regulation of niche and stem cell precursors by hormonal signaling.</a> PLoS Biol. 9, e1001202(2011).</li>
<li>Matsuoka, S., Hiromi, Y., Asaoka, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Egfr+signaling+controls+the+size+of+the+stem+cell+precursor+pool+in+the+Drosophila+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Egfr signaling controls the size of the stem cell precursor pool in the Drosophila ovary.</a> Mech Dev. 130, 241-253 (2013).</li>
<li>Song, X., Zhu, C. H., Doan, C., Xie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+stem+cells+anchored+by+adherens+junctions+in+the+Drosophila+ovary+niches%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Germline stem cells anchored by adherens junctions in the Drosophila ovary niches.</a> Science. 296, 1855-1857 (2002).</li>
<li>Homem, C. C., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila.+neuroblasts%3A+a+model+for+stem+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Drosophila. neuroblasts: a model for stem cell biology.</a> Development. 139, 4297-4310 (2012).</li>
<li>Urbach, R., Technau, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroblast+formation+and+patterning+during+early+brain+development+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila.</a> BioEssays. 26, 739-751 (2004).</li>
<li>Bello, B., Reichert, H., Hirth, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+brain+tumor+gene+negatively+regulates+neural+progenitor+cell+proliferation+in+the+larval+central+brain+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The brain tumor gene negatively regulates neural progenitor cell proliferation in the larval central brain of Drosophila.</a> Development. 133, 2639-2648 (2006).</li>
<li>Lee, C. Y., Wilkinson, B. D., Siegrist, S. E., Wharton, R. P., Doe, C. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brat+is+a+Miranda+cargo+protein+that+promotes+neuronal+differentiation+and+inhibits+neuroblast+self-renewal%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">Brat is a Miranda cargo protein that promotes neuronal differentiation and inhibits neuroblast self-renewal.</a> Dev Cell. 10, 441-449 (2006).</li>
<li>Betschinger, J., Mechtler, K., Knoblich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Asymmetric+segregation+of+the+tumor+suppressor+brat+regulates+self-renewal+in+Drosophila+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Asymmetric segregation of the tumor suppressor brat regulates self-renewal in Drosophila neural stem cells.</a> Cell. 124, 1241-1253 (2006).</li>
<li>Pereanu, W., Shy, D., Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphogenesis+and+proliferation+of+the+larval+brain+glia+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Morphogenesis and proliferation of the larval brain glia in Drosophila.</a> Dev Biol. 283, 191-203 (2005).</li>
<li>Moraru, M. M., Egger, B., Bao, D. B., Sprecher, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+identity%2C+morphology%2C+apoptosis+and+mitotic+activity+in+a+primary+neural+cell+culture+system+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell identity, morphology, apoptosis and mitotic activity in a primary neural cell culture system in Drosophila.</a> Neural Dev. 7, 14(2012).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu protokol, böylece başarılı bir diseksiyon için olan ihtiyacı ortadan kaldırarak, in situ Drosophila embriyonik ve larva hedef dokulara immunostain için bir yöntem sağlar. Erken embriyolar 1,2,3 boyanması için önce protokoller gereğince, koryonik membran% 50 çamaşır suyu (NaOCl) kullanılarak kaldırılır. Numuneler formaldehit ve metanol giderilmiştir. Larva kütikül yüzer eski numune neden olduğu için, bütün numune daha sonra larva tutulmasını sağlamak için bir hücre süzgecinden geçirildi. Örnek kimy...

Drosophila embriyoları ve larvaları birçok organda ve dokuda gelişim süreçlerini incelemek için mükemmel bir model sunmaktadır. Tek tek hücrelerin Görüntüleme hücrelerinin geliştiği karmaşık ortamları tespit etmek için, bu çalışmalarda genellikle gereklidir. Dokusunun Görselleştirme imüno yoluyla gerçekleştirilebilir. Protokolleri 17 saat Yumurtlayarak (AEL) 1-3 sonra embriyonik Drosophila dokular &lt;ana kadar immünolekeleme iyi tarif. Etkili antikor nüfuz etmesini önlemek embriyojenez sonuna doğru Bununla birlikte, koruyucu kütikül formlar. Bu nedenle, bu immün protokolleri son aşama embriyolarda dokuların analizi ve larva gelişimi (1. safha (L1), 2. safha (L2) ve 3. instar (L3)) daha sonraki aşamalarında verimsizdir. Bu verimsizlik bu genişletilmiş gelişme döneminde 4 sırasında meydana dinamik süreçleri anlamamıza engel dayatır. Tissue diseksiyonu bu engeli 5-7 aşmak için bir yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. Ancak, diseksiyon verimsiz kanıtlayabilirim. Ekstraksiyon bulma veya embriyonik ve larva dokuları izole güçlüğü ile ipotekli olabilir. Bundan başka, hedef dokuların fiziksel giderilmesi, bunları kırılması ya da tamamen bunları elde etmek için başarısız olarak zarar görmesine neden olabilir. Sonikasyon arası etkileşimleri bozmak ses dalgaları kullanan bir yöntemdir. Nöral hücre tipleri 6 geliştirmek immunostain amacıyla Drosophila larva kütikül bütünlüğünü bozmak için kullanılmıştır. Bu protokol geç evre embriyonik ve çapı 8-10 50um kadar küçük olabilir larva organlarında, immunostain adapte edilmiştir. Bu çalışmaları sayesinde, erkek tohum çizgisi kök hücreleri (GSC) hücresi oluşum süreci sonunda aşamasında karakterize edilmiştir kök hücre gelişimini düzenleyen ve dif Drosophila embriyolar 8-10 ve mekanizmaGeç evre embriyonik gonadlar ve larvaları ferentiation 9-12 saptanamamıştır. Böylece, sonikasyon nedeniyle doku boyutu zor olabilir doku diseksiyonu etkili bir alternatif sağlar. Bundan başka, bütün organizmanın bağlamında hücreleri bırakarak ve in situ morfolojisinde muhafaza yerinde Drosophila dokuların imüno-boyanmasını sağlar. Burada, in situ / erken orta L3 dokular içinden geç embriyonik aşama floresanlığıdır immün için adım adım protokol açıklar. Drosophila gonadal ve sinir dokusunun analizi bu protokolün etkinliğini göstermek için Temsilcisi Sonuçlar gösterilir. Ayrıca, bu imüno protokol bir dış kütikül diğer organizmalardaki diğer Drosophila dokusunu ve dokularının analiz edilmesi için adapte edilebilir.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tablo 1: Reaktifler ve Tamponlar</td></tr><tr><td>Fosfat tamponu Triton X-100 (PBTx)</td><td></td><td></td><td>5 L için: 500 ml PBS 10X, 4.45 L ddH2O, 50 ml Triton %10. RT'de saklayın.</td></tr><tr><td>Fosfat tampon tuzlu su 10X (PBS 10X)</td><td></td><td></td><td>dH'de 1 L için2O: 80 g NaCl, 2 g KCl, 14.4g Na2HPO4, 2.4 g KH2PO4. Bileşenleri ekleyin ve uygun hacme kadar doldurun. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Triton %</td><td></td><td></td>10 <td>50 ml için: 5 ml Triton, 5 ml PBS 10X, 45 ml ddH2O. Karıştırmak için kaya. RT'de saklayın.</td></tr><tr><td>PEMS</td><td></td><td></td><td>0,1 m borular (pH 6,9), 2,0 mM MgSO<alt>4</alt>, 1,0 mM EGTA. RT'de saklayın.</td></tr><tr><td>Borular</td><td></td><td></td><td>400 ml'lik 0,25 M'lik bir çözelti (pH 6,9) için: 30,24 g Borular dH20 NaOH. Boruları 300 ml dH2O'da çözün ve ardından NaOH ile pH 6.9'a ayarlayın. dH2O ve otoklav ile toplam hacmi 400 ml'ye getirin. RT'de saklayın.</td></tr><tr><td>Formaldehit</td><td></td><td></td>: <td>Metanol cinsinden ağırlıkça %37 formaldehit. Formaldehit, heptan ve metanol atık karışımını, kurumsal yönergelere göre atmadan önce çeker ocakta sıkıca kapatılmış bir kapta saklayın.</td></tr><tr><td>Heptan</td><td></td><td>CAS 142-82-5</td><td>n-Heptan. Formaldehit, heptan ve metanol atık karışımını, kurumsal yönergelere göre atmadan önce çeker ocakta sıkıca kapatılmış bir kapta saklayın.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td></td><td>CAS 67-56-1</td><td>RT'de saklayın. Formaldehit, heptan ve metanol atık karışımını, kurumsal yönergelere göre atmadan önce çeker ocakta sıkıca kapatılmış bir kapta saklayın.</td></tr><tr><td>Fosfat tamponu Tween (PBTw)</td><td></td><td></td><td>1 L yapmak için: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween %10. Tüm bileşenleri ekledikten sonra filtre sterilize edilir. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Tween 10%</td><td></td><td></td><td>50 ml için: 5 ml Tween, 5 ml PBS 10X, 40 ml ddH2O. Karıştırmak için kaya. RT'de saklayın.</td></tr><tr><td>Sığır serum albümini / fosfat tamponu Tween (BBTw)</td><td></td><td></td> <td>1 L yapmak için: 100 ml PBS 10X, 890 ml ddH2O, 10 ml Tween% 10, 1 g Sığır Serum Albümini (BSA). BSA ekleyin, ardından 0.2 & mu kullanarak sterilize edin; M vakumlu filtre ünitesi. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Normal keçi serumu (NGS)</td><td>ackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>005-000-121</td><td>10 ml yapmak için: Normal keçi serumu 10 ml ddH2O. NGS şişesine ddH2O ekleyin ve 0.2 & kullanarak sterilize edin; m syrninge filtresi. Alikotları -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>1,4-diazabisiklo[2.2.2]oktan (DABCO)</td><td></td><td>CAS: 281-57-9</td><td>100 ml yapmak için: 25 ml ddH2O, 1 ml Tris HCl (1M, pH 7.5), 2.5 g DABCO katı, 3.5 ml 6N HCl, 250 &mu; l 10N NaOH, 70 ml gliserol. Karıştırma çubuklu 250 ml'lik behere ddH2O, Tris HCl ve DABCO ekleyin. Karıştırın ve ardından 6N HCl, 10 N NaOH ve gliserol ekleyin. Daha sonra çözelti pH 7.5'e ulaşana kadar damla damla 10N NaOH ekleyin. Aliquot. Alikotları -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>DABCO + p-fenilendiamin (PPD) çözeltisi</td><td></td><td></td><td>1.765 ml NaHCO3, 0.353 Na2CO3, 0.02 g PPD (CAS: 106-50-3). PPD'yi NaHCO3 ve NaCO3 çözeltisinde çözün. 60 &mu ekleyin; l 500 & mu'ya PPD çözeltisi; DABCO'nun l. Alikotları -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Elma suyu tabakları</td><td></td><td></td><td>~200 tabak yapmak için: 45 g agar (CAS#9002-18-0), 45 g toz şeker (mağazadan satın alınmış), 500 ml elma suyu (mağazadan satın alınmış), 15 ml Tegosept %10, 1.5 ml ddH2O. 4 L'lik şişede ddH2O'ya agar ekleyin ve ardından 30 dakika otoklavlayın. Isıtılmış karıştırma plakasında elma suyu ve şekeri karıştırın. Yavaş yavaş elma suyu karışımını otoklavlanmış agar'a ekleyin. Isıtılmış karıştırma plakasında karıştırın, ardından 10 ml'lik hacimleri 35 mm'lik petri kaplarına alın ve katılaşması için RT'de bekletin. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Tegosept %10100</td><td></td><td></td> <td>ml yapmak için: 10 g Tegosept, 100 ml etanol. Alikotları -20 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td>Maya macunu</td><td></td><td></td> <td>~ 50 g kuru aktif maya. Macun kıvamına gelene kadar karıştırırken maya içeren behere ddH2O'yu yavaş yavaş ekleyin. 4 ° C'de saklayın.</td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 2: Boyama Malzemeleri</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>1:1000, 5 mg / ml'de stok.</td></tr><tr><td>Tavşan anti-Vasa</td><td></td><td></td><td>1:250, Ruth Lehmann'dan bir hediye.</td></tr><tr><td>Fare anti-Faşilin III</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)</td><td>7G10</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Fare anti-1B1</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)</td><td>1B1</td><td>1:4</td></tr><tr><td>Guniea domuzu anti-Trafik Sıkışıklığı</td><td></td><td></td><td>1:2500, Dorthea Godt'tan bir hediye (Li ve diğerleri, 2003).</td></tr><tr><td>Fare anti-Prospero</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)</td><td>Prospero MR1A</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Sıçan anti-Elav</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)</td><td>7EBA10</td><td>1:30</td></tr><tr><td>fare anti-Repo</td><td>Gelişimsel Çalışmalar Hibridoma Bankası (DSHB)</td><td>8D12</td><td>1:10</td></tr><tr><td>Keçi anti-tavşan Alexa546</td><td>Invitrogen</td><td>A11010</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Keçi anti-fare Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11029</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Keçi anti-guniea domuzu Alexa633</td><td>Invitrogen</td><td>A21105</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Keçi anti-sıçan Alexa488</td><td>Invitrogen</td><td>A11006</td><td>1:500</td></tr><tr><td colspan="4">Tablo 3: Malzeme ve</td></tr><tr><td>Ekipman Sinek Kafesleri</td><td>El yapımı; Genesee Scientific Corporation</td><td>Uygulanamaz; Şişeler: 32-130; Önceden yapılmış kafes: 59-101</td><td>Şeffaf dökme akrilik borunun (1 3/4 inç çapında) 400 rpm'de bileşik gönye testere ile 4 inç boyunda segmentler halinde kesilmesiyle yapılmıştır. Ultra ince paslanmaz çelik elek (küvetin bir ucuna akrilik bileşen yapıştırıcı ile tutturulmuştur. Boş bir sinek maması şişesi kullanan alternatif bir yöntem Drosophila Protokoller ISBN 0-87969-584-4'te bulunabilir. Kafesler ayrıca Genesee Scientific Corporation'dan da satın alınabilir.</td></tr><tr><td>Sonikatör: Branson 250 Dijital Sonifier</td><td>Branson</td><td>Model: Branson Dijital Sonifier 250</td><td></td></tr><tr><td>Sonikatör probu</td><td>Branson</td><td>Model #: 102C (CE)</td> <td>EDP: 101-135-066; S / N: OBU06064658</td></tr><tr><td>Şırınga filtresi</td><td>Nalgene</td><td>190-25-20</td><td>0.2 & mu; m selüloz, asetat membran filtre</td></tr><tr><td>Görüntüleme sistemi: Multikromatik ışık kaynağı, dijital CCD kamera ve görüntüleme yazılımı ile dönen diskli konfokal mikroskop</td><td>Mikroskop: Olympus, Işık kaynağı: Lümen Dinamiği, Kamera: Q-Görüntüleme, Görüntüleme Yazılımı: Intelligent Imaging Inc.</td><td></td><td>Mikroskop: DSU eğirme diski ile donatılmış BX51, Işık kaynağı: X-Cite 120Q, Kamera: RETIGA-SRV, Görüntüleme Yazılımı: Slidebook 5.0</td></tr><tr><td>Vakum filtre ünitesi</td><td>Nalgene</td><td>450-0020</td><td>0.2 & mu; M Selüloz Nitrat Membran Filtre</td></tr></tbody></table>

geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı immunoflorasan boyama<em&gt; drosophila</em&gt; dokular<em&gt; yerinde</em

Sonication-facilitated Immunofluorescence Staining of Late-stage Embryonic and Larval Drosophila Tissues In Situ

Drosophila yapılan çalışmalar embriyo ve larva gibi hücre kaderi şartname ve organogenezis gibi gelişimsel süreçlerine önemli bilgi sağlar melanogaster. İmmünoboyama doku ve organların geliştirilmesi görselleştirme sağlar. Bununla birlikte, embriyojenez sonunda oluşturan bir koruyucu üst deri geç dönem embriyo ve larvalarına antikorların geçirmesini engeller. Immün önce diseksiyon düzenli Drosophila larva dokularının analiz etmek için kullanılır iken, küçük dokular bulmak ve izole etmek zor olabilir çünkü, bazı analizler için verimsiz kanıtlıyor. Sonikasyon larva Drosophila immünoboyamasıdır protokoller diseksiyon için bir alternatif sağlar. Geç evre embriyo ve larvaların çok sayıda hızlı, eşzamanlı işleme izin verir ve yerinde morfolojisi tutar. Formaldehit içinde tespit sonra, bir numune ultrasonik banyoda tutulur. Numune, daha sonra antigen-spesifik primer ant ile imüno tabi tutuluribodies ve floresan etiketli sekonder antikorlar floresan mikroskobu ile hedef hücre tiplerini ve spesifik proteinlerin görselleştirmek için. Sonikasyon işlemi sırasında numunenin üstüne, bir sonikasyon probu, hem de sonikasyon süresi ve yoğunluğu, uygun yerleştirilmesi kritik öneme sahiptir. Standart immünoboyama protokolleri Ek bir küçük değişiklikler, yüksek kaliteli lekeler için gerekli olabilir. Gürültü oranı düşük sinyalli antikorlar için, daha uzun inkubasyon süreleri tipik olarak gereklidir. Bu Sonication kolaylaştırdı protokol konseptinin bir kanıtı olarak, gelişim aşamaları bir dizi üç doku tiplerinin (testisler, yumurtalıklar, ve nöral dokular) arasında immunohistokimyasal göstermektedir.

Geç evre embriyonik ve larva in situ dokularının analizi içinde sonikasyon bazlı imüno etkinliğini göstermek için, vahşi tip embriyoları ve larva testis, yumurtalık immün ve nöral doku için işlenmiştir. Numuneler konfokal mikroskobu ile görüntülendi ve temsili sonuçları (Şekil 1 ve Şekil 2) gösterilmiştir. Sonuçlar tarif edilen protokol Drosophila gelişiminin geç embriyonik erken aracılığıyla / orta L3 aşamalarında morfolojik özelliklerin yanı sıra, tek tek hücrelerin ...

İmmün boyama, dokulardaki belirli hücre tiplerini ve proteinleri görselleştirmek için etkili bir tekniktir. Sonikasyonu kullanarak, burada açıklanan protokol, immünostainingden önce Drosophila melanogaster dokularını geç evre embriyolardan ve larvalardan ayırma ihtiyacını hafifletir. Formaldehitle sabitlenmiş bütün mount larvalarının immün boyaması için etkili bir metodoloji sunuyoruz.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama<em&gt; Drosophila</em&gt; Dokular<em&gt; Yerinde</em

Studies performed in Drosophila melanogaster embryos and larvae provide crucial insight into developmental processes such as cell fate specification and ...

Bu prosedürün genel amacı, sonikasyon sonrası floresan mikroskobi kullanarak C. elegans dokularını görselleştirmek veya boyamaktır. Bu işlem, öncelikle embriyonik ve larval örneklerin toplanması ve ardından formaldehit, heptan ve metanol kullanılarak fikse edilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, antikor penetrasyonuna izin vermek amacıyla kütikülü uzaklaştırmak için fikse edilmiş örneğe sonikasyon uygulamaktır.Ardından, örnek primer ve floresan sekonder antikorlar ile immün boyamaya tabi tutulur. Son adım, örneğin gliserol bazlı bir Antifa çözeltisine yerleştirilmesidir. Nihayetinde, gelişmekte olan dokunun yanı sıra protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu görüntülemek için konfokal veya epi-floresan mikroskopi kullanılır.Bu tekniğin doku diseksiyonu gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, çeşitli gelişmekte olan dokuların in situ görüntülenmesine olanak tanımasıdır. Genel olarak, bu yöntemi ilk kez kullanacak kişiler, sonikasyon adımının maksimum verimliliğe ulaşması için sonikasyon probunun doğru konumlandırılması da dahil olmak üzere bir dizi faktöre bağlı olması nedeniyle zorluk yaşayabilirler. Prosedürü laboratuvarımdan iki yetenekli lisans araştırmacısı olan Ashley Fiddler ve Lauren Bole uygulamalı olarak gösterecektir.Deneye başlamak için, fosfat tamponu Triton X 100 veya PBTX çözeltisi ile nemlendirilmiş küçük bir resim fırçası kullanarak agar plakası üzerinde toplanan embriyoları dikkatlice alın. Ardından, numune yüklü fırçayı bir hücre süzgecinin içe bakan kenarına sürterek temizleyin. Hücre süzgecinin altına bir Petri kabı kapağı yerleştirin.Ardından, fırçayı ve hücre süzgecinin duvarlarını PBTX içeren bir püskürtme şişesiyle durulayın. Numune süzgece aktarıldıktan sonra, numuneyi gözeneklerden yukarı kaldırmak için süzgece yeterli miktarda PBTX dökün. Maya ve sinek atıklarını uzaklaştırmak için bu adımı üç kez tekrarlayın, ardından PBTX'i uzaklaştırın.Ardından, süzgecin içine %50'lik çamaşır suyu çözeltisi dökün ve larvaların çözelti içinde beş dakika beklemesini sağlayın. Sonra, çözeltiyi uzaklaştırın. Ardından örneği PBTX ile yıkayın ve örneğin çözelti içinde üç dakika beklemesine izin verin.Bu adımı beş kez tekrarlayın, hücre süzgecinin alt kısmını kurulayın. Ardından, örneği 1,75 milliliters pems içeren bir sintilasyon şişesine aktarmak için PBTX ile ıslatılmış bir resim fırçası kullanın. Bir çeker ocak altında, 250 microliters %37 formaldehyde ve sekiz milliliters reaktif kalitesinde madde ekleyin.Sintilasyon tüpüne heptan ekleyin ve tüpü 200 RPM hızında 20 dakika boyunca çalkalayın. Ardından, sulu fazı uzaklaştırmadan sintilasyon tüpüne 10 mililitre metanol ekleyin ve 500 RPM hızında kuvvetlice çalkalayın. Çalkalama işleminden hemen sonra içeriği, sıvı atık kabı üzerindeki bir hücre süzgecine boşaltın.Flakona ekstra metanol ekleyin ve içeriği hücre süzgecinden geçirin. Tüm örneğin alındığından emin olmak için hücre süzgecinin altına laboratuvar mendiliyle bastırın.Ardından, numuneyi süzgeçten 0.5 mililitre metanol içeren 1.5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için bir boya fırçası kullanın. Numunenin çökmesini bekleyin. Daha sonra metanolü bir pipetle çekerek uzaklaştırın ve yerine taze 0.5 mililitrelik bir metanol alikotu ekleyin.Bu adımı üç kez tekrarlayın ve tüpü -20 °C'de saklamadan önce içine son bir 0.5 mL metanol ekleyin. Daha sonra, saklanan örneği dondurucudan çıkarın ve metanolü bir pipet yardımıyla uzaklaştırın. Ardından tüpe 1 mL %50 metanol fosfat tamponu tween veya PBTW çözeltisi ekleyin ve tüpü üç dakika boyunca sallayın.Ardından, numuneyi bir mililitre PBTW ile iki kez durulayın; her seferinde PBTW'yi pipetle çekmeden önce numunenin çökmesine izin verin, flakona 1,0 mililitre sığır serum albümin fosfat tamponlu tween (BBTW) ekleyin ve üç dakika boyunca sallayın. Numunenin çökmesini bekleyin ve BBTW'yi pipetle uzaklaştırın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.Numuneden herhangi bir kayıp vermemeye dikkat ederek mümkün olduğunca fazla BBTW'yi uzaklaştırın. Ardından tüpe 0.5 milliliters BBTW ekleyin ve tübü buza yerleştirin. Sonrasında, sonikatörü %10 maksimum genlik ve iki saniyelik çalışma süresi ile sabit işlem moduna ayarlayın, sonikatör probunun ucunu deiyonize su ile doldurulmuş 50 milliliter konik tüpe yerleştirerek probu temizleyin ve sonikatörü çalıştırın.Ardından sonikasyon probunu bir laboratuvar mendili ile kurulayın. Probu tüpün içine, numunenin üç ila dört milimetre üzerine gelecek şekilde daldırın ve sonikasyonu başlatın. Daha sonra, sonikasyon kaynaklı aşırı ısınmayı önlemek ve numunenin tüpün dibine çökmesini sağlamak için tüpü çıkarıp 30 saniye boyunca buz üzerinde bekletin.Sonikasyon tamamlandıktan sonra, numunenin yaşına göre bu adımı gerektiği kadar tekrarlayın. Numuneyi bir mililitre BBTW ile iki kez durulayın. Her durulamadan sonra, BBTW'yi kurulamadan önce numunenin çökmesini bekleyin. Bir pipet yardımıyla viyale bir mililitre BBTW ekleyin ve viyali bir sallayıcıya yerleştirin.Üç dakika sonra örneğin çökmesine izin verin ve BBTW'yi bir pipetle uzaklaştırın. Ardından bu adımı iki kez tekrarlayın, tüpe BBTW ile seyreltilmiş %5 normal serumdan 0,5 mL ekleyerek örneği bloke edin ve örneği oda sıcaklığında bir saat boyunca sallayıcıya (rocker) yerleştirin.Ardından, 0,5 mililitre primer antikor solüsyonu ekleyin ve numuneyi dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca sallandırarak inkübe edin, ardından numunenin tüpün dibine çökmesini bekleyin. Daha sonra primer antikorları bir pipetle çekip alın ve bir mililitre BBTW ile iki kez durulayın. Flakona bir mililitre BBTW ekleyin ve ardından üç dakika boyunca bir sallayıcıya yerleştirin.Ardından BBTW'yi bir pipetle uzaklaştırın ve bu işlemi tekrarlayın. Beş kez uyguladıktan sonra, örneği %5 normal serum içeren BBTW çözeltisi ile bloklayın ve 30 dakika boyunca sallayın. Sonrasında çözeltiyi uzaklaştırın.%5 normal serum BBTW çözeltisi ile seyreltilmiş sekonder antikoru ekleyin ve tüpü alüminyum folyo ile sarın. Ardından numuneyi dört derece santigrat sıcaklıkta gece boyunca sallayarak inkübe edin. Sekonder antikorları bir pipetle çekip alın ve numuneyi iki kez bir mililitre PBTW ile durulayın.Ardından, viyale bir mililitre PBTW ekleyin ve beş dakika boyunca bir sallayıcıya yerleştirin. Daha sonra örneğin çökmesini bekleyin ve PBTW'yi bir pipetle uzaklaştırın. Bu işlemi tekrarlayın.Üç kez tekrarlayın. Tüpe 80 ila 100 µL DAB co solüsyonu ekleyin ve -20 °C'de saklayın. Son olarak, örneği kapatmak için 5 ila 10 µL dab BCO p lene diamine veya PPD anti-fade kullanın.Ardından floresan mikroskobu ile görüntüleyin. Dört konfokal kesitinin bu Z projeksiyonları, drosophila gelişiminin geç embriyonik evresinden erken ve orta L3 evrelerine kadar C2'deki bireysel hücrelerin yanı sıra morfolojik özelliklerin görselleştirilmesi için protokolün etkinliğini göstermektedir. Testis gelişimi, larval gelişim boyunca testis olgunlaşması dinamik olduğu için protokol etkinliğini örneklendirmek adına özellikle uygun bir sistemdir.Bu görüntüler, mid L3 beyinlerinin tek konfokal kesitlerinde germ hücrelerini kırmızıyla, hub hücrelerini ve FU bölgelerini ise yeşil ile vurgulamaktadır. Ganglion ana hücreleri, farklılaşmamış nöronlar yeşil renkte; olgunlaşmamış ve primer nöronlar ise kırmızı renkte immün boyanmış olup, beyin loblarında ve ventral sinir kordunda belirgin ekspresyon modelleriyle güçlü boyanma göstermektedir; montaj yönüne bağlı olarak görüntüleme, beyin dokusunun dorsal yüzeyden, ventral yüzeyden veya sagital kesitten görselleştirilmesine olanak tanır.Bu in situ tekniği, koruyucu kütikülün antikor penetrasyonunu engellediği organizmalarda biyologların doku morfojenezindeki organ gelişimini incelemelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, C iki'de gelişmekte olan dokuları görselleştirmek amacıyla geç evre embriyonik ve larval özofagus örneklerinin nasıl sonike edileceği ve immünboyama yapılacağı konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Formaldehit, heptan ve metanol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve çeker ocak altında çalışmak gibi önlemlerin gerektiğini unutmayın.Bu prosedür gerçekleştirilirken her zaman uygun eldiven ve laboratuvar önlüğü giyilmelidir.

sonication-facilitated-immunofluorescence-staining-late-stage

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Mezoskopik floresan tomografi doku kesit floresan mikroskopi penetrasyon sınırları ötesinde faaliyet göstermektedir. Tekniği çok projeksiyon aydınlatma ve foton bir taşıma açıklamasına dayanmaktadır. Biz, in vivo morfolojilerinden tüm vücut 3B görselleştirme, GFP ifade kanat hayali diskler...

Mezoskopik Floresans Tomografi için In-vivo Görüntüleme Geliştirme Drosophila</em

Drosophila hemocytes gelişmekte olan embriyonun bütünlüğü içinde dağılırlar . Bu protokol, floresan etiketli hemocytes embriyoları kullanılarak bu göçler montaj ve görüntü nasıl gösteriyor.

Uygulamalarda Canlı Görüntüleme Drosophila melanogaster Embriyonik Hemocyte Göçler

Drosophila pupa Karın İmmünohistokimya

Tüm Dağı RNA Floresan<em&gt; In situ</emVe&gt; Hibridizasyon<em&gt; Drosophila</em&gt; Embriyolar

Yaprak biti embriyoları üzerinde tam montajlı immün boyama protokolü sunulmuştur, burada arka plan boyamasını azaltmak ve doku geçirgenliğini artırmak için kritik koşullar ele alınmaktadır. Bu koşullar, yaprak bitlerinin embriyonik dokularında protein ekspresyonunun etkili bir şekilde tespit edilmesi için özel olarak geliştirilmiştir.

Bezelye Afit Embriyolar immün için kritik Koşulların Belirlenmesi: Doku geçirgenliğini arttırarak ve Arka Plan Boyama azaltılması

Işık levha bazlı floresan mikroskobu ile böcek embriyonlarından morfojenezini Görüntüleme tekniğin durumu haline gelmiştir. Bu protokol ana hatlarıyla ve Tribolium castaneum embriyolar için uygun üç montaj teknikleri karşılaştırır, canlı görüntüleme için uygun iki yeni ısmarlama transjenik çizgileri sunar, önemli bir kalite kontrol anlatılır ve mevcut deney sınırlamaları gösterir.

Işık Levha tabanlı Floresan Yaşayanlar Mikroskopi veya Sabit ve Lekeli<em&gt; Tribullum castaneum</em&gt; Embriyolar

Açıklanan RNA in situ hibridizasyon Protokolü RNA algılama bütün Drosophila embriyo veya disseke doku sağlar. 96-de microtiter plakaları ve tyramide sinyal Güçlendirme kullanma, yüksek kararlılık, duyarlılık ve işlem hacmi ve nispeten düşük bir maliyetle transkript tespit edilebilir.

Yüksek çözünürlüklü Floresan Situ hibridizasyon Drosophila embriyo ve Tyramide sinyal güçlendirme kullanarak doku

Burada, Drosophila embriyo proteini ve RNA'nın toplanmasından ön gömülmesine ve gömülmesine, immünoboyamaya ve mRNA in situ hibridizasyonuna kadar tespiti ve lokalizasyonu için bir protokol tarif ediyoruz.

Erken Drosophila Embriyosunda İmmünohistokimya ve RNA In-situ Dağılımı için Bir Protokol

Burada, geç embriyonik Drosophila erkek gonadını canlı olarak görüntülemek için gerekli bir diseksiyon protokolü sunuyoruz. Bu protokol, normal koşullar altında veya transgenik veya farmakolojik manipülasyondan sonra dinamik hücresel süreçlerin gözlemlenmesine izin verecektir.

Geç Embriyonik Drosophila Gonad'ın Diseksiyonu ve Canlı Görüntülemesi

Bu protokol, geleneksel GFP/mCherry etiketi yaklaşımları kullanılarak tespit edilmesi zor olan düşük bolluktaki proteinlerin veya translasyon sonrası modifikasyonların canlı görüntülenmesini sağlamak için özelleştirilmiş antikor bazlı floresan etiketlemeyi ve erken Drosophila embriyolarına enjeksiyonu açıklar.

Floresan Antikor Enjeksiyonu ile Canlı Drosophila Embriyolarında Düşük Bolluktaki Proteinlerin ve Translasyon Sonrası Modifikasyonların Görselleştirilmesi

Bu protokoller, kontrol ve mutant Drosophila embriyonik epitelisindeki pileli septat bağlantılarının organizasyonu ve kapatma fonksiyonunun nasıl karakterize edileceğini açıklar.

Drosophila embriyonik epitelinde çekirdek pileli septat bağlantı proteinlerini tanımlamak için immünboyama ve boya penetrasyonu deneyleri

Öğrenin Drosophila melanogaster dokularında sonikasyon destekli immünofloresan boyama yöntemini. Bu teknik, diseksiyon gerektirmeden protein lokalizasyonunu görselleştirerek gelişim biyolojisi araştırmalarını kolaylaştırır.

Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama

Daha fazla video keşfet