Geç evre embriyonik ve larva soniklenmesi-kolaylaştırdı Immunoflorasan Boyama Drosophila Dokular Yerinde

Bu prosedürün genel amacı, sonikasyonu takiben floresan mikroskobu kullanarak C iki'deki dokuları görselleştirmek veya doyurmaktır. Bu, önce embriyonik ve larva örneklerinin toplanması ve ardından bunların formaldehit, heptan ve metanol kullanılarak sabitlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, antikor penetrasyonuna izin vermek için kütikülü çıkarmak için sabit numuneyi sonikasyona tabi tutmaktır.

Daha sonra, numune birincil ve floresan ikincil antikorlarla immün boyamadır. Son adım, numuneyi gliserol bazlı bir Antifa çözeltisine monte etmektir. Sonuç olarak, gelişmekte olan dokunun yanı sıra protein ekspresyonu ve lokalizasyonunu görselleştirmek için konfokal veya epi floresan mikroskobu kullanılır.

Bu tekniğin doku diseksiyonu gibi diğer yöntemlere göre en büyük avantajı, çeşitli gelişmekte olan dokuların görüntülenmesine izin vermesidir. Genel olarak, bu yönteme yeni olan bireyler mücadele edecektir, çünkü sonikasyon adımı, sonica probunun uygun şekilde konumlandırılması da dahil olmak üzere maksimum verimliliği elde etmek için bir dizi faktöre bağlıdır. Prosedürü göstermek, laboratuvarımdan iki yetenekli lisans araştırmacısı olan Ashley Fiddler ve Lauren Bole olacak.

Deneye başlamak için, fosfat tamponu Triton X 100 veya PBTX çözeltisi ile birleştirilmiş küçük bir boya fırçası kullanarak bir agar plakasında toplanan embriyoları dikkatlice çıkarın. Ardından, numune yüklü boya fırçasını bir hücre süzgecinin iç bakan çıkıntısına doğru silin. Hücre süzgecinin altına bir Petri kabı kapağı yerleştirin.

Ardından boya fırçasını ve hücre süzgecinin duvarlarını PBTX içeren bir fışkırtma şişesiyle durulayın. Numune süzgecin süzgecine aktarıldıktan sonra, numuneyi ağdan kaldırmak için süzgecin içine yeterince PBTX dökün. Mayayı ve sinek atıklarını çıkarmak için bu adımı üç kez tekrarlayın, PBTX'i çıkarın.

Daha sonra süzgecin% 50 çamaşır suyu solüsyonu dökün ve larvaların solüsyonda beş dakika bekletilmesine izin verin. Sonra, çözeltiyi çıkarın. Daha sonra numuneyi PBTX ile yıkayın ve numunenin çözelti içinde üç dakika

Adımı beş kez tekrarlayın, hücre süzgecinin altını kurutun. Ardından, numuneyi 1.75 mililitre pem içeren bir parıldama şişesine aktarmak için PBTX ile birleştirilmiş bir boya fırçası kullanın. Bir çeker ocakta 250 mikrolitre %37 formaldehit ve sekiz mililitre reaktif derecesi ekleyin.

Sintilasyon şişesine heptan ekleyin ve şişeyi 20 dakika boyunca 200 RPM'de çalkalayın. Daha sonra sulu fazı çıkarmadan sintilasyon şişesine 10 mililitre metanol ekleyin ve 500 RPM'de kuvvetlice çalkalayın. Çalkaladıktan hemen sonra, içindekileri bir sıvı atık kabının üzerindeki bir hücre süzgecine dökün.

Şişeye ekstra metanol ekleyin ve içindekileri hücre süzgecinden geçirin. Tüm numunenin çıkarıldığından emin olmak için. Hücre süzgecinin altını laboratuvar dokusu ile deneyin.

Ardından, numuneyi süzgeçten 0,5 mililitre metanol içeren 1,5 mililitrelik bir mikro santrifüj tüpüne aktarmak için bir boya fırçası uygulayın. Numunenin oturmasını bekleyin. Daha sonra metanolü bir pipetle çıkarın ve yerine 0,5 mililitrelik taze bir metanol alikotu koyun.

Bu adımı üç kez tekrarlayın ve eksi 20 santigrat derecede saklamadan önce tüpe son bir 0,5 mililitre metanol ekleyin. Daha sonra, saklanan numuneyi dondurucudan alın ve metanolü bir pipetle çıkarın. Daha sonra tüpe bir mililitre %50 metanol fosfat tampon arası veya PBTW çözeltisi ekleyin ve tüpü üç dakika sallayın.

Daha sonra, numuneyi bir pipetle çekmeden önce numunenin çökmesine izin vererek iki kez bir mililitre PBTW ile durulayın, şişeye 1.0 mililitre sığır serum albümini fosfat tamponlu ara veya BBTW ekleyin ve üç dakika boyunca sallayın. Numunenin yerleşmesine izin verin ve BBTW'yi bir pipetle çıkarın. Bu adımı iki kez tekrarlayın.

Numunenin hiçbirini kaybetmeden mümkün olduğunca fazla BBTW çıkarmaya özen gösterin. Daha sonra tüpe 0,5 mililitre BBTW ekleyin ve buzun üzerine yerleştirin. Daha sonra, sonikatı% 10 maksimum genliğe ve sabit asyon ile iki saniyelik bir çalışma süresine ayarlayın, prob ucunu deiyonize su ile doldurulmuş 50 mililitrelik konik bir tüpe yerleştirerek ator probunu temizleyin ve sonikatı çalıştırın.

Sonra sonicate probunu bir laboratuvar dokusu ile kurulayın. Probu, numunenin üç ila dört milimetre yukarısındaki tüpe daldırın ve sonikasyonu başlatın. Daha sonra tüpü çıkarın ve sonikasyondan aşırı ısınmayı önlemek ve numunenin tüpün dibine yerleşmesini sağlamak için 30 saniye boyunca buzun üzerine yerleştirin.

Sonikasyon tamamlandıktan sonra numune yaşının gerektirdiği şekilde bu adımı tekrarlayın. Numuneyi bir mililitre BBTW ile iki kez durulayın. Her durulamadan sonra, BBTW'yi kurutmadan önce numunenin çökmesine izin verin Bir pipetle, şişeye bir mililitre BBTW ekleyin ve bir külbütör üzerine yerleştirin.

Üç dakika sonra, numunenin yerleşmesine izin verin ve BBTW'yi bir pipetle çıkarın. Sonra bunu tekrarlayın. İki kez adım atın, numuneyi BBTW içinde tüpe seyreltilmiş 0.5 mililitre% 5 normal serum ile bloke edin ve numuneyi oda sıcaklığında bir saat boyunca bir külbütöre yerleştirin.

Daha sonra, 0.5 mililitre birincil antikor çözeltisi ekleyin ve numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede sallayın, numunenin tüpün dibine çökmesine izin verin. Daha sonra bir pipetle birincil antikorları çekin ve bir mililitre BBTW ile iki kez durulayın. Şişeye bir mililitre BBTW ekleyin ve ardından üç dakika boyunca bir külbütöre yerleştirin.

Ardından BBTW'yi bir pipetle çıkarın ve bunu tekrarlayın. Beş kez adımlayın, numuneyi% 5 normal serum BBTW çözeltisi ile bloke edin ve 30 dakika boyunca sallayın. Sonra çözeltiyi çıkarın.

% 5 normal serum BBTW çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikor ekleyin ve tüpü alüminyum folyoya sarın. Ardından numuneyi gece boyunca dört santigrat derecede sallayın. İkincil antikorları bir pipetle çekin ve numuneyi bir mililitre PBTW ile iki kez durulayın.

Ardından, şişeye bir mililitre PBTW ekleyin ve beş dakika boyunca bir külbütöre yerleştirin. Ardından numunenin yerleşmesine izin verin ve PBTW'yi bir pipetle çıkarın. Bunu tekrarla.

Üç kez adım atın. Tüpe 80 ila 100 mikrolitre DAB co çözeltisi ekleyin ve eksi 20 santigrat derecede saklayın. Son olarak, numuneyi monte etmek için beş ila 10 mikrolitre dab BCO p lene diamin veya PPD anti fade kullanın.

Ardından floresan mikroskobu ile görüntüleyin. Dört konfokal dilimin bu Z projeksiyonları, drosophila gelişiminin geç embriyonik ve orta L üç aşaması sırasında C iki'deki tek tek hücrelerin yanı sıra morfolojik özellikleri görselleştirmek için protokolün etkinliğini göstermektedir. Testis gelişimi, protokol etkinliğini göstermek için özellikle iyi bir sistemdir, çünkü testislerin olgunlaşması larva gelişimi boyunca dinamiktir.

Bu görüntüler, orta L üç beynin kırmızı ve göbek hücrelerindeki germ hücrelerini ve yeşil tek konfokal bölümlerindeki FU bölgelerini vurgulamaktadır. Ganglion ana hücreleri, yeşil ve olgunlaşmamış ve primer nöronlarda farklılaşmamış nöronlar için immün boyama. Kırmızı renkte, beyin loblarında ve ventral sinir kordonunda farklı ekspresyon paternleri ile güçlü lekelenme gösterir, montaj oryantasyonuna bağlı olarak, görüntüleme, dorsal yüzeyden, ventral yüzeyden veya sagital kesitten beyin dokusunun görüntülenmesine izin verir.

Bu in situ iki teknik, biyologların, koruyucu kütikülün antikor penetrasyonunu önlediği organizmalarda doku morfogenezinde organ gelişimini keşfetmelerine olanak tanır. Bu videoyu izledikten sonra, C iki'de gelişmekte olan dokuları görselleştirmek için geç evre embriyonik ve larva özofagus örneklerini nasıl sonikasyon ve immünostain yapacağınızı iyi anlamalısınız. Formaldehit, heptan ve metanol ile çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve çeker ocakta çalışmak gibi önlemlerin alınabileceğini unutmayın.

Bu prosedürü gerçekleştirirken her zaman uygun eldiven ve laboratuvar önlüğü giyilmesine dikkat edilmelidir.