Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Bu prosedürün genel amacı, genomda çok çeşitli genetik hastalıklara yol açabilecek dengesizlikleri belirlemek için karşılaştırmalı genomik hibridizasyonun dizilmesidir. Bu, önce hastanın DNA'sını bir floresan boya ile etiketleyerek gerçekleştirilir. İkinci adımda, hasta, DNA ve farklı şekilde etiketlenmiş bir referans DNA, diziye hibritlenir.

Daha sonra, hastanın miktarını ölçmek için dizi taranır ve her prob için bol miktarda referans DN bulunur. Son adımda, taranan görüntü, hastanın DNA'sının referans DNA dizisinden daha fazla veya daha az materyale sahip olduğu genom bölgelerini tanımlamak için işlenir. Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon, hastanın genetik bir sendromla sonuçlanan bir kopya sayısı varyantı taşıyıp taşımadığını belirlemek için kullanılır.

Bu yöntemin görsel gösterimi, dizi slaytının montajı zor olabileceğinden ve hibridizasyon için kolay olduğundan kritik öneme sahiptir. Etiketleme reaksiyonuna başlamadan önce dökülenleri hazneden karıştırın. Kullanıma hazır 96 oyuklu nükleotid ve primer plakasını dört santigrat derecede çözdürün ve yaklaşık bir saat boyunca ışıktan koruyun.

Çözüldükten sonra, kapalı plakayı oda sıcaklığında 30 dakika daha dengeleyin, DNA örneklerini de bu sırada 60 santigrat derecede 15 dakika dengeleyin. Numuneler ısınırken, yeni bir 96 kuyulu plakanın her bir kuyucuğuna yeterli miktarda nükleaz içermeyen su dağıtmak için bir sıvı işleme robotu kullanın. Daha sonra DNA hazır olduğunda, oyuk başına bir mikrogram numuneyi 96 oyuklu su plakasına aktarın.

Şimdi 20 mikrolitre dengeleyici nükleotid ve primerleri seyreltilmiş DNA örneklerini içeren plakanın her birine aktarın ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamaya dikkat ederek plakayı şerit kapaklarla kapatın. Daha sonra, 10 dakika sonra ısıtılmış kapaklı bir PCR makinesinde DNA'yı 99 santigrat derecede denatüre edin ve plakayı beş dakika boyunca buz üzerinde soğutarak primerleri dizleyin. Ardından, her numuneye 10 mikrolitre temiz ekzo DNA polimeraz enzimi eklemek için sıvı işleme robotunu kullanın.

Numuneleri pipetle karıştırın ve ardından plakayı kapatın ve 37 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. Ertesi gün, reaksiyonu kuyucuk başına beş mikrolitre durdurma tamponu ile sonlandırın, Ardından dahil edilmemiş nükleotidleri çıkarın. Her bir kuyucuğun içeriğini önceden etiketlenmiş iki mililitrelik tüplere aktarın.

Numuneleri ve DNA saflaştırma spin kolonlarını bir spin kolon işleme robotuna ve ayrıca uygun ilgili tamponlara yükleyin. Üreticinin talimatlarına göre, spin kolon işleme robotu, etiketli DNA'yı tüp başına 250 mikrolitre yüksek tuzlu DNA bağlama tamponu ile silika membrana bağlayacak, daha sonra safsızlıklar, her biri 500 mikrolitre yıkama tamponu olan iki yıkama ile membranlardan çıkarılacaktır. Robot daha sonra, numuneleri hibridize etmek için saflaştırılmış etiketli DNA örneklerini yaklaşık 12 mikrolitrelik hacimlerde geri kazanmak için membranlara 15 mikrolitre düşük tuzlu çözelti tamponu ekleyecektir.

Daha sonra, bir hibridizasyon fırınını 65 santigrat dereceye ısıtın ve destek kızaklarını ve hibridizasyon odalarını önceden ısıtın. Hibridizasyon karışımını hazırlamak için, üretici tarafından sağlanan engelleme karışımından 1.1 mikrolitre manşon 1D NA 4.95 mikrolitre ve 24.75 mikrolitre hibridizasyon tamponunu birleştirin. Bu karışımı yeni bir 96 kuyulu plakanın her bir kuyucuğuna tahsis etmek için sıvı işleme robotunu kullanın ve aktarım doğruluğunu artırmak için her bir ucu önceden ıslatın.

Daha sonra 9.35 mikrolitre uygun imza, üç etiketli DNA, ardından 9.35 mikrolitre uygun imza, beş etiketli DNA pipetleyin. Plakayı her bir kuyuya kapatmak için, numuneleri bir dakika boyunca dört kez doldurun ve her birinin altındaki içeriği toplamak için plakaya hızlı bir dönüş yapın. Etiketli DNA'yı bir ön hibridizasyon inkübatöründe denatüre edin.

Önce 95 santigrat derecede üç dakika, ardından 37 santigrat derecede 30 dakika. Daha sonra 42 santigrat derece ısıtılmış bir platform üzerinde çalışıyor. Ön ıslak uçlar kullanarak, contanın şeffaf kısmının hibridizasyon odasının pencereli kısmı ile aynı hizada olduğundan emin olarak destek sürgüsünü hibridizasyon odasına yerleştirin.

Şimdi 42 mikrolitre hibridizasyon karışımını dizi destek sürgüsünün uygun konumunun ortasına yavaşça pipetleyin. Sıvının lastik halka sınırına temas etmemesine dikkat edin. Tüm pozisyonlar doldurulduktan sonra, dizi kızağını dikkatlice destek kızağına indirin ve hibridizasyon odasını monte edin.

Dizinin yazılı tarafının destek kızağına bakmasına dikkat edin, ardından hibridizasyon odası vidasını tamamen sıkın ve monte edilmiş hibridizasyon odasını kontrol ederek hibridizasyon sızıntısı olmadığını onaylayın. Lastik halka sınırlarının dışında karıştırın ve her bir hava kabarcığının yüksekliği yaklaşık dört milimetre olsun. Hibridizasyon odası dikey olarak ucuna oturtulduğunda, bunu kontrol etmek için hibridizasyon odasını döndürün.

Her pozisyondaki tüm hava kabarcıkları hareket ediyor. Kabarcıklardan herhangi biri sıkışmışsa, hazneye tezgahın üzerine keskin bir şekilde vurun. Daha sonra hibridizasyon odalarını 24 saat boyunca 65 santigrat derecede dönen fırına yerleştirin.

Ertesi gün, hibridizasyon odalarını birinci yıkama tamponuna daldırın ve slaytları ayırmak için bir çift plastik düz kenarlı forseps kullanın. Ardından conta kızaklarını atın ve dizi kızaklarını bir rafa yerleştirin, yeni bir tampona batırın. Dizi slaytlarını yaklaşık 700 mililitre yıkama tamponunda bir ila beş dakika yıkayın, bir pire ve manyetik bir starr ile kuvvetlice karıştırın.

Ardından, dizi slaytlarını, ikinci yıkamanın sonunda daha kuvvetli bir şekilde karıştırarak 90 saniye boyunca iki olmak üzere yaklaşık 700 mililitre yıkama tamponuna aktarın. Dizi slaytlarını yavaşça arabellekten kaldırın. Kuru çıkmaları gerekir.

Ardından dizi slaytlarını, slayt koruyucularıyla birlikte tarayıcıdaki slayt tutuculara yükleyin ve ardından örnekleri tarayın. Dizi üreticisinin talimatlarına göre, hibritleştirilmiş bir dizi üzerindeki her prob, kırmızı ve yeşil florokromların bir karışımı olarak görselleştirilir. Her prob için kırmızı ve yeşil floresan sinyalin oranları, tarayıcı tarafından ölçülür ve ilgili yazılım, bunları genomik konumlarına göre log iki oran olarak lotlar.

Elde edilen dizi izleri, genomik olarak dengesiz olarak tanımlanan bölgelerin yorumlanmasına izin verir. Örneğin, yedinci kromozomun proksimal bölgesinde düşük kopya tekrarlarının aracılık ettiği tekrarlayan bir mikro delesyon sendromu olan Williams sendromlu bir çocuktan alınan bu izde, genomik dengesizlik yazılım tarafından kırmızı bir çizgi ile tanımlandı. Prop floresan log oranı, genomun normal bölgeleri için bire bir yeşil-kırmızı oranını gösterecek şekilde sıfır civarında yakın bir şekilde kümelenmelidir.

Bu taramada gözlemlenen dağınık dizi izleri, anormal bölgelerin yanlış çağrılmasına veya genomik dengesizliğin tanımlanamamasına neden olabilir ve düşük DNA kalitesi veya ışınların varlığı, atmosfer küresindeki ozon seviyeleri dahil olmak üzere bir dizi faktörden kaynaklanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, A CGH ile test edilmek üzere hasta numunelerinin nasıl işleneceğini ve aşağı akış analizi ve kopya sayısı varyasyonunun tespiti için iyi kalitede verilerin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.