Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Bu prosedürün genel amacı, çok çeşitli genetik hastalıklara yol açabilen genomik dengesizlikleri belirlemek için karşılaştırmalı genomik hibridizasyon dizisi uygulamaktır. Bu işlem, öncelikle hastanın DNA'sının floresan bir boya ile işaretlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, hastanın DNA'sı ve farklı şekilde işaretlenmiş bir referans DNA, diziye hibridize edilir.

Ardından, her bir proba bağlanan hasta ve referans DNA miktarlarını ölçmek için dizi taranır. Son adımda, taranmış görüntü, hastanın DNA'sının referans DNA dizisine göre daha fazla veya daha az materyale sahip olduğu genom bölgelerini belirlemek üzere işlenir. Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon, hastanın genetik bir sendromla sonuçlanan bir kopya sayısı varyantı taşıyıp taşımadığını belirlemek için kullanılır.

Dizi lamının montajı zor olabildiği ve hibridizasyon sırasında hazne dışına sızıntı olması kolay olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. Etiketleme reaksiyonuna başlamadan önce hazne dışına sızan kısmı karıştırın. Kullanıma hazır nukleotid ve primer içeren 96 kuyucuklu plakayı, dört derece Celsius sıcaklıkta ve ışıktan korunmuş şekilde yaklaşık bir saat boyunca çözdürün.

Çözündükten sonra, kapaklı plakayı oda sıcaklığında 30 dakika daha dengeleyin; aynı zamanda DNA örneklerini de 60 °C'de 15 dakika boyunca dengeleyin. Örnekler ısınırken, bir sıvı transfer robotu kullanarak yeni bir 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna yeterli miktarda nükleaz içermeyen su dağıtın. DNA hazır olduğunda, kuyucuk başına bir mikrogram örnekten su içeren 96 kuyucuklu plakaya aktarın.

Şimdi, seyreltilmiş DNA örneklerini içeren plakanın her bir kuyucuğuna 20 µL dengeleme nükleotidleri ve primerleri aktarın ve plakayı şerit kapaklarla sıkıca kapattığınızdan emin olarak mühürleyin. Ardından, ısıtmalı kapağı olan bir PCR cihazında DNA'yı 99 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin ve plakayı beş dakika boyunca buz üzerinde şok soğutarak primerleri bağlayın. Daha sonra, her bir örneğe 10 µL clean out exo DNA polimeraz enzimi eklemek için sıvı taşıma robotunu kullanın.

Numuneleri pipetle karıştırın, ardından plakayı kapatıp 37 °C'de 16 saat inkübe edin. Ertesi gün, kuyucuk başına beş µL durdurma tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. Ardından, bağlanmamış nükleotidleri uzaklaştırın. Her kuyucuğun içeriğini, önceden etiketlenmiş ayrı iki mL'lik tüplere aktarın.

Örnekleri, DNA saflaştırma spin kolonlarını ve bunlarla ilişkili uygun tamponları bir spin kolon işleme robotuna yerleştirin. Üretici talimatlarına göre, spin kolon işleme robotu, tüp başına 250 µL yüksek tuzlu DNA bağlama tamponu kullanarak işaretli DNA'yı silika membrana bağlayacak ve ardından her biri 500 µL yıkama tamponu olan iki yıkama ile safsızlıklar membranlardan uzaklaştırılacaktır. Robot daha sonra, örnekleri hibritlemek amacıyla, saflaştırılmış işaretli DNA örneklerini yaklaşık 12 µL hacimlerde geri kazanmak için membranlara 15 µL düşük tuzlu çözelti tamponu ekleyecektir.

Ardından, bir hibridizasyon fırınını 65 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun ve destek lamlarını ve hibridizasyon odacıklarını önceden ısıtın. Hibridizasyon karışımını hazırlamak için 1,1 µL cot 1D NA, 4,95 µL üretici tarafından sağlanan bloklama karışımı ve 24,75 µL hibridizasyon tamponunu birleştirin. Aktarım doğruluğunu artırmak için her bir ucu önceden ıslatarak, bu karışımı yeni bir 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna dağıtmak için sıvı taşıma robotunu kullanın.

Ardından, uygun olan 3 işaretli DNA'dan 9,35 µL, ardından uygun olan 5 işaretli DNA'dan 9,35 µL pipetleyin. Her bir kuyucuğa ekleme yaptıktan sonra plakayı mühürleyin, örnekleri bir dakika boyunca vorteksleyin ve içerikleri her bir kuyucuğun dibinde toplamak için plakayı kısa süreliğine santrifüjleyin. İşaretli DNA'yı bir ön hibridizasyon inkübatöründe denatüre edin.

Önce 95 °C'de üç dakika, ardından 37 °C'de 30 dakika bekletilir. Daha sonra 42 °C'ye ısıtılmış bir platform üzerinde çalışılır. Önceden ıslatılmış uçlar kullanarak, contanın şeffaf kısmının hibridizasyon odasının pencereli kısmıyla hizalandığından emin olarak destek lamı hibridizasyon odasına yerleştirin.

Şimdi, hibridizasyon karışımının 42 µL'sini dizi destek lamının uygun konumunun merkezine yavaşça pipetleyin. Sıvının kauçuk halka sınırına temas etmemesine dikkat edin. Tüm konumlar doldurulduğunda, dizi lamını destek lamının üzerine dikkatlice indirin ve hibridizasyon odasını monte edin.

Dizinin yazılı tarafının destek lamına baktığından emin olduktan sonra, hibridizasyon odası vidasını tamamen sıkın ve monte edilmiş hibridizasyon odasını kontrol ederek hibridizasyon sızıntısı olmadığını onaylayın. Kauçuk halka sınırlarının dışında karıştırma yapın ve her bir hava kabarcığının yüksekliğinin yaklaşık dört milimetre olduğundan emin olun. Bunu kontrol etmek için, hibridizasyon odası dikey olarak ucunun üzerine getirildiğinde odayı döndürün.

Her konumdaki tüm hava kabarcıkları hareket etmektedir. Kabarcıklardan herhangi biri takılı kalmışsa, hazneye tezgah üzerinde sertçe vurun. Ardından hibridizasyon haznelerini 65 °C'ye ayarlanmış döner fırına 24 saat boyunca yerleştirin.

Ertesi gün hibridizasyon odalarını bir numaralı yıkama tamponuna daldırın ve lamları birbirinden ayırmak için plastik düz uçlu bir pens kullanın. Ardından conta lamlarını atın ve dizi lamlarını taze bir numaralı tampona daldırılmış bir rafa yerleştirin. Dizi lamlarını, bir manyetik karıştırıcı ve balık şeklinde karıştırma çubuğu ile kuvvetlice karıştırarak, yaklaşık 700 mililitre yıkama tamponu içinde bir ila beş dakika boyunca yıkayın.

Ardından, array lamlarını yaklaşık 700 mililitre yıkama tamponuna aktarın ve ikisini de 90 saniye boyunca yıkayın; ikinci yıkamanın sonunda karıştırma işlemini daha kuvvetli hale getirin. Array lamlarını tampon çözeltiden nazikçe kaldırın. Lamlar kuru çıkmalıdır.

Ardından, array lamlarını lam koruyucularıyla birlikte tarayıcıdaki lam tutucularına yerleştirin ve ardından örnekleri tarayın. Array üreticisinin talimatlarına göre, hibridize edilmiş bir array üzerindeki her bir prob, kırmızı ve yeşil florokromların bir karışımı olarak görüntülenir. Her prob için kırmızı ve yeşil floresan sinyal oranları tarayıcı tarafından nicelleştirilir ve ilgili yazılım bunları genomik konumlarına göre log iki oranları olarak belirler.

Elde edilen dizi izleri, genomik olarak dengesiz olduğu belirlenen bölgelerin yorumlanmasına olanak tanır. Örneğin, kromozom yedinin proksimal bölgesindeki düşük kopya tekrarlarının aracılık ettiği, tekrarlayan bir mikro delesyon sendromu olan Williams sendromlu bir çocuğa ait bu izde, genomik dengesizlik yazılım tarafından kırmızı bir çizgi ile belirlenmiştir. Prop floresan log oranı, genomun normal bölgeleri için bire bir yeşil-kırmızı oranını belirterek sıfır civarında kümelenmelidir.

Bu taramada gözlemlendiği gibi dağılmış dizi izleri, anormal bölgelerin hatalı belirlenmesine veya genomik dengesizliğin tanımlanamamasına yol açabilir; bu durum, düşük DNA kalitesi, ışınların varlığı veya atmosferdeki ozon seviyeleri dahil olmak üzere bir dizi faktörden kaynaklanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hasta örneklerinin aCGH testi için nasıl işleneceği ve alt analizler ile kopya sayısı varyasyonlarının tespiti için nasıl yüksek kaliteli veriler üretileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.