Name: Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 16 s
Description: Öğrenin, genomik kopya sayısı varyantlarını tespit etmek için dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (aCGH) yöntemini. Bu teknik, genetik sendromların tanısında geleneksel karyotiplemeye göre daha hassas sonuçlar sunar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların teşekkür hakkı yok.

1. Etiketleme Reaksiyon <ol><li> Kullanıma hazır -20 ° C&#39;de plakalar ve mağaza 96 oyuklu içine üretici tarafından tavsiye edilen derişimlerde, ön kısım siyanin 3 ve 5 etiketli dUTPs, etiketlenmemiş nükleotidleri ve rastgele primerler Kullanımdan önce. Bu protokol, kısım uygun etiketli dUTP&#39;nin 10.5 ul ve 10.5 ul etiketsiz nükleotidler ve her kuyuya rastgele primerler amaçları için. </li><li> Işıksız bir ortamda, yaklaşık 1 saat süreyle 4 ° C &#39;de nükleotid primerler hazır kullanımlı 96 gözlü levha, çözülme. </li><li> Çözülmüş sonra, ışıksız bir ortamda, en az 30 dakika, oda sıcaklığında, bu plaka dengeye getirin. </li><li> En az 15 dakika boyunca 60 ° C &#39;de DNA örnekleri dengelenmesi. </li><li> Bir sıvı kotarma robotu kullanılarak, 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna, nükleaz içermeyen su akıtın. Not: su hacmi, her giriş bir DNA numunesi konsantrasyonuna bağlı olacaktır ve 50 ng / ul nihai konsantrasyona neden olmak için yeterli olmalıdır. </li><li> Bir sıvı han kullanılmasıdling robotu, 96-çukurlu plaka içinde bir kuyu içine pipet DNA 1 ug (1.5), 20 ul toplam hacim getirmek. NOT: Veri Elde niteliği tehlikeye bununla birlikte DNA&#39;nın küçük miktarları kullanılabilir (değerli örnekler için, 400 ng kadar giriş DNA miktarları kullanılabilir). </li><li> Bir sıvı kotarma robotu kullanılarak seyreltilmiş DNA plakanın her oyuğuna dengelenmiş nükleotid primerler 20 ul transfer. </li><li> Şerit kapaklar (sıkı mühür önemlidir) ile 96-plaka Seal. </li><li> Bir ısıtılmış kapak ile, bir PCR makinesi içinde, 10 dakika boyunca 99 ° C&#39;de DNA&#39;nın denatüre edilmesi ve daha sonra tavlama primerler, 5 dakika için buz üzerinde soğuk ek. </li><li> Bir sıvı kotarma robotu kullanarak, iyice her DNA&#39;lar ve pipet karışımı elde etmek için Klenow DNA polimeraz enzimi Exo 10 ul ekle. NOT: toplam hacim 50 ul olmalıdır. </li><li> 96 oyuklu plaka kapatın ve 16 saat 37 ° C&#39;de inkübe edin. Not: 4 st daha kısa bir kuluçkalama, ancak bir O / N yeterlidircubation daha uygun olabilir. </li><li> Bir sıvı kotarma robotu kullanılarak, her bir durdurma tamponu 5 ul ilave edin. Not: etiketleme reaksiyonu için kullanılan reaktif bir özeti Tablo 1&#39;de gösterilmiştir. </li></ol> Adi Nükleotidlerinin 2. Kaldırma <ol><li> Silika-membran esaslı spin sütunları ve özel spin kolon işleme robot (spin sütunları elle de işlenebilir) kullanarak nükleotidleri çıkarın. Üreticinin talimatlarını izleyin. <ol><li> Iyi bir 2 ml tüp her içeriğini aktarmak; kuyu kimlikleri ile ön-etiket bu. NOT: Bu adım, bir sıvı kotarma robotu kullanılarak elle veya tercihen gerçekleştirilebilir. </li><li> Bir spin kolon işleme robot kullanıyorsanız, o zaman 2 ml tüpler, DNA saflaştırma kolonlanyla ve ilişkili tamponlar ile robot yükleyin. </li><li> Silika etiketli DNA bağlamak için etiketleme reaksiyonuna 250 ul yüksek tuz, DNA bağlama tamponu (tampon PB) EkleMembran. </li><li> 500 ul yıkama tamponu (PE tampon A) ile iki kez membran yıkama ile yabancı maddelerin çıkarın. </li><li> ~ 12 ul bir hacim içinde, saflaştırılmış etiketli DNA kurtarmak için zara 15 ul düşük tuz elüsyon tamponu (EB tampon A) ekleyin. </li></ol></li></ol> 3. Hyb Çiftleri birleştirin <ol><li> Cyanine 3 ve 5-etiketli DNA uygun çiftleri birleştirin, COT-1 DNA üretici tarafından sağlanan engelleme karışımı ve sıvı taşıma robotu kullanarak üretici tarafından sağlanan hibridizasyon tamponu. NOT: Paylaşılan CNVs bir sorun yoksa bu hyb çiftleri (örneğin, rutin çok olduğu gibi, böyle bir kraniyosinostozlar hasta vs renal displazi hasta olarak fenotip-uyumsuz örnekleri, eşleştirmek numune vs örnek ve referans veya örnek olabilir ) aynı klinik olarak anlamlı KNV taşımak için olası. Bir referans DNA kullanıyorsanız, ticari DNA kaynağı önerilir, ve numune ile birlikte işleme tabi tutulmalıdır. <ol><li> Bir sıvı taşıma ro kullanılmasıBot, COT-1 DNA (3333 ng / ul) ekleyin üretici tarafından sağlanan her bir çukura 1.1 ul COT-1 DNA, 4.95 ul bloke karışım ve 24,75 ihtiva ettiği şekilde, 96 oyuklu plakanın her oyuğuna karışım ve hibridizasyon tamponu bloke ul hibridizasyon tamponu. </li><li> Her bir oyuğa, uygun siyanin 3-etiketli DNA 9.35 ul ekleyin. Ön-ıslak her ipucu doğruluğunu pipetle geliştirmek için. </li><li> Her bir oyuğa, uygun siyanin 5-etiketli DNA 9.35 ul ekleyin. Ön-ıslak her ipucu doğruluğunu pipetle geliştirmek için. </li><li> 1 dakika boyunca 96 gözlü plaka ve vorteks kapatın. Her bir alt içeriğini toplamak için 96 oyuklu plaka dönerler. </li></ol></li></ol> 4. Melezleme <ol><li> 65 ° C bir melezleşme firinda bir destek slayt ve her dizi slayt için bir melezleme odasına prewarm. <ol><li> Diziler için geçerli olmadan önce bir ön-hibridizasyon inkübasyon etiketli DNA denatüre. 24 saat için bir döner fırın içinde hibridizasyon yapın. </li><li> 30 dakika boyunca 70 ° C&#39;de 96-çukurlu plaka inkübe ve ardından en az 5 dakika boyunca 37 ° C&#39;de bırakın. </li><li> 42 ° C&#39;de ısıtılmış bir platform üzerinde çalışarak, kullanımdan önce bir hibridizasyon odasına her sırt slayt yükleyin. Conta slayt şeffaf kısmı melezleme odasının &#39;pencereli&#39; kısmı ile aynı hizada olduğundan emin olun. </li><li> Pipet önceden hazırlanmış melezleme karışımı 42 ul slayt destek dizi üzerindeki uygun pozisyonda üzerine (bölüm 3). Ön-ıslak her ipucu doğruluğunu pipetle geliştirmek için. Pipet yavaş yavaş emin her pozisyon merkezinde, üzerine sıvı kauçuk halka sınır dokunmaz. </li><li> Destek slayt tüm pozisyonları doldurulur sonra, dikkatle üzerinde dizi slayt düşürmek ve melezleme odasına monte. Üzerinde yazılı olan dizinin yan destek slayt baktığından emin olun. Tam melezleme odası vidasını sıkın emin olun. </li><li> Monte hibridizasyon odasına kontrol edin. EOrada kauçuk halka sınırları dışında melezleme karışımı kaçak ve melezleme odası dikey sonuna dinlenmiş olduğunda her hava kabarcığı yüksekliği ~ 4 mm olduğunu nsure. Hibridizasyon odasına döndürün ve konumda ve hareket etmiyor sıkışmış hava kabarcıkları olmadığını kontrol edin. Bunlardan herhangi varsa, odayı bankta bir keskin musluk verin. Tüm hava kabarcıkları hareket olduğunu kontrol edin. </li><li> 24 saat boyunca 65 ° C&#39;de döner fırına melezleştirme odasına yerleştirin. Fırın rotor dengeli olduğundan emin olun; Gerekirse diğer boş odaları kullanın. </li></ol></li></ol> 5. Yıkama ve Tarama Slaytlar <ol><li> Fazla etiketli DNA kaldırmak ve daha sonra her sonda floresan ölçmek için tarama diziler yıkayın. <ol><li> Fırın ve demonte dışarı hibridizasyon odaları atın. dizi ve conta slaytlar araya sıkışmış olacak; yıkama tamponu 1 bu batığın ve onları ayrı gözetlemek için plastik, düz kenarlı forseps bir çift kullanın. </li><li> Diconta slayt scard ve tampon 1 batık bir rafa dizi slayt yerleştirin. </li><li> Kuvvetli bir şekilde karıştırma 5 dakika için taze yıkama tamponu 1 ~ 700 ml bir dizi slayt yıkayın (pire ve manyetik bir karıştırıcı kullanılır). </li><li> ~ 700 ml yıkama tamponu 2 dizi slayt aktarın ve kuvvetli bir şekilde karıştırıldı, 90 sn için yıkayın. Yavaşça yıkama tamponu 2 dışarı dizi slaytlar asansör, onlar kuru ortaya çıkmalıdır. </li><li> Bir slayt koruyucusu kullanarak, tarayıcı bir slayt tutucu içine dizi slayt yükleyin. Dizi tarayıcıya slayt yükleyin ve dizi üreticisinin talimatları izleyerek tarayın. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Miller, D. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Consensus+statement%3A+chromosomal+microarray+is+a+first-tier+clinical+diagnostic+test+for+individuals+with+developmental+disabilities+or+congenital+anomalies%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Hum.+Genet%22%5BJournal%5D)">Consensus statement: chromosomal microarray is a first-tier clinical diagnostic test for individuals with developmental disabilities or congenital anomalies.</a> Am. J. Hum. Genet. 86, 749-764 (2010).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Array+CGH+as+a+first+line+diagnostic+test+in+place+of+karyotyping+for+postnatal+referrals+-+results+from+four+years%27+clinical+application+for+over+8%2C700+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Array CGH as a first line diagnostic test in place of karyotyping for postnatal referrals - results from four years' clinical application for over 8,700 patients.</a> Mol. Cytogenet. 6 (16), 1755-8166 (2013).</li>
<li>Ahn, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+and+implementation+of+array+comparative+genomic+hybridisation+as+a+first+line+test+in+place+of+postnatal+karyotyping+for+genome+imbalance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Validation and implementation of array comparative genomic hybridisation as a first line test in place of postnatal karyotyping for genome imbalance.</a> Mol. Cytogenet. 3 (9), 1755-8166 (2010).</li>
<li>Beaudet, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+chromosomal+microarray+analysis+in+developmental+and+behavioral+pediatrics%5BTitle%5D)+AND+%22Child+Dev%22%5BJournal%5D)">The utility of chromosomal microarray analysis in developmental and behavioral pediatrics.</a> Child Dev. 84, 121-132 (2013).</li>
<li>Park, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical+implementation+of+whole-genome+array+CGH+as+a+first-tier+test+in+5080+pre+and+postnatal+cases%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">Clinical implementation of whole-genome array CGH as a first-tier test in 5080 pre and postnatal cases.</a> Mol. Cytogenet. 4, 12(2011).</li>
<li>Iafrate, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+large-scale+variation+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Genet%22%5BJournal%5D)">Detection of large-scale variation in the human genome.</a> Nat. Genet. 36, 949-951 (2004).</li>
<li>Redon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+variation+in+copy+number+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global variation in copy number in the human genome.</a> Nature. 444, 444-454 (2006).</li>
<li>Cafferkey, M., Ahn, J. W., Flinter, F., Ogilvie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+features+in+patients+with+15q11.2%28BP1-BP2%29+deletion%3A+Further+delineation+of+an+emerging+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Med.+Genet.+A%22%5BJournal%5D)">Phenotypic features in patients with 15q11.2(BP1-BP2) deletion: Further delineation of an emerging syndrome.</a> Am. J. Med. Genet. A. 164, 1916-1922 (2014).</li>
<li>Molin, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microdeletion+syndrome+at+3q13.31+characterised+by+developmental+delay%2C+postnatal+overgrowth%2C+hypoplastic+male+genitals%2C+and+characteristic+facial+features%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">A novel microdeletion syndrome at 3q13.31 characterised by developmental delay, postnatal overgrowth, hypoplastic male genitals, and characteristic facial features.</a> J. Med. Genet. 49, 104-109 (2012).</li>
<li>Tropeano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Male-biased+autosomal+effect+of+16p13.11+copy+number+variation+in+neurodevelopmental+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Male-biased autosomal effect of 16p13.11 copy number variation in neurodevelopmental disorders.</a> PLoS One. 8, e61365(2013).</li>
<li>Bon, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Further+delineation+of+the+15q13+microdeletion+and+duplication+syndromes%3A+a+clinical+spectrum+varying+from+non-pathogenic+to+a+severe+outcome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Genet%22%5BJournal%5D)">Further delineation of the 15q13 microdeletion and duplication syndromes: a clinical spectrum varying from non-pathogenic to a severe outcome.</a> J. Med. Genet. 46, 511-523 (2009).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Dizi CGH gibi triploidi gibi dengeli düzenlenmeleri veya ploidisi anormallikleri tespit olmayacaktır. Ayrıca, düşük seviyeli mozaik dengesizlikler tespit edilemeyebilir. Ancak dizi CGH birçok sitogenetik laboratuvarda yerini aldı G-bantlı kromozom analizi daha KNV tespiti için daha yüksek bir çözünürlüğe sahip. Bu nedenle genom KNV tespiti için geçerli altın standarttır. Gelecekte yeni nesil dizileme teknolojileri ile değiştirilebilir, ancak şu anda, kendi maliyet ve teknik karmaşıklığı bu henüz klinik kullanım için iyi...

Bu silmeler veya kromozomal bölümlerinin ekstra kopyaları zihinsel engeli, dismorfik ve congentical malformasyonlar neden olduğu uzun yıllardır bilinmektedir ve bazı durumlarda genetik sendromlara neden olmuştur 1. Ancak, bu değişikliklerin genom tespiti için 2000&#39;li yılların ortalarında kadar mevcut tek teknoloji olamaz dengesizlik bölge ve doğasına bağlı olarak, 5-10Mb etrafında bir çözünürlüğe sahip kromozom analizi,-bantlı, G, ve hangi Malzeme, aynı bant modeli farklı bir kromozom bir bölge ile ikame edilmiş anormal kromozom algılar. Böyle situ hibridizasyon ve multipleks ligasyon-spesifik prob amplifikasyon floresan gibi yardımcı sitogenetik teknikler şüpheli spesifik sendromik dengesizlik durumlarında, belirli loci sorgulama için kullanılabilir olmuştur, ama bu dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon getirilmesi kadar değildi (dizi CGH) Rutin klinik tanı s içinekopya sayısının genom algılama (CNVs) varyantları ervice 2-5 (genellikle 120KB civarında) bir ölçüde artmış çözünürlükte mümkün oldu. Bazı bölgelerde normal popülasyona 6-7 yaygındır için araştırma çalışmaları yanında, klinik hizmet çalışmaları diğer CNVs ederken, daha önce saptanamayan, otizm ve epilepsi 8-11 gibi neurodisabilities ile ilişkili, CNVs olduğunu göstermiştir. Bu yazıda anlatılan protokol bizim İngiltere Ulusal Sağlık Servisi (NHS) klinik tanı laboratuvarında kullanılan; Bu devlet destekli hizmet maliyetini en aza indirmek için yeni melezleme stratejileri, toplu test ve robotik kullanın. Aşağıda detayları verilen protokol önce, yüksek kaliteli DNA, uygun başlangıç ​​malzemesi, yaygın olarak kan, kültürlenmiş hücreler ya da doku numunelerinin elde edilmesi gerekmektedir. 280 emme oranı (b gerekir: Spektrofotometri konsantrasyonunun ölçülmesi için kullanılabilir ve 260 kontrol (&gt; 50 ng / ul olması gerekir)e 1,8-2,0). Jel elektroforezi, DNA önemli bir bozulma olmadan yüksek moleküler ağırlığa sahip olup olmadığını kontrol etmek için kullanılabilir. Bu protokol otomatik sıvı taşıma robotik kullanarak çalıştırmak başına 96 numune etiketleme yüksek verim laboratuvarlar için tasarlanmıştır. Bununla birlikte, otomasyon olmaksızın daha düşük verim laboratuarlar için adapte edilmiş olabilir.

<table><tbody><tr><td>CGH mikrodizi 8 x 60K</td><td>Agilent</td><td>G4126</td><td></td></tr><tr><td>Dizi CGH yıkama tamponları</td><td>Agilent</td><td>5188-5226</td><td></td></tr><tr><td>Dizi CGH hibridizasyon tamponu</td><td>Agilent</td><td>5188-5380</td><td></td></tr><tr><td>Minelute saflaştırma kiti</td><td>Qiagen</td><td>28006</td><td></td></tr><tr><td>Dizi CGH etiketleme kiti</td><td>Enzo</td><td>ENZ-42672-0000</td><td></td></tr></tbody></table>

genomik kopya sayısı variantların algılama için dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (cgh array)

Array Comparative Genomic Hybridization (Array CGH) for Detection of Genomic Copy Number Variants

Genomik kopya sayısı varyantlarının tespiti için dizi CGH, G-bantlı karyotip analizinin yerini almıştır. Bu makale, teknolojiyi ve bir klinik tanı hizmeti laboratuvarındaki uygulamasını açıklamaktadır. Bir hastanın örneğinden (kan, tükürük veya diğer doku tipleri) ekstrakte edilen DNA, bir florokrom (siyanin 5 veya siyanin 3) ile etiketlenir. Bir referans DNA örneği, zıt florokrom ile etiketlenir. Etiketli DNA'lar karıştırılmadan ve bir hibridizasyon tamponunda yeniden süspanse edilmeden ve klinik olarak önemli alanlarda yüksek prob yoğunluğuna sahip, genom boyunca lokuslardan ~ 60.000 oligonükleotid probu içeren bir diziye uygulanmadan önce, dahil edilmemiş nükleotidleri çıkarmak için bir temizleme adımı takip eder. Hibridizasyonun ardından, diziler yıkanır, daha sonra taranır ve elde edilen görüntüler, her prob için kırmızı ve yeşil floresansı ölçmek için analiz edilir. Yazılım, her bir prob ölçümünün kalitesini değerlendirmek, kırmızı ve yeşil floresan oranını hesaplamak ve potansiyel kopya sayısı varyantlarını tespit etmek için kullanılır.

Bir hibritlenmiş dizi Her prob kırmızı ve yeşil fluorochromes bir karışımı olarak görüntülenmiştir (Şekil 1). her bir prob için yeşil floresan sinyalinin kırmızı oranı tarayıcı tarafından ölçülür ve ilgili yazılım genomik pozisyonuna göre log2 oranları gibi, bu çizer ve dış önceden belirlenmiş sınırları düşen bölgeleri tanımlar. Elde edilen dizi izleri genomik dengesiz olarak tanımlanan bölgeler yoruma imkan vermek. Örneğin, Williams sendromu, kromozom 7&#39;nin yakın bölgede düşük kopya tekrarlar aracı...

Genomik kopya sayısı varyantları tespiti için Dizi CGH G-bantlı karyotip analizi yerini aldı. Bu kağıt teknolojisi ve teşhis hizmet laboratuvarında uygulanmasını açıklar.

Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Array CGH for the detection of genomic copy number variants has replaced G-banded karyotype analysis. This paper describes the technology and its ...

Bu prosedürün genel amacı, çok çeşitli genetik hastalıklara yol açabilen genomik dengesizlikleri belirlemek için karşılaştırmalı genomik hibridizasyon dizisi uygulamaktır. Bu işlem, öncelikle hastanın DNA'sının floresan bir boya ile işaretlenmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adımda, hastanın DNA'sı ve farklı şekilde işaretlenmiş bir referans DNA, diziye hibridize edilir.Ardından, her bir proba bağlanan hasta ve referans DNA miktarlarını ölçmek için dizi taranır. Son adımda, taranmış görüntü, hastanın DNA'sının referans DNA dizisine göre daha fazla veya daha az materyale sahip olduğu genom bölgelerini belirlemek üzere işlenir. Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon, hastanın genetik bir sendromla sonuçlanan bir kopya sayısı varyantı taşıyıp taşımadığını belirlemek için kullanılır.Dizi lamının montajı zor olabildiği ve hibridizasyon sırasında hazne dışına sızıntı olması kolay olduğu için bu yöntemin görsel gösterimi kritiktir. Etiketleme reaksiyonuna başlamadan önce hazne dışına sızan kısmı karıştırın. Kullanıma hazır nukleotid ve primer içeren 96 kuyucuklu plakayı, dört derece Celsius sıcaklıkta ve ışıktan korunmuş şekilde yaklaşık bir saat boyunca çözdürün.Çözündükten sonra, kapaklı plakayı oda sıcaklığında 30 dakika daha dengeleyin; aynı zamanda DNA örneklerini de 60 °C'de 15 dakika boyunca dengeleyin. Örnekler ısınırken, bir sıvı transfer robotu kullanarak yeni bir 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna yeterli miktarda nükleaz içermeyen su dağıtın. DNA hazır olduğunda, kuyucuk başına bir mikrogram örnekten su içeren 96 kuyucuklu plakaya aktarın.Şimdi, seyreltilmiş DNA örneklerini içeren plakanın her bir kuyucuğuna 20 µL dengeleme nükleotidleri ve primerleri aktarın ve plakayı şerit kapaklarla sıkıca kapattığınızdan emin olarak mühürleyin. Ardından, ısıtmalı kapağı olan bir PCR cihazında DNA'yı 99 °C'de 10 dakika boyunca denatüre edin ve plakayı beş dakika boyunca buz üzerinde şok soğutarak primerleri bağlayın. Daha sonra, her bir örneğe 10 µL clean out exo DNA polimeraz enzimi eklemek için sıvı taşıma robotunu kullanın.Numuneleri pipetle karıştırın, ardından plakayı kapatıp 37 °C'de 16 saat inkübe edin. Ertesi gün, kuyucuk başına beş µL durdurma tamponu ekleyerek reaksiyonu sonlandırın. Ardından, bağlanmamış nükleotidleri uzaklaştırın. Her kuyucuğun içeriğini, önceden etiketlenmiş ayrı iki mL'lik tüplere aktarın.Örnekleri, DNA saflaştırma spin kolonlarını ve bunlarla ilişkili uygun tamponları bir spin kolon işleme robotuna yerleştirin. Üretici talimatlarına göre, spin kolon işleme robotu, tüp başına 250 µL yüksek tuzlu DNA bağlama tamponu kullanarak işaretli DNA'yı silika membrana bağlayacak ve ardından her biri 500 µL yıkama tamponu olan iki yıkama ile safsızlıklar membranlardan uzaklaştırılacaktır. Robot daha sonra, örnekleri hibritlemek amacıyla, saflaştırılmış işaretli DNA örneklerini yaklaşık 12 µL hacimlerde geri kazanmak için membranlara 15 µL düşük tuzlu çözelti tamponu ekleyecektir.Ardından, bir hibridizasyon fırınını 65 °C'ye ön ısıtmaya tabi tutun ve destek lamlarını ve hibridizasyon odacıklarını önceden ısıtın. Hibridizasyon karışımını hazırlamak için 1,1 µL cot 1D NA, 4,95 µL üretici tarafından sağlanan bloklama karışımı ve 24,75 µL hibridizasyon tamponunu birleştirin. Aktarım doğruluğunu artırmak için her bir ucu önceden ıslatarak, bu karışımı yeni bir 96 kuyucuklu plakanın her bir kuyucuğuna dağıtmak için sıvı taşıma robotunu kullanın.Ardından, uygun olan 3 işaretli DNA'dan 9,35 µL, ardından uygun olan 5 işaretli DNA'dan 9,35 µL pipetleyin. Her bir kuyucuğa ekleme yaptıktan sonra plakayı mühürleyin, örnekleri bir dakika boyunca vorteksleyin ve içerikleri her bir kuyucuğun dibinde toplamak için plakayı kısa süreliğine santrifüjleyin. İşaretli DNA'yı bir ön hibridizasyon inkübatöründe denatüre edin.Önce 95 °C'de üç dakika, ardından 37 °C'de 30 dakika bekletilir. Daha sonra 42 °C'ye ısıtılmış bir platform üzerinde çalışılır. Önceden ıslatılmış uçlar kullanarak, contanın şeffaf kısmının hibridizasyon odasının pencereli kısmıyla hizalandığından emin olarak destek lamı hibridizasyon odasına yerleştirin.Şimdi, hibridizasyon karışımının 42 µL'sini dizi destek lamının uygun konumunun merkezine yavaşça pipetleyin. Sıvının kauçuk halka sınırına temas etmemesine dikkat edin. Tüm konumlar doldurulduğunda, dizi lamını destek lamının üzerine dikkatlice indirin ve hibridizasyon odasını monte edin.Dizinin yazılı tarafının destek lamına baktığından emin olduktan sonra, hibridizasyon odası vidasını tamamen sıkın ve monte edilmiş hibridizasyon odasını kontrol ederek hibridizasyon sızıntısı olmadığını onaylayın. Kauçuk halka sınırlarının dışında karıştırma yapın ve her bir hava kabarcığının yüksekliğinin yaklaşık dört milimetre olduğundan emin olun. Bunu kontrol etmek için, hibridizasyon odası dikey olarak ucunun üzerine getirildiğinde odayı döndürün.Her konumdaki tüm hava kabarcıkları hareket etmektedir. Kabarcıklardan herhangi biri takılı kalmışsa, hazneye tezgah üzerinde sertçe vurun. Ardından hibridizasyon haznelerini 65 °C'ye ayarlanmış döner fırına 24 saat boyunca yerleştirin.Ertesi gün hibridizasyon odalarını bir numaralı yıkama tamponuna daldırın ve lamları birbirinden ayırmak için plastik düz uçlu bir pens kullanın. Ardından conta lamlarını atın ve dizi lamlarını taze bir numaralı tampona daldırılmış bir rafa yerleştirin. Dizi lamlarını, bir manyetik karıştırıcı ve balık şeklinde karıştırma çubuğu ile kuvvetlice karıştırarak, yaklaşık 700 mililitre yıkama tamponu içinde bir ila beş dakika boyunca yıkayın.Ardından, array lamlarını yaklaşık 700 mililitre yıkama tamponuna aktarın ve ikisini de 90 saniye boyunca yıkayın; ikinci yıkamanın sonunda karıştırma işlemini daha kuvvetli hale getirin. Array lamlarını tampon çözeltiden nazikçe kaldırın. Lamlar kuru çıkmalıdır.Ardından, array lamlarını lam koruyucularıyla birlikte tarayıcıdaki lam tutucularına yerleştirin ve ardından örnekleri tarayın. Array üreticisinin talimatlarına göre, hibridize edilmiş bir array üzerindeki her bir prob, kırmızı ve yeşil florokromların bir karışımı olarak görüntülenir. Her prob için kırmızı ve yeşil floresan sinyal oranları tarayıcı tarafından nicelleştirilir ve ilgili yazılım bunları genomik konumlarına göre log iki oranları olarak belirler.Elde edilen dizi izleri, genomik olarak dengesiz olduğu belirlenen bölgelerin yorumlanmasına olanak tanır. Örneğin, kromozom yedinin proksimal bölgesindeki düşük kopya tekrarlarının aracılık ettiği, tekrarlayan bir mikro delesyon sendromu olan Williams sendromlu bir çocuğa ait bu izde, genomik dengesizlik yazılım tarafından kırmızı bir çizgi ile belirlenmiştir. Prop floresan log oranı, genomun normal bölgeleri için bire bir yeşil-kırmızı oranını belirterek sıfır civarında kümelenmelidir.Bu taramada gözlemlendiği gibi dağılmış dizi izleri, anormal bölgelerin hatalı belirlenmesine veya genomik dengesizliğin tanımlanamamasına yol açabilir; bu durum, düşük DNA kalitesi, ışınların varlığı veya atmosferdeki ozon seviyeleri dahil olmak üzere bir dizi faktörden kaynaklanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, hasta örneklerinin aCGH testi için nasıl işleneceği ve alt analizler ile kopya sayısı varyasyonlarının tespiti için nasıl yüksek kaliteli veriler üretileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız.

array-comparative-genomic-hybridization-array-cgh-for-detection

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Bu video için hibridizasyon protokol arşiv formalin sabit malzeme de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan izole edilebilen DNA sadece 25-100 ng kullanarak tüm insan genom taramaları tüm genom döşeme yol Array CGH, teknik bir gösteri.

Tüm Genom Dizisi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon Teknik gösteri

Bu makale, tek hücreli FISH, blastomer çekirdeklerinin yayılmasını teknikleri, in situ hibridizasyon ve klinik bir ortamda pre-implantasyon genetik tanı (PGD) uygulanan sinyal puanlama için uygun probların seçim açıklamaktadır.

Pre-implantasyon Genetik Tanı için FISH

Periventriküler Nodüler Heterotopya (PNH) malformasyonu kortikal gelişim (MCD) en sık görülen yetişkinlikte ama genetik temeli en dağınık durumda bilinmeyen kalır. Biz son zamanlarda roman aday genler MCD'ler için tanımlamak için ve doğrudan kendi etken rol içinde vivoonaylamak için bir strateji geliştirdik.

Dizi-CGH, Bütün exome sıralama ve rahim içinde elektroporasyon Rodents beyin malformasyonlar için sorumlu genlerin tanımlamak için birleştirerek yeni bir strateji

Tek hücre sıralama yüksek çözünürlükte genomik değişikliklerin ele almak için giderek daha popüler ve erişilebilir bir araçtır. Biz tek hücrelerde kopya sayısı değişiklikleri tanımlamak için tek bir hücre sıralama kullanan bir protokol sağlar.

Tek Hücre sıralama kullanarak Kopya sayısı Değişmeler Algılama

Bu iletişim kuralı kopya numarası değişimler tüm genom dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (CGH) analizi yürütmektedir ilgilenen araştırmacılar için deneysel adımlar ve reaktifler, ekipman ve çözümleme araçları hakkında bilgi sağlar bitkiler.

Dizi tabanlı Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon için bir Platform verimli algılama varyasyonları kopya numarası hızlı nötron kaynaklı Medicago truncatula mutantlar içinde

Bu el yazması kopya numarası varyasyon analizi serum veya plazma DNA gerçek zamanlı PCR yaklaşımı kullanarak gerçekleştirilen açıklar. Bu yöntem için tahmin kastrasyon dayanıklı prostat kanseri hastalarda ilaç direnci uygundur, ama aynı zamanda diğer hastalıklar için bilgilendirici olabilir.

Serum ve plazma kopya sayı algılama gerçek zamanlı PCR kullanarak

El yazması bir nadir CDH1 transkript değişken (CDH1a) taze donmuş normal ve mide kanseri olan hastalarda elde edilen tümör doku algılamak için bir çip tabanlı dijital PCR tahlil açıklar.

Bir CDH1 nadir transkript değişken mide kanseri taze donmuş dokularda çip tabanlı dijital PCR tarafından algılanması

CRISPR/sgRNA Kütüphane protein kodlayıcı genlerin sorguya için uygulanmıştır. Ancak, işlev bir CTCF sınır gen düzenlemesi içinde ortaya çıkarmak için bir sgRNA kitaplığı fizibilite keşfedilmemiş kalır. Burada, CTCF sınırları içinde HOX loci fonksiyon aydınlatmak için HOX loci belirli sgRNA Kütüphane açıklayın.

HOX Loci odaklı CRISPR/sgRNA Kütüphane eleme tanımlayan kritik CTCF sınırları

Burada, gastrointestinal kanserlerde DNA metilasyonunun genom çapında analizi için bir prosedür tanımladık. Prosedür, gastrointestinal kanserlerde kanserogeneze katkıda bulunan genlerin metilasyon desenleri ile faktörler arasındaki ilişkileri araştıran çalışmalarla ilgilidir.

Gastrointestinal Kanserde DNA Metilasyonunun Genom Çapında Analizi

Protokol, yarı iletken tabanlı yeni nesil dizileme platformunda anöploidi için implantasyon öncesi genetik testlerde gerekli olan genel laboratuvar içi prosedürleri sunar. Burada tüm genom amplifikasyonunun, DNA fragmanı seçiminin, kütüphane yapımının, şablon hazırlamanın ve dizileme çalışma akışının ayrıntılı adımlarını temsili sonuçlarla sunuyoruz.

Yarı İletken Tabanlı Yeni Nesil Dizileme Platformunda Anöploidi için İmplantasyon Öncesi Genetik Test

Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda hedeflenebilir genomik değişiklikleri tespit etmek için otomatik, ISO15189 onaylı yeni nesil dizileme iş akışını açıklar.

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hedeflenebilir Değişikliklerin Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak Saptanması

Öğrenin, genomik kopya sayısı varyantlarını tespit etmek için dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (aCGH) yöntemini. Bu teknik, genetik sendromların tanısında geleneksel karyotiplemeye göre daha hassas sonuçlar sunar.

Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)

Daha fazla video keşfet