Genomik Kopya Sayısı Variantların Algılama için dizi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon (CGH Array)
21 Şubat 2015
Genomik kopya sayısı varyantları tespiti için Dizi CGH G-bantlı karyotip analizi yerini aldı. Bu kağıt teknolojisi ve teşhis hizmet laboratuvarında uygulanmasını açıklar.
Bu prosedürün genel amacı, genomda çok çeşitli genetik hastalıklara yol açabilecek dengesizlikleri belirlemek için karşılaştırmalı genomik hibridizasyonun dizilmesidir. Bu, önce hastanın DNA'sını bir floresan boya ile etiketleyerek gerçekleştirilir. İkinci adımda, hasta, DNA ve farklı şekilde etiketlenmiş bir referans DNA, diziye hibritlenir.
Daha sonra, hastanın miktarını ölçmek için dizi taranır ve her prob için bol miktarda referans DN bulunur. Son adımda, taranan görüntü, hastanın DNA'sının referans DNA dizisinden daha fazla veya daha az materyale sahip olduğu genom bölgelerini tanımlamak için işlenir. Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon, hastanın genetik bir sendromla sonuçlanan bir kopya sayısı varyantı taşıyıp taşımadığını belirlemek için kullanılır.
Bu yöntemin görsel gösterimi, dizi slaytının montajı zor olabileceğinden ve hibridizasyon için kolay olduğundan kritik öneme sahiptir. Etiketleme reaksiyonuna başlamadan önce dökülenleri hazneden karıştırın. Kullanıma hazır 96 oyuklu nükleotid ve primer plakasını dört santigrat derecede çözdürün ve yaklaşık bir saat boyunca ışıktan koruyun.
Çözüldükten sonra, kapalı plakayı oda sıcaklığında 30 dakika daha dengeleyin, DNA örneklerini de bu sırada 60 santigrat derecede 15 dakika dengeleyin. Numuneler ısınırken, yeni bir 96 kuyulu plakanın her bir kuyucuğuna yeterli miktarda nükleaz içermeyen su dağıtmak için bir sıvı işleme robotu kullanın. Daha sonra DNA hazır olduğunda, oyuk başına bir mikrogram numuneyi 96 oyuklu su plakasına aktarın.
Şimdi 20 mikrolitre dengeleyici nükleotid ve primerleri seyreltilmiş DNA örneklerini içeren plakanın her birine aktarın ve sıkı bir sızdırmazlık sağlamaya dikkat ederek plakayı şerit kapaklarla kapatın. Daha sonra, 10 dakika sonra ısıtılmış kapaklı bir PCR makinesinde DNA'yı 99 santigrat derecede denatüre edin ve plakayı beş dakika boyunca buz üzerinde soğutarak primerleri dizleyin. Ardından, her numuneye 10 mikrolitre temiz ekzo DNA polimeraz enzimi eklemek için sıvı işleme robotunu kullanın.
Numuneleri pipetle karıştırın ve ardından plakayı kapatın ve 37 santigrat derecede 16 saat inkübe edin. Ertesi gün, reaksiyonu kuyucuk başına beş mikrolitre durdurma tamponu ile sonlandırın, Ardından dahil edilmemiş nükleotidleri çıkarın. Her bir kuyucuğun içeriğini önceden etiketlenmiş iki mililitrelik tüplere aktarın.
Numuneleri ve DNA saflaştırma spin kolonlarını bir spin kolon işleme robotuna ve ayrıca uygun ilgili tamponlara yükleyin. Üreticinin talimatlarına göre, spin kolon işleme robotu, etiketli DNA'yı tüp başına 250 mikrolitre yüksek tuzlu DNA bağlama tamponu ile silika membrana bağlayacak, daha sonra safsızlıklar, her biri 500 mikrolitre yıkama tamponu olan iki yıkama ile membranlardan çıkarılacaktır. Robot daha sonra, numuneleri hibridize etmek için saflaştırılmış etiketli DNA örneklerini yaklaşık 12 mikrolitrelik hacimlerde geri kazanmak için membranlara 15 mikrolitre düşük tuzlu çözelti tamponu ekleyecektir.
Daha sonra, bir hibridizasyon fırınını 65 santigrat dereceye ısıtın ve destek kızaklarını ve hibridizasyon odalarını önceden ısıtın. Hibridizasyon karışımını hazırlamak için, üretici tarafından sağlanan engelleme karışımından 1.1 mikrolitre manşon 1D NA 4.95 mikrolitre ve 24.75 mikrolitre hibridizasyon tamponunu birleştirin. Bu karışımı yeni bir 96 kuyulu plakanın her bir kuyucuğuna tahsis etmek için sıvı işleme robotunu kullanın ve aktarım doğruluğunu artırmak için her bir ucu önceden ıslatın.
Daha sonra 9.35 mikrolitre uygun imza, üç etiketli DNA, ardından 9.35 mikrolitre uygun imza, beş etiketli DNA pipetleyin. Plakayı her bir kuyuya kapatmak için, numuneleri bir dakika boyunca dört kez doldurun ve her birinin altındaki içeriği toplamak için plakaya hızlı bir dönüş yapın. Etiketli DNA'yı bir ön hibridizasyon inkübatöründe denatüre edin.
Önce 95 santigrat derecede üç dakika, ardından 37 santigrat derecede 30 dakika. Daha sonra 42 santigrat derece ısıtılmış bir platform üzerinde çalışıyor. Ön ıslak uçlar kullanarak, contanın şeffaf kısmının hibridizasyon odasının pencereli kısmı ile aynı hizada olduğundan emin olarak destek sürgüsünü hibridizasyon odasına yerleştirin.
Şimdi 42 mikrolitre hibridizasyon karışımını dizi destek sürgüsünün uygun konumunun ortasına yavaşça pipetleyin. Sıvının lastik halka sınırına temas etmemesine dikkat edin. Tüm pozisyonlar doldurulduktan sonra, dizi kızağını dikkatlice destek kızağına indirin ve hibridizasyon odasını monte edin.
Dizinin yazılı tarafının destek kızağına bakmasına dikkat edin, ardından hibridizasyon odası vidasını tamamen sıkın ve monte edilmiş hibridizasyon odasını kontrol ederek hibridizasyon sızıntısı olmadığını onaylayın. Lastik halka sınırlarının dışında karıştırın ve her bir hava kabarcığının yüksekliği yaklaşık dört milimetre olsun. Hibridizasyon odası dikey olarak ucuna oturtulduğunda, bunu kontrol etmek için hibridizasyon odasını döndürün.
Her pozisyondaki tüm hava kabarcıkları hareket ediyor. Kabarcıklardan herhangi biri sıkışmışsa, hazneye tezgahın üzerine keskin bir şekilde vurun. Daha sonra hibridizasyon odalarını 24 saat boyunca 65 santigrat derecede dönen fırına yerleştirin.
Ertesi gün, hibridizasyon odalarını birinci yıkama tamponuna daldırın ve slaytları ayırmak için bir çift plastik düz kenarlı forseps kullanın. Ardından conta kızaklarını atın ve dizi kızaklarını bir rafa yerleştirin, yeni bir tampona batırın. Dizi slaytlarını yaklaşık 700 mililitre yıkama tamponunda bir ila beş dakika yıkayın, bir pire ve manyetik bir starr ile kuvvetlice karıştırın.
Ardından, dizi slaytlarını, ikinci yıkamanın sonunda daha kuvvetli bir şekilde karıştırarak 90 saniye boyunca iki olmak üzere yaklaşık 700 mililitre yıkama tamponuna aktarın. Dizi slaytlarını yavaşça arabellekten kaldırın. Kuru çıkmaları gerekir.
Ardından dizi slaytlarını, slayt koruyucularıyla birlikte tarayıcıdaki slayt tutuculara yükleyin ve ardından örnekleri tarayın. Dizi üreticisinin talimatlarına göre, hibritleştirilmiş bir dizi üzerindeki her prob, kırmızı ve yeşil florokromların bir karışımı olarak görselleştirilir. Her prob için kırmızı ve yeşil floresan sinyalin oranları, tarayıcı tarafından ölçülür ve ilgili yazılım, bunları genomik konumlarına göre log iki oran olarak lotlar.
Elde edilen dizi izleri, genomik olarak dengesiz olarak tanımlanan bölgelerin yorumlanmasına izin verir. Örneğin, yedinci kromozomun proksimal bölgesinde düşük kopya tekrarlarının aracılık ettiği tekrarlayan bir mikro delesyon sendromu olan Williams sendromlu bir çocuktan alınan bu izde, genomik dengesizlik yazılım tarafından kırmızı bir çizgi ile tanımlandı. Prop floresan log oranı, genomun normal bölgeleri için bire bir yeşil-kırmızı oranını gösterecek şekilde sıfır civarında yakın bir şekilde kümelenmelidir.
Bu taramada gözlemlenen dağınık dizi izleri, anormal bölgelerin yanlış çağrılmasına veya genomik dengesizliğin tanımlanamamasına neden olabilir ve düşük DNA kalitesi veya ışınların varlığı, atmosfer küresindeki ozon seviyeleri dahil olmak üzere bir dizi faktörden kaynaklanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, A CGH ile test edilmek üzere hasta numunelerinin nasıl işleneceğini ve aşağı akış analizi ve kopya sayısı varyasyonunun tespiti için iyi kalitede verilerin nasıl üretileceğini iyi anlamış olmalısınız.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, genomik kopya sayısı varyantlarını saptamak için geleneksel G-bantlı kariotip analizinin yerini büyük ölçüde almış olan dizi karşılaştırmalı genomik hibridizasyonu (aCGH) yöntemini ele almaktadır. Prosedür, çeşitli genetik hastalıklara yol açabilecek genomik dengesizlikleri belirlemyi amaçlamaktadır.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genomik
- Genetik tanılama
- Karşılaştırmalı genomik hibridizasyon
Arka Plan
- Dizi CGH, genomik varyasyonları analiz etmek için modern bir tekniktir.
- Geleneksel yöntemlere kıyasla daha detaylı bir genomik dengesizlik görünümü sağlar.
- Teknoloji, genetik sendromların teşhisinde kritik öneme sahiptir.
- DNA'nın floresanla etiketlenmesi sürecin kilit bir adımıdır.
Çalışmanın Amacı
- Hastaların genomlarındaki kopya sayısı varyantlarını belirlemek.
- Genetik hastalıklar için tanı doğruluğunu artırmak.
- aCGH'nin klinik laboratuvar ortamında uygulamasını göstermek.
Kullanılan Yöntemler
- Hasta DNA'sını floresan boyalarla etiketlemek.
- Hasta ve referans DNA'yı bir diziye hibridize etmek.
- DNA'nın problara bağlanmasını ölçmek için diziyi taramak.
- Geometrik dengesizlikleri olan bölgeleri belirlemek için taranan görüntüleri işlemek.
Ana Sonuçlar
- Kopy numarası varyasyonları olan genomik bölgelerin belirlenmesi.
- aCGH'nin genetik sendromları teşhis etmede etkinliğini göstermek.
- Hasta DNA'sının dengesizlikleri saptamak için referansla karşılaştırılması.
- Yöntemin tanı bağlamındaki güvenilirliğinin doğrulanması.
Sonuçlar
- Dizi CGH, genetik tanılama için güçlü bir araçtır.
- Teknik, genetik hastalıkların anlaşılmasını artırır.
- Geleneksel kariotiplemeye göre önemli bir ilerlemeyi temsil eder.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Array CGH enables high-resolution detection of genomic copy number variants, supporting target validation in genetic disease research by providing quantitative, genome-wide imbalance data. This method enhances predictive confidence in preclinical models by identifying pathogenic variants linked to syndromes, informing mechanistic de-risking and portfolio prioritization in early discovery. Its clinical diagnostic utility translates to biomarker-aligned assay development for rare disease programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by detecting pathogenic copy number variants across the genome.
- Operational Value: Provides quantitative red-to-green fluorescence ratios for precise imbalance measurement per probe.
- Scientific Value: Supports biological de-risking through high-density oligonucleotide arrays targeting clinically relevant loci.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated biological systems for downstream workflows via purified, labeled DNA hybridization.
- Operational Value: Ensures assay standardization and reproducibility through controlled washing, scanning, and log-two ratio analysis.
- Scientific Value: Enables reliable compound evaluation by detecting genomic imbalances that may confound phenotypic screening.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Aligns with disease-relevant systems by identifying syndromes like Williams syndrome through recurrent microdeletion detection.
- Operational Value: Ensures translational continuity from discovery to preclinical validation via consistent reference DNA comparison.
- Scientific Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by validating genomic stability in model systems.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target validation to preclinical research, where genomic integrity assessment informs lead identification and disease model suitability.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by identifying copy number alterations in disease-associated genes.
- Screening: Describes assay readiness through hybridization buffer preparation and probe-level signal quantification.
- Analytics: Highlights log-two ratio outputs that enable comparison of patient versus reference DNA across genomic positions.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by validating genomic backgrounds in disease-relevant models.
- Enterprise Reuse: Positions the method as a reusable capability for batch processing of patient or model system samples.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Predictive confidence, target validation, reduction of mechanistic ambiguity.
- Operational Value: Standardization, reproducibility, and scalability.
- Strategic Value: Better go/no-go decisions, capital efficiency, and reduced late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Risk-adjusted prioritization and advancement decisions.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence imaging.
- Needs microarray scanner, liquid handling robot, and hybridization oven infrastructure.
- Demands cross-team standardization for probe selection, washing protocols, and ratio threshold setting.
- Requires adaptation considerations for varying DNA input quality and sample types (blood, saliva, tissue).
- Practical limitations include sensitivity to DNA purity, ozone levels, and bubble formation during hybridization.
