Tüm Genom Dizisi Karşılaştırmalı Genomik Hibridizasyon Teknik gösteri
5 Ağustos 2008
Bu video için hibridizasyon protokol arşiv formalin sabit malzeme de dahil olmak üzere çeşitli kaynaklardan izole edilebilen DNA sadece 25-100 ng kullanarak tüm insan genom taramaları tüm genom döşeme yol Array CGH, teknik bir gösteri.
Aşağıdaki kısa sunum, 27 K alt megabaz ting dizisi için hibridizasyon protokolünü gösteren bir videodur. Bu dizi veya akıllı dizi, tek bir slayta basılmış 26.946 ayrı ayrı sıralanmış arka klondan oluşur. 18 x 54 milimetrelik bir alanda basılan slayt başına toplam 54.000 öğe için çift olarak tespit edilirler.
Elde edilen veriler, biyoinformatik tarafından veri yorumlaması gerektirmeden yüksek yoğunluklu oligo dizileri ile karşılaştırılabilir. Arka klonlar gibi büyük bir insert dizisi kullanmanın en büyük avantajlarından biri, amplifikasyon olmadan 100 nanogram kadar küçük numune DNA'sının kullanılmasına izin vermesidir. Bu, kandaki DNA, donmuş doku, sınıflandırılmış hücreler ve FFPE materyali gibi çeşitli örneklerin analizine izin verir.
Akıllı dizinin klinik ortamda yararlı olduğu kanıtlanmıştır. BC Kanser Ajansı'nda, birden fazla hasta örneği analizi, ortalama bir çalışma haftasına kolayca sığdırılır. Sitogenetik için.
Dizi CGH'de kullanılan adımların çoğu, geleneksel CGH veya balığa benzer. Protokolün Yerleşik laboratuvarlara hızlı bir şekilde tanıtılmasına izin vermek. DNA'nın kalitesi, dizilerdeki sonuçlar üzerindeki en büyük etkidir.
CGH hibridizasyonu, düşük kaliteli veya kontamine DNA, PSI'nin ürüne dahil edilmesini olumsuz yönde etkileyerek verilerde loş görüntülere veya gürültüye neden olur. NanoDrop spektrofotometresi, hibridizasyondan önce DNA kalitesini değerlendirmek için mükemmel bir araçtır. DNA setini ölçmek için, nükleik asidi ölçmek için NanoDrop ve DNA'yı 50 boş ölçmek için mod, yeniden askıya alınmış numunenizle aynı çözeltiden 1.5 mikrolitre içeren NanoDrop.
Bu durumda, su Tris'tir. EDTA'nın PS D katılımı üzerinde potansiyel olumsuz etkileri olduğu gösterilmiştir. Boş mendili bir Kim mendiliyle çıkarın ve numune ölçümünüzün 1.5 Mikrolitresini ekleyin ve numune konsantrasyonunuzu kaydedin.
NanoDrop'taki iki 60 üzeri iki 80 okuması, 1.8 oranının optimum olduğu DNA kalitesinin iyi bir göstergesidir. Çift oran yöntemi, iki 60 üzeri iki 80 ve iki 60 üzeri iki 30 numunelerinizin saflığını belirlemek için daha da iyi bir yol sağlar. NanoDrop, dalga boyuna göre absorbansı temsil eden bir eğri görüntüler.
Tepe noktası olmayan pürüzsüz bir eğri, kaliteli DNA silmenin göstergesidir ve NanoDrop'u su ve Kim mendiliyle temizleyin veya numune sınırlıyorsa, Numuneyi kaideden pipetleyin. Bu Protokol, 100 ila 400 nanogram numune için optimize edilmiştir. Kaliteli DNA için hedef miktar 200 nanogramdır: Numuneyi etiketlemek için aşağıdaki reaktifler ve ekipman gereklidir.
SCI, üç SCI, beş rastgele ER, 10 kez DNTP karışımı, referans DNA, steril su, 0.2 mikrolitre steril PCR tüpleri, 100 santigrat derecede buz ısı bloğu, 45 santigrat derecede inkübatör. Referans DNA için bir reaksiyon tüpü ve bir reaksiyon tüpü ayarlayın. Örnek DNA için, sırasıyla bilim kurgu ve SCI üç ile etiketlenecekler.
Bir araştırma ortamında, ozon bozulmasına karşı daha dirençli olduğu için örnek DNA'mız için CY üç kullanmayı tercih ediyoruz. DNA su ve kanal tamponunuzu numuneye birleştirin ve referans DNA için tekrarlayın. Laboratuvarımızda, 10 kez arabelleği rastgele Optimus ile birleştiriyoruz.
Beş kez bir çözelti oluşturmak için, toplam 17 mikrolitre hacme steril su ekleyin. Tüpleri bir ısı bloğuna aktarın, 100 santigrat derecede beş dakika denatüre edin. Hemen buza aktarın.
Dört mikrolitre 10 kez DNTP karışımı ekleyin. Yan gözleri ekleyin. DNA'yı örneklemek için iki mikrolitre SCI üç etiketli DCTP ekleyin.
DNA'yı referans almak için iki mikrolitre bilimkurgu etiketli DCTP ekleyin. 2,5 mikrolitre kanal ekleyin ve karıştırın. Çözelti elle karıştırılabilir veya girdap olabilir.
Tezgah üstü santrifüjde hızlı bir darbeyle çözeltiyi tüpün dibine kadar kısaca döndürün. Bir fırına aktarın ve gece boyunca 37 derecede inkübe edin. Gece boyunca hibridizasyon süresi, etiketleme sürecini olumsuz etkilemeden 14 ila 24 saat arasında ayarlanabilir.
Bir MicroCon YM 30 sütunu kullanarak bir laboratuvar Programına sığdırmak için, sütuna 100 mikrolitre yakalanmış 1D NA ekleyin. Pipet ucu sıkışmış halde zara dokunmamaya dikkat edin. DNA partiden partiye varyansın, büyük distribütörlerden satın alındığında bile meydana geldiği bilinmektedir.
Kullanımdan önce büyük partilerin satın alınması ve test edilmesi önerilir. Artık her numune hibridizasyonu için biri mavi ve diğeri kırmızı renkli olmak üzere iki tüp olacaktır. Her numune için tüpleri birleştirin ve pipetleyerek karıştırın.
Ardından tüm solüsyonu MicroCon membranına aktarın. Sütunu Sağlanan MicroCon tüpüne yerleştirin ve 10 dakika boyunca 13.000 G'de döndürün. MicroCon sütunu bir boyut dışlama sütunudur ve DNA'yı dahil edilmiş yan boyalarla hapsedecek ve dahil edilmemiş boyaların zardan yıkanmasına izin verecektir.
Kalan dahil edilmemiş nükleotidleri veya yanları yıkamak için, Membrana 200 mikrolitre steril damıtılmış su ekleyin. 10 dakika boyunca 13.000 G'de tekrar döndürün. Tüpü atın ve MicroCon yoğunlaştırıcı kolonunun üstüne 45 mikrolitre hibridizasyon solüsyonu ekleyin.
Kullandığımız hibridizasyon solüsyonu Roche Scientific'ten Dig Easy'dir, beş mikrolitre paylaşımlı ringa balığı spermi de solüsyona eklenebilir. Geleneksel olarak bu, kayma yüzeyine rekabetçi olmayan bağlanmayı engellemek için kullanılırdı. Yeni bağlayıcı maddelerin ortaya çıkması bu adımın ortadan kaldırılmasına izin vermiştir.
Bununla birlikte, bazen hibridizasyon çözeltisinin viskozitesini arttırmak için eklenir. MicroCon sütununu ters çevirin ve yeni etiketli bir tüpe yerleştirin. Tüpü üç dakika boyunca 3000 G'de döndürün.
Çözelti yeni tüpün dibinde toplanacaktır. SD Kuruluşunun nicelleştirilmesi için 1,5 mikrolitre çözelti kullanılacaktır. NanoDrop'u mikrodizi analizine boş olarak ayarlayın.
1,5 mikrolitre kazı ile NanoDrop. Kolay hibridizasyon tamponu. NanoDrop ile boşluğu ölçün.
Okuma sıfır olmalıdır. Boş mendili bir silme mendiliyle çıkarın ve numune ölçümünüzün 1,5 mikrolitresini ekleyin ve numune katılımınızı kaydedin. NanoDrop size hem S3 hem de bilim kurgu boya birleştirme örneklerinin mikrolitre konsantrasyonu başına bir PICA mol verecektir.
Mikrolitre başına üç ole'nin çok az Fluor four'a sahip olduğu düşünülmelidir Devam etmek için NanoDrop, dalga boyuna karşı absorbansın bir grafiğini gösterecektir. Yan gözlerin her biri için bir tane olmak üzere iki tepe görünür olmalıdır NanoDrop'u su ve kim mendiliyle silin ve temizleyin. Kapağı yerleştirin, bir sürgülü ısıtıcı veya ısı bloğu üzerine kaydırın, hibridizasyon Sıcaklığını korumak için 45 santigrat dereceye kadar önceden ısıtın.
42 mikrolitre prob çözeltisini 22 milimetreye 60 milimetre kapak kızağına yerleştirin. Solüsyonda hava kabarcığı olmadığından emin olun. İnatçı bir balonu çıkarmanın hızlı bir püf noktası, yeni bir kapak fişi almak ve balonu keskin bir köşeyle patlatmaktır.
Sürgüyü kapak kızağı ve prob çözeltisinin üzerine hizalayın. Sürgünün bir kenarını indirin ve hibridizasyon çözeltisi ile temasa izin verin. Kapak kayması, yüzey gerilimi ile kızağa yapışana kadar bir kenarı indirmeye devam edin.
Slaytı ters çevirin. Slaytı bir hibridizasyon kasetine yerleştirin, 45 santigrat dereceye kadar ısıtın ve nemi kontrol etmek için alt oluğa 10 mikrolitre su ekleyin. Bu adım, kazma daha düşük sıcaklıklarda kolay kristalleşeceği ve slayt üzerinde arka plan bırakacağı için uygulanmalıdır.
Bu, çok ince bir sıvı tabakası olduğu için çözelti slayt üzerindeyken özellikle önemlidir. Bu noktada, kaseti kapatın ve 45 santigrat derecede 36 ila 40 saat inkübe edin. Sürgünün hibridizasyon kasetinden çıkarılması çok önemlidir.
Kazmak, oda sıcaklığında kolay kristalleşir. Sürgü hemen daldırılmalı ve kapak astarı yıkama solüsyonuna çıkarılmalıdır. Tüm yıkama solüsyonları önceden hazırlanmış olmalı ve pH değeri yedi olmalıdır, nötr olmayan pH yan gözleri bozabilir.
Yıkama solüsyonunu önceden 45 santigrat dereceye ısıtın. Hibridizasyon odasını açmadan önce bir Copeland kavanozuna yaklaşık 60 mililitre yıkama solüsyonu ekleyin. Odayı açın.
Slaytı cımbızla çıkarın ve slaytı yıkama solüsyonuna ekleyin. Kapak fişi hala takılıyken 10 ila 20 saniye bekleyin ve kapak fişini cımbızla geri alın. Kaydıraktan düşmüş olmalıydı.
Bu, kazma kolay tamponunun kristalleşmesini engellediği ve aynı zamanda kapak kızağının mekanik olarak çıkarılmasıyla sürgünün olası çizilmesini azalttığı için önemli bir adımdır. Slaytı yıkama solüsyonunda üç kez yıkayın. Her biri ajitasyon ile bir dakika.
Slaytı üç kez durulayın. Son yıkamadan sonra görülebilen yıkama solüsyonunda SDS'den kalan kabarcıklar olmamalıdır. Santrifüje hazır olana kadar slaytı yıkama solüsyonunda bırakın.
50 mililitrelik bir Falcon tüpünde 700 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin. Kullanmadan önce Falcon tüpünün kuru olduğundan emin olun. Sinyal yoğunlukları zamanla azalacağı için slaydı hemen tarayın.
Ortamdaki ozon Seviyelerine bağlı olarak, her Tarayıcı farklıdır, ancak izlenmesi gereken bazı ortak yönergeler vardır. Slayt görüntüleme için. Tarama işlemi sırasında ortamdaki ozon seviyeleri kritik öneme sahiptir.
Bilim kurgu kalıbı ozona duyarlıdır ve uzun bir tarama süresi boyunca hızla bozulur. Ozonun milyarda beş parçasının S beşini etkilediği gösterilmiştir. Bu, açık bir günde hafif trafik kirliliğine eşdeğerdir.
Ortam ozon seviyelerini kaydetmek için ozon ölçüm cihazları önerilir. Her kanal S3 ve SCI beş için ayrı bir görüntü oluşturulur. Kanallar, tarayıcının pozlama, zaman, uyarım, giriş veya yakalama hassasiyeti değiştirilerek dengelenebilir.
Bu görüntüler artık analiz için hazırdır.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu video, tüm genom tiling yolu dizi CGH için hibridizasyon protokolünü gösterir ve minimal DNA girişi ile insan genomunun tamamının taranmasını sağlar. Yöntem, arşiv materyalleri de dahil olmak üzere çeşitli numune tiplerinin analizini sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Genomik
- DNA Analizi
- Hibridizasyon Teknikleri
Arka Plan
- Dizi, tek tek sıralanmış 26.946 arka klondan oluşur.
- Her slayt toplam 54.000 elemana sahiptir.
- Elde edilen veriler yüksek yoğunluklu oligo dizilerle karşılaştırılabilir.
- Veri analizi için biyoinformatik yorum gerekmez.
Çalışmanın Amacı
- Genom taraması için bir hibridizasyon protokolünü göstermek.
- Kapsamlı genomik analiz için minimal DNA örneklerini kullanmak.
- Genomik çalışmalarda çeşitli numune tiplerinin kullanımını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Tüm genom tiling yolu dizi CGH için hibridizasyon protokolü.
- Çeşitli kaynaklardan 25-100 ng DNA kullanımı.
- Slaytlara iki kez lekelenmiş arka klonların uygulanması.
- Numunelerin amplifikasyon olmadan analizi.
Ana Sonuçlar
- Düşük DNA girişi ile insan genomunun başarılı bir şekilde taranması.
- Kan, dondurulmuş doku ve FFPE materyalden DNA analiz etme kabiliyeti.
- Daha yüksek yoğunluklu dizilere benzer veri kalitesi.
- Kapsamlı biyoinformatik gereksinimleri olmadan yapılan kolaylaştırılmış analiz.
Sonuçlar
- Hibridizasyon protokolü genom çapında analiz için etkilidir.
- Minimal DNA gereksinimleri numune tiplerinin kapsamını genişletir.
- Bu yöntem genomik araştırmalara erişimi artırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Array CGH enables genome-wide detection of DNA copy number alterations with minimal input, supporting target validation in oncology and genetic disease research. The method reduces dependency on bioinformatics expertise while maintaining data quality comparable to high-density arrays. This facilitates broader adoption in discovery pipelines where sample scarcity and heterogeneity are common challenges.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of genomic alterations across the whole genome to support target hypothesis testing.
- Operational Value: Works with as little as 25-100 ng of unamplified DNA, allowing use of precious or archival samples.
- Predictive Value: Detects alterations as small as 50 kb, providing resolution for early-stage mechanistic de-risking.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative log2 ratio data at each BAC target for objective comparison of sample and reference genomes.
- Operational Value: Uses SeeGH software to process 53,892 data points per experiment, standardizing output for downstream analysis.
- Reproducibility: Duplicate spotting of BAC clones enhances signal reliability and reduces technical variability.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Compatible with FFPE DNA, enabling use of clinically relevant, archival patient samples.
- Tissue Heterogeneity Tolerance: Large BAC insert size reduces need for microdissection, supporting analysis of complex tissue samples.
- Preclinical Modeling: Detects DNA gains, losses, amplifications, and homozygous deletions relevant to disease modeling.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification to preclinical validation, particularly when genomic alterations inform mechanistic understanding.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven screening for copy number changes linked to oncogenes or tumor suppressors.
- Analytics: Produces chromosomal position-aligned log2 ratios that enable visual and quantitative assessment of genomic instability.
- Enterprise Reuse: Protocol is standardized and reusable across labs, with minimal need for specialized bioinformatics support.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: High-resolution detection of DNA alterations aids in target confidence and pathway clarification.
- Operational Value: Low DNA input and tolerance for impure samples increase accessibility and reduce preprocessing burden.
- Strategic Value: Enables go/no-go decisions based on genomic profiles without requiring sequencing infrastructure.
- Portfolio Impact: Facilitates risk-adjusted prioritization of targets with validated genomic alterations.
Implementation Considerations
- Requires expertise in nucleic acid labeling, hybridization, and fluorescence detection.
- Dependent on hybridization cassettes, temperature-controlled incubators, and microarray scanners.
- NanoDrop quantification is essential for assessing DNA quality and dye incorporation efficiency.
- Protocol optimization needed for varying sample types, including FFPE and low-input materials.
- Ambient ozone levels must be monitored during scanning to prevent Cy5 dye degradation.
