Optimize Sentetik Yüzeyler Hepatosellüler Fenotip kullanma Stabilize

Bu prosedürün genel amacı, kök hücre kaynaklı insan hepatositlerinin uzun süreli stabil kültürünü korumak için polimer kaplı yüzeyleri optimize etmektir. Bu, öncelikle poliüretan 1 3 4 veya PU 1 3 4 sentezlenerek gerçekleştirilir. İkinci adım ise PU 1 3 4'ü çözmek için uygun çözücüyü seçmektir.

Ardından, cam lam üzerindeki PU 1 3 4 ile spin kaplama işlemi optimize edilir. Son adım, PU 1 34 kaplı cam lamların sterilizasyon prosedürünün optimizasyonudur; nihayetinde taramalı elektron mikroskobu, atomik kuvvet mikroskobu ve ilaç metabolizması analizleri kullanılarak PU 1 34 polimer kaplamanın kök hücre türevli hepatositlerin fonksiyonu üzerindeki etkisi gösterilir.

Bu tekniğin, hepatosit içeren URI potansiyel kök hücrelerin kültürde korunmasında kullanılan al Metrices gibi mevcut yöntemlere göre temel avantajı, bu sentetik malzemelerin amaca uygun olarak hassas bir şekilde ayarlanabilmesi ve kalite güvence standartlarında ölçeklendirilebilmesidir. Ayrıca, bu malzemeler partiler arası tutarlılık sergiler. Bu tekniğin doğurduğu sonuçlar, sentetik bir polimer yüzeyinin hücre fenotipini korumak için nasıl optimize edilebileceğine dair bir örnek teşkil ettiği için karaciğer hastalıklarının tedavisine kadar uzanmaktadır.

Prosedürü, laboratuvarımdan doktora sonrası araştırmacı Dr. Jeffrey Waltonle göstereceğiz. Bu prosedüre başlamadan önce, mono's one altı heksan dial di etilen glikol ve neo PenTile glikole vakumlu fırında 40 °C'de 48 saat boyunca ısı işlemi uygulayın. Kalan tüm suyu uzaklaştırmak için, Dean Stark düzeneğine bağlı ve manyetik karıştırma çubuğu ile donatılmış iki boyunlu yuvarlak tabanlı bir balona her bir monomerden 22 millimol ve 55 millimol dpic asit ekleyin.

Ardından, balona kimyasal ekleme sırasında herhangi bir nem emilimini önlemek için tüm düzeneği vakum altına alın ve cam malzemeyi 40 °C'de altı saat boyunca hafifçe ısıtın. Düzenek fırından çıkarılıp sistem azot altına alındıktan sonra, 0,0055 mol titanyum dört klorür katalizörünü bir şırınga yardımıyla damla damla balona ekleyin. Reaksiyon karışımını 180 °C'de 24 saat boyunca karıştırın ve kalıntı suyu Dean-Stark tuzağında toplayın.

Ürünün oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Ardından, Dean-Stark aparatı bağlı ve manyetik karıştırma çubuğu içeren iki boyunlu yuvarlak tabanlı bir balona, 12 mililitre anhidroz DML içerisinde 3,2 milimol (veya bir eşdeğer) polyol P-H-N-G-A-G ile 6,4 milimol (veya iki eşdeğer) dört dört metil ve bir bisfenol izosiyanat ekleyerek karıştırın.

Reaksiyon karışımını azot atmosferi altında 70 °C'de karıştırın. Ardından, katalizör titanyum dört oksidi şırınga yardımıyla damla damla ekleyerek son konsantrasyonun 0.8% olmasını sağlayın. Bir saat sonra, kopolimer ürün elde etmek için bir eşdeğer zincir uzatıcı bir dört butan diol ekleyin. Sıcaklığı 90 °C'ye yükseltin ve azot atmosferi altında 24 saat boyunca bekletin.

Reaksiyon karışımı oda sıcaklığına geldiğinde, poliüretan ürünün çökelmesi gözlemlenene kadar reaksiyon karışımına damla damla dieter ekleyin. Reaksiyon karışımını bir santrifüj tüpüne aktardıktan sonra, çözeltiyi 5.300 ×g'de beş dakika boyunca santrifüjleyin. Üst fazı uzaklaştırdıktan sonra, çökeleti solvent buharlaşana kadar oda sıcaklığında kurutun.

Sıradaki adımda, 200 mg PU 1 34'ü bir cam şişeye tartarak ekleyin. Numuneyi kloroformda veya bir bir oranında kloroform ve toluen karışımında veya tetrahidrofuran içerisinde ya da bir bir oranında tetrahidrofuran ve klorometan kombinasyonunda %2'lik bir nihai konsantrasyona kadar seyreltin. Çözelti homojen hale gelene ve herhangi bir çökelek gözlemlenmeyene kadar, çözeltiyi bir çalkalayıcı kullanarak oda sıcaklığında, dakikada 200 hareket hızında 20 dakika boyunca kuvvetlice çalkalayın.

İşlem tamamlandığında, spin kaplayıcıya yaklaşık 15 milimetrelik kare bir cam lamel yerleştirin. Bir pipet kullanarak lamelin üzerine 50 µL PU bir ila dört çözeltisi uygulayın; her bir lameli 23 ×g hızında yedi saniye boyunca döndürün. Ardından, sterilizasyon öncesinde lameli oda sıcaklığında en az 24 saat boyunca kurumaya bırakın. Bu aşamada, her bir polimer kaplı lamele laboratuvar radyatörü kullanarak 12 dakika boyunca 10 Gray dozunda gama ışını uygulayın.

Alternatif olarak, polimer kaplı her bir lamın her iki tarafını 30 watt'lık bir UV ampul kullanarak 16 dakika boyunca UV ışınlamasına tabi tutun. İşlem tamamlandığında, polimer kaplı lamı, lam boyutuna uygun bir doku kültürü plağına yerleştirin. İnsan embriyonik kök hücre hattını kültüre alıp farklılaştırdıktan sonra, hücreleri bir disosiyasyon reaktifi kullanarak ayırın ve farklılaştırma sürecinin dokuzuncu gününde, serumsuz ortam varlığında PU 1 34 kaplı lamların üzerine yeniden ekin; ardından taramalı elektron mikroskobu ile inceleyin.

Farklı kaplamalı cam lamel görüntüleri, toluen veya kloroform ile yapılan kaplamanın homojen olmadığını ve PE 1 34 çökelmesiyle birlikte düzensiz bir kaplama oluştuğunu göstermektedir. Buna karşılık, tetrahidrofuran çok daha üniform bir yüzeyin spin kaplamasına olanak sağlamıştır. Ayrıca, farklı polimer kaplamaların atom kuvvet mikroskobu analizi, tetrahidrofuran içinde çözündürülmüş P 1 34'ün pürüzlülüğünde diğer çözücülere kıyasla %40 azalma olduğunu göstererek daha üniform bir PU 1 34 kaplama olduğunu kanıtlamıştır; biyolojik bir uygulama olarak hepatik endoderm diferansiyasyonu indüklenmiş ve dokuzuncu günde, hücrelerin çoğunluğu cytokeratin 19, alfa feta protein ve hepatosit nükleer faktör 4 alfa eksprese ederken, metabolik fonksiyon ölçütü olarak düşük seviyelerde albumin ile hepatoblast benzeri hücreler belirginleşmiştir.

Sitokrom P450 fonksiyonu, farklı polimer kaplı yüzeylere yeniden ekimden dört gün sonra değerlendirildi. Tetra hidro furan mpu 1 3 4 kaplı yüzeylere yeniden ekilen hücrelerde metabolik aktivitede iki kat artış gözlendi. Bu sonuçlar, insan embriyonik kök hücre türevli hepatosit metabolik aktivitesinin, daha üniform bir P 1 34 kaplama yüzeyi ile iyileştiğini göstermektedir. Kontrast görüntüleme, UV veya gama ışınlaması sonrası belirgin bir fark göstermemiş olup, bu durum taramalı elektron mikroskopisi analizi ile daha sonra doğrulanmıştır.

Gama radyasyonuna maruz bırakılmış PU 1 34 kaplı cam lameller üzerine yeniden ekilen insan embriyonik kök hücre türevli hepatositler, UV radyasyonuna maruz bırakılmış PU 1 34 kaplı cam lameller üzerine ekilen hücrelere kıyasla CYP 3A aktivitesinde üç kat artış göstermiştir. Bu gözlemler, gama radyasyonunun optimal sterilizasyon tekniği olduğunu kanıtlamaktadır. Bu prosedürü uygularken, farklı spin kaplama CLO'ları arasındaki kaplama homojenliğini kontrol etmeyi unutmamak önemlidir; ayrıca kimyasal çözücü ekipmanlarıyla çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini göz önünde bulundurunuz.

Bu prosedür uygulanırken güvenlik gözlüğü takmak gibi önlemler her zaman alınmalıdır.