Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, bir fare pankreasından isletleri başarıyla izole etmektir. Bu işlem, öncelikle pankreasın çevre dokulardan izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, pankreasın kollagenaz proteaz karışımı ile şişirilebilmesi için safra kanalı kanüle edilir.

Şişirildikten sonra pankreas çıkarılır ve adacıklar dikkatlice ayrıştırılır. Son olarak, izole edilen adacıklar filtrelenir ve gelecekteki kullanımlar için plaklara ekilir. Nihayetinde, saflaştırılmış kollajenaz ve nötral proteaz ile gerçekleştirilen bu adacık izolasyon yöntemi, maksimum adacık verimi ve optimal adacık morfolojisi elde etmek için kullanılır.

Bu tekniğin mevcut adacık izolasyon yöntemlerine göre temel avantajı, saflaştırılmış enzimler kullanarak lotlar arası değişkenliği ortadan kaldırmış olmamızdır. Ayrıca, adacık morfolojisini iyileştirmek için bazı protokolleri değiştirmiş veya iyileştirmeler yapmışız. Ötanaziden sonra, karın boşluğunu anüsten diyaframa kadar tamamen açmadan önce gövdeyi %70 ethanol ile kaplayın.

Ardından fareyi bir diseksiyon mikroskobunun platformuna yerleştirin. Sekumu ve çıkan kolonu çekip vücut boşluğunun dışına, sola alın; karaciğer loblarını diyaframa doğru iterek yerleştirin. Eğer kendi başlarına orada kalmıyorlarsa, vücut boşluğunun açıklığını artırın.

Duodenumu kavisli penslerle kavrayın ve karaciğere giden hepatik arter, portal ven ve safra kanalı demetini bulun. Başka bir kavisli pens çifti kullanarak, arter, ven ve kanal demetinin altına bir sütür yerleştirin ve bunu karaciğere mümkün olduğunca yakın olacak şekilde sıkın.

İki çift eğri pens kullanarak duodenumu dikkatlice kavrayın ve papillaya bağlı olan safra kanalını bulun. Papillanın hemen altında ve safra kanalının yakınındaki pankreası ve bağ dokusunu delmek için pensin bir ucunu kullanın. Pensle açılan delikten hızlıca bir sütür geçirin. Sütürü, 90 derecelik pens yardımıyla safra kanalının etrafında küçük bir halka oluşturacak şekilde gevşekçe bağlayın.

Safra kanalı gerginleşene kadar ince bağırsağı çekin. Bağırsağı tutarken, safra kanalını papilladan ayırmadan süper ince makasla papilla üzerinden tek bir yatay kesik atın. Safra kanalına bir kanül yerleştirin ve ardından kanül etrafındaki dikişi nazikçe sıkın.

Ardından, üç mililitrelik bir şırıngayı 2.0 mililitre kollajenaz proteaz karışımı ile doldurun. Bu karışımı kanüle yavaş ve sabit bir hızda enjekte edin. Pankreasın şişirilmesi tamamlandıktan sonra, kanülü safra kanalından çıkarın.

İnen kolondan başlayarak, safra kanalına ulaşana kadar bağırsakları yukarı çekerek bağ dokusunu kesin. Ardından, pankreası dalaktan ve çevre dokulardan ayırın. Son olarak, dikişleri kesin ve pankreası çıkarın.

Çıkardıktan sonra, pankreası buz üzerinde beş mililitre HBSS içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Tüm örnekler toplandıktan sonra, pankreas dokusu içeren 50 mililitrelik tüpleri 37 derece Celsius'lik bir su banyosuna yerleştirin. 15 dakika boyunca tüpü yavaşça sallayın ve doku disosyasyonunu kontrol edin.

Tüpü kapağından tutarak dokunun kolayca ayrıldığından emin olun. Dokuyu daha fazla ayrıştırmak için 12 kez çalkalayın. 30 mililitreden fazla HBSS eklemeyin ve santrifüjleyin.

Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücre pelletini bozmamak için dipte az miktarda süpernatant bırakın. 14 gauge iğneye takılı 30 mililitrelik bir şırınga kullanarak 10 mililitreden fazla olmayacak şekilde HBSS ekleyin ve süspansiyonu iki kez yukarı aşağı aspire edin. Hücre karışımını plastik bir T süzgeç aracılığıyla 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin.

10 mililitre daha HBSS ile yıkayın ve santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve tüpleri bir dakika boyunca emici bir kağıt havlu üzerinde süzülmeleri için ters çevirin. Her tüpü 10 mililitre içinde yeniden süspande edin.

1100'de soğutun. Opak örtücü tabakasını, 10 mililitre HBSS ile yıkayın ve santrifüjleyin. Tüm 20 mililitre süpernatantı geniş ağızlı 25 mililitrelik bir pipetle alın ve süpernatantı ters çevrilmiş 70 mikronluk bir filtreden geçirin.

Kapsülleri doğrudan bir Petri kabına filtreleyin ve filtre kültüründen 10 mililitre kapsül besiyeri pipetleyerek durulama yapın. Kapsülleri, deney için hazır hale gelene kadar bir doku kültürü inkübatöründe bekletin. Kapsül verimi, morfolojisi ve kalitesi, kapsül izolasyonunun başarısını değerlendirmek için kullanılan genel parametrelerdir.

Tipik adacık morfolojisi burada gösterilmiştir. Adacıklar, nispeten tek tip boyutta, yuvarlak veya oval bir şekle sahiptir. İzole edilmiş adacıklar, glukozla stimüle edilmiş insülin sekresyonu açısından analiz edilmiştir.

İnsülin stimülasyonu, Sigma Type 11 ile hazırlanan adacıklar ile ci zyme TM, MABP ile hazırlananlar arasında benzerlik göstermiş olup, bu durum adacık hazırlığının yüksek kalitesine işaret etmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, bir fare safra kanalının nasıl kanüle edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Herhangi bir analiz için adacıklarınızı izole etmek amacıyla zyme kollajenaz ve nötro proteazlar ile çalışın.