Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

Bu prosedürün genel amacı, delikleri bir fare pankreasından başarılı bir şekilde izole etmektir. Bu, önce pankreasın çevre dokudan izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra, safra kanalı kanüle edilir, böylece pankreas kollajenaz proteaz karışımı ile şişirilebilir.

Şişirildikten sonra pankreas çıkarılır ve halkalar dikkatlice ayrılır. Son olarak, izole edilmiş halkalar ileride kullanılmak üzere filtrelenir ve kaplanır. Sonuç olarak, saflaştırılmış kollajenaz ve nötr proteaz ile bu kuşgözü izolasyonu yöntemi, maksimum kuşgözü verimi ve optimum kuşgözü morfolojisi elde etmek için kullanılır.

Bu tekniğin mevcut kuşgözü izolasyon yöntemlerine göre en büyük avantajı, saflaştırılmış enzimler kullanarak partiden partiye değişkenliği ortadan kaldırmış olmamızdır. Buna ek olarak, kuşgözü morfolojisini iyileştirmek için bazı protokolleri değiştirdik veya iyileştirmeler yaptık. Ötenaziden sonra, karın boşluğunu anüsten diyaframa tamamen açmadan önce gövdeyi% 70 etanol ile örtün.

Ardından, fareyi bir diseksiyon mikroskobu platformuna yerleştirin. Çekumu ve yükselen kolonu dışarı çekin ve bunları vücut boşluğunun dışına sola doğru yerleştirin, karaciğerin loblarını diyaframa doğru kaydırın. Orada kendi başlarına kalmazlarsa, vücut boşluğunun açıklığını arttırın.

Duodenumu kavisli forseps ile kavrayın ve karaciğere giden hepatik arter portal venini ve safra kanalı demetini bulun. Başka bir çift kavisli forseps ile. Arter damarı ve kanal demetinin altına bir dikiş yerleştirin ve karaciğere mümkün olduğunca yakın sıkın.

İki çift kavisli forseps kullanarak, duodenumu dikkatlice tutun ve bağlı safra kanalını bulun Papillada, safra kanalının hemen altında ve papilla çalışmasının yakınında pankreas ve bağ dokusunu delmek için bir tonluk forseps kullanın. Hızlı bir şekilde forsepsleri delikten geçirin ve bir dikiş yerleştirin. Gevşek. 90 derecelik forseps kullanarak küçük bir daire oluşturmak için dikişi safra kanalının etrafına bağlayın.

Safra kanalı tau olana kadar ince bağırsağı çekin. Bağırsağı tutarken safra kanalını papilladan çıkarmadan süper ince makasla papilla boyunca yatay bir kesim yapın. Safra kanalına bir kanül yerleştirin ve ardından dikişi kanülün etrafına sıkıca çekin.

Daha sonra, üç mililitrelik bir şırıngayı 2.0 mililitre kollajenaz proteaz karışımı ile doldurun. Bu karışımı kanüle yavaş ve sabit bir hızda enjekte edin. Pankreasın şişmesi tamamlandıktan sonra, kanülü safra kanalından çıkarın.

İnen kolondan başlayarak, safra kanalına ulaşılana kadar bağırsakları yukarı çekerken bağ dokusunu kesin. Daha sonra, pankreası dalak ve çevresindeki dokulardan ayırın. Son olarak dikişleri kesin ve pankreası çıkarın.

Çıkarıldıktan sonra, pankreası buz üzerinde beş mililitre HBSS içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Tüm örnekler toplandıktan sonra, pankreas dokusu içeren 50 mililitrelik tüpleri 37 santigrat derecelik bir su banyosuna yerleştirin. 15 dakika boyunca tüpü hafifçe sallayın ve doku ayrışmasını kontrol edin.

Tüpü kapaktan tutarak dokunun kolayca ayrıldığından emin olun. Dokuyu daha fazla ayırmak için 12 kez döndürün. 30 mililitreden fazla HBSS ve santrifüj eklemeyin.

Süpernatanı dikkatlice aspire edin ve hücre paletini bozmamak için altta az miktarda süpernatan bırakın. 14 gauge iğneye bağlı 30 mililitrelik bir şırınga kullanarak, 10 mililitreden fazla HBSS eklemeyin ve süspansiyonu iki kez yukarı ve aşağı aspire edin. Hücre karışımını plastik bir T süzgecinden geçirerek 50 mililitrelik bir tüpe süzün.

Başka bir 10 mililitre, HBSS ve santrifüj ile durulayın. Süpernatanı boşaltın ve emici bir kağıt havlu üzerinde bir dakika boyunca boşaltmak için tüpleri ters çevirin. Her tüpü 10 mililitre olarak yeniden süspanse edin.

Soğuk 1100. Onun opak kaplaması, onun opak 10 mililitre, HBSS ve santrifüj ile. Büyük delikli 25 mililitrelik bir pipet kullanarak 20 mililitrelik süpernatanın tamamını çıkarın ve süpernatanı ters çevrilmiş 70 mikronluk bir filtreden geçirin.

Kuşgözü doğrudan bir Petri kabına süzün ve 10 mililitre kuşgözü ortamını filtre kültüründen pipetleyerek durulayın. Bir doku kültürü inkübatöründeki delikler, deney için hazır olana kadar. Kuşgözü verimi, morfoloji ve kalite, kuşgözü izolasyonunun başarısını değerlendirmek için kullanılan genel parametrelerdir.

Tipik kuşgözü morfolojisi burada gösterilmiştir. Halkalar, nispeten düzgün bir boyuta sahip yuvarlak ila dikdörtgen bir şekle sahiptir. Burada. İzole edilen halkalar glukoz ile uyarılan insülin sekresyonu açısından analiz edildi.

İnsülin stimülasyonu, Sigma Tip 11 ile hazırlanan kuşgözü taramagözleri arasında, CIZYME TM, MABP ile karşılaştırıldığında, yüksek kaliteli bir kuşgözü hazırlığına işaret eden benzerdi. Bu videoyu izledikten sonra, bir fare safra kanalının nasıl kanüle edileceğini iyi anlamış olmalısınız. Herhangi bir test için göz kapaklarınızı izole etmek için zim, kollajenaz ve nötro proteazlarla çalışın.