Name: Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2012-09-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 59 s
Description: Öğrenin, fare pankreasından Langerhans adacıklarını izole etmek için saf kolajenaz ve nötr proteaz kullanımını. Bu yöntem, yüksek verim ve optimal morfoloji sağlayarak partiler arası değişkenliği azaltır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma NIH hibe R01 DK060581, R01 DK083583 (RGM hem) tarafından kısmen desteklenmiştir.

A. Malzeme İhtiyaç: Tablo 1 (reaktifleri) Bkz hazırlanmasından önceki <ol><li> HBSS (P / S): 100 ml 10X HBSS + 900 ml H 2 0 +% 1 penisilin / streptomisin (buzdolabında saklanan veya buz üzerinde tutulmalıdır). </li><li> % 20 BSA stok su içinde yapılmış ve bölünüp ve -20 ° C&#39;de depolanır </li><li> HBSS (BSA): 1X 200 ml HBSS (P / S)% 20 BSA + 3 ml (nihai konsantrasyonlar BSA,% 0.3 &#39;tür) </li><li> Adacık orta: RPMI +% 10 FBS +% 1 glutamin +% 1 penisilin / streptomisin </li><li> Histopaque 1100: 1119, 240 ml Histopaque + 200 mL 1077 Histopaque </li><li> 4-0 Sütür (McKesson): 2 ¾ inç parçalar halinde kesilir ve 10 cm Petri saklanır </li><li> Araçlar: 90 ° Güzel Bilim Araçları forseps bükün ve forseps her üç çift dişli diş aşağı dosya. Amacınız onları kaldırmak için değil, sıkıcı dişleri için. </li><li> Kollajenaz / proteaz karışımı yönetimi için Kanül: 27G ½ iğne inç, 30 ½ inçiğne, PE50 boru parçaları 12 inç kesti. Keskin kenarları yumuşak bir yuvarlak sonuna kadar her iki iğne aşağı Dosya. PE50 boru parçası içeri bir 12 bir ucunun içine 27G iğne takın. Kasa dönüm, bir pense ile gövde kırarak kasasından 30G iğne çıkarın ¼ her zaman açın. Kasasından pense ile iğne çıkarın ve diseksiyon mikroskop altında PE50 boru diğer ucunu takın. Eğer PE50 boru içine iğne eklemek gibi tüp bükmeyiniz emin olun. 27G iğne Eğer kollajenaz şırınga takmak olacağı sonudur. </li><li> Kollajenaz (CI zyme MA) ve Nötr Proteaz (CI zyme BP). Üreticinin talimatlarına göre sulandırın TDE. Enzim aktivitesi konsantrasyonu hesaplamak için Analiz sürü belirli Sertifikası bakın. Sulandırılan kollajenaz 350,000 kollajen aşağılayıcı aktivitesi (CDA) birimleri ve reconstit 100.000 nötral proteaz adet toplam aktarınuted BP konik bir tüp içine Proteaz ve HBSS 15 ml&#39;den (P / S) kadar seyreltmek </li></ol> B. Adım Adım Protokolü 1. Kollajenaz / Proteaz Karışımı ile Pankreas Enflasyon <ol><li> Servikal dislokasyon ile fare Euthanize,% 70 EtOH, herhangi bir diseksiyon makas ve forseps ile tamamen anüsten diyafram açık karın boşluğu ile fare gövde doyurabilecek. </li><li> Bir diseksiyon mikroskobu platformu üzerinde fare yerleştirin. </li><li> Çekum ve çıkan kolon çekin ve sol vücut boşluğuna dışında onları ayarlayın. Aşağıdaki adımlar bir özeti için Şekil 1&#39;e bakınız. </li><li> Diyafram karşı karaciğer lobları yerleştirin; vücut boşluğuna yeterince açıksa orada kalmalıdır. Hepatik arter, portal ven ve kavisli bir forseps ile onikiparmak kavrayarak karaciğere giden safra kanalı paket bulun. Kavisli bir forseps bir çift ile, arter, ven altına ulaşarak, ve kanal metndle ve arter, ven, safra kanalı altında 4-0 sütür parçası içeri ¾ 2 çekin ve bir kez kravat ve mümkün olduğunca karaciğer yakın sıkı çekin. </li><li> Kavisli bir forseps iki çift kullanarak, dikkatle duodenum kapmak ve papillada duodenuma bağlı safra kanalı bulabilirsiniz. Papilla için safra kanalı yakın altında pankreas ve bağ dokusu hakkı yoluyla poke forseps bir maşa kullanın. Bir delik yapmak organı aracılığıyla hızla forseps Poke ve sonra forseps hem maşa aracılığıyla koymak ve 4-0 sütür başka 2 ¾ inç parça kapmak yoluyla ve kravat kez ve küçük bir daire için çekin, ama sıkı çekmeyin. </li><li> 90 ° forseps ve Superfine Vannas makas değiştirin. 90 ° forseps ile dikkatlice tutun ve safra kanalı gergin olana kadar ince bağırsak çekin. Bağırsak içine açık makas bıçaklama ve sonra bir hareket ile keserek makasla papilla çapında bir yatay kesim olun. Sadece o yapmaya çalışınne papilladan koledok oradan çıkarmadan papilla genelinde kesti. </li><li> Hala 90 ° forseps ile bağırsak tutarken, safra yolu uzunluğunun yarısı kadar safra kanalı içine kanül takın ve ardından yavaşça kanülün etrafında sıkı dikiş çekin. </li><li> Kollajenaz / proteaz karışımı 2.0 ml 3 ml şırınga doldurun ve yavaş, sabit bir hızda kanül içine enjekte edilir. </li><li> Pankreasın enflasyon tamamlandıktan sonra, safra kanalı arasından kanül kaldırmak ve inen kolon başlayan ve bağırsak yukarı çekin gibi bağ dokusu kırpma tarafından şişirilmiş pankreas kaldırmak için kavisli bir forseps ve kavisli makas makas kullanın. Eğer safra kanalı ulaşana kadar bağırsak, pankreas kaldırmak için devam, sonra, dalak, mide, pankreas kaldırmak ve sonra karın boşluğu organları gelen. Sütürler uzak kırpma kaldırarak bitirin. HBSS 5 ml içeren 50 ml&#39;lik bir tüpe pankreas ekleme(P / S). Bu boru, buz üzerinde olmalıdır. </li><li> Dört hayvanlara her hayvan için yukarıdaki işlemi tekrarlayın. En iyi sonuçlar için, tek seferde sadece dört pancreata çözerler. Ilk dört 37 ° C su banyosu içinde iken Tipik olarak, bir başka dört pancreata şişirmek. </li></ol> 2. Pankreas Ayrılma <ol><li> 15 dakika için bir 37 ° C su banyosu içine pancreata ihtiva eden 50 ml&#39;lik tüplere yerleştirin. </li><li> Yavaşça tüp kaya ve doku disosiyasyon kontrol için kapağı tarafından tüpü tutarak iken doku tüpler girdap sonra kolayca ayrı 12 kez gelir emin olun. </li><li> Bir dakika boyunca 290 xg&#39;de en fazla 30 HBSS (BSA) (bu adım için santrifüj tüpleri dengelemek için gerekli olan ne kadar bağlı olarak, daha düşük bir miktar olabilir) ml ve santrifüj ekleyin. </li><li> Süpernatant dikkatlice aspire ve hücre peleti bozmayacak şekilde alt süpernatant (2-3 ml) küçük bir miktar bırakın. </li><li> 30 ml şırınga attac kullanma14G iğne hed, HBSS (BSA) ve en fazla 10 ml ekleyin ve 2 kez aşağı süspansiyon aspirat ve. </li><li> 50 ml&#39;lik bir tüp içine plastik bir çay süzgeci yoluyla hücre karışımı süzün ve başka bir 10 ml HBSS (BSA) ile yıkayın. </li><li> 2 dakika süreyle 330 xg&#39;de santrifüjleyin. </li><li> Durusu süpernatant ve 1 dakika için bir emici kağıt havlu üzerine drenaj boruları ters. </li><li> 10 ml soğuk 1100 histopaque her bir tüp içinde yeniden süspanse edin. </li><li> 10 ml HBSS (BSA) ile histopaque kaplaması ve 18 dakika için 900 x g&#39;da santrifüjlenir. </li><li> Büyük bir delik 25 ml pipet kullanarak süpernatant genelinde 20 ml çıkarın ve filtre ters 70 mikron ile süpernatant geçmek. </li><li> Yemeğin üzerine sağ tarafı yukarıda tutarak filtre ile 10 ml adacık medya pipetleme 10 cm Petri kabı içine adacıklar durulayın. </li><li> Deney için hazır olana kadar bir kültür 37 ° C&#39;de,% 5 CO2 doku kültürü inkübatöründe islets. Tipik olarak, adacık el-aldı ve önceki exper kadar saydımimentation. </li></ol> 3. Temsilcisi Sonuçlar Islet verimleri, morfolojisi ve kalitesi adacık izolasyonu başarı yargılamak için kullanılan genel parametrelerdir. Bizim eller, ortalama C57BL / 6 fare adacık verimleri bu protokolü (bkz. Tablo 2) kullanılarak 150-250 adacıklar aralığında ve optimize Sigma tip XI kollajenaz kullanılarak elde edilen veriler karşılaştırılabilir. Ancak, verimleri kullanılan fare zorlanma ve fare yaşına bağlı olarak değişebilir. Biz istihdam hayvanların çoğu 8-16 hafta yaş aralığındaki Bu protokol C57BL / 6 (180-250 adacıklar / fare), CD1 (200-300 adacıklar / fare), 129 / dahil olmak üzere, birden fazla fare suşları üzerinde test edilmiştir vardır B6 (200-300 adacıklar / fare), BLKS-db/db (120-200 adacıklar / fare), NOD (10 haftalık, 100-150 adacıklar / fare), ve NOD-SCID (100-150 adacıklar / fare ). Tipik adacık morfolojisi (adacık nispeten homojen bir boyut ile şekil dikdörtgen bir yuvarlak sahip olduğu, Şekil 2 &#39;de gösterilen boyut UNIF rağmenormity) zorlanma gerginlik değişebilir. Şekil 3 saflaştırılmış TDES vs Sigma tipi XI kollajenaz ile C57BL / 6 fare izole adacıklar glikoz ile uyarılan insülin salgısının bizim tipik analizini gösterir. Tipik olarak, 2.5 mM glikoz de gözlenenden daha 6-20 kat daha fazla olan, 25 mM glikoz bir insülin uyarım yüksek kaliteli adacık hazırlama sonuçlanır. Diğer uygulamalar da izole adacıklar kalitesini test etmek için kullanılan ve bu perifusion teknikler, diğerleri arasında 11. Ca2 + görüntüleme (Fura2 ile) ve ters transkripsiyon-PCR kullanılması dahil edilebilir. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig1.jpg" alt="Şekil 1" /> Şekil 1. Koledok kanülasyonu bir özeti. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig2.jpg" alt="Şekil 2," /> Şekil 2. 24 saat aşağıdaki yalıtımı konusunda C57BL / 6 adacıktan tipik görünümü. Görüntüler içinde yakalanmaları40X büyütmede verted mikroskop. <img src="/files/ftp_upload/4137/4137fig3.jpg" alt="Şekil 3" /> Şekil 3,. C57BL / 6 adacık glukoz-uyarılmış insülin salgılanması. 24 saat aşağıdaki izolasyon olarak, 100 adacıkları 37 2.5 mM glükoz ihtiva eden Krebs-Ringer ° C HEPES-tamponlu çözelti, 1 saat boyunca bir 12-kuyu çanak içinde inkübe edildi. Adacıkları ardından iki sitenin immunospecific enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) (Kristal Kimya) kullanarak süpernatant insülin ölçümü için toplandı sonra ek bir saat için 2.5 mM glukozun Krebs-Ringer HEPES aktarılmıştır. Aynı Adacıklar daha sonra 25 mM glükoz ihtiva eden Krebs-Ringer HEPES-tamponlu çözelti ile transfer edildi ve ortam içine insülin salınması inkübasyondan 1 saat sonra ELISA ile ölçülmüştür.

<ol><li>Li, D. -S., Yuan, Y. -H., Tu, H. -J., Liang, Q. -L., Dai, L. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+islet+isolation+from+mouse+pancreas%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for islet isolation from mouse pancreas.</a> Nat. Protoc. 4, 1649-1652 (2009).</li>
<li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+pancreatic+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Murine pancreatic islet isolation.</a> J. Vis. Exp. (7), e255(2007).</li>
<li>Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096(2011).</li>
<li>Kin, T., O'Gorman, D., Senior, P., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experience+of+islet+isolation+without+neutral+protease+supplementation%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Experience of islet isolation without neutral protease supplementation.</a> Islets. 2, 278-282 (2010).</li>
<li>Gramignoli, R., Green, M. L., Tahan, V., Dorko, K., Skvorak, K. J., Marongiu, F., Zao, W., Venkataramanan, R., Ellis, E. C. S., Geller, D., Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C., Strom, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+application+of+purified+tissue+dissociation+enzyme+mixtures+for+human+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Development and application of purified tissue dissociation enzyme mixtures for human hepatocyte isolation.</a> Cell Transplant. , Forthcoming (2012).</li>
<li>McCarthy, R. C., Spurlin, B., Wright, M. J., Breite, A. G., Sturdevant, L. K., Dwulet, C. S., Dwulet, F. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+collagen+degradation+assay+to+assess+purified+collagenase+used+in+islet+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a collagen degradation assay to assess purified collagenase used in islet isolation.</a> Transplant. Proc. 40, 339-342 (2008).</li>
<li>Gotoh, M., Ohzato, H., Porter, J., Maki, T., Monaco, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crucial+role+of+pancreatic+ductal+collagenase+injection+for+isolation+of+pancreatic+islets%5BTitle%5D)+AND+%22Horm.+Metab.+Res.+Suppl%22%5BJournal%5D)">Crucial role of pancreatic ductal collagenase injection for isolation of pancreatic islets.</a> Horm. Metab. Res. Suppl. 25, 10-16 (1990).</li>
<li>Ohzato, H., Gotoh, M., Monden, M., Dono, K., Kanai, T., Mori, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+in+islet+yield+from+a+cold-preserved+pancreas+by+pancreatic+ductal+collagenase+distention+at+the+time+of+harvesting%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation%22%5BJournal%5D)">Improvement in islet yield from a cold-preserved pancreas by pancreatic ductal collagenase distention at the time of harvesting.</a> Transplantation. 51, 566-570 (1991).</li>
<li>McCall, M. D., Maciver, A. H., Pawlick, R., Edgar, R., Shapiro, A. M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopaque+provides+optimal+mouse+islet+purification+kinetics%3A+comparison+study+with+Ficoll%2C+iodixanol+and+dextran%5BTitle%5D)+AND+%22Islets%22%5BJournal%5D)">Histopaque provides optimal mouse islet purification kinetics: comparison study with Ficoll, iodixanol and dextran.</a> Islets. 3, 144-149 (2011).</li>
<li>Breite, A. G., Dwulet, F. E., McCarthy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+dissociation+enzyme+neutral+protease+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Transplant.+Proc%22%5BJournal%5D)">Tissue dissociation enzyme neutral protease assessment.</a> Transplant. Proc. 42, 2052-2054 (2010).</li>
<li>Evans-Molina, C., Robbins, R. D., Kono, T., Tersey, S. A., Vestermark, G. L., Nunemaker, C. S., Garmey, J. C., Deering, T. G., Keller, S. R., Maier, B., Mirmira, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PPAR-%7Bgamma%7D+Activation+Restores+Islet+Function+in+Diabetic+Mice+Through+Reduction+of+ER+Stress+and+Maintenance+of+Euchromatin+Structure%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">PPAR-{gamma} Activation Restores Islet Function in Diabetic Mice Through Reduction of ER Stress and Maintenance of Euchromatin Structure.</a> Mol. Cell. Biol. 29, 2053-2067 (2009).</li>
</ol>

NDS, SAT ve RGM ifşa hiçbir şeyim yok. Yazar AGB VitaCyte tarafından istihdam edilmektedir. Yazar RCM VitaCyte bir mülkiyet çıkarı vardır.

Bu protokol, Langerhans adacıkları izole amacı ile, kanülasyon, kollajenaz perfüzyon ve fare pankreas ayrışması için prosedürü tarif var. Teknik olarak, bizim yöntemi, bir kez hakim, hayvan ötenazi 4 dk içinde pankreas izolasyonu için izin vermeli, ve 1 saat tek bir hayvandan adacık izolasyonu sonuçlanmalıdır. Tekniğin hız bize böylece 3.000 adacıklar için bir izolasyon ile sonuçlanan kadar, tipik bir streç 12 fareler için adacıkları izole etmek için olanak sağlar. Kollajenaz ham preparatları kullanan diğer protokoller aksine, bizim protokol saflaştırılmış proteazlar, CI zyme Kollajenaz MA ve CI zyme BP Protease kullanımı sunmaktadır. Ticari olarak temin edilebilirler TDE preparatlar tutarlılık varyasyonlar her bir çok ayrı ayrı genel kullanım öncesinde test edilmiş ve optimize edilmiş olmasını gerektirir. Bu çok-to-çok değişkenlik bize puri kullanımı dikkate yol açtıVitaCyte dan ğı TDES. Bunlar, yüksek oranda saflaştırılmış TDES duyarlı fluoresan etiketli substrat testlerinin kullanılması da dahil olmak üzere birden fazla yöntem ile karakterize edilir. Floresans CDA tahlil aşağılayıcı yerli kollajen farklı kinetik var kollajenaz farklı moleküler formları daha duyarlıdır. Tarihsel peptid substrat testlerinin kollajenaz tamamlanmamış bir değerlendirmesini sağlar. Birden yöntemlerle kollajenaz niteleme sürü arasında büyük enzim aktivitesi sağlar. Piyasada bulunan kollajenaz hazırlıkları çeşitli kullanarak bizim in-house test dayanarak, saflaştırılmış enzim kombinasyonları tekrarlanabilir sürü-için-lot sonuçları verdiğini bulundu. Bu uygulama son derece saf ve titizlikle karakterize TDES kullanmanın önemli avantajları kez Optimum enzim yapısı tanımlanmaktadır olan, çok-to-lot performans tutarlılığı sağlanır. Bu tutarlılık normalde gerekli yeri yeterlilik emek yoğun bir süreç ortadan kaldırırham veya zenginleştirilmiş kollajenaz ürünler için. Saflaştırılmış TDES da farklı fare suşları kurtarıldı adacıklar verim ve kalitesini artırmak için kompozisyonun ek değişiklikleri etkinleştirmek. Farelerin farklı suşları adacık izolasyonu için optimum enzim bileşimler, raporlanması daha etkili bir şekilde iletişim olabilir. Bu da, kaynaklar ve deneysel tasarım geliştirilmiş esneklik daha verimli kullanımına yol açmaktadır. Bizim protokolü kullanılarak adacık izolasyonların sonucunu etkileyebilecek birçok kritik adımlar vardır. Birinci enzim hazırlanması perfüzyon sırasında pankreas etkili şişirme elde etmek için ihtiyaç vardır. Bu şırınga üzerine nazik bir güçle enflasyon başlatın ve pankreas açılırsa olarak kuvvetini artırmak için önemlidir. Bu bağırsak hareket ve kollajenaz tüm organı perfuses böylece enflasyonun sırasında pankreas kaldırmak için yardımcı olur. Başka kritik adım biri tüpler afte sallar hangi ile güçtür37 ° C (adım 2.2) de r inkübasyon. Bu tüp kapak karşı sert pankreas sallama adacık parçalanma neden olur, ancak bu aşamada mekanik ayrışma herhangi bir biçimde, adacık verimleri önemli ölçüde düşmesi bulduk. Bu şırınga (adım 2.5) ile ayrışma basamağı sırasında, bir orta-düzey kuvvet ile piston yukarı ve aşağı doğru hareketi sırasında uygulanan da çok önemlidir, bu filtreleme adımı (2.6) daha önce yeterli doku çözünme sağlar, burada çok az doku çay süzgeci filtre üzerinde saklanmalıdır. Son olarak, dikkatle takip etmek son adım histopaque fraksiyone adacık genelinde 20 ml aspirasyon olduğunu. Adacıklar histopaque ve HBSS ve arayüzü tipik olmasına rağmen, biz sadece arayüz kaldırmaya çalıştığınızda biz adacıklar kaybetmek bulduk, bunun yerine, artık büyük bir delik 25 ml pipet kullanarak tüm 20 ml çıkarın. Biz c ihtiyacını ortadan kaldırmak için ters 70 mikron filtre (adım 2.11) aracılığıyla filtrasyon eklendihistopaque uzak yıkamak için art arda adacıklar entrifuge.

<table border="1"><tbody><tr><td> Reaktif Adı </td><td> Şirket </td><td></td><td> Katalog # </td></tr><tr><td> 10X HBSS </td><td> Yaşam Teknolojileri </td><td> 14065 </td><td></td></tr><tr><td> RPMI </td><td> Fisher Scientific </td><td> 10-040 </td><td></td></tr><tr><td> BSA </td><td> Sigma Aldrich </td><td> herhangi </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1077 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 10771 </td><td></td></tr><tr><td> Histopaque 1119 </td><td> Sigma Aldrich </td><td> 11191 </td><td></td></tr><tr><td> 4-0 Sütür 100 yd rulo </td><td> McKesson </td><td> 451521 </td><td></td></tr><tr><td> 14 g kör uçlu iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14-8216M </td><td></td></tr><tr><td>Vannas Superfine sciss </td><td> Fisher Scientific </td><td> 501778 </td><td></td></tr><tr><td> Kavisli Bahar Makas </td><td> Fisher Scientific </td><td> 14127 </td><td></td></tr><tr><td> Kavisli Forseps (2) </td><td> Fisher Scientific </td><td> 15914G </td><td></td></tr><tr><td> Kavisli forseps (90 °) </td><td> Güzel Bilim Araçları </td><td> 11052-10 </td><td></td></tr><tr><td> 27G 1/2 inç iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305109 </td><td></td></tr><tr><td> 30G 1/2 inç iğne </td><td> Fisher Scientific </td><td> 305106 </td><td></td></tr><tr><td> PE boru </td><td> Becton Dickinson </td><td> 427411 </td><td></td></tr><tr><td> Kollajenaz MA </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 001-2030 </td><td></td></tr><tr><td> BP Proteaz </td><td> Vitacyte, LLC </td><td> 003-1000 </td><td></td></tr><tr><td> 3 ml şırınga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309585 </td><td></td></tr><tr><td> 30 ml&#39;lik şırınga </td><td> Fisher Scientific </td><td> 309650 </td><td></td></tr><tr><td> 70 um bir filtreden </td><td> Fisher Scientific </td><td> 352350 </td><td></td></tr><tr><td> 10 cm 2 Petri Dish </td><td> Fisher Scientific </td><td> 351005 </td><td></td></tr><tr><td> Plastik çay süzgeci </td><td> Herhangi bir mutfak tedarik </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Tablo 1. Reaktifler ve Ekipmanları </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td><table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0" width="510"><tbody><tr><td> Sigma tipi XI (L010M8618) </td><td> MA (100615) BP (110.329) </td><td> MA (081104) BP (100.823) </td><td> MA (091.211) BP (101.109) </td></tr><tr><td> 216 (± 74) </td><td> 260 (± 45) </td><td> 157 (± 37) </td><td> 200 (± 4) </td></tr></tbody></table></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Farklı TDE sürü kullanarak * Tablo 2. Ortalama adacık verimleri (± SD) * Veriler, en az 10 farelerin ortalama adacık verimi temsil eder. Parantez içindeki Lot numaraları </td></tr></tbody></table>

langerhans İzolasyonu fare islet saflaştırılmış collagenase ve nötr proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease

Beta hücre gen ekspresyonu ve in vitro fonksiyon sorgulama dürüstçe kemirgen tümörojenik hücre hatları çalışma izole kemirgen adacıklar çalışması için yılda kaymıştır. Birincil adacıkları daha sadakatle hücre içi sinyal yolları ve sekretuar yanıtları biyoloji yansıtan ayrı bir avantaj sunuyoruz. Doku dissociating enzim (TDE) preparatlarını kullanan adacık izolasyon yöntemi de birçok laboratuvarlarında 1-4 kurulmuştur Oysa, herhangi bir kemirgen gerginlik adacık verim ve kalite tutarlılığı farklılıklar ölçüde ve birincil adacık çalışmalar fizibilite sınırlayabilir. Bu varyasyonlar, sık sık adacık izolasyon prosedüründe kullanılan ham kısmen saflaştırılmış TDES bir sonucu olarak ortaya çıkar; sık sık aktivitesi çok arası çok varyasyonları gösteren ve sık sık kullanılan enzim doz ayarlamaları gerektirir TDES. Raporlar az sayıda kemirgen hücre izolasyonları için TDES 5, 6 saflaştırılmış kullanmış </sup&gt;, ama pratikte insan adacık izolasyonları için TDES saflaştırılmış rutin kullanımı ve avantajları rağmen yaygın değildir. VitaCyte, LLC (Indianapolis, IN) ile işbirliği içinde, biz yoluyla ham doku fraksiyonasyon takip TDES farelerin pankreatik kanal içine doğrudan perfüze edildiği Gotoh 7, 8, tarafından tarif dayalı bir modifiye fare adacık izolasyonu protokolü geliştirdi Bir Histopaque gradiyent 9, ve adacıklar saflaştırılmış izolasyonu. Bizim protokol anlamlı bir fark saflaştırılmış kollajenaz (CI zyme MA) ve nötr proteaz (CI zyme BP) kombinasyonunun kullanımıdır. Kollajenaz substrat 6 olarak floresan etiketli çözülebilir buzağı cilt fibrillerin yararlanılan 6 floresans kollajen aşağılayıcı aktivitesi (CDA) testinin kullanımı ile karakterize edilmiştir. Bu substrat olarak yerli kollajen dayanır çünkü bu substrat doku matriksinin kollajen bozunma kinetiği daha prediktif olduğunu. Proteaz CH olduğuhassas bir floresan kinetik yöntemde 10 ile aracterized. Daha geleneksel biyokimyasal analizi ile birlikte bu gelişmiş testlerin kullanılması TDE lotlar arasında gelişmiş performans tutarlılığı yol daha tutarlı üretilmesini sağlayacak. Burada açıklanan protokol C57BL / 6 fareler kullanılarak maksimal adacık verimi ve en uygun adacık morfoloji için optimize edilmiştir. Bu protokolün geliştirilmesi sırasında, kollajenaz ve nötral proteazların çeşitli kombinasyonları farklı konsantrasyonlarda değerlendirilmektedir ve kollajenaz nihai oranı edildi: 35:10 nötral proteaz Sigma Tip XI karşılaştırılabilir enzim performansını gösterir. Sıçan ve farelerin farklı suşları ortalama adacık verimlerinde önemli değişkenlik bildirilmiştir Çünkü, TDE kompozisyonun ek değişiklikler farklı tür ve suşlarının kurtarıldı adacıklar verim ve kalitesini artırmak için yapılmalıdır.

Fare adacık izolasyon ayrıntılı bir açıklaması kolajenaz nötr proteaz ve saflaştırılmış bir bileşimi in situ pankreatik kanal kanülasyon ve perfüzyon tekniği kullanılarak tarif edilir.

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

Beta hücre gen ekspresyonunun ve fonksiyonunun in vitro incelenmesi, yıllar içinde kemirgen tümörijenik hücre hatlarının çalışılmasından...

Bu prosedürün genel amacı, bir fare pankreasından isletleri başarıyla izole etmektir. Bu işlem, öncelikle pankreasın çevre dokulardan izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, pankreasın kollagenaz proteaz karışımı ile şişirilebilmesi için safra kanalı kanüle edilir.Şişirildikten sonra pankreas çıkarılır ve adacıklar dikkatlice ayrıştırılır. Son olarak, izole edilen adacıklar filtrelenir ve gelecekteki kullanımlar için plaklara ekilir. Nihayetinde, saflaştırılmış kollajenaz ve nötral proteaz ile gerçekleştirilen bu adacık izolasyon yöntemi, maksimum adacık verimi ve optimal adacık morfolojisi elde etmek için kullanılır.Bu tekniğin mevcut adacık izolasyon yöntemlerine göre temel avantajı, saflaştırılmış enzimler kullanarak lotlar arası değişkenliği ortadan kaldırmış olmamızdır. Ayrıca, adacık morfolojisini iyileştirmek için bazı protokolleri değiştirmiş veya iyileştirmeler yapmışız. Ötanaziden sonra, karın boşluğunu anüsten diyaframa kadar tamamen açmadan önce gövdeyi %70 ethanol ile kaplayın.Ardından fareyi bir diseksiyon mikroskobunun platformuna yerleştirin. Sekumu ve çıkan kolonu çekip vücut boşluğunun dışına, sola alın; karaciğer loblarını diyaframa doğru iterek yerleştirin. Eğer kendi başlarına orada kalmıyorlarsa, vücut boşluğunun açıklığını artırın.Duodenumu kavisli penslerle kavrayın ve karaciğere giden hepatik arter, portal ven ve safra kanalı demetini bulun. Başka bir kavisli pens çifti kullanarak, arter, ven ve kanal demetinin altına bir sütür yerleştirin ve bunu karaciğere mümkün olduğunca yakın olacak şekilde sıkın.İki çift eğri pens kullanarak duodenumu dikkatlice kavrayın ve papillaya bağlı olan safra kanalını bulun. Papillanın hemen altında ve safra kanalının yakınındaki pankreası ve bağ dokusunu delmek için pensin bir ucunu kullanın. Pensle açılan delikten hızlıca bir sütür geçirin. Sütürü, 90 derecelik pens yardımıyla safra kanalının etrafında küçük bir halka oluşturacak şekilde gevşekçe bağlayın.Safra kanalı gerginleşene kadar ince bağırsağı çekin. Bağırsağı tutarken, safra kanalını papilladan ayırmadan süper ince makasla papilla üzerinden tek bir yatay kesik atın. Safra kanalına bir kanül yerleştirin ve ardından kanül etrafındaki dikişi nazikçe sıkın.Ardından, üç mililitrelik bir şırıngayı 2.0 mililitre kollajenaz proteaz karışımı ile doldurun. Bu karışımı kanüle yavaş ve sabit bir hızda enjekte edin. Pankreasın şişirilmesi tamamlandıktan sonra, kanülü safra kanalından çıkarın.İnen kolondan başlayarak, safra kanalına ulaşana kadar bağırsakları yukarı çekerek bağ dokusunu kesin. Ardından, pankreası dalaktan ve çevre dokulardan ayırın. Son olarak, dikişleri kesin ve pankreası çıkarın.Çıkardıktan sonra, pankreası buz üzerinde beş mililitre HBSS içeren 50 mililitrelik bir tüpe yerleştirin. Tüm örnekler toplandıktan sonra, pankreas dokusu içeren 50 mililitrelik tüpleri 37 derece Celsius'lik bir su banyosuna yerleştirin. 15 dakika boyunca tüpü yavaşça sallayın ve doku disosyasyonunu kontrol edin.Tüpü kapağından tutarak dokunun kolayca ayrıldığından emin olun. Dokuyu daha fazla ayrıştırmak için 12 kez çalkalayın. 30 mililitreden fazla HBSS eklemeyin ve santrifüjleyin.Süpernatantı dikkatlice aspire edin ve hücre pelletini bozmamak için dipte az miktarda süpernatant bırakın. 14 gauge iğneye takılı 30 mililitrelik bir şırınga kullanarak 10 mililitreden fazla olmayacak şekilde HBSS ekleyin ve süspansiyonu iki kez yukarı aşağı aspire edin. Hücre karışımını plastik bir T süzgeç aracılığıyla 50 mililitrelik bir tüpe filtreleyin.10 mililitre daha HBSS ile yıkayın ve santrifüjleyin. Süpernatantı dökün ve tüpleri bir dakika boyunca emici bir kağıt havlu üzerinde süzülmeleri için ters çevirin. Her tüpü 10 mililitre içinde yeniden süspande edin.1100'de soğutun. Opak örtücü tabakasını, 10 mililitre HBSS ile yıkayın ve santrifüjleyin. Tüm 20 mililitre süpernatantı geniş ağızlı 25 mililitrelik bir pipetle alın ve süpernatantı ters çevrilmiş 70 mikronluk bir filtreden geçirin.Kapsülleri doğrudan bir Petri kabına filtreleyin ve filtre kültüründen 10 mililitre kapsül besiyeri pipetleyerek durulama yapın. Kapsülleri, deney için hazır hale gelene kadar bir doku kültürü inkübatöründe bekletin. Kapsül verimi, morfolojisi ve kalitesi, kapsül izolasyonunun başarısını değerlendirmek için kullanılan genel parametrelerdir.Tipik adacık morfolojisi burada gösterilmiştir. Adacıklar, nispeten tek tip boyutta, yuvarlak veya oval bir şekle sahiptir. İzole edilmiş adacıklar, glukozla stimüle edilmiş insülin sekresyonu açısından analiz edilmiştir.İnsülin stimülasyonu, Sigma Type 11 ile hazırlanan adacıklar ile ci zyme TM, MABP ile hazırlananlar arasında benzerlik göstermiş olup, bu durum adacık hazırlığının yüksek kalitesine işaret etmektedir. Bu videoyu izledikten sonra, bir fare safra kanalının nasıl kanüle edileceği konusunda iyi bir anlayış kazanmış olmalısınız. Herhangi bir analiz için adacıklarınızı izole etmek amacıyla zyme kollajenaz ve nötro proteazlar ile çalışın.

mouse-islet-langerhans-isolation-using-combination-purified

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Murin Pankreas Adacık İzolasyonu

Langerhans Adacıkları olarak da adlandırılan pankreas adacıkları, glikoz regülasyonu ve diğer önemli biyolojik işlevler için hormonlar üreten bir endokrin hücre kümesidir. Bu protokol, ekzokrin pankreas dokusunu sindirmek için önce Ampulla of Vater yoluyla kollajenaz perfüze ederek pankreas adacıklarını izole etmek için bir yöntemi ve adacıkları farelerden saflaştırmak için basitleştirilmiş bir yoğunluk gradyan santrifüjünü açıklar.

Kollajenaz Perfüzyonu ile Pankreas Adacıkları İzolasyonu: Pankreas Adacığı Hücrelerini İzole Etmek İçin Enzimatik Bir Yöntem

Langerhans adacıkları izole edilmiş fare kullanılarak in vitro β-hücre fonksiyonu denenmesi diyabet patofizyolojisi ve terapötik çalışmada önemli bir bileşenidir. Çok sayıda alt-uygulama mevcut olmakla birlikte, bu protokol, spesifik olarak β-hücresi fonksiyonunu belirleyen önemli bir parametre olarak hücre içi siklik adenozin monofosfat (cAMP) ölçümünü açıklamaktadır.

Fare Pankreas Adacık İzolasyonu ve hücre içi cAMP Belirlenmesi için Bir Yöntem

Burada, tip 2 diyabetin fare modelinden adacıkların izolasyonu için bir protokol, Leprdb ve 2 foton mikroskobu kullanan sağlam adacıklardan insülin sekresyonunun ölçümü için bir canlı hücre testinin ayrıntılarını sunuyoruz.

Lepr<sup&gt; Db</sup&gt; Tip 2 Diyabet Fare Modeli: Bozulmamış Islets Of Pankreas Adacık İzolasyonu ve Canlı hücre 2-Foton Görüntüleme

Neonatal farelerden sağlam adacıklar izole edilmesi için bu tarifnamede, bir protokol açıklar. Pancreata kısmen yıkama ve elle toplama ile, ardından kollajenaz ile sindirilir. 20-80 adacık kümeleri birkaç adacık çalışmalar için uygun yeni doğan farelerin, gelen pankreas başına elde edilebilir.

Yenidoğan Fare Pankreas gelen Fonksiyonel Adacık etkili İzolasyonu

Bu adacık izolasyon protokolü ekroz dokuyu sindirmek için kollajenaz enjeksiyonunun yeni bir rotasını ve adacıkları farelerden arındırmak için basitleştirilmiş bir degrade prosedürünü tanımlamıştır. Enzimatik sindirim, degrade ayırma/arıtma ve adacık el toplama içerir. Başarılı yalıtım fare başına 250-350 yüksek kaliteli ve tam işlevsel adacıklar verebilir.

Farelerden Pankreas Adacık İzolasyon için Basit Bir Yüksek Verimlilik Protokolü

Burada potansiyel diyabetojenik xenobiotic kimyasallar tanımlamak için xenobiotics tarafından ROS indüksiyon süzmek için fare pankreas adacık hücreleri izole etmek için bir iletişim kuralı mevcut.

Bir fare pankreas adacık hücre tabanlı tarama diyabetojenik çevresel kimyasallar için

Bu protokolde inguinal subkutan beyaz yağ dokusuna murine adacık izolasyonu ve transplantasyon yöntemi tanımlanmıştır. İzole syngeneic murine adacıkları bir murine alıcı içine bir bodrum membran hidrojel kullanılarak nakledilir. Alıcıların kan şekeri düzeyi izlenir ve adacık greftlerinin histoloji analizi yapılır.

Inguinal Subkutan Beyaz Yağ Dokusu (ISWAT) Transplantasyon Modeli Murine Adacıkları

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Bu çalışma, fare pankreasındaki fonksiyonel birincil adacıqları ve asinar hücreleri verimli bir şekilde çıkaran basitleştirilmiş bir yöntem geliştirdi ve Akut Pankreatit Kaynaklı Diyabetin patogenezinde hücrelerarası iletişimi incelemek için değerli bir araç sağladı.

Farelerden Birincil Adaçik Ve Birincil Pankreas Asinar Hücrelerinin Eşzamanlı İzolasyonu İçin Basit ve Hızlı Bir Yöntem

Bu protokol, Lewis sıçan pankreas adacıqlarının cerrahi hasamı, enzimatik sindirim ve yoğunluk gradyanlı arındırması için standartlaştırılmış bir yöntemi tanımlar; böylece doğrudan nakil veya in vitro çalışmalarda kullanılmak üzere yüksek verimli, yüksek saflıkta preparatlar sağlanır.

Lewis Farelerinden Pankreas Adacığı İzolyasyonu ve Arındırma, Enzimatik Sindirim ve Yoğunluk-Gradient Ayrımı Kullanılarak

Öğrenin, fare pankreasından Langerhans adacıklarını izole etmek için saf kolajenaz ve nötr proteaz kullanımını. Bu yöntem, yüksek verim ve optimal morfoloji sağlayarak partiler arası değişkenliği azaltır.

Langerhans İzolasyonu Fare Islet Saflaştırılmış Collagenase ve Nötr Proteaz bir kombinasyonu kullanılarak

Daha fazla video keşfet