İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Bu prosedürün genel amacı mitokondriyi izole etmek ve mitokondriyal solunum yapmaktır. Bu, ilk olarak iskelet kasının püskürtülen sıçanlardan izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra kas homojenize edilir ve mitokondri santrifüjleme ile izole edilir.

Protein konsantrasyonu daha sonra Bradford testi kullanılarak belirlenir. Son olarak, mitokondriyal solunum poligrafi ile ölçülür. Sonuç olarak, farklı mitokondriyal solunum durumları yoluyla oksijen tüketimini gösteren sonuçlar elde edilebilir.

Bu yöntem, mitokondriyal fonksiyonun farklı müdahalelerinin etkisi gibi iskelet kası alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem iskelet kası metabolizması hakkında fikir verebilse de, işleme başlamadan önce karaciğer, beyin, böbrek veya hemen hemen her doku gibi diğer organlara da uygulanabilir. İskelet kasını izole etmek için aşağıdaki çözeltileri hazırlayın, P-B-S-P-B-S artı 10 milimolar EDTA, sekiz kez mitokondri tamponu izolasyon tamponu bir veya IB bir, izolasyon tamponu iki veya IB iki ve deneysel tampon veya eb.

Talimatlar için ekteki yazılı protokole bakın. Ardından, santrifüjü açın ve dört santigrat dereceye ayarlayın. Bir su banyosunu açın ve 37 santigrat dereceye ayarlayın.

Güzel bir kovaya üç adet 10 mililitrelik beher, çömlekçi dirseği, değerli taş doku öğütücüler, küçük cerrahi makaslar ve buzun üzerine 10 mikro santrifüj tüpü koyun. Deney boyunca her şey buz gibi soğuk kalmalıdır. IB bir ve IB iki'yi ICE ve EB'yi ılık su banyosuna yerleştirin.

Daha sonra buz kabındaki üç behere aşağıdaki çözeltileri ekleyin: bir adet 10 mililitre PBS beher, iki adet 10 mililitre P-B-S-E-D-T-A beher. Üç. Üç mililitre ib. Biri, yerel kurumsal hayvan bakımı ve meyve suyu komiteniz tarafından onaylanan prosedürlere göre bir fareye ötenazi yapın.

Daha sonra 250 ila 500 miligram iskelet kasını forseps ve mayonez Kliniği makası ile hızla izole edin. Beca bir'de durulayın, ardından kası homojenize etmek için beca iki'ye aktarın. Önce üçüncü kabın içine aktarın ve son olarak makasla kıyın.

Çözeltiyi çömlekçi Elva mücevher homojenizatöre aktarın, motorlu bir havaneli kullanarak kası 10 kez homojenize edin, tüpü her zaman buzda tutun. Daha sonra, homojenatı önceden soğutulmuş iki mililitrelik mikro santrifüje, tüplere aktarın ve dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 700 Gs'de santrifüjleyin. S süpernatanı önceden dosyalanmış yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve pelet santrifüjünü atın.

10 dakika boyunca 10, 500 Gs'de S süpernatantı Dört santigrat derecede, SNAT'ı önceden doldurulmuş yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve SN one ve kas tipi Reese ile etiketleyin. Peleti 500 mikrolitre IB ikide askıya alın, daha sonra dört santigrat derecede 10 dakika boyunca 10, 500 Gs'de santrifüjleyin. Sırtı önceden doldurulmuş yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve SN iki ve kas tipi ile etiketleyin.

Son mitokondriyal peleti 100 mikrolitre IB ikide askıya alın. Birkaç saniye boyunca mini bir füje içinde döndürün. Bir pelet varsa, supinatı önceden doldurulmuş yeni bir mikro santrifüj tüpüne aktarın ve peleti atın Oksijen elektrodunun kalibrasyonu bu protokolde önemli bir adımdır ve günlük olarak yapılmalıdır.

Elektrotun kalibrasyonu mitokondriyal izolasyon sırasında tamamlanabilir. Başlamak için, 250 mililitrelik bir şişe yıldızına 20 dakika kuvvetlice 100 mililitre damıtılmış su ekleyin. Suyu atmosferik gazla dengelemek için GRAT elektrodunu birkaç damla %50 potasyum klorür ile kaplayın.

Daha sonra elektrotun üzerine küçük bir parça mavi rizla sarma kağıdı yerleştirin. Sonra bir parça PTFE membran. Haddeleme kağıdının üstünde.

Halka aplikatörünü kullanarak iç halkayı uygulayın ve ardından dış halkayı elektrot oluğuna yerleştirin. Elektrotları bağlayın ve daha büyük plastik halka tabanını, mitokondriyal odayı ve su hortumlarını monte edin. GRAT kutularını açın ve GRAS yazılımını başlatın.

Dengelenmiş suyu mitokondriyal odaya ekleyin. Ardından karıştırma çubuğunu açmak için bir karıştırma çubuğu ekleyin. Donanıma tıklayın.

Sonra bir hız karıştırın. Hızı 60'a ayarlayın ve üzerine tıklayın. Ardından, yeni bir deneye başlayın.

Kalibre et'e ve ardından sıvı faz kalibrasyonuna tıklayın. Birinci kutu için sıcaklığı 37 santigrat dereceye değiştirin ve iki kez tamam'ı tıklayın. Geçersiz kılma olarak değiştiğinde, tamam, tıklayın ve nitrojen gazı deposunu açın.

Azot tankına bağlı ucu hazneye yerleştirin ve sıfır oksijen oluşturun. Geçersiz kılmadan geçiş yaptığında Tamam'ı tıklayın. Suyu aspire edin ve mitokondriyal odalara 500 mikrolitre EB ekleyin.

Hazneyi bir pistonla kapatın. Birden fazla kutu kullanıyorsanız, her kutu için kalibrasyon adımından itibaren tekrarlayın. Yeni bir deneme başlatın ve yaklaşık bir dakika çalışmasına izin verin.

Sinyali stabilize etmek için, her odada 150 mikrograma ulaşmak için gerekli mitokondri süspansiyonu hacmini ekleyin. Olayı işaretleyin ve çalışmasına izin verin. Bir dakika boyunca, 10 mikrolitre ılık 250 milimolar glutamat, 125 milimolar malat son konsantrasyonu için beş milimolar glutamat, 2.5 milimolar malat işareti ekleyin ve bir dakika çalışmasına izin verin.

Bu, ikinci durum olarak tanımlanır. Daha sonra, 150 mikromolar nihai konsantrasyon için 7.5 mikrolitre 10 milimolar bir DP ekleyin. Ardından işaretleyin ve 30 saniye çalışmasına izin verin.

Bu, üçüncü durum olarak tanımlanır. 7,5 mikrolitre daha 10 milimolar DP işareti ekleyin ve 1,5 dakika çalışmasına izin verin. Bir mikromolar işaretin son konsantrasyonu için 0.5 mikrolitre soğuk 10 milimolar oligo misin ekleyin ve üç dakika çalışmasına izin verin.

Bu, dördüncü durum olarak tanımlanır. 0.2 mikromolar işaretli son konsantrasyon için bir mikrolitre soğuk, 0.1 milimolar FCCP ekleyin ve RUM'u üç dakika bekletin. Bu, beşinci durum olarak tanımlanır.

İşiniz bittiğinde denemeyi sonlandırın ve kaydedin. Sal yazılımını kullanarak solunum oranlarını elde edin. Normalleştirme faktörünü girin.

150 mikrogram mitokondriyal protein eklenirse, normalizasyon faktörü 0.15 olacaktır. Farklı solunum durumları için normalleştirilmiş solunum hızlarını hesaplayın. Solunum kontrol oranını veya RCR'yi, üçüncü durumu dörde bölerek hesaplayın.

Bu şekil, iskelet kası tarafından oksijen tüketiminin temsili bir şekilde izlenmesini göstermektedir. Mitokondri. Elektrot sinyali stabilize edildikten sonra, mitokondri numunesi GRAT odasına eklenir. İkinci durum, solunum glutamat ve malat ilavesiyle başlar.

A DP ilavesi oksijen tüketimini artırır. Üçüncü durumu tanımlama. Solunum: Bir TP sentazı, dördüncü durum solunumu elde etmek için bir liga misin ilavesiyle bloke edilir.

Son olarak, mitokondriyal solunumu ayırmak için FCCP eklenir. Bu diyagram 2, 3, 4 ve beşinci durumlar için temsili oksijen tüketim oranlarını gösterir. Her deney için solunum kontrol oranı veya RCR hesaplanır.

Dörtten büyük bir RCR, bu prosedürü denerken uygulanabilir bir mitokondri preparatının kanıtı olarak kabul edilir. Mitokondriyal örnekleri her zaman buzda tutmak önemlidir. Bu prosedürü takiben.

Mitokondriyal proteinlerin içeriği gibi ek soruları yanıtlamak için Western blots gibi diğer yöntemler de uygulanabilir. Bu videoyu izledikten sonra, mitokondriyal solunumun yanı sıra iskelet kasından nasıl izole edileceğini iyi anlamış olmalısınız.