Name: İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-03-30T11:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Öğrenin, iskelet kasından mitokondri izolasyonu ve solunum ölçümü yöntemini. Santrifügasyon ve Bradford assay ile fonksiyonel analiz yaparak metabolik süreçleri araştırın.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Bu çalışma, FH Andrade Ulusal Göz Enstitüsü (R01 EY12998) bir hibe ile desteklenmiştir.

1. Tamponlar hazırlanması <ol><li> Santrifüj 5804R açın ve ayarı 4 ° C 37 ° C'ye kadar Isotemp 3006D su banyosu ve set açın </li><li> Kas izolasyon önce aşağıdaki çözümleri hazırlayın: <ul><li> PBS: distile su (5 tablet / litre) fosfat tamponlu salin (PBS) tablet eritin. İyice karıştırın. </li><li> PBS artı 10 mM EDTA: 100 ml solüsyon hazırlamak için, 500 mM EDTA 2 ml, 98 ml PBS ekleyin. </li><li> 8X Mitokondri tampon: 10.28 g sakaroz nihai konsantrasyonu 0.6 M, serbest yağ asit 400 mg sığır serum final konsantrasyon% 0.8, 160 mM son bir konsantrasyon için Hepes 2.08 g, pH albumin (BSA) 50 ml distile su ile 7.4 'e ve QS. </li><li> İzolasyon Tampon 1 (IB1): 10, 0,392 için 215 mM son bir konsantrasyon için D-mannitol g, 1.25 ml 8X mitokondri tamponu, pH 7.4 ve QS 10 mM nihai konsantrasyonu 500 mM EDTA 200 ul ekle distile su ile ml. </li><li> İzolasyon Tampon 2 (IB2): 10, 0,392 için 215 mM son bir konsantrasyon için D-mannitol g, 1.25 ml 8X mitokondri tamponu, pH 7.4 ve QS 3 mM nihai konsantrasyonu 500 mM EGTA 60 ul ekle distile su ile ml. </li><li> Deneysel Buffer (EB): son bir konsantrasyon için 5 mM son bir konsantrasyon, D-mannitol 215 mM son bir konsantrasyon için 0.392 gr, 25 ul 2.5 mM KH 2 PO 4 için 500 mM MgCl 2 100 ul ekle 6.25 mcM, 20 mcM nihai konsantrasyonu 100 mM EGTA 2 ul, mitokondriyal tamponu, pH 7.4 'e ve QS 10 ml saf su ile 1.25 ml. </li></ul></li></ol> 2. Kas İzolasyon <ol><li> Bir buz kovası, üç adet 10 ml bardak, Potter-Elvehjem doku öğütücüler ve buz üzerinde aletleri / gereçleri gerekli diğer tüm koydu. Her şey deney boyunca buz kalmalıdır. </li><li> Yapılan ılık su banyosu, buz kovası ve EB IB1 ve IB2 yerleştirin. </li><li> Üç adet 10 ml bardak, aşağıdaki çözümleri eklenmesi gerekmektedir: <ul><li> Beher 1: 10 ml PBS </li><li> Beher 2: 10 ml PBS / EDTA </li><li> Beher 3: IB1 3 ml </li></ul></li><li> Insanca yerel Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Kurulu tarafından onaylanan bir sıçan öldürün. </li><li> Hızla, 250-500 mg iskelet kas izole Beher 1 durulayın, daha sonra 2 Beher aktarın. </li></ol> 3. Homojenizasyon / Mitokondrial İzolasyon <ol><li> Beher 3 kas transferi ve ince makas ile kas kıyma. </li><li> Potter-Elvehjem homojenizatör çözüm aktarın. Havaneli (her zaman buz tüpü tutarak bir motorlu matkap basın iş yapacak) 10 kez kullanarak kas homojenize. </li><li> 4 10 dakika için 700 g ° C önceden soğutulmuş 2 ml mikrosantrifüj tüpleri ve santrifüj Homojenat transfer </li><li> Supernatant yeni bir ön-soğutulmuş mikrosantrifüj tüpüne aktarın. Pelet atın. </li><li> 4 10 dakika 10.500 g supernatant Santrifüj ° C </li><li> Yeni bir ön-soğutulmuş mikrosantrifüj tüp ve etiket SN1 (süpernatantın 1 numara) ve kas tipi supernatant aktarın. </li><li> IB2, 500 ul pelet yeniden askıya. </li><li> 10.500 g 10 dakika boyunca santrifüjleyin 4 ° C </li><li> Transferi öncesi yeni bir soğuk mikrosantrifüj tüp ve etiket SN2 (süpernatantın 2) ve kas tipi supernatant. </li><li> IB2 100 ul final mitokondriyal pelet askıya alınması. </li><li> Birkaç saniye için minifuge Re-spin son mitokondriyal süspansiyon. Bir pelet varsa, yeni bir ön-soğutulmuş mikrosantrifüj tüp süpernatantı transferi ve pelet atın. </li><li> Bradford tahlil 8 kullanarak protein konsantrasyonu belirleyin. </li></ol> 4. Elektrot Kalibrasyonu NOT: mitokondriyal izolasyon sırasında Komple elektrot kalibrasyon. <ol><li> 250 ml'lik şişesi 100 ml distile su ekleyin. Atmosferik gaz ile su denge sağlaması için 20 dakika kuvvetlice karıştırın. </li><li> Oxygraph elektrot KCl% 50 birkaç damla ekleyin. </li><li> Elektrot Mavi Rizla haddeleme kağıt üstünde küçük bir parça yerleştirin. </li><li> PTFE membran bir parça kağıt inişli üstüne yerleştirin. </li><li> Iç halka halka aplikatör kullanarak uygulayın ve sonra elektrot oluk dış halkası. </li><li> Elektrotlar bağlayın ve teçhizatın geri kalanı monte: büyük plastik halka kaideli, mitokondriyal haznesi ve su hortumları. </li><li> Oxygraph kutuları açın ve Oxygraph yazılımını başlatmak. </li><li> Mitokondriyal odasına dengelenmiş su ekleyin. </li><li> Bar karıştırın ve 60 hız açmak ekleyin. </li><li> Yeni bir deneme başlayın. </li><li> Kalibre üzerine tıklayın ve ardından sıvı faz Kutu 1 kalibrasyon. 37 sıcaklık değişimi ° C ve "Tamam" iki kere tıklamanız yeterli. </li><li> "Tamam" "Override" Değişiklikleri tıklatın ve nitrojen gazı tankının açtığınızda. </li><li> Yeri ucu odasına azot tankına bağlı ve sıfır oksijen kurmak. Cgeçtiğinde, "Tamam" yalamak "geçersiz kılın." </li><li> Aspire su ve mitokondriyal odalarına EB tampon 500 ul eklemek. </li><li> Piston ile Seal odası. </li><li> Birden fazla kutularını kullanarak, tekrar Kutu 2 kalibrasyonu için 11-15 adımları. </li></ol> 5. Mitokondriyal Solunum <ol><li> Yeni bir deneme başlayın; sinyali stabilize etmek için yaklaşık 1 dakika çalışmasına izin. </li><li> Her odasında 150 mcg, mark olay için gerekli ses mitokondriyal süspansiyon (adım 3.11) ekleyin ve 1 dakika boyunca çalışmasına izin. </li><li> 10 ul 250 mM/125 sıcak mM nihai bir konsantrasyon için 5 mM/2.5 mM glutamat / malat. Mark ve 1 dakika boyunca çalışmasına izin. Bu durum 2 olarak tanımlanır. </li><li> 150 mcM, işareti nihai konsantrasyonu 10 mM ADP 7.5 ul ekleyin ve 30 saniye boyunca çalışmasına izin. Devlet 3 olarak tanımlanmıştır. </li><li> 10 mM ADP işaretini başka bir 7.5 ul ekleyin ve 1,5 dakika çalışmasına izin. </li><li> 1 mcM, işareti nihai konsantrasyonu 10 mM soğuk oligomycin 0.5 ul ekleyin ve 3 dakika boyunca çalışmasına izin. Devlet 4 olarak tanımlanır. </li><li> 1 ul soğuk 0,1 mM FCCP son bir konsantrasyon için 0.2 mcM, işareti ekleyin ve 3 dakika boyunca çalışmasına izin. Devlet 5 olarak tanımlanır. </li><li> Bittiğinde, deney sonu ve kaydetmek. </li><li> Oxygraph yazılımı kullanarak solunum oranları edinin. </li><li> Normalizasyon faktörü girin: mitokondriyal protein 150 mg eklenmesi, normalizasyon faktörü 0.15 olacaktır. </li><li> Farklı solunum devletler için normalize solunum oranları hesaplayın. </li><li> Devlet Devlet 4 3 bölerek Solunum Kontrol Oranı (RCR) hesaplayın. </li></ol> 6. Temsilcisi Sonuçlar: <img src="/files/ftp_upload/2452/2452fig1.jpg" alt="Şekil 1" data-altupdatedat="1788238805000" data-alt="Şekil 1"> Şekil 1. mitokondri iskelet kasında oksijen tüketimi dayanan bir temsilci gösterir. Elektrot sinyali stabilize edildikten sonra, mitokondri örnek Oxygraph odasına eklenir. Eyalet 2 solunum glutamat ve malat ilavesi ile başlar. ADP Toplama tanımlayan devlet 3 solunum, oksijen tüketimini artırır. ATP sentaz devlet 4 solunum almak için oligomycin ek tarafından bloke edilir. Son olarak, mitokondriyal solunum (devlet 5) birbirinden ayırmak için FCCP eklenir. Tablo 1 devletler 2, 3, 4 ve 5 temsilci oksijen tüketimi oranlarını gösterir. Her bir deney için solunum kontrolü oranı (RCR) hesaplanır. RCR ≥ 4, geçerli bir mitokondri hazırlık delil olarak kabul edilir. <table border="1"><tbody><tr><td> Devletleri </td><td> Normalize Oranları </td></tr><tr><td> Eyalet 2 </td><td> 34,74 </td></tr><tr><td> Durum 3 </td><td> 153,40 </td></tr><tr><td> Devlet 4 </td><td> 16,49 </td></tr><tr><td> Devlet 5 </td><td> 143,70 </td></tr><tr><td> RCR </td><td> 9,30 </td></tr></tbody></table> Tablo 1. Mitokondriyal solunum oranları mitokondri iskelet kas Representativeoxygen tüketim oranları. Değerler odasına mitokondri miktarı normalize edilir. Solunum kontrol oranı (RCR), 4 devlet tarafından devlet 3'e bölerek belirlenir. Bir RCR ≥ 4 yaşayabilir bir mitokondri hazırlık dönemini temsil etmektedir.

<ol><li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2, 287-295 (2007).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roles+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Roles of mitochondria in health and disease.</a> Diabetes. 53, Suppl 1. S96-S102 (2004).</li>
<li>Johannsen, D. L., Ravussin, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mitochondria+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The role of mitochondria in health and disease.</a> Curr Opin Pharmacol. , (2009).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 80, 3-44 (2007).</li>
<li>Pallotti, F., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+subfractionation+of+mitochondria+from+animal+cells+and+tissue+culture+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and subfractionation of mitochondria from animal cells and tissue culture lines.</a> Methods Cell Biol. 65, 1-35 (2001).</li>
<li>Gamboa, J. L., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+content+and+distribution+changes+specific+to+mouse+diaphragm+after+chronic+normobaric+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Regul+Integr+Comp+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial content and distribution changes specific to mouse diaphragm after chronic normobaric hypoxia.</a> Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2009).</li>
<li>Patel, S. P., Gamboa, J. L., McMullen, C. A., Rabchevsky, A., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lower+respiratory+capacity+in+extraocular+muscle+mitochondria%3A+evidence+for+intrinsic+differences+in+mitochondrial+composition+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Lower respiratory capacity in extraocular muscle mitochondria: evidence for intrinsic differences in mitochondrial composition and function.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50, 180-186 (2009).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
</ol>

Biz iskelet kaslarının canlı mitokondri izole etmek için bir protokol mevcut. Verimi bir sorun ise, protokol, 30 dakika boyunca buz PBS/10mM EDTA/0.01% tripsin 5 ml izole kas kuluçka tarafından değiştirilebilir. Tripsin ile tam bir kas sindirim sağlamak için, kas tam kıyılmış gerekir. 30 dakika inkübasyondan sonra, PBS/10mM EDTA/0.01% tripsin çözüm tamamen izolasyon tampon 1 (IB1) 3 ml ile değiştirilmesi gerekir. Buna ek olarak, tripsin, mitokondriyal solunum protokol sırasında bazı substratlar engel olabilir. Tripsin k...

<table><tbody><tr><td>%95 CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; / %5 O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; karışımı</td><td>Yerel Gaz Tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adenozin 5&amp;#8242;-difosfat sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754</td><td></td></tr><tr><td>Mavi Rizla Kağıdı</td><td>Hansatech</td><td>890101</td><td></td></tr><tr><td>Bradford protein analizi</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Karbonilsiyanid p-triflorometoksifenilhidrazon (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>Santrifüj 5804R</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sıkıştırılmış azot</td><td>Yerel Gaz Tedarikçisi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9647</td><td></td></tr><tr><td>Etilen-glikol-bis-tetraasetik asit (EGTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Etilendiamintetraasetik asit (EDTA)</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0728</td><td></td></tr><tr><td>Serbest yağ asidi sığır serum albümini</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8806</td><td></td></tr><tr><td>Glutamik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5889</td><td></td></tr><tr><td>HEPES sodyum tuzu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7006</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp 3006D</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnezyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Erkek Sprague Dawley Sıçanları</td><td>Harlan Laboratories</td><td>300-500g</td><td></td></tr><tr><td>Malik asit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9138</td><td></td></tr><tr><td>Minifüj</td><td>ISC Bioexpress</td><td>C1301P</td><td></td></tr><tr><td>Oligomisin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td>Oksijen elektrot diski</td><td>Hansatech</td><td>S1</td><td></td></tr><tr><td>Oksigraf</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oxygraph Plus V1.01 Yazılımı</td><td>Hansatech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pH-metre</td><td>Mettler Toledo</td><td>1225506149</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat tamponlu salin (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum klorür</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td>Potasyum fosfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8416</td><td></td></tr><tr><td>Potter-Elvehjem homojenizatörleri</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-414-14A</td><td></td></tr><tr><td>PTFE (0.0125mm &amp;#215; 25mm) membran</td><td>Hansatech</td><td>S4</td><td></td></tr><tr><td>SKIL 3320 sütunlu matkap</td><td>Hırdavatçı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sükroz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5016</td><td></td></tr></tbody></table>

İskelet kası mitokondrial İzolasyon

Mitochondrial Isolation from Skeletal Muscle

Mitokondri hücrenin yaşam ve ölüm kontrol organelleri. Bunlar önemli metabolik reaksiyonlarda katılmak, ATP sentezlemek ve şelaleri 2,3 sinyal sayısını düzenleyen. Geçmiş ve mevcut araştırmacılar mitokondri, karaciğer, beyin ve 4,5 kalp gibi sıçan ve fareler dokulardan izole var . Son yıllarda, birçok araştırmacı, iskelet kaslarının mitokondriyal fonksiyon eğitimi üzerine odaklanmıştır. Burada, iskelet kaslarının 6 mitokondri izolasyonu için başarılı bir şekilde kullanılan bir yöntem açıklanmaktadır. Bizim prosedür Tüm tamponları ve reaktifler taze ve iskelet kası hakkında 250-500 mg ihtiyacınız olduğunu gerektirir. Biz, sıçan ve fare gastroknemius ve diyafram izole edilen mitokondri okudu ve sıçan ekstraoküler kasları. Mitokondrial Bradford yöntemi ile protein konsantrasyonu ölçülür. Mitokondriyal numunelerin hazırlanması sırasında ve fonksiyonel çalışmalar nispeten kısa bir süre (~ 1 saat) içinde yapılmalıdır buz gibi soğuk tutulması önemlidir. Mitokondriyal solunum 37 Clark-tipi elektrot (Oxygraph sistemi) ° C arasında 7 polarografi kullanarak ölçülür. Oksijen elektrot kalibrasyonu bu protokolü önemli bir adım olduğunu ve günlük olarak yapılmalıdır. İzole mitokondri (150 mikrogram) deneysel tamponu (EB) 0,5 ml eklenir. Eyalet 2 solunum glutamat (5mM) ve malat (2.5 mM) eklenmesi ile başlar. Sonra, adenozin difosfat (ADP) (150 mcM) devletin 3 başlatmak için eklenir. Oligomycin (1 mcM), bir ATPaz sentaz bloker, 4 devlet tahmin etmek için kullanılır. Son olarak, karbonil siyanür p [trifluoromethoxy]-fenil-Hidrazon (FCCP, 0.2 mcM) 5 measurestate eklendi veya solunum 6 Kuplajsız. Solunum kontrolü oranı (RCR), devlet 4 devlet (3) oranı, her bir deney sonrası hesaplanır. Bir RCR ≥ 4, geçerli bir mitokondri hazırlık delil olarak kabul edilir. Özetle, biz, uygulanabilir mitokondrinin biyokimyasal (örneğin, enzim aktivitesi, İmmuno, proteomik) ve fonksiyonel çalışmalar (mitokondrial solunum) kullanılabilir iskelet kaslarının izolasyonu için bir yöntem mevcut.

Bu protokol, iskelet kaslarının izole edilen mitokondri solunum çalışması için bir prosedür açıklanmıştır. Bu yöntem Scorrano uyarlanmıştır<em&gt; Ve ark.</em&gt; (2007). Mitokondrial izolasyon prosedürü yaklaşık 2 saat gerektirir. Mitokondriyal solunum yaklaşık 1 saat içinde tamamlanabiliyor.

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Mitokondriler, hücrenin yaşamını ve ölümünü kontrol eden organellerdir. Temel metabolik reaksiyonlarda yer alırlar, ATP'nin çoğunu sentezlerler ve ...

Bu prosedürün genel amacı, mitokondrileri izole etmek ve mitokondriyal solunumu gerçekleştirmektir. Bu işlem, öncelikle Sprague Dawley sıçanlarından iskelet kasının izole edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından, kas homojenize edilir ve santrifüjleme yoluyla mitokondriler izole edilir.Ardından, Bradford testi kullanılarak protein konsantrasyonu belirlenir. Son olarak, mitokondriyal solunum poligrafy ile ölçülür. Nihayetinde, farklı mitokondriyal solunum durumları üzerinden oksijen tüketimini gösteren sonuçlar elde edilebilir.Bu yöntem, mitokondriyal fonksiyon üzerindeki farklı müdahalelerin etkisi gibi iskelet kası alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu yöntem iskelet kası metabolizması hakkında bilgi sağlayabilse de, karaciğer, beyin, böbrek veya hemen hemen her doku gibi diğer organlara da uygulanabilir. İşleme başlamadan önce, iskelet kasını izole etmek için şu çözeltileri hazırlayın: PBS, 10 millimolar EDTA içeren PBS, sekiz kat mitokondri izolasyon tamponu veya IB1, izolasyon tamponu iki veya IB2 ve deney tamponu veya eb.Talimatlar için ekteki yazılı protokole bakınız. Ardından, santrifüjü açın ve 4 °C'ye ayarlayın. Bir benmariyi açın ve 37 °C'ye ayarla

mitochondrial-isolation-from-skeletal-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Vastus lateralis biyopsi saflaştırılmış mitokondrinin preparasyonu ve respirometrik profil için yöntemler tarif edilmiştir. Küçük kas hacminin kullanımı klinik araştırma uygulamaları için bu teknik uygundur.

Perkütan İğne Biyopsisi ile Elde Edilen İskelet Kası Doku İzole Mitokondri hazırlanması ve Respirometrik Değerlendirmesi

Burada, daha küçük miktarlarda fare iskelet kasından yüksek kaliteli ve saflaştırılmış mitokondrinin izolasyonuna izin veren daha önce bildirilen bir yöntemin bir modifikasyonunu sunuyoruz. Bu prosedür, mikroplaka bazlı respirometirk testleri sırasında yüksek işlevle solunum yapan yüksek oranda bağlanmış mitokondri ile sonuçlanır.

Yüksek Verimli Mikroplate Solunum Ölçümler için Fare İskelet Kası Minimal Miktarları gelen Mitokondri İzolasyonu

Burada, anestezi uygulanmış bir domuzdan kuadriseps kas örneği alınır ve mitokondri diferansiyel santrifüjleme ile izole edilir. Daha sonra, mitokondriyal solunum zinciri kompleksleri I, II ve IV'ün solunum hızları, yüksek çözünürlüklü respirometri kullanılarak belirlenir.

Yüksek çözünürlüklü Solunum Ölçümleri için Diferansiyel Santrifüj tarafından İskelet Kası Bozulmamış Mitokondri izolasyonu

Mitokondri, iskelet kasında yüksek düzeyde fenotipik plastisite gösteren anahtar metabolik organellerdir. Sitozolden protein ithalatı, retikülün genişlemesi ve mitokondriyal fonksiyonun sürdürülmesi için gerekli olan organel biyogenez için kritik bir yoldur.  Bu nedenle, protein ithalatı hücresel sağlığın barometresi olarak hizmet eder.

İskelet Kas Mitokondrilerinin Protein İthalat Kapasitesinin Ölçümü

Burada, fare iskelet kasından mitokondri izolasyonu için ayrıntılı bir yöntem ve ardından mikroplaka tabanlı respirometrik testler kullanılarak Oksijen Tüketim Hızı (OCR) ile solunum analizi için ayrıntılı bir yöntem açıklanmaktadır. Bu boru hattı, çoklu çevresel veya genetik müdahalelerin mitokondriyal metabolizma üzerindeki etkilerini incelemek için uygulanabilir.

Respirometrik Testler için Fare İskelet Kasından Mitokondri İzolasyonu

Bu protokol, sadece küçük miktarlarda numune mevcut olduğunda solunum süper komplekslerinin analizi için bir tekniği tanımlar.

Küçük Doku ve Hücre Kültürü Örneklerinden Mitokondriyal Süperkompleks Analizi için Mitokondri İzolasyonu 

Mitokondri ile ilgili biyoenerjetik ve metabolomik çalışmalar, mitokondrilerin birçok hastalıkta çok yönlü rolünü ortaya koymuştur, ancak bu organeller için izolasyon yöntemleri farklılık göstermektedir. Burada ayrıntılı olarak açıklanan yöntem, yüksek kaliteli mitokondriyi birden fazla doku kaynağından saflaştırma yeteneğine sahiptir. Kalite, solunum kontrol oranları ve yüksek çözünürlüklü respirometri ile değerlendirilen diğer metriklerle belirlenir.

Kemirgen Kalp Dokusundan Sağlam Mitokondriyal İzolasyon 

Mikro-disseke eksplantlar tekniği, iskelet kas kök hücre kaynağı olarak çocuk, yetişkin ya da embriyonik kasları proliferatif iskelet kas hücreleri izole için sağlam ve güvenilir bir yöntemdir. Benzersiz, bu hücrelerin klonal in vivo nakli için kullanılan iskelet kas kök hücre hatları üretmek için türetilmiştir.

Yetişkin ve Embriyonik İskelet, Kas Microexplant Kültür ve İskelet Kası Kök Hücre İzolasyonu

Enzimatik disosiasyon, fibro / adipogenic ve fare iskelet kası miyojenik atalarıdır flow sitometri ile yüzey etiketleme ve arıtma yöntemi.

İskelet Kası progenitörlerin saflaştırılması

Canlı hücreler Mağaza çalışan Kalsiyum Giriş Floresans tabanlı Ölçümü: Kültür Kanseri Hücre gelen İskelet Kası Fiber

Öğrenin, iskelet kasından mitokondri izolasyonu ve solunum ölçümü yöntemini. Santrifügasyon ve Bradford assay ile fonksiyonel analiz yaparak metabolik süreçleri araştırın.

İskelet Kası Mitokondrial İzolasyon

Daha fazla video keşfet