In-Cloning araç setini kullanarak Modüler Klonlama (MoClo) ile Polisistronik Operonların Standartlaştırılmış Modüler Montajı

Modüler DNA montajını küçük bireysel moleküler parçalardan kromozom büyüklüğündeki yapılara kadar mümkün kılan yöntemler geliştirdim ve bu yapay kromozomlarla hücreleri yeniden programlayabildim. Alandaki önemli yeniliklerden biri, standartlaştırılmış moleküler parçalar kütüphanesinden çok genli yapıların modüler bir montajına olanak tanıyan modüler klonlama araç setlerinin geliştirilmesidir. Modüler klonlama araç setleri genellikle monosistronik transkripsiyon birimlerini klonlamak için tasarlanmıştır.

Bu protokol, polisistronik transkripsiyon birimlerinin klonlama araç setiyle birleştirilmesinin genelleştirilebilir bir yolunu gösterir. Polisistronik transkripsiyon biriminin klonlanması stratejisi, kodlama dizilerinin bireysel transkripsiyon biriminde veya polisistronik düzenlemelerde esnek şekilde kullanılmasına olanak tanır. Başlamak için, bir transkripsiyon ünitesine monte edilecek Seviye 0 parçalarını seçin.

Bunlar en az bir RBS, bir kodlama dizisi ve bir terminatör içermelidir. Transkripsiyon biriminin operonda hangi konumda monte edileceğini seçin. Seçilen konuma göre, ilgili alıcı plazmini seçin ve SnapGene'de Golden Gate montajını simüle edin.

Golden Gate reaksiyonunda, SAP1 enzimi kullanılarak ribozom bağlanma bölgesi, kodlama dizisi ve terminatörü ilgili plazmidlerden serbest bırakılır ve alıcı plazmidi kesilir. Ribozom bağlanma bölgesini, kodlama dizisini ve terminatörü kesilmiş alıcı plazmide birleştirin. Sonra, Golden Gate reaksiyonu için bir pipet kullanarak istenen her insertten 50 femtomol ve akseptör plazmidden 50 femtomol ekleyin.

Her biri 10x T4 DNA ligaz tamponu, T4 ligaz ve SAP1'den oluşan bir mikrolitre reaksiyon tüpüne aktarılır. Sonra nükleazsız su ekleyerek son hacmi 10 mikrolitre çıkarır. Tüpü bir termosiklere yerleştirin.

25 döngü boyunca 37 derece Celsius, dört dakika 16 derece Celsius ve 20 dakika 50 derece Celsius çalıştırın. Sonra enzimleri 80 derece Celsius'ta 20 dakika boyunca ısıtarak inaktive edin. İsteğe bağlı olarak, GG reaksiyonuna 0,5 mikrolitre SAP1 pipetlenin ve 37 derece Celsius'ta bir saat kuluçka yapın.

Reaksiyon karışımından beş mikrolitre kimyasal olarak yetkin E.coli hücrelerine 50 mikrolitre pipetleyin. Tüpü 42 derece Celsius'ta 30 saniye boyunca su banyosuna daldırarak ısı şoku dönüşümü yapın ve ardından tüpü iki dakika buzun üzerine koyun. Sonrasında, hücreleri bir mililitre ortamda bir saat boyunca kuluçkaya geçirerek iyileşmeye yardımcı olun.

Transformasyon çıkışının 100 mikrolitresi, mililitrede 100 mikrogram ampisilin içeren LB burgu plakasına yerleştirilir. Plakayı gece boyunca 37 derece Celsius'ta kuluçka edin. Ertesi gün, aşılama döngüsü veya pipet ucu kullanarak iki beyaz koloni seçin.

Her birini mililitrede 100 mikrogram ampisilin içeren beş mililitre LB ortamına aşılayın. Gece boyunca 37 derece Celsius sıcaklığında, dakikada 250 devirde sallanan bir kuluçka makinesinde. Üreticinin talimatlarına göre ekose ekstraksiyon yapın.

Bir mikrolitre 10x sindirim tamponu ve bir mikrolitre BBS1 ekleyerek ekstraksiyon plazma DNA'sından bir mikrogram sindirin. Nükleaz içermeyen su ekleyerek toplam hacmi 10 mikrolitre yapın ve kuluçka yapın. Şimdi sindirilmiş plazmidi %1 agaroz jeli üzerine yükleyin ve elektroforezi 100 voltta 35 dakika boyunca çalıştırın.

Sonra jelin görüntüsünü çekin ve plazmidin doğru montajını doğrulayın. Seviye M yapısını oluşturmak için, birleştirilecek Seviye 1 transkripsiyon birimlerini seçin. Golden Gate montajını, birinci ve ikinci transkripsiyon birimlerini ve uç linkeri BBS1 enzimi kullanarak serbest bırakarak simüle edin.

Aynı anda, alıcı plazmidi kesilir, ardından üç parçayı alıcı plazmid içine birleştirerek polisistronik transkripsiyon birimi oluşturur. Seviye 1 plazmid montajının negatif kontrolü, terminatör kısmı bulunmadığı için koloni vermedi; tam reaksiyon ise 292 beyaz koloni ve kırmızı koloni üretmedi. İkinci kaset olmadan 37 derece Celsius'ta çok genli yapı birleştirildiğinde sadece iki beyaz koloni elde edilirken, tam montajda dokuz büyük koloni ve 435 küçük koloni ortaya çıktı.

30 derece Celsius'ta, çoklu gen montajının negatif kontrolü dört beyaz koloni verirken, tam reaksiyon 1.500'den fazla koloni ortaya çıkardı. Alıcı plazmidi PMA60'ın BSA1 sindirimi, 5.500 baz çiftinde beklenen tek bandı verir. 24 koloniden alınan plazmidlerin BSA1 sindirimi, 24 koloniden 23'ünün yaklaşık 4.300 baz çifti ve 1.700 baz çiftinde iki bandın doğru kısıtlama desenini gösterdiğini ortaya koydu.

Floresans görüntüleme, OC6 indüktörünü içeren plakalardan alınan kolonilerde güçlü yeşil ve camgöbeği floresansı gösterdi; oysa indüktör olmayan plakalarda minimal veya hiç floresans yoktu.