Lazer Yakalama Mikrodisseksiyon - Bireysel Dopamin Nöronlar İzolasyonu ve Tüm ventral tegmental Area bir Gösteri

Bu prosedürün genel amacı, dopamin nöronlarını slaytlar üzerindeki doku bölümlerinden izole etmektir. Bu, önce donmuş ventral mezensefalon dokusunun stilize slaytlar veya kalem zarı slaytları üzerine bölünmesiyle gerçekleştirilir. Daha sonra dopamin nöronları hızlı bir floresan immünohistokimya ile etiketlenir.

Daha sonra doku kurutulur ve lazer yakalama mikroskobuna yüklenir. Daha sonra etiketli dopamin nöronları, kızılötesi lazer kullanılarak LCM başlığına bağlanır ve ilgilenilen RNA veya molekül izole edilir. Sonuçlar, lazer yakalama mikroskobu kullanılarak kantitatif PCR ölçümleri için yeterli miktar ve kalitede RNA'nın elde edilebileceğini göstermektedir.

Bu tekniğin brüt diseksiyon veya mikro yumruklar gibi mevcut yöntemlere göre ana avantajı, bireysel hücre popülasyonlarının izole edilebilmesi veya çok ayrı beyin bölgeleri olabilmesidir. RNA izolasyon daldırmasına hazırlanmak için, selin hazırlama slaytları veya polietilen metilat veya kalem membran camı dekontaminasyon çözeltisine slaytlar ve dereceli bir RNA serisi serbest etanol kullanarak üç kez yıkamak için RNA'lar serbest su kullanın, slaytları dehidre edin ve bir kriyostat ile 30 dakika vakumla kurutun, 10 mikron kalınlığında doku kesitlerini kesin ve hazırlanan RNA'lara monte edin. Serbest slaytlar, RNA kalitesini korumak için kesitleme sırasında numuneleri donmuş halde tutar.

İmmünohistokimya yapmak için bir sonraki. Dokunun ana hatlarını çizmek için hidrofobik bir kalem kullanın ve kurumaya bırakın, ardından bire bir aseton metanol çözeltisi içinde. Dokuyu 10 dakika boyunca eksi 20 santigrat derecede sabitleyin Dokuyu dondurucudan çıkardıktan sonra, bölümleri 10 dakika boyunca 100 ila 200 mikrolitre tirozin hidroksilaz antikoru NPBS ve% 1 tritton ile örtün.

Ardından, bölümleri Alexa Fluor 4 88 ile etiketlenmiş 100 ila 200 mikrolitre keçi tavşan önleyici IgG ile kaplamadan önce slaytları durulamak için% 1 tritton ile PBS kullanın, beş dakika inkübe edin ve ardından slaytları iki kez durulamak için PBS kullanın. Daha sonra, bu videoda daha önce gösterildiği gibi, numunelerin entegre edilmiş RNA serbest etanol serisini her biri 30 saniye boyunca dehidre edin. Ksilen içinde bir dakika ve bir saniye inkübe edin, beş dakika yıkayın.

LCM için kullanmadan hemen önce slaytları çıkarın ve kurumaya bırakın. LCM kapaklarını ve kızakları yükledikten ve LCM sistemini metin protokolüne göre kurduktan sonra, IR lazer yakalamayı güç için ayarlayın ve hedefleyin. Kapağı, yakalama lazeri araç çubuğundaki slaytın dokudan uzak bir bölgesine yerleştirin.

Etkinleştir'i seçin, lazerin güç darbesini ve vuruş sayısını ayarlayın. Kapak, dokusuz slaydın bir kısmının üzerindeyken IR lazeri ateşleyin ve lazerin LCM kapak zarını yeterince eritip eritmediğini kontrol edin. IR lazer yoğunluğunu ayarladıktan sonra, lazeri cline hazırlık slaytlarından bireysel dopamin nöronları üzerinde LCM gerçekleştirmeye hedeflemek için sağ tıklayın ve yakalama lazerini seçin.

Bir cline hazırlık tarafındaki tek tek hücreleri yakalamak için hücreleri yakalamak için ilgilenilen bölgeye hareket ederek başlayın. Mikrodiseksiyon araç çubuğunda, LCM sekmesini ve ardından tek nokta simgesini seçin. Daha sonra, mikroskop araç çubuğunda, floresan filtrelerle floresan ve parlak alan arasında geçiş yapmak için deklanşör sekmesini, uygun filtreleri seçmek için sekmeleri kullanın ve büyütmeyi değiştirmek için hedefler sekmelerini kullanın.

İlgilenilen hücreler canlı video penceresinde göründükten sonra, ilgilenilen hücreleri işaretlemek için kullanılan nokta boyutunu hücrelerin yaklaşık boyutuna ayarlayın. Tek nokta simgesini seçerek ve ardından hücrelere tıklayarak ilgilenilen hücreleri işaretleyin. Hücreler mikrodiseksiyon araç çubuğunda işaretlendikten sonra, git kes ve yakala sekmesini seçin ve IR lazer seçilen tüm işaretli hücrelere otomatik olarak ateşlenecektir.

Hücrelerin LCM kapağına yakalanıp yakalanmadığını kontrol etmek için kapağı bölümden uzaklaştırın ve slaydın açık bir bölgesine taşıyın. Doku toplamayı bitirdiğinizde, kapağa sağ tıklayarak ve metin protokolünde belirtildiği gibi taşı'yı seçerek kapağı hareket ettirin ve ardından boşaltın, immünohistokimya için işlenen slaydı, kalem zarındaki dokudan ilgilenilen bölgeyi seçmek için bir kılavuz olarak kullanın. Mikro diseksiyon araç çubuğunda, kes ve yakala sekmesini seçin, ardından kesim çizgisi sekmesini seçin ve immünohistokimya etiketli slaydı kılavuz olarak kullanarak, 10 x hedefi altında ilgilenilen bölgeyi ana hatlarıyla belirtin.

IR ve UV lazerlerini daha önce gösterildiği gibi test edin, ateşleyin ve hedefleyin. Bu videoda, mikrodiseksiyon araç çubuğunda, git yakala ve kes sekmesini seçin. Ardından, dokunun bölümden çıkarılıp çıkarılmadığını belirlemek için LCM kapağını dokudan çıkarın ve kapağa takın.

Kapağı çıkarmak için doku toplamayı bitirdiğinizde, kapağa sağ tıklayın ve ardından mikrografları boşaltmak için taşı'yı seçin, bu şekiller LCM'nin IR lazer veya IR ve UV lazerleri kullanarak bireysel tirozin hidroksilaz immünoreaktif dopamin nöronlarını izole edebildiğini göstermektedir, çünkü LCM kullanılarak izole edilen dokulardaki hücrelerin en yaygın kullanımı RNA analizidir. Sunulan prosedürler, RRNA 28 S zirvesinin yüksekliğinde 18 S zirvesine kıyasla nispi bir azalma ile görüldüğü gibi RNA bütünlüğünü korumak için optimize edildi, immünohistokimyadan sonra daha düşük bütünlüğe sahip LCM örneklerinde RNA kalitesi düşürüldü ve ardından tüm beyin RNA'sına kıyasla aseton fiksasyonu yapıldı. Tuzlu su preparatından ventral teal bölgeden dopamin nöronlarından L-C-M-R-N-A yoluyla elde edilen nöronlardan elde edilen RNA miktarını ölçmek için slaytlar, üretilen standart eğriye göre izole edildi, mikrolitre başına toplam 17.3, 24.8 ve 50.9 pikogram sırasıyla 5, 100 ve 200 dopamin nöronundan izole edildi.

E, RNA kalitesini ölçmek için QPCR kullanılarak, dopamin nöronlarından bir dizi tüm beyin RNA ve RNA konsantrasyonu tersine çevrildi, transkribe edildi ve beta aktin geni ölçüldü, bu ölçümlerden üç nokta 55, 6, 0.82 ve 20 nokta 58 pikogram konsantrasyonları mikrolitre başına sırasıyla 5, 100 ve 200 dopamin nöronundan hesaplandı. Bu videoyu izledikten sonra, tek tek dopamin nöronlarını izole etmek veya dopamin nöronlarının bölgelerini izole etmek için lazer yakalama mikroskobunu nasıl kullanacağınızı iyi anlamış olmalısınız.