Name: Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastomanın Roman modelleri oluşturmak için (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-02-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 58 s
Description: Öğrenin, transposon plazmid DNA enjeksiyonu ile yenidoğan farelerde glioblastoma modelleri oluşturmayı. Bu yöntem, tümör ilerlemesini biyolüminesans görüntüleme ile izleyerek nöro-onkoloji araştırmalarında kullanılır.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dr. John Ohlfest ve Dr. Stacey Decker'a13 cömert plazmid armağanı ve bu yöntemde ustalaşmak için verilen eğitim için teşekkür ederiz. Parafine gömülü bölümlerin Hematoksilen-Eozin boyama prosedürünün standardize edilmesine yardımcı olduğu için Marta Dzaman'a teşekkür ederiz. Ayrıca bu el yazmasını incelediği ve yararlı önerilerde bulunduğu için Molly Dahlgren'e teşekkür ederiz. Bu çalışma, MGC ve PRL'ye NIH/NINDS hibeleri, MCG ve PRL'ye Leah's Happy Hearts Foundation hibesi ile desteklenmektedir. Alex'in Limonata Vakfı genç Araştırmacı Ödülü ve St. Baldrick's Vakfı CK'ye bursu.

<ol><li>Weller, M., Cloughesy, T., Perry, J. R., Wick, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standards+of+care+for+treatment+of+recurrent+glioblastoma--are+we+there+yet%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Standards of care for treatment of recurrent glioblastoma--are we there yet.</a> Neuro Oncol. 15 (1), 4-27 (2013).</li>
<li>Dai, C., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma+models%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Glioma models.</a> Biochim Biophys Acta. 1551 (1), M19-M27 (2001).</li>
<li>Houchens, D. P., Ovejera, A. A., Riblet, S. M., Slagel, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+brain+tumor+xenografts+in+nude+mice+as+a+chemotherapy+model%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Human brain tumor xenografts in nude mice as a chemotherapy model.</a> Eur J Cancer Clin Oncol. 19 (6), 799-805 (1983).</li>
<li>Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma+multiforme%3A+the+terminator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma multiforme: the terminator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (12), 6242-6244 (2000).</li>
<li>Candolfi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+glioblastoma+models+in+preclinical+neuro-oncology%3A+neuropathological+characterization+and+tumor+progression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurooncol%22%5BJournal%5D)">Intracranial glioblastoma models in preclinical neuro-oncology: neuropathological characterization and tumor progression.</a> J Neurooncol. 85 (2), 133-148 (2007).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+modeling+of+gliomas+in+mice%3A+new+tools+to+tackle+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems.</a> Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).</li>
<li>Rojiani, A. M., Dorovini-Zis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glomeruloid+vascular+structures+in+glioblastoma+multiforme%3A+an+immunohistochemical+and+ultrastructural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosurg%22%5BJournal%5D)">Glomeruloid vascular structures in glioblastoma multiforme: an immunohistochemical and ultrastructural study.</a> J Neurosurg. 85 (6), 1078-1084 (1996).</li>
<li>Hambardzumyan, D., Amankulor, N. M., Helmy, K. Y., Becher, O. J., Holland, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Adult+Gliomas+Using+RCAS%2Ft-va+Technology%5BTitle%5D)+AND+%22Translational+Oncology%22%5BJournal%5D)">Modeling Adult Gliomas Using RCAS/t-va Technology.</a> Translational Oncology. 2 (2), 89-95 (2009).</li>
<li>Friedmann-Morvinski, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+of+neurons+and+astrocytes+by+oncogenes+can+induce+gliomas+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation of neurons and astrocytes by oncogenes can induce gliomas in mice.</a> Science. 338 (6110), 1080-1084 (2012).</li>
<li>Lynes, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral-Induced+High-Grade+Gliomas+in+Rats%3A+The+Effects+of+PDGFB%2C+HRAS-G12V%2C+AKT%2C+and+IDH1-R132H%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics+%3A+the+journal+of+the+American+Society+for+Experimental+NeuroTherapeutic%22%5BJournal%5D)">Lentiviral-Induced High-Grade Gliomas in Rats: The Effects of PDGFB, HRAS-G12V, AKT, and IDH1-R132H.</a> Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutic. , (2014).</li>
<li>Uhrbom, L., Hesselager, G., Nister, M., Westermark, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+brain+tumors+in+mice+using+a+recombinant+platelet-derived+growth+factor+B-chain+retrovirus%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Induction of brain tumors in mice using a recombinant platelet-derived growth factor B-chain retrovirus.</a> Cancer Res. 58 (23), 5275-5279 (1998).</li>
<li>Marumoto, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+novel+mouse+glioma+model+using+lentiviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Development of a novel mouse glioma model using lentiviral vectors.</a> Nat Med. 15 (1), 110-116 (2009).</li>
<li>Wiesner, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+induction+of+genetically+engineered+brain+tumors+in+mice+using+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">De novo induction of genetically engineered brain tumors in mice using plasmid DNA.</a> Cancer Res. 69 (2), 431-439 (2009).</li>
<li>Bailey, O. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genesis+of+the+Percival+Bailey-Cushing+classification+of+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatr+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genesis of the Percival Bailey-Cushing classification of gliomas.</a> Pediatr Neurosci. 12 (4-5), 261-265 (1985).</li>
<li>Patel, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+highlights+intratumoral+heterogeneity+in+primary+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq highlights intratumoral heterogeneity in primary glioblastoma.</a> Science. 344 (6190), 1396-1401 (2014).</li>
<li>Agnihotri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioblastoma%2C+a+brief+review+of+history%2C+molecular+genetics%2C+animal+models+and+novel+therapeutic+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Immunol+Ther+Exp+%28Warsz%29%22%5BJournal%5D)">Glioblastoma, a brief review of history, molecular genetics, animal models and novel therapeutic strategies.</a> Arch Immunol Ther Exp (Warsz). 61 (1), 25-41 (2013).</li>
<li><a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+genomic+characterization+defines+human+glioblastoma+genes+and+core+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive genomic characterization defines human glioblastoma genes and core pathways.</a> Nature. 455 (7216), 1061-1068 (2008).</li>
<li>Ivics, Z., Izsvak, Z., Minter, A., Hackett, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+functional+domains+and+evolution+of+Tc1-like+transposable+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Identification of functional domains and evolution of Tc1-like transposable elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (10), 5008-5013 (1996).</li>
<li>Ivics, Z., Hackett, P. B., Plasterk, R. H., Izsvak, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+reconstruction+of+Sleeping+Beauty%2C+a+Tc1-like+transposon+from+fish%2C+and+its+transposition+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Molecular reconstruction of Sleeping Beauty, a Tc1-like transposon from fish, and its transposition in human cells.</a> Cell. 91 (4), 501-510 (1997).</li>
<li>Hackett, P. B., Ekker, S. C., Largaespada, D. A., McIvor, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleeping+beauty+transposon-mediated+gene+therapy+for+prolonged+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">Sleeping beauty transposon-mediated gene therapy for prolonged expression.</a> Adv Genet. 54, 189-232 (2005).</li>
<li>Ammar, I., Izsvak, Z., Ivics, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Sleeping+Beauty+transposon+toolbox%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The Sleeping Beauty transposon toolbox.</a> Methods Mol Biol. 859, 229-240 (2012).</li>
<li>Mates, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+evolution+of+a+novel+hyperactive+Sleeping+Beauty+transposase+enables+robust+stable+gene+transfer+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Molecular evolution of a novel hyperactive Sleeping Beauty transposase enables robust stable gene transfer in vertebrates.</a> Nat Genet. 41 (6), 753-761 (2009).</li>
<li>Koso, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon+mutagenesis+identifies+genes+that+transform+neural+stem+cells+into+glioma-initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Transposon mutagenesis identifies genes that transform neural stem cells into glioma-initiating cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (44), E2998-E3007 (2012).</li>
<li>Fujita, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COX-2+blockade+suppresses+gliomagenesis+by+inhibiting+myeloid-derived+suppressor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">COX-2 blockade suppresses gliomagenesis by inhibiting myeloid-derived suppressor cells.</a> Cancer Research. 71 (7), 2664-2674 (2011).</li>
<li>Geurts, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+genomes+of+human+cells+by+the+sleeping+beauty+transposon+system%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%3A+The+Journal+Of+The+American+Society+Of+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into genomes of human cells by the sleeping beauty transposon system.</a> Molecular Therapy: The Journal Of The American Society Of Gene Therapy. 8 (1), 108-117 (2003).</li>
<li>Dickins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+tumor+phenotypes+using+stable+and+regulated+synthetic+microRNA+precursors%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Probing tumor phenotypes using stable and regulated synthetic microRNA precursors.</a> Nat Genet. 37 (11), 1289-1295 (2005).</li>
<li>Liu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+with+double+markers+reveals+tumor+cell+of+origin+in+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma.</a> Cell. 146 (2), 209-221 (2011).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Bu makalede, biz detay yenidoğan farelerin subventriküler bölgesini çevreleyen hücrelerin içine onkojenik plazmid DNA SB transposase- aracılı entegrasyon kullanarak GBM yeni modeller üretmek için çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem. Biz yeni ilgi genleri ile Transposon plasmidlerini oluşturmak için bir protokol mevcut, canlı hayvanlarda tümörlerin ilerlemesini izlemek için nasıl, bu tümörlerin histopatolojik ve immunohistokimyasal özellikleri karakterize nasıl göstermektedir. Laboratuarı...

Cerrahi, radyasyon tedavisi, kemoterapi ve 1 ile tedavi edildiklerinde glioblastoma multiforme (GBM) 15-21 aylık bir medyan sağkalım, erişkinlerde en sık (% 60) primer beyin tümörü olduğunu. GBM için yeni tedaviler zorunludur. Deneysel tedaviler yeterince insan hastalığının belirgin özelliklerini yeniden hayvan modellerinde test gerektirir. Kemirgenler glioma hücre hatları 2 kullanılarak kimyasal alkilleyici ajanlarla mutagenezini, mikrop hattı veya somatik genetik değişiklikler, ya nakli dahil Stratejiler GBM ikna etmek. En yaygın olarak kullanılan model, beyin içine veya deri altına aynı genotipe sahip hayvanlarda singeneik hücreleri kullanılarak, ya da ortotopikal, glioma hücre hatlarının implantasyonu kullanır; veya ksenojenik hücreler, bağışıklık implante en yaygın insan GBM hücre çizgileri, fare 3 ele geçirildi. Ksenogratflardır intrakranial tümörlerin çalışma için birçok avantaj sunuyoruz: tekrarlanabilirlik kolaylık, Standardized büyüme oranları, ölüm ve tümör lokalizasyonu zamanı. Sözde pallisading nekroz, nükleer atypias, yaygın işgali, mikro-vasküler proliferasyon: implantasyonu ve doğru histolojik yeniden sınırlı yeteneği için kullanılan yapay, invaziv cerrahi yaklaşım insan GBM (WHO Evre IV) karakteristik özellikleri nedeniyle Ancak, bu modeller sınırlamaları var ve glomerüloid vasküler oluşumu 4-7 anormallikler. Onkojenik DNA ile, ya viral vektörlerin 8-12 veya transpozon-aracılı entegrasyon 13 ile somatik hücre genomu değiştirerek GBM İndüksiyon, daha yakından insan hastalığı etyolojisi üretir ve insan GBM histopatolojik özellikleri tartışıldı. Tarihsel, MSS tümörleri sınıflandırılmış gözlendi kökenli algılanan hücreye dayalı olan, hayatta kalma 14 açısından belirleyici bir faktör olacaktır. GBMs birincil ve ikincil olarak sınıflandırılır. Gelişen kanıtlar today birincil glioblastoma 15 derece heterojen doğasına işaret. İkincil GBM (% 15), düşük dereceli astrositom (WHO grade I) ve anaplasic astrositomların malign transformasyon sonucu (WHO grade II), hastalığın erken başlaması, daha iyi prognoz ve gen ifadesinin bir &quot;proneural&quot; modeli ile ilişkili olan primer GBM (% 85) ise geç başlangıçlı, kötü prognoz ve glial (klasik), sinirsel ya da mezenkimal ifade kalıplarını göstermektedir. Gen ifadesinin bu kalıplar tümörün köken gerçek hücre ile ilişkili olsun hala aktif araştırılmaktadır. Veri Biriken GBM&#39;lerde ile ilişkili genetik mutasyonlar kombinasyonu yaşam için öngörü olduğunu göstermektedir. Örneğin, kromozom 1p / 19q, IDH1 mutasyonları, PDGFRα amplifikasyonlar, bir heterozygocity kaybı (LOH) EGFR ekspresyonu, Notch ve Sonic kirpi yolu aktivasyonu, Nf ise, ikincil GBM&#39;lerde, proneural ifade desen ve daha iyi prognoz ile ilişkili1 ve PTEN kaybı ve p53 mutasyonları nöral, klasik, ya da mezenkimal birincil GBM ve kötü prognoz 16,17 ile ilişkilidir. Büyük ölçekli projelerin sıralama gelişi ve test için kullanılabilir sayısız hasta örneklerinin birikimi GBM patogenezinde ve ilerlemesinde ve tedaviler özellikle uygun olabilir bireyselleştirilmiş tıp, olasılığı karıştığı genetik mutasyonlar ve yollar ile ilgili yeni bilgi hazinesi getiriyor Hastanın genetik anormallikler. Sonuçta, sistematik bir şekilde bu mutasyonların ve yolların öngörü değerini değerlendirmek için, ve her durumda olası tedaviler test etmek için, önceden belirlenmiş genetik değişikliklerle GBM hayvan modelleri gerektirmektedir. Genomik DNA transpozon aracılı entegrasyon uygun bir yaklaşım sunmaktadır. Sleeping Beauty transpozon sistemi, transposonların Tc1 / denizci sınıfının üyesi, bir çok adım prosedürü içinde (inşa) &quot;uyanmış&quot; olduatıl fazla 10 milyon yıl önce 18,19 oldu bir salmonoid transposaz geni, site özel mutajenez ss. Özünde, belirli dizileri (ters tekrarlar / doğrudan tekrarlar: IR / DR) tarafından çevrili DNA transposonlar Sleeping Beauty transpozazın faaliyet vasıtasıyla &quot;kes ve yapıştır&quot; şekilde genomuna entegre edilebilir. transposaz, IR siteleri uçlarını tanır transpozonun excises ve bazlar, T ve A, transpozisyon (Şekil 1a) sırasında transpozonun her sonunda çoğaltılır bazlar arasında başka bir DNA siteye rastgele bütünleştirir. Uyku Güzellik transposaz üç alanda, bir transpozon bağlama alanı, bir nükleer lokalizasyon dizisi ve katalitik bir etki oluşturmaktadır. Dört transposaz moleküllerin bir araya transpozonun iki ucunu getirmek ve aktarılması için izin transpozazın çok molekülleri mevcut olan, ancak, bunlar dimerize ve önlenmesi için tetramerize gerekmektedirtranspozisyon reaksiyonu 20. Verimli bir transpozisyon reaksiyon transposonların için transpozazın optimal oranı gerektirir. Transposaz kodlayan DNA (cis olarak) transposon aynı plazmid veya (trans) farklı bir plazmid üzerinde temin edilebilir. Transpozaz ve transpozonlar arasında optimal oranı sağlamak için, yeterli bir etkinliğe sahip bir promotörü ((&quot;cis&quot; modeli için) transpozazın ifadesi ya da optimize edilebilir, enjeksiyon çözeltisi içinde plasmidlerin oranı seçilebilir &quot;Trans&quot; modeli). Sleeping Beauty Transpozon sistemi fonksiyonel genomik ekleme mütajenezi, transgenesis ve somatik gen terapisi 21 başarıyla kullanılabilir. Sentetik yapı, bir atıl salmonoid varyantı fonksiyonel molekül için yeniden tasarlanmış olan uyku güzellik transposaz, insanlarda ve diğer memelilerde 20 diğer transpozonlar bağlanmaz. Keşfedilmesinden bu yana, moleküler mühendislik donanımlrn vardıred IR dizileri ve TATA dinükleotidleri, transpozonun yan pT2 transposonların sonuçlanan eklenmesiyle değişiklikler yoluyla SB transpozonu sisteminin aktarılması etkinliği. Bu transposonlar IR sitesine SB bağlama optimize edilmiş ve eksizyon etkinliğini artırmıştır. SB transposaz da önemli bir gelişme göstermiştir; Burada sunulan Deneylerde kullanılan transposaz SB100X, memeli hücrelerinde 22 büyük çaplı bir genetik ekranından sonra bir DNA karıştırma stratejisi tarafından üretilen bir hiperaktif transposaz olup. Bu yazıda yenidoğan farelerin 23 alt-ventriküler bölgenin hücrelerine plazmid DNA viral olmayan, transpozon-aracılı entegrasyonu ile farelerde iç GBM ikna etmek için hızlı, çok yönlü ve tekrarlanabilir bir yöntem sunuyoruz. Biz Sleeping Beauty transposase kullanarak genomik entegrasyon için mükellef yeni genlerle transpozonlar oluşturmak ve plazmid alımını izlemek için nasıl göstermek için basit bir yol sunmak veışıldaması kullanarak hastalığın ilerlemesi. Biz de bu model ile yeniden GBM histolojik ve immunohistokimyasal özellikleri karakterize. Buna ek olarak, bu tümörler birincil GBM hücre hatları oluşturmak için hızlı bir yöntem sunulmaktadır. Tümörler hayvan orijinal hücrelerden kaynaklı olduğu Sleeping Beauty modeli, indüksiyon ve tümörlerin gelişiminde aday GBM genlerin rolü fonksiyonel değerlendirilmesini sağlar. Bu sistem, aynı zamanda, yerel mikro-değiştirebilir invaziv enflamatuar cerrahi prosedürlerin gerek olmaksızın, bağışıklık-kompetan farelerde bağışıklık terapisi de dahil olmak üzere, yeni GBM tedaviler, test edilmesi için uygundur.

<table><tbody><tr><td>Stoelting'in Sıçan ve Fare Adaptörlü Laboratuvar Standardı</td><td>Stoelting</td><td>51670</td><td>Diğer şirketler de benzer çerçeveler üretiyor, bunlardan herhangi biri küçük fare adaptörlerine sahip&nbsp;</td></tr><tr><td>Özetin Özeti Stereotaksik Enjektör (QSI)</td><td>Stoelting</td><td>53311</td><td>Enjeksiyonlar onsuz yapılabilir, ,ama&nbsp; &nbsp; &nbsp; otomatik enjektör daha fazla tekrarlanabilirlik ve rahatlık sağlar</td></tr><tr><td>10 & mu; l 700 serisi elle takılan MİKROLİTE şırınga</td><td>Hamilton</td><td>Model 701</td><td>Bu şırınga modeli, 0,5 ila 500 ul çözeltiyi güvenilir bir şekilde teslim edecektir. Diğer sistemler (fro örnek 5 ul, Model 75) ayrıca</td></tr><tr><td>30 gauge hipodermik iğne (1.25", 15o eğimi) de kullanılabilir;</td><td>Hamilton</td><td>S/O# 197462</td><td>Bu iğne, diğer invaziv prosedürlere ihtiyaç duymadan yenidoğan bir farenin derisini ve kafatasını delmek için idealdir. Donuklaşırsa (cilde kolayca girmezse), değiştirilmesi gerekir.</td></tr><tr><td>in vivo-jetPEI</td><td>Polyplus Transfeksiyon</td><td>201-10G</td><td>Aliquot küçük hacimlerde ve -20 oC&nbsp'de tutun;</td></tr><tr><td>D-Luciferin, Potasyum Tuzu</td><td>Goldbio.com</td><td>LuckK-1g</td><td>Diğer ateşböceği lusifierase kaynakları da aynı derecede yeterlidir</td></tr><tr><td>Hematoksilen Çözeltisi, Harris Modifiye</td><td>Sigma Aldrich</td><td>HHS128-4L</td><td></td></tr><tr><td>Doku-Tek OCT Bileşik Elektron</td><td>Mikroskobu Bilimleri</td><td>62550-01</td><td>Kriyoseksiyon ve immünohistohemistri için beyinleri gömmek için</td></tr><tr><td>Gelişmiş DMEM/F-12, glutamin yok</td><td>Hayat Teknolojiler</td><td>12634-010</td><td>Nörosfer kültürü için</td></tr><tr><td>B-27&uml; Takviye (50X), serumsuz&nbsp;</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17504-044</td><td>Nörosfer kültürü için serumsuz takviye</td></tr><tr><td>N2 Takviyesi (100x)</td><td>Yaşam Teknolojileri</td><td>17502-048</td><td>Nörosfer kültürü için serum içermeyen takviye</td></tr><tr><td>Normocyn</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-1</td><td>Nörosfer kültürü için anti-mikoplazma ajanı</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan EGF</td><td>PEPROTECH</td><td>AF-100-15</td><td>Kültür için büyüme faktörü takviyesi&nbsp; nöroküreler</td></tr><tr><td>Rekombinant İnsan FGF-temel</td><td>PEPROTECH</td><td>100-18B</td><td>Nörokürelerin kültürü için büyüme faktörü takviyesi&nbsp<</td></tr>td colspan="4">[header]HyClone HyQTase&nbsp;<tr></td></tr><tr><td> Hücre Ayırma Reaktifi&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>SV3003001</td><td>Nörosferlerin ayrışması için</td></tr><tr><td>Kimble-Chase Kontes Pelet Havaneli</td><td>Fisher Scientific</td><td>K749510-0590</td><td>Yeni diseke edilmiş tümörlerin ayrışması için</td></tr><tr><td>Falcon Hücre Süzgeçleri ağ boyutu 70 um</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td>Ayrışmış nörosferlerin tek hücreli süspansiyonlarını oluşturmak için</td></tr><tr><td>Ksilenler Histolojik sınıf</td><td>Fisher Scientific</td><td>C8H10</td><td></td></tr><tr><td>Protokolü Harris Hematoksilen Cıva içermez (asitleştirilmiş)</td><td>Fisher Scientific</td><td>245-678</td><td></td></tr><tr><td>Protokolü Eosyn Y Çözeltisi (yoğunlaştırılmış)</td><td>Fisher Scientific</td><td>314-631</td><td></td></tr></tbody></table>

yenidoğan fareler subventricular bölgesi içine plazmid dna transpozon aracılı entegrasyon glioblastoma&#39;nın roman modelleri oluşturmak için

Transposon Mediated Integration of Plasmid DNA into the Subventricular Zone of Neonatal Mice to Generate Novel Models of Glioblastoma

Erişkinlerde en sık görülen primer beyin tümörü olan insan glioblastomlarının (GBM) patogenezine ve ilerlemesine yeni genlerin katkısını test etmek için acil bir ihtiyaç vardır. Yeni potansiyel tedaviler hızla tezgahtan ortaya çıkıyor ve insan hastalığının göze çarpan özelliklerini yakından yeniden üreten deneysel modellerde sistematik testler gerektiriyor. Burada, plazmit DNA'nın yenidoğan farelerin subventriküler bölgesinin hücrelerine transpozon aracılı entegrasyonu ile yeni GBM modellerini indüklemek için bir yöntemi ayrıntılı olarak açıklıyoruz. Uyuyan Güzel transpozon sistemini kullanarak genomik entegrasyona uygun yeni transpozonları klonlamanın basit bir yolunu sunuyoruz ve biyolüminesans, histoloji ve immüno-histokimya kullanarak plazmit alımının ve hastalık ilerlemesinin nasıl izleneceğini gösteriyoruz. Ayrıca yeni birincil GBM hücre hatları oluşturmak için bir yöntem de açıklıyoruz. İdeal olarak, bu rapor, Uyuyan Güzel transpozon sisteminin beyin tümörü araştırmacıları arasında daha fazla yayılmasına izin vererek, GBM patogenezi ve ilerlemesinin derinlemesine anlaşılmasına ve hastalar için etkili tedavilerin zamanında tasarlanmasına ve test edilmesine yol açacaktır.

SB-kaynaklı glioblastomlar histo-patolojik özellikleri karakterize etmek için, C57 / BL6 fareleri, neonatal plazmidler onkojenik DNA, örneğin, NRAS (Pt / CAGGS ile transpozonlar kodlayan ile kombinasyon halinde bir plazmid kodlayan lusiferaz (pT2 / SB100x-Luc) ile P1 enjekte edilmiştir -NRASV12) SV40 LGT (PT / CMVSV40-LGT) (Şekil 3c) veya PDGFβ ile kısa saç tokası p53 ve NRAS (Şekil 3d ile kombinasyon halinde bir GFP raportör (pT2shp53 / GFP4 / mPDGFβ) kodlayan bir plazmid). Ha...

Burada, yenidoğan farelerin ventriküllerine enjekte edilen transpozon DNA'yı kullanarak yeni glioblastomları (GBM) indüklemek, izlemek ve analiz etmek için verimli ve çok yönlü bir protokolü açıklıyoruz. Plazmidi alan subventriküler bölgenin hücreleri, insan GBM'sinin histo-patolojik özelliklerine sahip tümörleri dönüştürür, çoğalır ve oluşturur.

Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastoma&#39;nın Roman modelleri oluşturmak için

An urgent need exists to test the contribution of new genes to the pathogenesis and progression of human glioblastomas (GBM), the most common primary ...

Bu prosedürün amacı, farelerde spesifik genetik mutasyonlar taşıyan glioblastoma oluşumunu tetikleyerek glioblastomalar için yeni modeller oluşturmak ve nihayetinde yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmektir. Bu işlem, öncelikle ilgilenilen spesifik genleri kodlayan transpozon plazmitleri oluşturularak gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, plazmitlerin bir transfeksiyon reaktifi ile hazırlanması ve yenidoğan farelerin lateral ventrikülüne enjekte edilmesidir.Tümör ilerlemesindeki tutulum daha sonra lüminesans ile izlenir. Hayvan sayısı arttığında, histolojik ve immünohistokimyasal analizler için sakrifiye edilirler. Böylece, vahşi tip veya hedeflenmiş genetik arka planlarda, spesifik genetik değişikliklere sahip yeni glioblastomlar indüklenir.Bu tümörler in vivo olarak çalışılabilir veya kemoterapötik ajanlar kullanılarak biyokimyasal analizlere ve sitotoksisite deneylerine uygun yeni hücre hatları oluşturmak için in vitro olarak kullanılabilir. Bu tekniğin, örneğin glioblastoma hücre hattının ortotopik enjeksiyonları gibi diğer yöntemlere göre temel avantajı, tümörlerin, çok spesifik olarak seçilmiş genetik değişiklikler kullanılarak, immünokompetan bir hayvana endojen hücrelerin malign transformasyonu ile indüklenmesidir. Bu süreç, insan hastalığının etiyolojisini daha yakındanle taklit eder ve insan GBM'nin belirgin histopatolojik özelliklerini yeniden ortaya koyar.Bu yöntem, yetişkinlerdeki klasik, ön-nöral, nöral veya pediatrik tümörler gibi farklı glioblastoma multiforme türlerini tetikleyen sürücü mutasyonların neler olduğu gibi nöro-onkoloji alanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, yeni kemoterapötiklerin, radyasyon immün terapilerin veya bunların kombinasyonlarının bu model kullanılarak in vivo veya in vitro ortamda nispeten hızlı bir şekilde test edilebilmesi sayesinde GBM tedavisini kapsamaktadır.Bu yöntemle ilgili ilk fikri, onkogenlerin konak genomik DNA'sına entegrasyonunu sağlayan ve tümör baskılayıcı genlerin inhibitörü olan sleeping beauty transpozarını kullanarak ilk beyin tümörü modelini geliştirmiş olan Minnesota Üniversitesi'ndeki meslektaşım Dr. John ile görüştüğümde edindim. Bu metodolojinin, yeni mutasyonların tümör progresyonu üzerindeki etkisini incelemek ve beyin kanseri için hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmak adına çok güçlü olacağını düşündüm. Deneyden üç ila dört hafta önce, çevre zenginleştirmek ve çiftleşme şansını artırmak için renkli plastik bir iglo içeren, bir erkek ve bir dişiden oluşan bir fare üretme kafesi hazırlayın. Gebelik onaylandıktan sonra erkeği ayırın ve çiftleşme gününden 18 gün sonra dişiyi doğum için izlemeye başlayın.Doğum zamanı civarında bir taşıyıcı annenin hazır olduğundan emin olun. Doğumdan sonraki birinci günde, intraventriküler enjeksiyonları gerçekleştirin. Enjeksiyon solüsyonunu, önce plazmidler üzerindeki transposazı içeren, final konsantrasyonu 0,5 µg DNA/µL olan DNA karışımından 20 µL alarak hazırlayın.Ardından, DNA çözeltisine 20 µL PEI çözeltisi alikotu ekleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika ile bir saat arasında inkübe edin; sonrasında karışım buz üzerinde saklanmalıdır. Enjeksiyon iğnesi için, 10 µL'lik bir şırıngayı 12,5 derece eğimli 30 gauge'lik bir hipodermik iğneye takın. Daha sonra şırıngayı, otomatik enjeksiyon özellikli bir mikro pompaya bağlayın.Sistemi 10 µL su ile test edin ve şırınganın boşaldığından emin olun. Şimdi, neonatal stereotaxic sahneyi kuru buz ve alkol karışımı ile soğutun. Sıcaklık 2 ile 8 °C arasına düştüğündele enjeksiyonlara geçin.Öncelikle bir yavruyu iki dakika boyunca buz üzerinde tutarak anestezi uygulayın. Yavru buz üzerindeyken, şırıngayı enjeksiyon çözeltisiyle doldurun. Anestezi sonrası yavruyu çerçeveye aktarın ve başını gazlı bezle kaplı kulak barlarının arasına sabitleyerek immobilize edin.Kafatası dorsal tarafının yatay olduğundan ve çerçeve yüzeyine paralel olduğundan emin olun. Ayrıca, kranial sütürler net bir şekilde görülmelidir. Yavru farenin başı yeterince sıkı bir şekilde sabitlenmemişse, enjeksiyon sırasında hareket edecektir.Kafanın çerçeve kulak çubukları arasında çok sıkı sıkıştırılması durumunda lambda görünmeyecek ve kafa içindeki basınç, enjekte edilen solüsyonun dışarı sızmasına neden olacaktır. Yavru çerçeve ile sıkıca kavranmışken, başı %70 etanol ile silin, ardından iğneyi indirerek lambda ile temas edecek şekilde konumunu ayarlayın. Daha sonra iğneyi kaldırın ve 0,8 milimetre lateralde ve 1,5 milimetre tally yönünde hareket ettirin. Ardından, deriyi hafifçe çukurlaştırana kadar iğneyi tekrar indirin.Bu pozisyonun koordinatlarını kaydedin. Ardından iğneyi cilt ve kafatası boyunca 1,5 milimetre aşağı indirerek lateral ventrikül düzeyindeki kortekse ulaştırın. 90 saniye boyunca 0,75 mikrolitre enjekte edin ve çözeltinin yayılması için bir dakika bekleyin.Enjekte edilecek bir sonraki yavru anestezi altına alınabilir. Tartım işleminden sonra iğneyi yavaşça kaldırın, ardından yavruyu bir ısıtma lambası altındaki iyileşme alanına taşıyın. Anesteziden ısıtma işlemine kadar geçen süre 10 dakikadan az olmalıdır.Solunumu ne kadar hızlı izlenirse o kadar iyidir; gerekirse, solunumu uyarmak için ekstremiteleri nazikçe ovun. Yavru ısındığında, rengi pembeleştiğinde ve solunumu düzene girdiğinde onu annesine geri verin. Bu süreç genellikle enjeksiyondan itibaren beş ila yedi dakika sürer.Birden fazla yavruya enjeksiyon yapıldıysa, herhangi birini anneye geri vermeden önce tüm yavruların kendine gelmesi beklenmelidir. Yarım saat sonra tüm yavrular henüz hazır değilse, yarısını anneye geri verin ve geri kalanları prosedürün sonunda daha sonra teslim edin, anneyi gözlemleyin. Yavrular geri verildikten sonra.Eğer yavrulara karşı tepkisizse, yedek anneyi kafese ekleyin. Enjeksiyondan 24 ila 72 saat sonra plazmit alımını izleyin ve tüm yavruları, her kuyucuğa bir yavru gelecek şekilde altı kuyucuklu doku kültürü plakalarına aktarın. Ardından, bir mililitrelik bir şırıngayı salin veya PBS içinde 30 mg/mL Lucifer ile doldurun ve 30 gauge'lik bir hipodermik iğne takın.Yavruların zarar görmesini önlemek için, her bir yavrunun kürek kemikleri arasına, derinin küçük bir kıvrımı altına 30 µL çözelti deri altına enjekte edin. Yavruları derhal bir in vivo biyolüminesans görüntüleme sistemine aktarın. Otomatik pozlama, yüksek binning (benning) ve bir diyafram açıklığı ile birer dakika aralıklarla dört ardışık görüntü elde etmek için bir sekans ayarlayın.Yaklaşık 17 gün sonra, hayvanlarda biyolüminesans ve histoloji ile tespit edilebilen makroskobik tümörler oluşmaya başlayabilir. Tümörlerin izlenmesi altı haftaya kadar sürebilir. 26 gauge bir iğne ile intraperitonal olarak 100 µL Luciferian çözeltisi enjekte edin.Üç dakika sonra, hayvanları bir ISO florin oksijen anestezi odasında anesteziye alın ve hayvanları, ISO florini dağıtmak için konilerle donatılmış görüntüleme odasına yerleştirin. Otomatik pozlama süresi, orta derece binning ve bir olan açık diyafram F-stop değeri ile iki dakikalık aralıklarla altı görüntüden oluşan bir seri elde edin. İlgi alanı tipik olarak baş üzerinde oval bir bölgedir; SB kaynaklı glioblastomların histopatolojik özelliklerini karakterize etmek için her bir hayvanda aynı ayarları kullanarak lüminesans yoğunluğunu ölçün.C 57 black six neonatal farelere, P 1 aşamasında, onkogenik DNA içeren Inod transpozonları ile birlikte NRA S ve SV 40 large T plazmidleri ile lusiferaz kodlayan bir plazmid enjekte edildi. Alternatif olarak, NRAS ile birlikte PDGF beta ile kısa saç tokası P 53 kodlayan bir plazmid ve bir GFP raporlayıcı enjekte edildi. Perivasküler ve beyne yaygın infiltrasyonla birlikte psödopalizat nekroz belirgindi.Parankimal glioblastomlar da biyolüminesans ile izlendi. Hayvanlar genellikle tümör yüküne bağlı olarak öldüler. Lüminesans, 10⁷ ile 10⁹ kalibre edilmiş birim arasında bir yoğunluğa ulaştığında.Hayvanların medyan sağkalım süresi, neonatal beyne enjekte edilen onkojenik transpozon kombinasyonlarına bağlı olarak öngörüldüğü şekilde değişmiştir. En agresif tümörler NRS ve SV 40 large T antijeni ile indüklenmiş olup, de novo tümörler karakteristik moleküllerin ekspresyonu ile tanımlanmıştır. SHP 53 ve nras ile indüklenen ve GFP eksprese eden yeni tümörler, nöral kök hücre markeri neston eksprese etmiş ve bazıları ayrıca glio fibriler asidik protein eksprese etmiştir.56 gün sonra, etrafı çok sayıda GFAP pozitif astrositlerle çevrili bir tümör tespit edilmiştir. Bu tümör hücreleri nestin eksprese etmiş ancak GFAP eksprese etmemiştir. Bu videoyu izledikten sonra, yenidoğan farelere intraventriküler enjeksiyonlar yoluyla spesifik genetik mutasyonlar içeren glioblastom oluşumunun nasıl indükleneceği ve hastalığın ilerleyişinin biyolüminesans ile nasıl izleneceği konusunda kapsamlı bir bilgi edinmiş olmalısınız.Bu makalede, ilgi duyulan genleri kodlayan yeni trans pro plazmidlerin nasıl kolayca klonlanacağı, ayrıca tümörlerin nasıl izleneceği ve histoloji ile immünohistokimya ile nasıl analiz edileceği hakkında ayrıntılar bulacaksınız. Ek olarak, genetik olarak mühendislik uygulanmış tümörlere sahip hayvanlardan yeni glioblastoma hücre hatlarının nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir yöntem bulacaksınız. Bu makalenin, bu yıkıcı insan hastalığına yönelik yeni tedavilerin keşfini hızlandırmaya yardımcı olacağını umuyoruz.

transposon-mediated-integration-plasmid-dna-into-subventricular-zone

Research

JoVE Journal

Medicine

Tıp

Bu videoda, yenidoğan farelerin ventriküllerine enjekte edilen transpozon DNA'yı kullanarak glioblastomları (GBM) indüklemek için etkili bir teknik açıklanmaktadır. Plazmidi alan subventriküler bölgenin hücreleri, insan GBM'sinin histopatolojik özelliklerine sahip tümörleri dönüştürür, çoğalır ve oluşturur.

SB Aracılı Transpozisyon Kullanılarak Glioblastoma İndüksiyonu: SB Plazmidinin Yenidoğan Fare Beynine Transpozon Aracılı Entegrasyonu Kullanılarak Yeni Fare Modeli Oluşturmak İçin Bir Teknik

Neuroblast göç postnatal nörojenezindeki temel bir olaydır. Biz akut beyin dilimleri zaman atlamalı görüntüleme kullanarak in vivo doğum sonrası elektroporasyon ve onların göç sonraki görselleştirme tarafından neuroblasts verimli etiketleme için bir protokol açıklar. Biz video izleme tarafından neuroblast dinamiklerinin kantitatif analiz için bir açıklama içerir.

Fare Akut Beyin Dilimleri Neuroblast Göç vivo Doğum Sonrası Elektroporasyonla ve Time-lapse Görüntüleme

Biz, tümörün büyüme sırasında oynayan normal biyo-fiziksel kısıtlamalar tekrarıdır intravital iki foton mikroskopi için farelerde kortikal glioblastoma ortotopik bir model oluşturduk. Tümörün yukarıdaki kafatasını yerine bir kronik cam pencere, iki-foton mikroskobu ile zamanla tümörün ilerlemesinin takibini sağlar.

Ortotopik Glioblastoma Fare Modeli Beyin parankim fiziksel kısıtlamaları bakımı ve Intravital İki foton Mikroskopi için uygundur

Bu prosedür, in utero elektroporasyon yoluyla gelişmekte olan fare ön beynindeki internöronların nasıl hedefleneceğini gösterir. Bu teknik, korteksin yüzeysel katmanlarına yönelik internöron alt tiplerinde seçici gen ekspresyonu elde etmek için özellikle etkiliydi.

Kortikal internöronlar alt tip-selektif Elektroporasyon

Burada, adeno-ilişkili virüsün yenidoğan fare beynine intraventriküler enjeksiyonu ile yaygın nöronal transdüksiyon için bir teknik gösteriyoruz.  Bu yöntem, viral olarak verilen transgenlerin yaşam boyu ekspresyonunu elde etmek için hızlı ve kolay bir yol sağlar.

Kalıcı ve yaygın Nöronal İletim için Yenidoğan Fare Beyin intraserooroventriküler Viral Enjeksiyon

Erken beyin tümörü mikro giren bağışıklık hücrelerinin sayısının ve aktivasyon durumu ile ilgili zamana bağlı nicel verileri verir glioma-infiltre periferik kan mononükleer hücrelerinin izolasyonu ve akım sitometri analizi için bir basit bir yöntem burada sunulmuştur.

İzolasyon ve Glioma-sızmakta periferik kan mononükleer hücrelerinin Akışı Sitometrik Analizi

Gen beyinde hücre-otonom fonksiyonları kaybı inducing tarafından okudu ya da seyrek nüfus hücre işlevinin kazanmak. Burada, rahim içinde elektroporasyon Cre recombinase işlev içinde vivokaybına neden için floxed genler ile kortikal nöronlar geliştirme seyrek nüfus sunmak için açıklamak.

CRE-lox rekombinasyon fare serebral korteks rahim içinde elektroporasyon ile inducing

Lazer mikrodisesi ( LMD) glioma heterojenite ve invazyon aracılık yolları ortaya çıkarmak için kullanılabilecek hassas ve son derece tekrarlanabilir bir tekniktir. Burada lazer LMD kullanarak glioma dokusundan ayrık alanları izole etmek ve ardından transkripsiyonanalizi yapmak için optimize edilmiş bir protokol tanımlıyoruz.

İntratümöral Heterojenite, Oncostreams ve Invasion'ın Mekansal ve Moleküler Karakterizasyonu için Glioma Alt Bölgelerinin Lazer Yakalama Mikrodizması

Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA'nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.

Hasta Mutasyon İmzalarını Temsil Eden Plazmid DNA'nın Elektroporasyona Dayalı İletimi Kullanılarak Beyin Tümörlerinin İn Vivo Modellenmesi

Sepsis bir mikrobik enfeksiyon sonucu ortaya çıkan bir sistemik inflamatuvar yanıt sendromu ifade eder ve çekal ligasyon ve delme (CLP) diye adlandırdıkları bir cerrahi teknik ile simüle edilebilir. Burada tedavi ajanları için şifalı otlar taranması amacıyla CLP bağlı hayvan modelinde kullanılacak bir yöntem açıklanmaktadır.

Roman Bitkisel Tedaviler Değerlendirmek için Sepsis Hayvan Modeli kullanımı

Öğrenin, transposon plazmid DNA enjeksiyonu ile yenidoğan farelerde glioblastoma modelleri oluşturmayı. Bu yöntem, tümör ilerlemesini biyolüminesans görüntüleme ile izleyerek nöro-onkoloji araştırmalarında kullanılır.

Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastomanın Roman modelleri oluşturmak için (Video) | JoVE Journal

Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastoma'nın Roman modelleri oluşturmak için

Daha fazla video keşfet