Yenidoğan Fareler subventricular Bölgesi içine Plazmid DNA Transpozon Aracılı Entegrasyon Glioblastoma'nın Roman modelleri oluşturmak için

Bu prosedürün amacı, glioblastomlar için yeni modeller oluşturmak ve nihayetinde farelerde spesifik genetik mutasyonları barındıran glioblastomların oluşumunu indükleyerek yeni terapötik yaklaşımlar geliştirmektir. Bu, önce ilgilenilen spesifik genleri kodlayan transpozon plazmitleri oluşturarak gerçekleştirilir. Sonraki adımlar, plazmitleri bir transfeksiyon reaktifi ile hazırlamak ve bunları yenidoğan farelerin lateral ventrikülüne enjekte etmektir.

Tümör ilerlemesindeki tutulum daha sonra lüminesans ile izlenir. Hayvanlar daha bol hale geldiğinde, histolojik ve immünohistokimyasal analizler için kurban edilirler. Bu nedenle, spesifik genetik değişikliklere sahip yeni glioblastomlar, vahşi tip veya hedeflenen genetik arka planlarda indüklenir.

Bu tümörler in vivo olarak incelenebilir veya kemoterapötik ajanlar kullanılarak biyokimyasal analiz ve sitotoksisite deneylerine uygun yeni hücre hatları oluşturmak için in vitro olarak kullanılabilir. Bu tekniğin, örneğin glioblastoma hücre hattının ortotopik enjeksiyonları gibi diğer yöntemlere göre ana avantajı, tümörlerin, çok özel olarak seçilmiş genetik değişiklikler kullanılarak bir immünokompetan hayvana endojen hücrelerin malign dönüşümü ile indüklenmesidir. Bu süreç, insan hastalığının etiyolojisini daha yakından yeniden üretir ve insan GBM'sinin belirgin histopatolojik özelliklerini özetler.

Bu yöntem, yetişkinlerde veya pediatrik tümörlerde farklı glioblastoma multiforme, klasik, pre nöral, nöral chy tiplerini indüklemekten sorumlu sürücü mutasyonların neler olduğu gibi nöro-onkoloji alanındaki kilit soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin etkileri, yeni kemoterapötiklerden beri GPM tedavisine kadar uzanır. Radyasyon bağışıklık tedavileri veya bunların bir kombinasyonu, bu model kullanılarak in vivo veya in vitro olarak nispeten hızlı bir şekilde test edilebilir.

Bu yöntem için ilk fikri, Minnesota Üniversitesi'ndeki meslektaşım Dr. John ile tartıştığımda, uyuyan güzelin transpoze aracılı onkogenlerin entegrasyonunu, tümör baskılayıcı genlerin bir inhibitörünü konakçı genomik DNA'ya dönüştüren ilk beyin tümörü modelini geliştirdiğini tartıştığımda aklıma geldi. Bu metodolojinin, tümör ilerlemesindeki yeni mutasyonların etkisini incelemek ve beyin kanseri için hedefe yönelik tedavilerin geliştirilmesine yardımcı olmak için çok güçlü olacağını düşündüm: Deneyden üç ila dört hafta önce, bir erkek ve bir dişi ile bir fare yetiştirme kafesi kurun, çevreyi zenginleştirmek ve çiftleşme şansını artırmak için renkli bir plastik iglo ekleyin. Hamilelik onaylandıktan sonra erkeği çıkarın ve çiftleşme gününden 18 gün sonra dişiyi doğum için izlemeye başlayın.

Doğum sırasında bir taşıyıcı annenin hazır olduğundan emin olun. Doğum sonrası ilk gün, intraventriküler enjeksiyonları gerçekleştirin. Enjeksiyon çözeltisini önce Ali'ye ekleyerek, mikrolitre başına 0.5 mikrogram DNA'lık bir nihai konsantrasyonda plazmitler üzerindeki transpoze içeren DNA karışımından 20 mikrolitre alıntı yaparak hazırlayın.

Daha sonra, DNA çözeltisine 20 mikrolitrelik bir PEI çözeltisi alikotunda ve oda sıcaklığında 20 dakika ila bir saat arasında inkübe etmelerine izin verin, ardından karışım buz üzerinde saklanmalıdır. Enjeksiyon iğnesi için, 12,5 derecede eğimli 30 gauge hipodermik iğneye 10 mikrolitrelik bir şırınga takın. Ardından şırıngayı otomatik enjeksiyonlu bir mikro pompaya takın.

Kurulumu 10 mikrolitre su ile test edin ve şırıngayı boşalttığınızdan emin olun. Şimdi, yenidoğan stereotaksik aşamasını bir kuru buz ve alkol bulamacı ile soğutun. İki ila sekiz santigrat dereceye kadar soğutulduğunda, enjeksiyonlara devam edin.

İlk olarak, bir yavruyu iki dakika boyunca buzun üzerine koyarak uyuşturun. Yavru buz üzerindeyken, şırıngaya enjeksiyon solüsyonu yükleyin. Anestezi uygulandıktan sonra, yavruyu çerçeveye aktarın ve başını gazlı bezle kaplı kulak çubukları arasında hareketsiz hale getirin.

Kafatasının sırt tarafının yatay ve çerçeve yüzeyine paralel olduğunu kontrol edin. Ayrıca, kraniyal sütürler açıkça görülebilir olmalıdır. Yavrunun başı yeterince sıkı bir şekilde hareketsiz hale getirilmezse, enjeksiyon sırasında hareket edecektir.

Oysa çerçevenin kulak çubukları arasına çok sıkı bir şekilde sıkılırsa, lambda görünmeyecek ve kafa içindeki basınç enjekte edilen çözeltiyi dışarı sızmaya zorlayacaktır Yavru çerçeve tarafından sıkıca kavrandığında, kafayı %70 etanol ile silin, ardından iğneyi indirin ve konumunu lambda ile temas edecek şekilde ayarlayın. Ardından, iğneyi kaldırın ve yanal olarak 0,8 milimetre ve toplamda 1,5 milimetre hareket ettirin. Ardından cildi hafifçe çukurlaştırana kadar tekrar indirin.

Bu konumun koordinatlarını kaydedin. Daha sonra iğneyi deriden ve kafatasından 1,5 milimetre aşağı indirin ve oradaki lateral ventriküldeki kortekse indirin. 90 saniye boyunca 0,75 mikrolitre enjekte edin ve beklerken çözeltinin dağılması için bir dakika bekleyin.

Enjekte edilecek bir sonraki yavru uyuşturulabilir. Ağırlıktan sonra iğneyi yavaşça kaldırın, ardından yavruyu bir ısıtma lambasının altındaki bir kurtarma konumuna aktarın. Anesteziden ısınmaya kadar geçen süre 10 dakikadan az olmalıdır.

Ne kadar hızlı olursa, solunumu o kadar iyi izler ve gerekirse nefes almayı teşvik etmek için uzuvları hafifçe ovalayın. Yavru ısındığında, pembe bir renge ve sabit bir nefese sahip olduğunda, annesine geri verin. Bu genellikle enjeksiyondan beş ila yedi dakika sürer.

Birkaç yavru enjekte edilirse, herhangi biri anneye geri dönmeden önce hepsi kurtarılmalıdır. Yarım saat sonra tüm yavrular hazır değilse, yarısını ona geri verin ve geri kalanını işlemin sonunda daha sonra geri koyun, barajı izleyin. Yavruları geri getirdikten sonra.

Yavrulara cevap vermiyorsa, taşıyıcı anneyi kafese ekleyin. Enjeksiyondan 24 ila 72 saat sonra, plazmid alımını izleyin ve tüm yavruları kuyucuk başına bir yavru olmak üzere altı kuyu doku kültürü kabına aktarın. Daha sonra salin veya PBS'ye mililitre başına 30 miligram Lucifer içeren bir mililitrelik bir şırınga yükleyin ve 30 gauge hipodermik iğne takın.

Yavruya zarar vermemek için her yavrunun omuz bıçakları arasına deri altından 30 mikrolitre solüsyon enjekte edin, solüsyonu küçük bir deri kıvrımının altına enjekte edin. Yavruları hemen bir in vivo biyolüminesans görüntüleme sistemine aktarın. Otomatik pozlama, büyük benning ve bir diyafram açıklığı ile bir dakikalık aralıklarla dört ardışık görüntü elde etmek için bir dizi ayarlayın. Sonra.

Yaklaşık 17 gün sonra, hayvanlar biyolüminesans ve histoloji ile tespit edilebilen makroskopik tümörler oluşturmaya başlayabilir. Tümörlerin izlenmesi de altı hafta kadar sürebilir. 26 gauge iğne ile intraperitoneal 100 mikrolitre Luciferian solüsyonu enjekte edin.

Üç dakika sonra, hayvanları bir ISO flor oksijen anestezi odasında uyuşturun ve hayvanları ISO florunu dağıtmak için konilerle donatılmış görüntüleme odasına yerleştirin. Otomatik pozlama süresi, orta gruplama ve bir açık diyafram F-stop'u ile iki dakikalık aralıklarla altı görüntüden oluşan bir seri elde edin. İlgilenilen bölge tipik olarak başın üzerinde bir ovaldir, SB'nin neden olduğu glioblastomların histopatolojik özelliklerini karakterize etmek için aynı ayarları kullanarak her hayvanda lüminesans yoğunluğunu ölçtü.

C 57 siyah altı yenidoğan faresi, onkojenik DNA'lı NRA, S ve SV 40 büyük T plazmitleri, Inod transpozonları ile kombinasyon halinde bir plazmit ve kaplama lusiferaz ile P bir'e enjekte edildi. Alternatif olarak, PDGF beta ile kısa bir saç tokası P 53'ü kodlayan bir plazmit ve NRAS ile kombinasyon halinde bir GFP raportörü enjekte edildi. Psödopalis nekrozu, perivasküler ve beyne yaygın olduğu gibi belirgindi.

Parankima glioblastomları da biyolüminesans ile izlendi. Hayvanlar genellikle tümör yüküne yenik düşerler. Lüminesans 10 ila yedinci ila 10 ila dokuzuncu kalibre edilmiş birimler arasında bir yoğunluğa ulaştığında.

Hayvanların medyan sağkalımı, tahmin edilebileceği gibi, yenidoğan beynine enjekte edilen onkojenik transpozonların kombinasyonlarına bağlıydı. En agresif tümörler NRS ile indüklendi ve SV 40 büyük T antijeni de novo tümörler karakteristik moleküllerin ekspresyonu ile karakterize edildi. SHP 53 ve nras ile indüklenen GFP'yi eksprese etmek için yapılan yeni ortaya çıkan tümörler nöral kök hücre markörü nestonunu eksprese etti ve bazıları da glio fibriler asidik proteini eksprese etti.

56 gün sonra, çok sayıda GFAP pozitif astrosit ile çevrili bir tümör bulundu. Bu tümör hücreleri nein eksprese edildi, ancak GFAP'ı ifade etmedi. Bu videoyu izledikten sonra, yenidoğan farelere intraventriküler enjeksiyonlar yoluyla spesifik genetik mutasyonları barındıran glioblastom oluşumunu nasıl indükleyeceğinizi ve biyolüminesans ile hastalığın ilerlemesini nasıl izleyeceğinizi iyi anlamış olmalısınız.

Makalede, yeni trans pro plazmidin nasıl kolayca klonlanacağı, ilgilenilen genlerin nasıl kodlanacağı ve ayrıca tümörlerin nasıl izleneceği ve histoloji ve immünohistokimya ile nasıl analiz edileceği ile ilgili ayrıntıları bulacaksınız. Ek olarak, genetik mühendislik tümörleri olan hayvanlardan yeni glioblastoma hücre hatlarının nasıl oluşturulacağına dair ayrıntılı bir yöntem bulacaksınız. Bu makalenin, bu yıkıcı insan hastalığı için yeni tedavilerin keşfedilmesini hızlandırmaya yardımcı olacağını umuyoruz.