Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Bu prosedürün genel amacı, mikro sütunlara sahip bir mikroakışkan cihazda bakteri flamalarının oluşumunu göstermektir. Bu, önce mikroakışkan çipin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, test edilen bakterileri kültürlemektir, bu durumda pseudomonas floresansı.

Son adımlar, deney düzeneğini bir araya getirmek, bakterileri mikroakışkan çipe enjekte etmek ve veri toplamaktır. Sonuç olarak, sonuçlar, grip floresan mikroskobu görüntüleri aracılığıyla flamaların zaman evrimini gösterebilir. Farklı adımların öğrenilmesi zor olduğu için bu metalin görsel gösterimi çok önemlidir.

Deneyin disiplinler arası doğası nedeniyle, bu prosedür, derin reaktif iyon aşındırma özelliğine sahip silikon gofretler gerektirir. Gofretlerin üzerindeki fotorezist yıkanmalıdır. Ana kalıbı sessiz ile başlayın.

Bir şişeye iki veya üç damla trikloroetilen ekleyin ve kalıp tasarımı yukarı bakacak şekilde bir kuruya koyun. İki veya üç saat içinde kalıp silolaşacaktır. Silolama sırasında, PDMS karışım purosu 1 8 4 silikon tabanını 10'a bir oranında bir kürleme maddesi ile hazırlayın.

Daha sonra PDMS'yi yaklaşık iki saat boyunca bir vakum altında gazdan arındırın. Şimdi silolanmış bir gofreti bir tutucuya aktarın ve PDMS'yi üzerine dökün, kabarcık oluşmadığından emin olun. PDMS'nin gofret üzerinde iki saat boyunca 80 santigrat derecede kürlenmesine izin verin.

Bu, boyutlandırılmış silikon kalıptan A-P-D-M-S damgasını üretir. Kürleme tamamlandığında, bir kesici yardımıyla PDMS damgasını soyun. Ardından kesiciyi kullanarak damgayı mikroakışkan bir çip halinde kesin.

Şimdi, bir kesme çekirdeği kullanarak damga üzerindeki giriş ve çıkış konumlarında delikler açın. Bir sonraki adım, damgayı cama yapıştırmaktır. 24 milimetrelik bir kapak kaymasını ve PDMS damgasını 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın.

Pozlamadan sonra, kapak fişini PDMS damgasının alt tarafına takın ve bir bağ oluşacaktır. Düzeneği 10 dakika boyunca 70 derecelik bir fırına koyun. Bu protokolün işlemini tamamlamak için, ultra saf su ile yapılan ve 50 ila 55 santigrat derecede eklenen mililitre tetrasiklin başına 50 mikrogram ile dozlanan LB plakalarını hazırlayın.

Plakaları dökerken, kabarcıklar alevlendirilerek patlatılabilir. Soğutulmuş ve katılaşmış plakalar tarihlendirilmeli ve bir folyo folyo sargısında dört santigrat derecede saklanmalıdır. Ayrıca ultra saf su ile yapılan ve mililitre tetrasiklin başına 50 mikrogram ile dozlanan LB suyu hazırladınız.

Et suyunu dört santigrat derecede saklayın ve ayrıca folyoya sarın. Şimdi, LB plakaları üzerinde eksi 80 santigrat derecede depolanan pseudomonas floresan kültür stokları, plakaları zikzak şeklinde çizin ve karanlıkta 30 santigrat derecede gece boyunca inkübe edin. Ertesi gün, plakadan bir koloni seçin ve 150 RPM çalkalama ile 30 santigrat derecede gece boyunca inkübe edilmiş taze hazırlanmış bir S şişesi aşılayın.

İnkübasyondan sonra kültürün optik yoğunluğunu ölçün. Ardından S iki çözümünü yapın. Plastik bir tüpe beş mililitre LB ekleyin ve daha sonra bir biyofilm deneyi için tipik olan 600 nanometre 0.1'de bir OD için yeterli miktarda S bir çözelti ekleyin.

İlk olarak, deneyi cımbız kullanarak kurun İç çapı 0,20 inç olan plastik tüpleri hazırlanan çipin giriş ve çıkışlarına bağlayın. Tüpler esnek ve yeterince uzun olmalıdır. İşte onlar yaklaşık 20 inç.

Ardından şırıngaları S iki solüsyonu ile doldurun. 30 gauge körelmiş iğneleri takın ve kabarcıkları çıkarın. Hava kabarcıklarının kanala girmesini önlemek, özellikle deneyin hat süresi nedeniyle kritik bir adımdır.

Kabarcıklar bakterilerin oluşturduğu yumuşak yapılara zarar verebilir. Ardından şırıngaları giriş tüplerine bağlayın ve çıkış tüplerini atık konteynerlerine bağlayın. Şimdi şırıngaları bir şırınga pompasına yerleştirin ve pompayı, inkübasyon sıcaklığına ayarlanmış bir hücre odası ile donatılmış bir mikroskopta saatte sekiz mikrolitre gibi istenen akış hızına ayarlayın.

Belki de mikroakışkan çipi görüntülemek için 40 x objektif kullanın. Şimdi pompayı çalıştırın. Bakteriler odaya verildiğinde biyofilm oluşumu da başlar.

Biyofilm saatlerce, günlerce oluşacak ve olgunlaşacak, ilerlemesini izlemek için görüntüler çekecektir. SEMA kullanılarak fabrikasyon mikroakışkan çip görüntülendi. Çatal benzeri giriş, cihaz boyunca basınç kafasını eşitlemek için oluşturulmuştur.

Sütun duvarlarının neredeyse dikey olduğu da görülebilir. Biyofilm oluşumunu incelemek için cihaza saatte sekiz mikrolitre pf floresan enjekte edildi. Seyreltilmiş bakteri kültürünün birkaç dakika infüzyonundan sonra biyofilm oluşumu başladı.

Bununla birlikte, birkaç saat sonra, orta bölüme yakın bir yerde mikro sütunlar arasında uzanan ipliksi yapıların ortaya çıktığı gözlendi. Kesikli elips, mikro sütunlardan birinin kutup bölgesine bir ucunda bağlı olarak oluşturulmuş bir flama oluşturan flamaları sınırlar. Flamalar ayrıca iki mikro sütun arasındaki diyagonal boyunca da görüldü.

Flamalar kalınlığı, hücre bölünmesinin yanı sıra planktonik bakterilerin dahil edilmesi nedeniyle zamanla artmıştır. Ayrıca, cihazda büyük bir hacim kaplayan zaman flamalarıyla çoğaldılar ve cihazı tıkayabilecek olgun biyofilm oluşumuna yol açtılar. Cihazdaki akışın mekanik bir simülasyonu, flamaların başlangıçta kendilerini akışkan akış hatları boyunca yönlendirdiğini gösterir.

Ayrıca, ilk aşamada, flamalar en yüksek akış hızına sahip konumlardan kaynaklanır. Bu videoyu izledikten sonra, biyofilm flamalarının mikroakışkan bir ortamda nasıl oluştuğunu ve geliştiğini iyi anlamış olmalısınız. Bakterilerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu işlemi gerçekleştirirken her zaman biyogüvenlik protokolleri gibi önlemlerin alınması gerektiğini unutmayın.