Name: Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-08-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 19 s
Description: Öğrenin, mikro-ayaklı mikroakışkan cihazda Pseudomonas fluorescens ile biyofilm oluşumunu ve bakteri akıntılarının zaman içinde gelişimini. Bu yöntem, gözenekli ortamdaki mikrobiyal davranışları incelemek için değerlidir.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar, bakteri suşlarını sağladığı için Calgary Üniversitesi Biyolojik Bilimler Bölümü'nden Profesör Howard Ceri'ye teşekkür eder. A. Kumar, NSERC'den gelen desteği kabul ediyor. T. Thundat, Kanada Mükemmeliyet Araştırma Kürsüsü (CERC) programından mali destek aldığını kabul ediyor. Yazarlar ayrıca videografi konusunda yardım için Bayan Zahra Nikakhtari'nin yardımına teşekkür etmek isterler.

Aşağıda tarif edilen sırayla burada deney protokolleri gerçekleştirir. Mikroakışkan platform oluşturmak için mikroimalat protokoller 1. Adım 2 bakteri kültürü protokolü (Şekil 2) açıklar ve Adım 3 deney düzeneği (Şekil 3) montaj ilgilidir Adım tartışılmıştır. Son olarak, gerçek deneysel bir süreç Aşama 4&#39;te tarif edilmektedir. 1. Chip Fabrikasyon Prosedürü NOT: Özgün güvenlik prosedürleri aşağıda açıklanan işlemleri için takip edilmelidir. Ayrıntılar için kurumsal güvenlik görevlisine danışın. <ol><li> Uygun bir yazılım (örneğin, L-Edit) ile maske tasarlayın. Kanal tasarımı genişliği 625 mikron, bir ana mikro-kanal oluşur. Kanalın merkez bölge çapında 50 mikron, (Ek Dosyaları bak) birbirinden 25 mikron aralıklı mikro mesajların bir dizi içerir. </li><li> Camına bu tasarım yazdır (5 &quot;x 5&quot; soda kireç camı), &quot;0.09 bir kalınlığa sahiptir ve bir fotoğraf maske hazırlamak için maskeleme ile, krom (Cr), yaklaşık 70 nm kalınlığında bir tabaka ile kaplanmıştır. Kullanımlar AZ400K geliştirici 1 dakika boyunca edilmektedir. Sonra Cr pürüzlendirici kullanarak Cr katman etch yaklaşık 1 dakika boyunca karşı ve soğuk pirana çözeltisi ile temizleyin şerit aseton kullanın. (H 2 SO 4 ve H 3 2 oranında O 2: 1). </li><li> Fotolitografi <ol><li> 20 dakika boyunca piranha çözümü ile kimyasal bir standart 4 &quot;silikon gofret temizleyin. </li><li> DI su ile durulayın gofret ve kurulayın. </li><li> Sıcak bir levha (15 dakika 200 ° C) gofretin ısıtın. </li><li> Kaplayın Fotorezist ile silikon gofret. Burada, pozitif fotorezist AZ4620 12.5 mikron kalınlığında bir tabaka elde edilmesi için 25 saniye boyunca 2000 rpm&#39;de bir silikon gofret üzerinde yan kaplanmıştır. </li><li> 100 ° C de azot akımı ile 90 saniye boyunca gofretin yüzen sıcak bir plaka üzerinde, ince bisküvinin tüm yumuşak pişirme çözücüyü çıkarın. Daha sonra, t vakumda tutun60 saniye boyunca o aynı sıcaklığı. </li><li> Dehidrasyon için 24 saat için karanlık bir kutu içinde gofret yerleştirin. </li><li> Fotorezist için tasarlanmış desen transfer etmek için UV ışığına gofret Açığa. </li><li> 240 sn Fotorezist geliştirici solüsyon (AZ400K) olarak gofret daldırın. Daha sonra, izopropil alkol ile gofret yıkayın ve bir azot gazı akımı içinde yerleştirerek kurutun. </li></ol></li><li> ICP-DRIE (ICP - Derin Reaktif İyon Dağlama) Süreci <ol><li> DRIE aşındırma uygulayın. Cihaz için gerekli nihai derinliği (bu soruşturmada 50 mikron) göre uygun rölyef derinliği seçin. Fotorezist Bu işlem sırasında, bir maskeleme tabakası olarak görev yapar. </li><li> Aseton ile kalan photoresist&#39;i çıkarın ve gofret temizleyin. </li></ol></li><li> PDMS (polidimetilsiloksan) Döküm <ol><li> Silikon ana kalıp Silanizing için trichloromethylsilane (TCMS) kullanın. Bir cam şişede trichloromethylsilane 2 veya 3 damla dökün ve yanında bir desikatör içine yerleştirinsilikon ana kalıp. Silanizing işleminin tamamlanması için 2-3 saat izin verin. </li><li> PDMS hazırlamak için 1: Ayrı bir kapta, 10, ağırlıkça oranı ile sertleştirme maddesi ile Sylgard 184 silikon taban karıştırın. Koşulları (yaklaşık 2 saat), vakum tabi tutarak PDMS gaz boşaltılır. </li><li> , Bir taşıyıcı içinde silikon ana kalıp koyun. Daha sonra PDMS damga oluşturulması için silikon ana kalıp üzerindeki PDMS dökün. Kabarcıklar bu süreçte PDMS formu etmediğinden emin olun. </li><li> 80 ° C&#39;de 2 saat boyunca PDMS Cure. </li><li> Peel ana kalıp PDMS damga kapalı. Ardından, PDMS ayrı mikroçip içine damga kesti. Son olarak, giriş (ler) ile çıkış (lar) için delikler kesme çekirdek kullanın. </li></ol></li><li> Glass PDMS yapıştırılması <ol><li> 30 saniye boyunca oksijen plazma kapak kayma ve PDMS damga Açığa. Kapak kayma Bond PDMS damgası. </li><li> PDMS damga ve kapak kayma arasında düzgün bir sızdırmazlık elde etmek için, 10 dakika boyunca 70 ° C &#39;de fırında koyarak cihazı tavlanması. </li&gt; </ol></li></ol> 2. Bakteriyel Kültür NOT: Özgün biyogüvenlik protokolleri Adımlar 2-4 takip edilmelidir. Ayrıntılar için kurumsal güvenlik görevlisine danışın. <ol><li> LB agar kaplarının üzerine hazırlanması <ol><li> 1 L&#39;lik bir şişeye, 20 g Luria-Bertani (LB) agar (Miller) tozları ve ultra saf su 500 ml ilave edilir. Tozu eritmek için karıştırın. </li><li> 15 psi, 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklavda tutarak sterilize edin. </li><li> Şişe, bir tezgah veya biyo-güvenlik başlığı içinde bir su banyosu içerisinde 50-55 ° C&#39;ye kadar soğumasına izin verin. </li><li> 50 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyona ulaşmak için antibiyotik tetrasiklin ekleyin. Dönen ile iyice karıştırın. </li><li> Plakalar içine dökün. Tam 2/3 - 1/2 kadar her plaka doldurun. </li><li> Alev hava bunların oluşturdukları takdirde onları pop kısaca kabarcıklar. Katılaşmış hava kabarcıkları üzerinde bakteri kültürünü yaymak için zordur. </li><li> Plakalar, oda sıcaklığında gece boyunca soğumaya bırakın. </li><li> Serin olduğunda,, kendi kovan geri tabak koymak 4 ° C&#39;de çanta, etiket (antibiyotik ve tarih), ve mağaza mühür. NOT: çok ışık antibiyotikler devre dışı bırakır gibi, kalay folyo ile plakaların stok örtün. </li></ol></li><li> LB suyu hazırlama <ol><li> 20 gr Luria-Bertani (LB) suyu (Miller) tozları ve bir şişeye 1 ultra saf su ilave edin. Tozu eritmek için karıştırın. </li><li> 15 psi, 15 dakika boyunca 121 ° C&#39;de otoklavda tutarak sterilize edin. </li><li> Şişe bir bankta ya da biyogüvenlik kaput bir su banyosunda 50-55 ° C&#39;ye kadar soğumasını bekleyin. </li><li> 50 ug / ml &#39;lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için antibiyotik tetrasiklin ekleyin. Dönen ile iyice karıştırın. </li><li> Soğuyunca, 4 ° C&#39;de etiketli şişe yerleştirin. NOT: çok ışık antibiyotikler devre dışı bırakır gibi, kalay folyo ile şişeyi örtün. </li></ol></li><li> LB Agar Plate Kültür Bakteri (Bu protokolü kullanan Pseudomonas fluorescens&#39;den) <ol><li> (Dondurucu -80 ° bakteriyel stok atınC) ve buz üzerine yerleştirin. </li><li> -80 ° C bakteri stok ve biyogüvenlik kaput içinde bir LB agar plaka yerleştirin. </li><li> Şerit bir zik ​​zak usul içinde, LB agar plakası üzerinde bakteri suşu. Agar plaka örtün ve gece boyunca 30 ° C&#39;de inkübe. Son olarak, 4 ° C&#39;de buzdolabında plaka saklayın. </li></ol></li><li> Bakteriyel Çözüm hazırlayın (S1) <ol><li> Bir Otoklavlanmış balona 50 ml LB suyu ortamı dökün. Bir biyogüvenlik kaput içinde bu işlemi gerçekleştirin. </li><li> Şişeye LB agar plaka tek bir bakteri koloni aktarın. Bu işlem, aynı zamanda biyo-güvenlik kaput içinde yapılmalıdır. </li><li> 30 ° C ve yeterli bir süre (4 saat) boyunca 150 rpm&#39;de bir gece boyunca kuluçkaya yatırılmaktadırlar şişeyi koyun. </li></ol></li><li> Bakteriyel seyreltin Solüsyonu (S2) hazırlanması <ol><li> Steril bir plastik tübe 5 mi LB suyu ortamı dökün. </li><li> LB suyu medya ile karıştırılarak S1 sulandırmak. Daha sonra, çözelti vorteks. Çözelti, istenen optik elde seyreltinarkadaşları yoğunluk (OD 600 nm = 0.1 ölçülen). NOT: Biyofilm deneyler genellikle bu civarda OD değerleri kullanır. </li></ol></li></ol> 3. Deneysel Setup hazırlayın <ol><li> Cımbız mikroçip girişine (ler) ve çıkış (lar) içine esnek plastik borular (0.20 &quot;kimliği) bağlayın. Girişleri ve çıkışları daha önce mikroçip (adım 1.5.5) PDMS kısmına açılmıştır. Bu araştırmada , mikroçip iki giriş ve bir çıkış içerir. </li><li> Bakteri çözeltisi (S2 çözeltisi) şırınga (ler) doldurun ve şırınga (ler) tüm kabarcıklar çıkarın. </li><li> Giriş borusu (ler) içine şırınga ucu (ler) (30 G 0.5 &quot;künt iğne) bağlayın. Ardından, konteyner atık çıkış tüp (ler) bağlayın. </li></ol> 4. Deney çalıştırın <ol><li> Şırınga ucunun (ler) için bir enjektör (ler) takın. </li><li> Şırınga pompası üzerine yerleştirin ve düzeltme şırınga (ler). Daha sonra desir objektifinde sahip bir optik mikroskop altında yer mikroçiped büyütme (örneğin, 40X). Bakteri üremesi (P. 30 ° C fluorescens&#39;in) için sabit bir sıcaklık ortamı korumak için canlı bir hücre odası cihazı ile mikroçip örtün. </li><li> Istenen akış hızı seviyeye pompayı (diyelim ki 10 ul / saat) olarak ayarlayın ve akışkan pompalama başlatmak. </li><li> Bakteriler haznesine sonra, biyofilm oluşumu da başlatılır. Biyofilm oluşumu ve olgunlaşma tipik olarak birkaç saat ya da günlük bir süre içinde meydana gelir. Gözlemleyin ve mikroskop aracılığıyla biyofilm büyüme görüntüleri çekmek. </li></ol>

<ol><li>Valiei, A., Kumar, A., Mukherjee, P. P., Liu, Y., Thundat, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+web+of+streamers%3A+biofilm+formation+in+a+porous+microfluidic+device%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A web of streamers: biofilm formation in a porous microfluidic device.</a> Lab Chip. 12, 5133-5137 (2012).</li>
<li>Costerton, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+Biofilms%3A+A+Common+Cause+of+Persistent+Infections%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial Biofilms: A Common Cause of Persistent Infections.</a> Science. 284, 1318-1322 (1999).</li>
<li>Flemming, H. C., Wingender, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biofilm+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The biofilm matrix.</a> Nat Rev Microbiol. 8, 623-633 (2010).</li>
<li>Wong, G. C. L., O’Toole, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((All+together+now%3A+Integrating+biofilm+research+across+disciplines%5BTitle%5D)+AND+%22MRS+Bulletin%22%5BJournal%5D)">All together now: Integrating biofilm research across disciplines.</a> MRS Bulletin. 36, 339-342 (2011).</li>
<li>Yazdi, S., Ardekani, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+aggregation+and+biofilm+formation+in+a+vortical+flow%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Bacterial aggregation and biofilm formation in a vortical flow.</a> Biomicrofluidics. 6, 044114(2012).</li>
<li>Rusconi, R., Lecuyer, S., Guglielmini, L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laminar+flow+around+corners+triggers+the+formation+of+biofilm+streamers%5BTitle%5D)+AND+%22J+R+Soc+Interface%22%5BJournal%5D)">Laminar flow around corners triggers the formation of biofilm streamers.</a> J R Soc Interface. 7, 1293-1299 (2010).</li>
<li>Drescher, K., Shen, Y., Bassler, B. L., Stone, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+streamers+cause+catastrophic+disruption+of+flow+with+consequences+for+environmental+and+medical+systems%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Biofilm streamers cause catastrophic disruption of flow with consequences for environmental and medical systems.</a> P Natl Acad Sci USA. 110, 4345-4350 (2013).</li>
<li>Marty, A., Roques, C., Causserand, C., Bacchin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+bacterial+streamers+during+filtration+in+microfluidic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biofouling%22%5BJournal%5D)">Formation of bacterial streamers during filtration in microfluidic systems.</a> Biofouling. 28, 551-562 (2012).</li>
<li>Taherzadeh, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computational+Study+of+the+Drag+and+Oscillatory+Movement+of+Biofilm+Streamers+in+Fast+Flows%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Computational Study of the Drag and Oscillatory Movement of Biofilm Streamers in Fast Flows.</a> Biotechnol Bioeng. 105, 600-610 (2010).</li>
<li>Vrouwenvelder, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+flow+regime+on+pressure+drop+increase+and+biomass+accumulation+and+morphology+in+membrane+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Water+Res%22%5BJournal%5D)">Impact of flow regime on pressure drop increase and biomass accumulation and morphology in membrane systems.</a> Water Res. 44, 689-702 (2010).</li>
<li>Mitchell, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biofilm+enhanced+geologic+sequestration+of+supercritical+CO2%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Greenhouse+Gas+Control%22%5BJournal%5D)">Biofilm enhanced geologic sequestration of supercritical CO2.</a> International Journal of Greenhouse Gas Control. 3, 90-99 (2009).</li>
<li>Soleimani, S., Van Geel, P. J., Isgor, O. B., Mostafa, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+of+biological+clogging+in+unsaturated+porous+media%5BTitle%5D)+AND+%22J+Contam+Hydrol%22%5BJournal%5D)">Modeling of biological clogging in unsaturated porous media.</a> J Contam Hydrol. 106, 39-50 (2009).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microscale+confinement+features+can+affect+biofilm+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Microscale confinement features can affect biofilm formation.</a> Microfluid Nanofluid. 14, 895-902 (2013).</li>
<li>Neethirajan, S., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aNeethirajan%2C+S+%22Encylopedia+of+Nanotechnology%22">Encylopedia of Nanotechnology</a>. Bhushan, B., et al. , Springer. (2012).</li>
<li>Barathi, S., Vasudevan, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilization+of+petroleum+hydrocarbons+by+Pseudomonas+fluorescens+isolated+from+a+petroleum-contaminated+soil%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Int%22%5BJournal%5D)">Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil.</a> Environ Int. 26, 413-416 (2001).</li>
<li>Das, S., Kumar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+post-formation+dynamics+of+bacterial+biofilm+streamers+as+highly+viscous+liquid+jets%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv+preprint+arXiv%3A1312.6056%22%5BJournal%5D)">Formation and post-formation dynamics of bacterial biofilm streamers as highly viscous liquid jets.</a> arXiv preprint arXiv:1312.6056. , (2013).</li>
<li>Shaw, T., Winston, M., Rupp, C. J., Klapper, I., Stoodley, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Commonality+of+elastic+relaxation+times+in+biofilms%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Rev+Lett%22%5BJournal%5D)">Commonality of elastic relaxation times in biofilms.</a> Phys Rev Lett. 93, (2004).</li>
<li>Berejnov, V., Djilali, N., Sinton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lab-on-chip+methodologies+for+the+study+of+transport+in+porous+media%3A+energy+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Lab-on-chip methodologies for the study of transport in porous media: energy applications.</a> Lab Chip. 8, 689-693 (2008).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

Biz karmaşık habitatlarda biyofilm geliştirme eğitimi için gözenekli ortam taklit basit mikroakışkan cihazı gösterdi. Deneylerin sonucunu dikte birkaç kritik adımlar vardır. Bunlar cihaz geometrisini içermektedir. Sonrası geometri değişebilirken, flamalar oluşturmak için yeterli gözenek alanı gereklidir. Ayrıca, Valiei ve ark. 1 flama formasyonu sadece belirli bir akış hızı aralığında meydana geldiğini göstermiştir. Bir eşik değerinden daha düşük akış hızlarında, serpantin haline biyofilm deformasyon...

Son zamanlarda, gözenekli ortam 1 ​​taklit mikroakışkan bir cihaz bakteriyel biyofilm oluşum dinamiklerini göstermiştir. Bakteriyel biyofilm esasen hücre dışı polimerik maddelerin (EPS), 2-4 ile kaplı olan yüzey toplanan bakteri kolonileri vardır. Bu bakteri ince filmler düz yüzeylerinden gözenekli ortamın çok daha karmaşık yaşam kadar neredeyse her hücresi meydana gelebilir. Valiei ve ark. 1 gözenekli bir ortam yapısının simüle etmek için mikro-ayağı bir dizi olan bir mikroakışkan olarak kullanmış ve sıvı akış hızının bir fonksiyonu olarak, bu cihazda biyofilm oluşumunu inceledik. Onlar belli bir akış rejiminde, flamalar olarak bilinen ipliksi biyofilm farklı sütunlar arasında ortaya çıkmaya başladı bulundu. Streamers birinde gergin edilebilir ya da her iki katı yüzeylere uçları, ancak, yapının geri kalan sıvı içinde süspansiyon haline getirilir. Flama oluşumu, tipik olarak başlar biyofilm bir ilk tabaka oluşturulmuş ve biçimi sonraiyon tür karmaşık habitatlarda biyofilm uzun vadeli evrim dikte edebilirsiniz. Son zamanlarda, bazı araştırmacılar flama formasyonu dinamiklerini araştırdık. Yezdi&#39;nin ve diğ. 5 flamalar bir salınım kabarcık kaynaklanan dikey akışlarında meydana getirdiğini göstermiştir. Başka bir deneyde, Rusconi ve ark. 6 flamalar oluşumu üzerine kanal eğrilik ve kanal geometrisinin etkisini araştırdık. Bunlar flamalar mikrokanallar kavisli bölümlerde bir şekilde meydana getirdiğini, morfoloji ve kanal motilitesi ile ilgilidir. Son zamanlarda yapılan araştırmalar flamalar bunlar gözenekli arabirimleri olgun yapıların oluşturulması için ön madde olarak hareket edebilir gibi, çeşitli doğal ve yapay senaryolarda geniş etkilere sahip bir biyomedikal sistemlerde hızlı ve katastrofik biyofilm proliferasyonuna yol açan ve aynı zamanda önemli bir akış-neden olduğunu göstermiştir yapı etkileşimleri, vb 1,7-9. Biyofilm flamalar genellikle i oluştururlargibi gözenekli medya gibi n kompleks habitatları. Gözenekli ortam ortamında anlama biyofilm büyüme örneğin CO2 tutumu 11 olarak iyi durumlarda delikli bütünlüğünü korumak ve toprakta 12 deliklerinin tıkanmalarını biyolojik atık su arıtma 10 gibi, çok sayıda çevresel ve endüstriyel işlemler için geçerlidir. Bu tür karmaşık habitatlarda biyofilm oluşumunu gözlemleyerek genellikle nedeniyle gözenekli ortamın opaklığına zor olabilir. Gerçek zamanlı ve yerinde izleme izin gibi durumlarda, Mikroakiskan bazlı gözenekli medya platformları son derece avantajlı kanıtlayabilirim. Mikroakiskan diğer bir avantajı, tek bir biyo-mikroakışkan platform üzerinde birden fazla biyoreaktörler oluşturmak ve aynı anda online izleme ve / veya sensörler dahil edilmesi için izin vermek için yeteneğidir. Tek bir cihazla ve doğru istatistiksel analiz için önemli bir ilgili veri toplamak için yeteneği birden laboratuar deneyleri uygulamak için esneklik önemli bir zarf olduğunuakışkan sistemleri 13,14 antage. Yukarıdaki tartışmanın bağlamında, bir gözenekli ortam maddesi ortamında anlama flama oluşumu dinamik çeşitli uygulamalara faydalı olacaktır. Bu çalışmada, taklit eden gözenekli ortam cihazında flama oluşumunu araştırılması için protokol geliştirmek. Mikroakışkan platformu Fabrikasyon, hücre kültürü ve deney için gerekli adımlar açıklanmaktadır. Deneylerde, Pseudomonas fluorescens, yabani tipteki, bakteri soyu kullanıldı. S. toprakta doğal olarak bulunan fluorescens, toprak ekolojisine 15 sağlanması bakımından önemli bir rol oynar. Kullanılan bakteri soyu genetik kurucu yeşil flüoresan protein (GFP) ifade etmek üzere mühendislik edilmiştir.

<table><tbody><tr><td>Floresan Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LB agar</td><td>Fisher</td><td>BP1425-500</td><td>1 L arıtılmış suda 40 g süspansiyon</td></tr><tr><td>LB suyu</td><td>Fisher</td><td>BP1427-500</td><td>1 L arıtılmış suda 20 g süspansiyon</td></tr><tr><td>Biyogüvenlik başlığı</td><td>Microzone corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Petri kabı</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td>steril 100 mm x 15 mm polistiren Petri kabı</td></tr><tr><td>İnkübatör çalkalayıcı</td><td>New Brunswick Scientific</td><td></td><td>Excella E24 inkübatör çalkalayıcı serisi</td></tr><tr><td>50 ml sterilize santrifüj tüpü</td><td>Corning</td><td>430828</td><td>Polipropilen RNase-/DNaz içermeyen</td></tr><tr><td>Tetrasiklin içermeyen baz</td><td>MP Biomedicals</td><td>103012</td><td>50 &#956; g/ml</td></tr><tr><td>SYLGARD 184 silikon</td><td>Dow Corning Corporation</td><td>68037-59-2</td><td>Elastomer Baz ve kürleme maddesi</td></tr><tr><td>Pozitif fotorezist (AZ4620)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastik tüp</td><td>Cole-Parmer</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mikro-ayağı ile bir mikroakışkan aygıt biyofilm Çıtası formasyonu protokolü

Protocol for Biofilm Streamer Formation in a Microfluidic Device with Micro-pillars

Çeşitli bakteri türleri yüzeylere bağlanmasına ve biyofilm olarak adlandırılan ince film şeklinde kolonize yeteneğine sahiptirler. Gözenekli ortamda büyümek Biofilmler atık su arıtımı ve CO 2 haciz gibi çeşitli endüstriyel ve çevresel süreçlere alakalı. Biz taklit eden gözenekli ortam mikroakışkan bir cihaz biyofilm oluşumunu araştırmak için, Pseudomonas fluorescens&#39;in Gram-negatif aerobik bakteri kullanılır. Mikroakışkan cihaz yumuşak litografi kullanarak fabrikasyon edildi mikro-mesajların bir dizi oluşur. Daha sonra, akış ile bu cihazlarda biyofilm oluşumu araştırıldı ve bizim cihazda flamalar olarak bilinen ipliksi biyofilm oluşumunu göstermektedir. Imalat ve mikroakışkan cihazın montajı için ayrıntılı protokolleri, bakteriyel kültür protokolleri ile birlikte burada sağlanmaktadır. Mikroakışkan cihaz ile deney için detaylı prosedürler de temsilcisi ile birlikte sunulmuşturSonuçlar.

Yukarıda bahsedilen protokolü kullanarak mikroüretim, PDMS göre mikroakışkan cihaz inşa edilmiştir. 1 taramalı elektron mikroskobu (SEM) PDMS görüntüleri göstermektedir cihazı. Şekil 1a, aygıtın giriş bölümünü göstermektedir. Bir çatal benzeri giriş cihaz üzerinde basınç başını eşitlemek için oluşturulur. Ayrıca SEM görüntüleme ayrıca ayağı duvarları (Şekil 1b) neredeyse dik olduğunu gösterdi. Kültürlenmiş bakteri çözeltisi (Şekil 2) il...

Gözenekli ortamı taklit eden mikroakışkan bir cihazda biyofilm oluşumunun incelenmesi için protokoller tartışılmaktadır. Mikroakışkan cihaz, bir dizi mikro sütundan oluşur ve bu cihazda Pseudomonas floresanları tarafından biyofilm oluşumu incelenir.

Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Several bacterial species possess the ability to attach to surfaces and colonize them in the form of thin films called biofilms. Biofilms that grow in ...

Bu prosedürün genel amacı, mikro sütunlara sahip bir mikroakışkan cihazda bakteriyel akıntıların (streamers) oluşumunu göstermektir. Bu, öncelikle mikroakışkan çipin üretilmesiyle gerçekleştirilir. Prosedürün ikinci adımı, test edilen bakterilerin, bu durumda pseudomonas fluorescence'ın kültüre edilmesidir.Son adımlar deneysel düzeneğin kurulması, bakterilerin mikroakışkan çipe enjekte edilmesi ve verilerin toplanmasıdır. Nihayetinde, sonuçlar floresan mikroskopi görüntüleri aracılığıyla streamerların zamansal evrimini gösterebilir. Farklı adımların öğrenilmesinin zor olması nedeniyle, bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik önem taşımaktadır.Deneyin disiplinler arası doğası gereği, bu prosedür derin reaktif iyon aşındırmalı silikon gofretler gerektirir. Gofretler üzerindeki fotoresist yıkanarak temizlenmelidir. İşleme ana kalıbı hazırlayarak başlayın.Bir flakona iki veya üç damla trikloroetilen ekleyin ve kalıbı, tasarım kısmı yukarı bakacak şekilde yanına yerleştirerek bir desikatöre koyun. İki veya üç saat içinde kalıp silolanmış olacaktır. Silolanma sırasında, PDMS karışımını 10:1 oranında kürleme ajanı ile silicone base kullanarak hazırlayın.Ardından PDMS'yi yaklaşık iki saat boyunca vakum altında gazdan arındırın. Şimdi silolanmış bir gofretle taşıyıcıya aktarın ve hava kabarcığı oluşmadığından emin olarak PDMS'yi üzerine dökün. PDMS'nin gofret üzerinde 80 °C'de iki saat boyunca kürleşmesini sağlayın.Bu işlem, boyutlandırılmış silikon kalıptan A-P-D-M-S damgası oluşturur. Kürleme tamamlandığında, PDMS damgasını bir maket bıçağı yardımıyla soyun. Ardından, damgayı maket bıçağı kullanarak bir mikroakışkan çip şeklinde kesin.Şimdi, bir kesme karot matkabı kullanarak damganın giriş ve çıkış konumlarında delikler açın. Bir sonraki adım damganın cama bağlanmasıdır. 24 milimetrelik bir lamel ve PDMS damgayı 30 saniye boyunca oksijen plazmasına maruz bırakın.Pozlamanın ardından, lamelliği PDMS damganın alt tarafına tutturun ve bir bağ oluşmasını sağlayın. Düzenekle birlikte 10 dakika boyunca 70 °C'lik fırında bekletin. Bu protokoldeki işlemi tamamlamak için, ultrapure su ile hazırlanmış ve 50 ila 55 °C'de 50 µg/mL tetrasiklin eklenmiş LB plakaları hazırlayın.Plakalar dökülürken, oluşan hava kabarcıkları alevle geçilerek patlatılabilir. Soğumuş ve katılaşmış plakalar tarihlenmeli ve alüminyum folyo ile sarılarak dört derece Celsius'ta saklanmalıdır. Ayrıca, ultra saf su ile hazırlanmış ve mililitre başına 50 mikrogram tetrasiklin eklenmiş LB besiyerini hazır bulundurun.Besiyerini 4 °C'de ve folyoya sarılı olarak saklayın. Şimdi, -80 °C'de saklanan Pseudomonas fluorescence kültür stoklarını LB plaklarına ekin, plakları zigzak şeklinde çizin ve karanlıkta 30 °C'de gece boyu inkübe edin. Ertesi gün, plaktan bir koloni seçin ve taze hazırlanmış bir S1 erlenine inoküle ederek 150 RPM çalkalamayla 30 °C'de gece boyu inkübe edin.İnkübasyon sonrası kültürün optik yoğunluğunu ölçün. Ardından S iki çözeltisini hazırlayın. Plastik bir tüpe beş mililitre LB ekleyin ve ardından, bir biyofilm deneyi için tipik olan 600 nanometrede 0,1 OD değerine ulaşacak miktarda S bir çözeltisi ekleyin.İlk olarak, cımbız kullanarak deneyi kurun. İç çapı 0,20 inç olan plastik tüpleri hazırlanan çipin giriş ve çıkışlarına bağlayın. Tüpler esnek ve yeterince uzun olmalıdır. Burada yaklaşık 20 inç uzunluğundadırlar.Ardından şırıngaları S two çözeltisi ile doldurun. 30 gauge körelmiş iğneleri takın ve hava kabarcıklarını giderin. Hava kabarcıklarının kanala girmesini önlemek, özellikle deneyin süresi nedeniyle kritik bir adımdır.Hava kabarcıkları, bakteriler tarafından oluşturulan yumuşak yapılara zarar verebilir. Ardından şırıngaları giriş tüplerine ve çıkış tüplerini atık kaplarına bağlayın. Şimdi şırıngaları bir şırınga pompasına yerleştirin ve pompayı, inkübasyon sıcaklığına ayarlanmış bir hücre odasına sahip bir mikroskop üzerinde saatte 8 µL gibi istenen akış hızına ayarlayın.Mikroakışkan çipi görüntülemek için muhtemelen 40x objektif kullanın. Şimdi, pompayı çalıştırın. Bakteriler hazneye verildiğinde, biyofilm oluşumu da başlatılmış olur.Biyofilmle saatlerce veya günlerce oluşup olgunlaşacaktır; ilerlemesini takip etmek için görüntüler alın. SEMA ile üretilmiş mikroakışkan çip kullanılarak görüntüleme yapılmıştır. Basınç başlığını cihaz genelinde eşitlemek için çatallı bir giriş oluşturulmuştur.Ayrıca, sütun duvarlarının neredeyse dikey olduğu görülmektedir. Biyofilm oluşumunu incelemek için cihaza saatte sekiz mikrolitre hızla floresan enjekte edilmiştir. Biyofilm oluşumu, seyreltilmiş bakteri kültürünün infüzyonundan birkaç dakika sonra başlamıştır.Bununla birlikte, birkaç saat sonra orta bölgenin yakınında, mikro sütunlar arasında uzanan filamanöz yapıların ortaya çıktığı gözlemlendi. Kesikli elips, bir mikro sütunun kutup bölgesine bir ucuyla bağlı olarak oluşan bir akımı (streamer) sınırlandırmaktadır. İki mikro sütun arasındaki diyagonal boyunca da akımlar görülmüştür.Hücre bölünmesinin yanı sıra planktonik bakterilerin katılımıyla, streamerların kalınlığı zamanla artmıştır. Zamanla çoğalan ve cihazda geniş bir hacmi kaplayan streamerlar, cihazı tıkayabilecek olgun bir biyofilm oluşumuna yol açmıştır. Cihaz üzerinden akışın mekanik simülasyonu, streamerların başlangıçta kendilerini akış çizgileri boyunca yönlendirdiklerini göstermektedir.Ayrıca, başlangıç aşamasında, akış çizgileri en yüksek akış hızının olduğu noktalarda ortaya çıkar. Bu videoyu izledikten sonra, mikroakışkan bir ortamda biyofilm akış çizgilerinin nasıl oluştuğu ve geliştiği konusunda iyi bir anlayışa sahip olmalısınız. Bakterilerle çalışmanın son derece tehlikeli olabileceğini ve bu prosedürü gerçekleştirirken biyogüvenlik protokolleri gibi önlemlerin her zaman alınması gerektiğini unutmayın.

protocol-for-biofilm-streamer-formation-microfluidic-device-with

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biyomühendislik

Biz hücre yakalama ve kültür etkinleştirebilirsiniz mikroakışkan cihazların imalatı için bir protokol tanımlamaktadır. Bu yaklaşımda, mikroakışkan kanallar içinde oluk gibi desenli mikro, içinde hücre sabitleyebilirsiniz Shear stresin düşük olduğu bölgelerde oluşturmak için kullanılır.

Hücresel Davranış incelenmesi için Groove Desenler mikroakışkan Aygıt

Bu protokol, eşzamanlı ve lokalize epitel hücreleri ve bakteri kültürü için bir mikroakışkan ortak kültür modeli açıklamaktadır. Bu model, varsayılan probiyotik bakteri suşlarının etkinliğini patogenezinde farklı çözünür moleküler sinyallerin rolünü araştıran gibi ekran için kullanılabilir.

Çözünür Sinyal aracılı Etkileşimleri Araştırılması için Epitel Hücreleri ve Bakteriler mikroakışkan Co-kültür

Kaynak: Kurz, D. L. ve diğerleri. Gözenekli ortamlarda biyotıkanmayı incelemek için mikrofluidik platform. J. Vis. Exp. (2022)Video, biyofilm oluşumunu incelemek için mikrofluidik cihazın kullanıldığını gösteriyor. Mikrokanala bakteriyel bir süspansiyon getirilir ve ardından biyofilm gelişimi için kuluçka yapılır. Akış daha sonra yeniden başlatılır ve basınç izleme ile görüntüleme kullanılarak biyofilm oluşumu ve gözenek tıkanıklığı zamanla tespit edilir.

Biyofilm oluşumu sırasında gerçek zamanlı görüntüleme ve basınç takibi için mikrofluidik bir cihaz

Yarık gözenek geometrisinde kılcal köprüler oluşturmak ve görüntülemek için bir prosedür sunulmuştur. Kılcal köprülerin oluşturulması, sıvıyı sabitlemek için yönlü fiziksel ve kimyasal bir heterojenlik sağlamak için sütunların oluşumuna dayanır.  Kılcal köprüler mikrostages kullanılarak oluşturulur ve manipüle edilir ve ccd kamera kullanılarak görselleştirilir.

Yarık Gözenek Geometrisinde Kılcal Köprülerin İmalatı ve Görselleştirilmesi

Bu yöntemler kağıt amacı tipik insan Mikrobiyal dental plak tespit türler içeren çok tür biyofilm gelişmesi için mikroakışkan sisteminin kullanımını tarif etmektir. Yöntem biyofilm mimarisi, biyofilm canlılığı ve vurgulanır kültür-bağımlı veya kültür-bağımsız analizler için hasat biyofilm bir yaklaşım açıklamak için.

Yüksek verimli bir kullanımı<em&gt; İn Vitro</em&gt; Mikroakışkan Sistemi Ağız Çok türler biyofilm Geliştirmek İçin

Biyofilmlerin çevreleriyle karmaşık etkileşimleri vardır. Biyofilm-çevre etkileşimlerini kapsamlı bir şekilde araştırmak için, burada biyofilm gelişimi için heterojen kimyasal ortam oluşturmak, yerel akış hızını ölçmek ve biyofilm kolonileri içinde ve çevresinde kütle taşınmasını analiz etmek için bir dizi yöntem sunuyoruz.

Biyofilm ve Habitat Heterojen Eş-geliştirme karakterize Yöntemleri

Bu protokol ana bilgisayar fizyolojik koşullar altında Candida albicans biyofilm oluşumu görselleştirmek için özelleştirilebilir otomatik mikrosıvısal aygıt kullanımını açıklar.

Görselleştirme bir otomatik mikrosıvısal aygıtı kullanarak Candida albicans biyofilm oluşumu

Çığır açan eğriler (BTC'ler), gözenekli ortamda bakterilerin taşınmasını incelemek için etkili araçlardır. Burada, BTC'ler elde etmek için mikroskopik ve akış sitometrik sayma ile birlikte akışkan cihazlara dayalı araçlar sıyoruz.

Akışkan Cihazların Mikroskopi ve Akış Sitometrisi ile Birleştirilmesi, Mekansal Ölçekler Arasında Gözenekli Ortamda Mikrobiyal Taşımayı İncelemek

Bakteri ve kolloidler gibi bir sıvıda asılı mikro boyutlu nesneleri polidimetilsiloksisan substratında öngörülen dizilere desenleştirmek için mikroakışkan bir platformda kapilarite destekli montaj kullanan bir teknoloji sunuyoruz.

Sıralı Capillarity destekli Montaj yoluyla Mikroorganizmaların ve Mikropartiküllerin Deseni

Mevcut protokol, yüksek çözünürlüklü mikroskopi görüntülemeyi eşzamanlı basınç farkı ölçümleriyle birleştirerek yarı-2D gözenekli ortamlarda biyofilm gelişimini incelemek için mikroakışkan bir platformu tanımlamaktadır. Platform, gözenekli ortamlardaki gözenek boyutunun ve sıvı akış hızlarının biyotıkanma üzerindeki etkisini ölçer.

Gözenekli Ortamlarda Biyotıkanıklığı İncelemek için Mikroakışkan Bir Platform

Öğrenin, mikro-ayaklı mikroakışkan cihazda Pseudomonas fluorescens ile biyofilm oluşumunu ve bakteri akıntılarının zaman içinde gelişimini. Bu yöntem, gözenekli ortamdaki mikrobiyal davranışları incelemek için değerlidir.

Mikro-ayağı ile bir mikroakışkan Aygıt Biyofilm Çıtası Formasyonu Protokolü

Daha fazla video keşfet