Efektör CD4 Evlatlık transferi ile Kemirgen Bağırsak Enflamasyon indüksiyonu ⁺ CD45RB ^Yüksek Bağışık yetmezliği olan farelere içine T Hücreleri

Bu prosedürün genel amacı, naif T hücrelerinin immün yetmezliği olan farelere evlat edinici transferi yoluyla bağırsak iltihabını indüklemektir. Bu, önce fare dalaklarından hücrelerin izole edilmesi, kan hücrelerinin parçalanması ve daha sonra popülasyonun CD dört pozitif T hücresi için zenginleştirilmesiyle gerçekleştirilir. İkinci adım, bu hücreleri floresan DI konjuge CD dört ve CD 45 RB antikorları ile etiketlemektir.

Daha sonra, etiketli hücreler gerçekler kullanılarak CD 45, RB düşük ve CD 45 RB yüksek popülasyonlarına sıralanır. Son adım, CD 45 RB yüksek hücrelerinin intraperitoneal enjeksiyon ile immün yetmezliği olan farelere aktarılmasıdır. Sonuçta, transfer edilen hücreler aktive edilir ve T düzenleyici hücrelerin yokluğunda lokal doku hasarına neden olur ve bu da deneysel kolit ile sonuçlanır.

Bu yöntem, inflamatuar barsak hastalıklarının çalışmasında, spesifik hücre popülasyonlarının rolü ve hastalık patogenezinde gastrointestinal mikrobiyota gibi temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Donör fareye ötenazi yaptıktan sonra, bölgeyi sterilize etmek için karın% 70 etanol püskürtün. Daha sonra karın boyunca yatay bir kesi yapın ve forseps kullanarak peritonu ortaya çıkarmak için cildi geri soyun.

Peritonu iç organlardan uzak tutun ve sol karın peritonunda bir kesi yapın. Daha sonra, dalağı fareden çıkarın ve 10 mililitre buz gibi, tam orta içeren bir Petri kabına yerleştirin. Tek hücreli bir süspansiyon yapmak için dalağı iki steril cam slaytla ezin.

Hücreleri 70 mikronluk bir süzgeçten 50 mililitrelik bir konik tüpe süzün ve ardından süzgeci bir konik tüpte beş dalağa kadar beş mililitre tam orta süzgeçle durulayın. Daha sonra, hücreleri dört santigrat derecede yedi dakika boyunca 450 kez G'de santrifüjleyin. Süpernatanı bir atık kabına aspire edin ve ardından hücreleri 10 mililitre buz gibi soğuk etiketleme tamponunda nazikçe yeniden süspanse edin.

20 mikrolitre hücre süspansiyonunu 180 mikrolitre% 0.4 trian mavisi çözeltisi ile birleştirin ve hücreleri oda sıcaklığında beş dakika inkübe edin. Daha sonra bir hemo sitometreye 10 mikrolitre hücre süspansiyonu ekleyin ve zenginleştirme peletini başlatmak için mikroskop altında mavi olmayan hücrelerin sayısını sayın ve hücreleri 20 kez 10 ila mililitre başına altı hücreye kadar bir konsantrasyonda buz gibi soğuk etiketleme tamponunda nazikçe yeniden askıya alın. Altı hücreye bir kez 10'da beş mikrolitre biyotinile CD dört T hücre zenginleştirme antikoru ekleyin ve daha sonra hücreleri antikorla birlikte 15 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin.

Hücre süspansiyonuna etiketleme tamponu hacminin 10 katını ekleyin ve ardından hücreleri yedi dakika boyunca 450 kez G'de santrifüjleyin. Hücre peletini bozmadan süpernatanı dikkatlice aspire edin. Daha sonra, streptavidin konjuge manyetik parçacıklarını girdaplama yoluyla yeniden askıya alın ve hücrelere altı hücreye bir kez 10 kez beş mikrolitre parçacık ekleyin.

Tüpü hafifçe vurarak parçacıkları hücrelerle karıştırın ve ardından karışımı 30 dakika boyunca altı ila 12 santigrat derecede inkübe edin. Hücreleri, etiketleme tamponu ile mililitrede 20 ila 80 kez 10 ila altı hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse edin. Daha sonra bir mililitre etiketli hücreyi 12 milimetreye 75 milimetre yuvarlak tabanlı bir test tüpüne aktarın ve bu pozitif fraksiyon tüpünü altı ila sekiz dakika boyunca bir mıknatıs üzerine yerleştirin.

Tüp mıknatıs üzerindeyken, etiketli hücreleri rahatsız etmeden süpernatanı bir cam macun pipeti ile dikkatlice çıkarın ve yeni bir steril 50 mililitre konik tüpe aktarın. Bu fraksiyon, CD'nin dört pozitif T hücresini içerir. Pozitif fraksiyon tüpünü mıknatıstan çıkarın ve kuvvetlice pipetleyerek hücreleri etiketleme tamponunda yeniden süspanse edin.

Tüpü altı ila sekiz dakika daha mıknatısa geri koyun. Yine, SUP nain'i dikkatlice zenginleştirilmiş fraksiyon tüpüne aktarın. Hücreleri etiketlemeye hazırlamak için gerektiği kadar zenginleştirmeyi tekrarlayarak CD dört pozitif T hücresinin verimini artırın: İlk olarak, zenginleştirilmiş fraksiyonu yedi dakika boyunca 450 kez G'de santrifüjleyin ve süpernatanı atın.

Daha sonra etiketleme tamponundaki hücreleri, mililitre başına 10 kez 10 ila altıncı hücre konsantrasyonuna yeniden süspanse edin. Lekelenmemiş izotop lekeli ve tek lekeli kontrol hücreleri için ayrı mikro fuge tüplerinde beşinci hücrelerin 10'unu beş kez alikotlayın. Daha sonra, orijinal hücre süspansiyonunu içeren tüpe mililitre CD dört, FE başına beş mikrogram ve mililitre CD 45 RB PE antikorları başına bir mikrogram ekleyin.

İzotop kontrol lekelerini ve aynı konsantrasyondaki tek lekeleri uygun hücre alikotlarına ekleyin. Hücreleri antikorlarla nazikçe karıştırın ve ardından tüpleri 30 dakika boyunca buz üzerinde inkübe edin. Işıktan korumak için tüpleri örtün.

Daha sonra, hücreleri metin protokolünde belirtildiği gibi etiketleme tamponunda iki kez yıkayın ve hücreleri etiketleme tamponunda mililitre başına altı hücrenin 10'u kadar 10 kez yeniden süspanse edin. Ardından hücre süspansiyonunu 70 mikronluk bir süzgeçten geçirerek bir faks tüpüne geçirin. Tüpü buzun üzerine yerleştirin ve üzerini örtün Lekelerin foto ağartılmasını önlemek için.

Hücre sıralayıcıdaki kompanzasyonu kalibre etmek için boyanmamış ve tek aşamalı kontrol hücrelerini kullanın. İleri ve yan dağınık geçit kullanarak canlı olmayan hücreleri hariç tutun. Ve sonra izotop lekeli kontrollerle CD dört pozitif ve CD dört RB pozitif hücreler için kapıyı ayarlayın.

Bir sonraki kapı, CD dört pozitif popülasyon ve daha sonra hücreleri CD 45, RB yüksek ve CD 45 RB düşük popülasyonlara sıralar. Hücreleri iki mililitre tam ortam içeren tüplerde toplayın ve daha sonra CD 45 RB yüksek ve CD 45 RB düşük hücreleri enjeksiyon yıkaması için hazırlamak üzere numune saflığını değerlendirmek için hücre sıralayıcıdaki her fraksiyondan yaklaşık 10 kez 10 ila üçüncü hücreye bir alikot çalıştırın ve bunları metin protokolünde belirtildiği gibi uygun hücre yoğunluğuna PBS'de yeniden süspanse edin. Daha sonra, alıcı fareyi sıkıca kısıtlayın ve karnın sağ ve sol taraflarına 100 mikrolitre hücre süspansiyonu intraperitoneal enjekte edin.

Alıcı fareleri her hafta metin protokolünde belirtildiği gibi klinik parametreler için izleyin. Enjeksiyon sonrası hastalığın ilerlemesi tipik olarak beşinci haftada belirgindir. Bir fareyi önceden belirlenmiş bir zaman noktasında veya başlangıç vücut ağırlığının %20'sini kaybettiğinde kurban edin ve kolonu çıkarın.

Ardından kolonun uzunluğunu ve ağırlığını ölçün ve kaydedin. CD dört pozitif CD 45 RB yüksek T hücreleri, enjeksiyondan beş hafta sonra rag one knockout ve NFIL üç RAG one double knockout alıcı farelere transfer edildi. Çift nakavt Fareler, başlangıçtaki vücut ağırlıklarının %10'unu kaybetmişti, hem paçavra bir nakavt hem de çift nakavtın kolonları.

Alıcı fareler, kontrol farelerinden alınan kolonlara kıyasla kalınlaştırıldı ve kısaltıldı, CD dört pozitif CD 45 RB yüksek T hücreleri, paçavra bir nakavt ve paçavra bir nakavt için P bir 10 delta mutant alıcı fare, transferden üç hafta sonra histolojik analiz, epitelyal hiperplazi, inflamatuar hücre infiltratları ve paçavra bir nakavt delta mutant alıcılarında kript apseleri gösterdi, ancak paçavra bir nakavt farede değil, bir kez ustalaştı. Bu teknik, uygun şekilde yapılırsa dört ila altı saat içinde yapılabilir.