Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Bu prosedürün genel amacı, bir kavram kanıtı olarak rekombinant divalent bir adenoviral vektör kullanarak, antijen kapsid entegrasyon stratejisi aracılığıyla adenovirüs serotip beş vektörlü aşı yaklaşımları geliştirmektir. Antijen kapsid entegrasyon stratejisi kullanılarak, modifiye plazmid A D five R one K-W-S-H-V-R five hiss'i oluşturmak için birden fazla klonlama adımı uygulanır. Ardından, divalent adenoviral vektör R one K was HVR five hazırlanır.

Hiss kurtarılır, çoğaltılır ve saflaştırılır. Ardından viral titrelere ve viral kapside dahil edilen antijenlerin antijenik sunumuna bakılarak karakterizasyon yapılır. Son olarak, antijen kapsid dahil etme stratejisi kullanılarak Divalent Aden viral vektörünün, D beş pozitif serumlar tarafından gerçekleştirilen nötralizasyonu atlatma potansiyeli değerlendirilir.

Modifiye plazmit A D five R one K-W-A-S-H-V-R five hiss'i oluşturmak için çok sayıda klonlama adımı kullanılır. Bugün, antijen kapsid entegrasyon stratejisini göstereceğiz. Bu strateji, transgen ekspresyon yöntemi gibi diğer stratejilere kıyasla avantajlıdır çünkü ilgili antijeni adenovirüs kapsidi üzerinde bir protein olarak sergilemekle kalmaz, aynı zamanda bu antijene karşı güçlü bir humoral yanıt oluşmasını sağlar.

Kapak modifiye eden adenovirüsün üretimine ilişkin adımlar, restriksiyon enzimlerinin seçimi ve ilgi duyulan genin uzunluğu gibi birçok değişkenin önerilen viral vektörlerin geliştirilmesine katkıda bulunması nedeniyle öğrenilmesi zor olduğundan, bu yöntemin görsel gösterimi kritik öneme sahiptir. Prosedürleri bugün iki doktora sonrası araştırmacım Dr. Lin Lin Gu ve Dr. Nitra Farrow ile laboratuvardaki araştırma görevlisi Alexandre Kren gösterecekler. Shuttle plazmidi oluşturmak için, 6 µg HVR 1 KWA fragmanına altı'şar ünite GE 1 ve CCC 1 ekleyin.

Sindirim reaksiyonunu 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Sindirim fragmanını %2 agroz jelde elektroforez ile ayırın ve fragmanı saflaştırmak için üretici protokolüne uygun olarak bir DNA jel ekstraksiyon kiti kullanın. Ardından, saflaştırılmış fragmanın 12 ng'ını, daha önce oluşturulmuş shuttle plazmidin 100 ng'ındaki a G one ve ACC one bölgelerine ligeyin.

HVR five hiss six pH five s ve 10 µL reaksiyon hacmi ile oda sıcaklığında iki saat boyunca bekletin. Ardından, 1 µL ligasyon reaksiyonunu 50 µL elektrokompetan DH5α hücrelerine ekleyin ve 950 µL SOC besiyeri eklemeden önce elektroporasyon uygulayın. Transforme edilmiş hücreleri 37 °C'de ve 200 RPM'de bir saat boyunca inkübe ettikten sonra, kültürün 100 ila 200 µL'sini bir LB CANY plakasına yayın.

37 °C'de gece boyunca inkübe edin. Saflaştırılmış shuttle plazmidinin 6 µg'ını 37 °C'de üç saat boyunca sindirmek için altışar ünite Eco RI ve Pme I kullanın. Homolog rekombinasyon kolları ve çift modifiye ekzon 5 genini içeren fragmanı saflaştırdıktan sonra, backbone plazmidi pAD5, delta H5'in homolog rekombinasyonunu gerçekleştirmek için Swa I ile lineerize edin.

Saflaştırılmış shuttle fragmanı ve backbone plazmidinin her birinden 100 nanogramı, 50 mikrolitre elektrokometan BJ 5 180 3 hücresine elektroporasyon yoluyla birlikte transforme edin. Bu videonun başında gösterildiği gibi, ertesi gün kanmisin içeren üç mililitre sıvı LB içerisine yaklaşık 10 koloni seçin ve metin protokolüne göre tarama yapmadan önce gece boyunca büyütün. Ardından, ad viral vektörünü kurtarmak için daha önce gösterildiği gibi, 100 nanogram saflaştırılmış plazmidi DH beş alfa hücrelerine transforme edin.

Öncelikle, 100 µL hacimde 15 µL vektörü lineerize etmek için PAC one kullanın. Sindirim işleminden sonra 37 °C'de üç saat boyunca inkübe edin. Lineerize edilmiş plazmidi bir çeker ocak altında ekstrakte edin.

Reaksiyona eşit hacimde fenol kloroform, izoamil alkol ekleyip 10.000 G'de bir dakika boyunca santrifüjleyin ve ekstraksiyon ile santrifüj işlemini ekstrakte hacme ulaşana kadar tekrarlamadan önce süpernatantı toplayın. 300 µL %100 etanol ve 10 µL asetat ekleyerek 10.000 G'de 10 dakika santrifüjleyin. Ardından süpernatantı attıktan sonra, tekrar santrifüjlemeden önce 700 µL %70 etanol ekleyin.

Pelet yeniden süspanse edilip DNA miktarı belirlendikten sonra, üretici talimatlarına uygun olarak, üç mikrogram lineerize plazmidi ticari lipozomal transfeksiyon reaktifi ile birlikte, önceden hazırlanmış %80 konfluens düzeyindeki HEK 2 93 hücrelerinin bulunduğu T 25 flaskına transfekte edin. Altı saatlik inkübasyonun ardından, flaskı inkübatöre geri yerleştirmeden önce transfeksiyon besiyerini komple besiyeri ile değiştirin. Plaklar steril bir çeker ocak altında tam bir sitopatik etki veya CPE geliştirdiğinde, flaskta kalan hücreleri kazıyın ve kültürü 300 G'de ve dört derece Celsius'ta 10 dakika boyunca santrifüjleyin.

Ardından, hücre peletini yeniden süspanse etmek için %2 FBS içeren bir mililitre besiyeri kullanın. Sonrasında, dört tur dondurma-çözdürme işlemi uygulayarak hücreleri parçalayın ve ardından lizatı dört derece santigrat sıcaklıkta 10 dakika boyunca santrifüjleyin. Viral vektörü büyük ölçekli bir kültürde çoğaltmak için kurtarılan virüsü içeren S süpernatantını toplayın.

T 25 flaskındaki viral lizatın üçte birini, HEK 2 93 hücreleri içeren bir T 75 flaskına aktarın. Tam CPE gelişiminin tamamlanmasına izin verdikten ve süpernatantı daha önce gösterildiği şekilde topladıktan sonra, tüm virüsün yarısını bir veya daha fazla T 1 75 HK 2 93 hücresi flaskında çoğaltın; ardından T 1 75 flasklarından izole edilen virüsü bir düzine veya daha fazla flaskta çoğaltın.

1,33 g/mL ve 1,45 g/mL sezyum klorür çözeltileri hazırlandıktan sonra, hücrelerin bulunduğu T 75 flaskları kullanılır. Bir ultrasentrifüj tüpüne 4 mL 1,33 g/mL sezyum klorür ekleyin ve aynı tüpün tabanına 4 mL 1,45 g/mL sezyum klorür ekleyin. Aynı tüpün en üst kısmına 4 mL viral lizat süpernatanı ekleyin, ardından tüpü 110.000 ×g ve 4 °C'de üç saat boyunca santrifüjleyin.

Bu işlem, arka planda olgun alt virüs bandını, defektif üst virüs bandından ayıracaktır. Alt bandı toplamak için üç mililitrelik bir şırıngaya takılı 33 gauge iğne kullanın. Ardından, çözeltiyi dört mililitreye tamamlamak için beş pipet kullanın.

Ardından, iki adet daha sezyum klorür gradyanı hazırladıktan sonra, seyreltilmiş virüsü üst kısma yükleyin ve gradyanları 110,000 G'de ve dört santigrat derecede gece boyunca santrifüjleyin. Sahne arkası. Viral bandı az önce gösterildiği gibi toplayın.

Ardından, virüs solüsyonunu bir diyaliz kasetine enjekte etmek için 33 gauge iğne ve üç mililitrelik şırınga kullanın. Bir kaseti, metin protokolüne göre hazırlanan 700 mililitre 1x diyaliz tamponu içine yerleştirin ve tamponu her üç saatte bir toplam dört kez değiştirin. Daha sonra iğne ve şırınga kullanarak.

Viral fiziksel titreyi belirlemek için viral solüsyonu kasetten toplayın. Hem virüsü hem de arka plan kontrolü olarak kullanılan diyaliz tamponunu, virüs lizis tamponu ile 1/10 ve 1/20 oranlarında dilüe edin ve tüm tüpleri 56 °C'de 10 dakika boyunca inkübe edin. Bir biyofotometreyi açın ve absorbans modunu 260 nm optik yoğunluğa ayarlayın.

Boş (blank) düğmesine tıklayarak arka plan sinyalini dengelemek için 1:10 oranında seyreltilmiş diyaliz tamponu kullanın. Biyo fotometre ekranına 10 artı 90 yazın. Tüpü, 1:10 oranında seyreltilmiş virüs tüpü ile değiştirin ve 1:10 oranında seyreltilmiş virüsün sinyalini okuyun.

1/20 seyreltmeyi ölçmek için, tampon tüpünü 1/20 seyreltilmiş virüs tüpüyle değiştirmeden ve sinyali okumadan önce, arka planı dengelemek amacıyla ekranda 5+95 şeklinde yazarak 1/20 oranında seyreltilmiş diyaliz tamponu kullanın. İki virüs okuma değerini 1,1 × 10¹² ile çarpın ve iki ayrı seyreltmeden elde edilen iki bireysel titreye dayanarak VP/mL birimiyle ortalama titreyi hesaplayın. Kurtarılan virüsün, viral kapsid yüzeyinde antijenik HIV antijeni ve hist etiketini sergileyip sergilemediğini göstermek için farelerdeki virüsü metin protokolüne göre değerlendirin.

Majör protein Heon beş. ELISA, burada gösterildiği üzere sırasıyla human 2F5 monoklonal antikor ve mouse anti-his tag monoklonal antikor ile gerçekleştirilmiştir; hem human 2F5 antikoru hem de mouse anti-his antikoru divalent A5 virüs partikülüne bağlanırken, negatif kontrol A5 vektörüne herhangi bir bağlanma gözlenmemiştir. ELISA verilerini doğrulamak için Western blot analizi kullanılmış ve hem human 2F5 antikoru hem de mouse anti-his antikoru sadece 117 kilodalton civarında spesifik bantlar saptamıştır.

DIVALENT'e, Heon beşli proteininin boyutuna karşılık gelen add beşli virüs eklendi. Oluşturulan add beşli virüsün, add beşli pozitifler tarafından gerçekleştirilen nötralizasyonu atlatma potansiyelini değerlendirmek için bir nötralizasyon deneyi gerçekleştirildi. Sonuçlar, kontrol add beşli vektörünün add beşli pozitif serum olmadan işlendiğinde, serumla işlendiği duruma göre göreceli lümineans birimlerinin (rlu) 12 kat daha yüksek olduğunu göstermiş ve bu durum virüsün nötralize edildiğini ortaya koymuştur.

Buna karşılık, oluşturulan divalent AD five virüsü için kullanılan R değerinde, işlem görmüş ve işlem görmemiş örnekler arasında çok az fark vardı; bu durum, oluşturulan virüsün nötralizasyondan kaçtığını göstermektedir. Bu videoyu izledikten sonra, add five vektör aşı geliştirme için antijen kapsid inklüzyon yaklaşımı hakkında daha geniş bir anlayışa sahip olmalısınız. Şu anda bu stratejiyi nadir serotipli vektörlerle kombinasyon halinde kullanmaktayız.

Bunu da yapabilirsiniz.