Adenovirüs Serotipinin 5-vektörlü Aşı Yaklaşımlar Geliştirme Antijen Kapsid-Ortaklık Stratejisi kullanmak

Bu prosedürün genel amacı, antijen kapsid dahil etme stratejisini kullanarak, prensip kanıtı olarak bir rekombinant iki değerlikli adenoviral vektör kullanarak adenovirüs serotip beş vektörlü aşı yaklaşımlarının geliştirilmesi için antijen kapakları dahil etme stratejisini kullanmaktır, modifiye edilmiş plazmidi oluşturmak için çoklu klonlama adımları kullanılır, AD beş R bir K-W-S-H-V-R beş tıslama. Daha sonra, iki değerlikli adenil viral vektörü. R bir, K HVR beş idi.

Hiss kurtarılır, yayılır ve saflaştırılır. Daha sonra viral titreler ve viral kapsid üzerindeki birleşik antijenlerin antijenik gösterimi karakterize edilir. Son olarak, İki değerlikli Aden viral vektörünün bir D beş pozitif serum ile nötralizasyonu atlatma potansiyeli, antijen kapsid dahil etme stratejisi kullanılarak değerlendirilir.

Modifiye edilmiş plazmidi oluşturmak için çoklu klonlama adımları kullanılır, AD beş R bir K-W-A-S-H-V-R beş tıslama. Bugün antijen kapsid dahil etme stratejisini göstereceğiz. Bu strateji, transgen ekspresyon yöntemi gibi diğer stratejilerle karşılaştırıldığında faydalıdır, çünkü sadece adenovirüs tutsak üzerindeki ilgilenilen antijeni bir protein olarak göstermekle kalmaz, aynı zamanda bu antijene karşı sağlam bir humoral yanıta izin verir.

Bu yöntemin görsel olarak gösterilmesi kritik öneme sahiptir, çünkü kapak modifiye edici adenovirüsün üretilmesi ile ilgili adımların öğrenilmesi zordur, çünkü birçok değişken, kısıtlama enzimlerinin seçimi, diğerlerinde ilgilenilen enerjinin merceği gibi önerilen viral vektörlerin geliştirilmesine katkıda bulunur. Bugün benim iki doktora sonrası arkadaşım, Dr.Lin Lin Gu ve Dr.Nitra Farrow olacak. Ayrıca laboratuvarda araştırma görevlisi olan Alexandre Kren Mekik plazmidini oluşturmak için, her biri bir GE birimi ve bir CCC bir ila altı mikrogram HVR bir KWA parçası ekleyin.

Sindirim reaksiyonunu üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Sindirim fragmanını elektroforez ile% 2'lik bir agros jel içinde çözün ve parçayı saflaştırmak için üreticinin protokolüne göre bir DNA jeli ekstraksiyon kiti kullanın. Daha sonra, saflaştırılmış parçanın 12 nanogramını, önceden oluşturulmuş mekik plazmidinin 100 nanogramının a G ve ACC bir bölgesine bağlayın.

HVR beş tıslama, altı pH, beş s ve iki saat boyunca oda sıcaklığında 10 mikrolitre reaksiyon hacmi. Daha sonra, 950 mikrolitre SOC ortamı eklemeden önce 50 mikrolitre elektro yetkin DH beş alfa hücresine, bir elektro sekize bir mikrolitre ligasyon reaksiyonu ekleyin. Dönüştürülmüş hücreleri 37 santigrat derece ve 200 RPM'de bir saat boyunca inkübe edin ve 100 ila 200 mikrolitre kültürü bir LB CANY plakasına yayın.

Gece boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Üç saat boyunca 37 santigrat derecede saflaştırılmış mekik plazmidinin altı mikrogramını sindirmek için Echo R one ve PME one'ın her biri altı ünite kullanın. Homolog rekombinasyon kolları ve çift modifiye ekzon beş geni içeren fragman saflaştırıldıktan sonra, homolog rekombinasyonu gerçekleştirmek için omurga plazmidini doğrusallaştırmak için SUA bir, PAD beş, delta H beş kullanın.

Saflaştırılmış mekik parçasının ve omurga plazmidinin her birinin 100 nanogramını 50 mikrolitre elektro yetkin BJ 5 180 3 hücresine dönüştürmek için elektroporasyon kullanın. Ertesi gün bu videoda daha önce gösterildiği gibi, metin protokolüne göre taramadan önce teneke kutu misin içeren üç mililitre sıvı LB içine yaklaşık 10 kolon alın ve gece boyunca büyüyün. Daha sonra, eklenen viral vektörü kurtarmak için 100 nanogram saflaştırılmış plazmiti daha önce gösterildiği gibi DH beş alfa hücresine dönüştürün.

100 mikrolitrelik bir hacimde 15 mikrolitre vektörü doğrusallaştırmak için PAC one kullanarak başlayın. Sindirimden sonra üç saat boyunca 37 santigrat derecede inkübe edin. Doğrusallaştırılmış plazmiti bir çeker ocak altında çıkarmak için.

Bir dakika boyunca 10.000 G'deki reaksiyon santrifüjüne eşit hacimde fenol kloroform, izoamil alkol ekleyin ve ekstraksiyonu tekrarlamadan önce süpernatan toplayın ve ekstrakte edilen hacme döndürün. 10 dakika boyunca 10.000 G'de 300 mikrolitre% 100 etanol ve 10 mikrolitre asetat dönüşü ekleyin. Daha sonra süpernatanı attıktan sonra, tekrar döndürmeden önce 700 mikrolitre% 70 etanol ekleyin.

Pelet yeniden süspanse edildikten ve DNA ölçüldükten sonra, ticari lipozomal transfeksiyon reaktifi ile birlikte doğrusallaştırılmış plazmitin üç mikrogramını, üreticinin talimatlarına göre% 80 birleşik HEK 2 93 hücresinden oluşan önceden hazırlanmış bir T 25 şişesine aktarın. Altı saat inkübe ettikten sonra, şişeyi inkübatöre geri koymadan önce transfeksiyon ortamını tam ortamla değiştirin. Plaklar steril bir başlık altında tam bir sitopatik etki veya CPE geliştirdiğinde, kalan hücreleri şişeden kazıyın ve kültürü 10 dakika boyunca 300 G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Ardından, hücre peletini yeniden süspanse etmek için %2 FBS içeren bir mililitre ortam kullanın. Daha sonra, dört tur donarak çözme işlemi gerçekleştirerek hücreleri kırın, ardından lizatı 10 dakika boyunca dört santigrat derecede santrifüjleyin. Viral vektörü büyük ölçekli bir kültürde yaymak için kurtarılan virüsü içeren S süpernatantını toplayın.

T 25 şişesinden gelen viral lizatın üçte biri, HEK 2 93 hücreleri içeren bir T 75 şişesine dönüştürülür. Tam CPE'nin gelişmesine izin verdikten ve daha önce gösterildiği gibi supinatın hasat edilmesinden sonra, tüm virüsün yarısını bir veya daha fazla şekilde yayın. HK 2 93 hücrelerinin T 1 75 şişeleri daha sonra T 1 75 şişelerinden izole edilen virüsü bir düzine veya daha fazla miktarda çoğaltır.

T 1: Bir nokta hazırlandıktan sonra 75 hücre şişesi, mililitrede 33 gram ve mililitrede 1.45 gram. Sezyum klorür çözeltileri, bir ultrasantrifüj tüpüne dört mililitre, mililitre başına 1.33 gram, sezyum klorür ekler ve aynı tüpün dibine karşı dört mililitre, mililitre başına 1.45 gram sezyum klorür ekler. Aynı tüpün üstüne dört mililitre viral lizat supinat ekleyin, daha sonra tüpü üç saat boyunca 110.000 G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin.

Bu, olgun alt virüs bandını, kaputun altındaki kusurlu yüksek virüs bandından ayıracaktır. Alt bandı toplamak için üç mililitrelik bir şırıngaya bağlı 33 gauge iğne kullanın. Sonra çözeltiyi dört mililitreye çıkarmak için beş hippi kullanın.

Daha sonra iki sezyum klorür gradyanı daha hazırladıktan sonra, seyreltilmiş virüsü üstüne yükleyin ve gradyanları gece boyunca 110, 000 G ve dört santigrat derecede santrifüjleyin. Kaputun altında. Az önce gösterildiği gibi viral bandı toplayın.

Daha sonra virüs solüsyonunu bir diyaliz kasetine enjekte etmek için 33 gauge iğne ve üç mililitrelik bir şırınga kullanın. Metin protokolüne göre hazırlanan 700 mililitrelik bir x diyaliz tamponuna bir kaset yerleştirin ve tamponu her üç saatte bir dört kez değiştirin. Sonra bir iğne ve şırınga kullanarak.

Viral fiziksel titreyi belirlemek için viral çözeltiyi kasetten toplayın. Arka plan kontrolü olarak kullanılan hem virüsü hem de diyaliz tamponunu bir ila 10 ve bir ila 20 arasında seyreltmek için virüs liziz tamponu kullanın ve tüm tüpleri 56 santigrat derecede 10 dakika inkübe edin. Bir biyo fotometreyi açın ve emme modunu 260 nanometre optik yoğunluğa ayarlayın.

Boş düğmeye tıklayarak arka plan sinyalini dengelemek için birden 10'a kadar seyreltilmiş diyaliz tamponunu kullanın. Biyo fotometre ekranına 10 artı 90 yazın. Tüpü bir ila 10 oranında seyreltilmiş virüs tüpü ile değiştirin ve bir ila 10 oranında seyreltilmiş virüsün sinyalini okuyun.

Bir ila 20 seyreltmeyi ölçmek için, tampon tüpünü bir ila 20 seyreltilmiş virüs tüpüyle değiştirmeden ve sinyali okumadan önce ekranda beş artı 95 yazarak arka planı dengelemek için bir ila 20'ye seyreltilmiş diyaliz tamponunu kullanın. İki virüs okuma numarasını 1.1 çarpı 10'a 12 ile çarpın ve iki diludan iki ayrı titreye dayalı olarak mililitre başına VP birimleriyle ortalama titreyi hesaplayın. Kurtarılan virüsün viral kapsidin yüzeyinde antijenik HIV antijenini ve hist etiketini gösterip göstermediğini göstermek için farelerde virüsü metin protokolüne göre değerlendirin.

Ana protein Heon beş. Eliza, burada gösterildiği gibi sırasıyla insan iki F beş monoklonal antikoru ve fare anti tıslama etiketi monoklonal antikoru ile gerçekleştirildi, hem insan iki F beş antikoru hem de fare anti tıslama antikoru iki değerlikli beş virüs partikülü eklerken, negatif kontrole bağlanma yoktu. Hem insan iki F beş antikoru hem de fare anti tıslama antikoru tespit edildiğinden, E iza verilerini doğrulamak için beş vektörlü bir Western kan analizi kullanıldı Sadece 117 kilodalton civarında spesifik bantlar.

DIVALENT'te, Heon beş proteininin boyutuna karşılık gelen beş virüs ekleyin. Beş pozitif ekleyerek nötralizasyonu atlatmak için inşa edilen beş ek virüsün potansiyelini değerlendirmek için bir nötralizasyon testi gerçekleştirildi. Sonuçlar, nispi ışıldayan birimlerin veya rlu'nun, kontrol ekleme vektörü beş pozitif serum eklenmeden tedavi edildiğinde, serumla tedavi edildiğinden 12 kat daha yüksek olduğunu göstermektedir, bu da virüsün nötralize edildiğini düşündürmektedir.

Buna karşılık, tedavi edilmiş ve tedavi edilmemiş numuneler arasında yapılandırılmış iki değerlikli AD beş virüsü için R kullanımında çok az fark vardı, bu da yapılandırılmış virüsün nötralizasyondan kaçtığını düşündürdü. Bu videoyu izledikten sonra, beş vektör aşı geliştirme için antijen kapsid dahil etme yaklaşımını daha iyi anlamış olmalısınız. Şu anda, bu stratejiyi nadir serotip vektörleri ile birlikte kullanıyoruz.

Bunu da yapabilirsiniz.