Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi
30 Nisan 2015
Fenestre karaciğer sinüzoidal endotel hücresi, çeşitli hastalıklardan, toksinlerden ve fizyolojik durumlardan oldukça etkilenen biyolojik olarak önemli bir filtre sistemidir. Bu değişiklikler karaciğer fonksiyonunu önemli ölçüde etkiler. Bu hücrelerdeki pencere boyutlarının ve sayısının ölçümünün standardizasyonu için yöntemler açıklanmaktadır.
Bu prosedürün genel amacı, karaciğer sinüzoidal endotelini analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle bir karaciğerin izole edilmesi ve fiksatif ile perfüze edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından karaciğer, elektron mikroskobisine hazırlık amacıyla bloklar halinde kesilir ve dehidre edilir.
Ardından, karaciğer örnekleri püskürtme kaplama işlemine tabi tutulur ve elektron mikroskobu altında incelenir. Son olarak, elektron mikrografları analiz edilerek fenestrasyon çapı, frekansı ve gözeneklilik yüzdesi hesaplanır. Nihayetinde, çeşitli koşullar altında karaciğer sinüzoidal endotelindeki değişiklikleri göstermek için elektron mikroskopisi kullanılır.
Bu yöntem, karaciğer kan damarlarının endotelindeki ultrastrüktür ve morfoloji hakkında bize bilgi sağlar. Aynı şekilde böbrek ve beynin incelenmesi için de kullanılabilir. Hayvan kullanımını içeren tüm prosedürler yerel mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmektedir. Bu çalışma, Sydney Yerel Sağlık Bölgesi Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır.
İzin verilen prosedürler proje lisans belgelerinde açıklanmıştır ve hayvan refahının her an sağlanmasını garanti eden kılavuzlara uygundur. Bu, hayatta kalma amaçlı olmayan (non survival) bir cerrahidir. Metin protokolüne göre fiksatifi hazırladıktan sonra, perfüzyon tamponunu ve fiksatifi 35 ila 37 °C'ye ısıtın.
Hayvan, tek bir intraperitoneal ketamin ve xylazine enjeksiyonu ile anestezi edildikten sonra, sedasyon seviyesi arka ekstremite çekme refleksi ve kuyruk sıkıştırma ile değerlendirilir. Ardından, küt uçlu makas kullanılarak, karaciğere ve portal vene ulaşmak için hayvanın abdomeninde Y şeklinde bir insizyon yapılır. Daha sonra portal venin etrafına, biri karaciğere proksimalde, diğeri ise karaciğere daha distalde olmak üzere iki adet çok gevşek sütür bağlanır.
Portal veni uygun büyüklükte bir IV kanül ile kanüle edin. Ardından kanülü sabitlemek için sütürleri sıkın. Şimdi 37 °C'ye ısıtılmış 5 ila 20 mL PBS kullanarak, 10 cm H2O basınçta perfüzyona başlayın.
Artefaktlara ve karaciğere zarar verecek kadar yüksek hava basıncına neden olabileceği için karaciğere hava kabarcığı girmesinden kaçının; tamponun karaciğerden serbestçe çıkışına izin vermek için abdominal ve torasik vena cava'yı kesin. Bu işlem; yüksek geri basıncı, karaciğerin, sinüzoidal ve endotelyal hücrelerin veya LCC'lerin hasar görmesini önler. Karaciğer kandan arındığında, PBS'yi elektron mikroskopisi veya em fiksatörü ile değiştirin ve karaciğer sertleşip oldukça soluklaşana kadar perfüzyona devam edin.
Yaklaşık beş dakika. Ardından skalpelle karaciğeri bir ila iki kübik milimetrelik bloklar halinde kesin. Sabitleme işlemi için em fiksatif kullanın.
Dokuyu 4 °C'de 24 ila 72 saat boyunca fikse edin. Ardından dokuyu 0,1 molar sodyum sitrat tamponuna aktarın ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelemek üzere numuneleri hazırlayana kadar 4 °C'de 12 aya kadar saklayın. Numuneler metin protokolüne uygun olarak dehidrate edildikten sonra, metal SEM stuplarının tabanını etiketleyin ve bir diseksiyon mikroskobu altında stupların üst kısmına çift taraflı karbon bant uygulayın; SEM için en uygun sinüzoidlere sahip yüzeyi belirlemek amacıyla numuneleri görselleştirin.
Seçilen yüzeyi karbon bantlı stub yüzeyine bakacak şekilde yerleştirin ve stub üzerine sıkıca yapıştırın. Metin protokolüne uygun olarak sputter kaplama ve SEM işlemlerini gerçekleştirdikten sonra, ImageJ'de bir görüntü açın ve resme gömülü ölçek çubuğunu kullanarak ölçeği ayarlayın; ImageJ'deki poligon aracını kullanarak, fenestreli ve fenestresiz alanlar dahil olmak üzere LSEC'in tüm düz alanının çevresini çizin, hücre yüzeyinde bulunan ve fenestrasyonları kapatabilecek büyük debris parçalarını hariç tutun. Fenestrasyon çapını ölçmek için çizgi aracını seçerek her bir fenestrasyonun en uzun çapı boyunca bir çizgi yerleştirin.
Çizgiyi ölçmek için M'ye, çizgiyi resim üzerine kalıcı olarak çizmek için D'ye basın. Bu çizgi fenestrasyon çapı olarak tanımlanır ve artık Image J'nin sonuçlar kutusunda mevcut olacaktır. Fenestrasyonların yanı sıra LSEC sitoplazmasındaki 250 nanometer üzerindeki daha büyük delikler olan tüm boşlukları ölçün. Dairesel olmayan boşlukların çevresini çizerek ve Image J kullanarak alanlarını hesaplayın; ardından Image J sonuçlar kutusundaki verileri bir Excel hesap tablosuna aktarın.
Daha ileri analizler için, fenestrasyon hesaplamalarını gerçekleştirmek üzere aşağıdaki formülleri kullanın. Ortalama fenestrasyon çapı, tüm fenestrasyon çaplarının ortalamasına eşittir. Fenestrasyon alanı, r'nin karesi ile pi'nin çarpımına eşittir; burada R, tekil fenestrasyon çaplarından hesaplanır.
Gözeneklilik yüzdesi, sigma pi R kare değerinin analiz edilen toplam alan çarpı mikron değerine bölünmesi ve 100 ile çarpılmasıyla hesaplanır; boşlukların toplam alanı bu hesaplamadan hariç tutulmalıdır. Verileri yayınlarda sunarken, fenestrasyonları tanımlamak için sınır çaplarının kullanıldığını belirten bir ifadeyle birlikte fenestrasyon çapını, fenestrasyon frekansını ve gözenekliliği ekleyin; ayrıca boşlukların analize dahil edilip edilmediğini onaylayan bir ifade ile fenestrasyon çapının frekans dağılım grafiğini, karaciğer blok sayısını ve görüntüleri de ekleyin. SEM ile yapılan düşük büyütmeli inceleme, karaciğer örneğinin; portal traktus ve burada gösterilen merkezi ven dahil olmak üzere birçok büyük karaciğer damarını ve sinüzoidi gözlemlemek için yeterince geniş bir açık alana sahip düz bir yüzeyini ortaya koymaktadır.
Karaciğer bloğunun montaj sapına doğru şekilde yerleştirilmesi, sinüzoidlerin net görüntülerinin elde edilmesi için esastır; karaciğer sinüzoidlerinin tüm detaylarını kapatan parlak kapsülden ise kaçınılmalıdır. Bu nedenle, burada gösterildiği gibi, daha yüksek büyütme LSEC fenestrasyonlarının gözlemlenmesine olanak tanır. Hepatosit plakaları kan damarlarına benzeyebilir, ancak BLI gibi özellikler oryantasyona yardımcı olur.
Bu şekil, yüksek perfüzyon basıncının, SEM altında kolayca tanımlanabilen ve LSEC SIV plakalarının birleşmesinden kaynaklandığı düşünülen endotelyumdaki büyük boşluklar gibi artefaktlara neden olabileceğini göstermektedir; çekirdeklerin hemen üzerindeki hücre membranından kaçınmak, LSEC yüzeyinin altında bir şişkinlik şeklinde görülebilir ve fenestrasyon yoğunluğu ile gözeneklilik hesaplamalarının doğruluğuna yardımcı olur. Son olarak, LSEC fenestrasyon çapının, yoğunluğunun ve frekansının kantifikasyonu, fenestrasyonların ampirik bir ölçümünü sağlar ve yaşlanma, hastalık, toksinler veya tedavilerin neden olduğu değişikliklerin ölçülmesine olanak tanır. Perfüzyon prosedürünün ardından doku, hücresel ultrastrüktüre ve mitokondriyal yapıya bakmak için transmisyon elektron mikroskobisi gibi diğer teknikler için işlenebilir.
Histoloji için de kullanılabilir.
Tam transkripti görüntüleyin ve binlerce bilimsel videoya erişin
Genel Bakış
Bu makale, taramalı elektron mikroskobu (SEM) kullanarak karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin (LSEC'ler) morfolojisinin analiz edilmesi için standartlaştırılmış bir protokolü detaylandırmaktadır. Bu yöntem; fizyolojik, patolojik ve farmakolojik faktörlerin karaciğer fonksiyonlarını nasıl etkilediğini anlamak için kritik öneme sahip olan fenestrasyon boyutunun, frekansının ve porositesinin doğru şekilde ölçülmesine olanak tanır.
Temel Çalışma Bileşenleri
Bilim Alanı
- Karaciğer biyolojisi
- Hücresel morfoloji
- Elektron mikroskobisi
Arka Plan
- LSEC'ler, maddelerin kandan karaciğer parenkimine transferini kolaylaştıran transhücresel fenestrasyonlara sahiptir.
- Fenestrasyonlar dinamiktir ve hastalıklara, ilaçlara veya fizyolojik durumlara yanıt olarak boyut ve sayı bakımından değişiklik gösterebilirler.
- Fenestrasyonların doğru şekilde miktarının belirlenmesi, karaciğer fonksiyonlarının ve patolojisinin incelenmesi için temeldir.
- Çalışmalar arasında tekrarlanabilirlik ve karşılaştırılabilirlik için standardize edilmiş görüntüleme ve analiz protokollerine ihtiyaç vardır.
Çalışmanın Amacı
- LSEC'lerin fiksasyonu, işlemesi ve SEM analizi için tekrarlanabilir bir protokol sağlamak.
- Fenestrasyon çapının, sıklığının ve porozitesinin doğru ölçümünü mümkün kılmak.
- Çeşitli deneysel koşullar altında LSEC morfolojik değişikliklerinin incelenmesini kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Isıtılmış tamponlar ve fiksatifler kullanarak karaciğerin perfüzyon fiksasyonu.
- Karaciğer dokusunun diseksiyonu ve küçük bloklar halinde kesilmesi.
- SEM için örneklerindehidratasyonu, montajı ve sputter kaplaması.
- LSEC fenestrasyonlarını görüntülemek için çeşitli büyütmelerde SEM görüntüleme.
- Fenestrasyon çapını, frekansını ve gözeneklilik yüzdesini ölçmek için ImageJ kullanılarak yapılan kantitatif görüntü analizi.
Temel Sonuçlar
- SEM, LSEC fenestrasyonlarının ve karaciğer sinüzoidal yapılarının net bir şekilde görselleştirilmesini sağlar.
- Yapay boşluklar gibi artefaktların önlenmesi için uygun perfüzyon basıncı ve doku işleme kritik öneme sahiptir.
- Kantitatif analiz; fenestrasyon çapı, yoğunluğu ve gözenekliliği hakkında ampirik veriler sağlar.
- Protokol; yaşlanma, hastalık, toksinler veya tedavilerin LSEC'lerde yol açtığı morfolojik değişikliklerin tespit edilmesine olanak tanır.
Sonuçlar
- Bu standartlaştırılmış SEM protokolü, LSEC fenestrasyonlarının güvenilir ve tekrarlanabilir ölçümlerini sağlar.
- Doğru morfolojik analiz, karaciğer fonksiyonu ve patolojisi üzerine yapılan çalışmaları destekler.
- Yöntem; böbrek ve beyin gibi diğer organların analizi için uyarlanabilir.
Sıkça Sorulan Sorular
Sektörel Uygulama ve Önem
Karaciğer sinüzoidal endotel hücre fenestrasyonlarının doğru şekilde nicelleştirilmesi, hepatotoksisite ve metabolik hastalık hedef doğrulamalarında mekanistik risk azaltmaya olanak tanır. Standartlaştırılmış SEM tabanlı analiz, bileşik kaynaklı endotel değişikliklerini değerlendirmek için öngörülebilir bir güvenilirlik sağlayarak keşif süreçlerindeki erken aşama devam/dur kararlarını destekler. Bu yöntem, preklinik modeller genelinde ultrastrüktürel fenotipleri karaciğer fonksiyon sonuçlarıyla ilişkilendirerek translasyonel sürekliliği artırır.
Biyofarma Ar-Ge'de Stratejik Uygulamalar
Erken Keşif ve Hedef Doğrulama
- Bilimsel Değer: Fenestrasyon çapını, frekansını ve porozitesini LSEC fenotipinin fonksiyonel çıktıları olarak nicelleştirerek terapötik hipotezleri sorgular.
- Operasyonel Değer: Endotelyal geçirgenlik mekanizmalarının tekrarlanabilir ultrastrüktürel değerlendirmesi yoluyla biyolojik risklerin azaltılmasını sağlar.
- Portföy Etkisi: Fenestrasyon dinamiklerini hastalıkla ilgili fizyolojik durumlarla ilişkilendirerek hedef seçimindeki öngörü güvenilirliğini destekler.
Tarama ve Assay Geliştirme
- Bilimsel Değer: Temel fenestrasyon metriklerini belirleyerek, valide edilmiş biyolojik sistemleri sonraki aşamadaki bileşik taramalarına hazırlar.
- Operasyonel Değer: Sabit perfüzyon, fiksasyon ve görüntü analizi protokolleri aracılığıyla analiz standardizasyonu ve tekrarlanabilirliğini sağlar.
- Stratejik Değer: Yüksek içerikli endotelyal fenotiplendirmeye uygun, SEM kaynaklı kantitatif çıktılarla tarama hazırlık durumunu vurgular.
Translasyonel ve Preklinik Araştırmalar
- Bilimsel Değer: Toksinler, yaşlanma veya hastalık durumlarına yanıt olarak fenestrasyon değişikliklerinin tespit edilmesine olanak tanıyarak hastalıkla olan ilgiyi tartışır.
- Operasyonel Değer: Tutarlı LSEC morfometrik analizi aracılığıyla, keşif aşamasından preklinik doğrulamaya kadar olan sürekliliği tanımlar.
- Portföy Etkisi: Deneysel koşullar altında endotelyal bütünlüğe dair ampirik veriler sağlayarak risk ayarlı ilerleme kararlarını ele alır.
İşlem Hattı ve İş Akışı Entegrasyonu
Yöntemi, endotelyal bütünlüğün mekanizma tabanlı bileşik değerlendirmesine temel oluşturduğu, hedef doğrulamadan preklinik değerlendirmeye kadar uzanan keşif sürekliliği içindeki konumuna yerleştirir.
- Keşif Biyolojisi: Yöntemin; fenestrasyon morfometrisi aracılığıyla hipotez testini, yolak açıklığının netleştirilmesini veya biyolojik risklerin azaltılmasını nasıl desteklediğini açıklar.
- Tarama: Makale tarafından desteklendiği durumlarda; analiz hazırlığını, tekrarlanabilirliği veya kantitatif çıktıları tanımlar.
- Analitikler: Ekiplerin farklı deneysel gruplar arasındaki koşulları karşılaştırmasına yardımcı olan ölçümleri, okumaları veya istatistiksel çıktıları vurgular.
- Translasyonel Araştırma: Yalnızca kaynak desteklediği takdirde, yöntemi preklinik süreklilik veya biyobelirteç uyumu ile ilişkilendirir.
- Kurumsal Yeniden Kullanım: Yöntemi tek kullanımlık bir teknikten ziyade, yeniden kullanılabilir bir yetkinlik olarak çerçeveler.
Operasyonel ve Kurumsal Etki
- Bilimsel Değer: Öngörücü güven, hedef doğrulaması, endotel fonksiyon değerlendirmesindeki mekanistik belirsizliğin azaltılması.
- Operasyonel Değer: LSEC fenotipleme iş akışlarının standardizasyonu, tekrarlanabilirliği ve ölçeklenebilirliği.
- Stratejik Değer: Karaciğer hedefli programlarda daha iyi devam/durdurma kararları, sermaye verimliliği ve azaltılmış geç evre biyolojik risk.
- Portföy Etkisi: Nicelendirilebilir endotel değişimlerine dayalı, riske göre ayarlanmış önceliklendirme ve ilerleme kararları.
Uygulama Hususları
- Elektron mikroskopisi numune hazırlama ve morfometrik analiz konularında gerekli bilimsel uzmanlık.
- SEM, sputter kaplama cihazı ve görüntü analiz yazılımı dahil olmak üzere enstrümantasyon ve analitik altyapı ihtiyaçları.
- Laboratuvarlar arası fiksasyon, dehidrasyon ve görüntüleme protokolleri için ekipler arası standardizasyon gereksinimleri.
- Kaynağında belirtildiği üzere, böbrek ve beyin endotelyumu gibi model sistemler arasındaki adaptasyon hususları.
- Perfüzyon basıncından kaynaklanan artefaktların önlenmesi ve uygun numune oryantasyonu dahil olmak üzere, kaynak materyalle desteklenen pratik sınırlamalar.
