Name: Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-04-30T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 38 s
Description: Keşfedin karaciğer sinüs endotel hücrelerinin morfolojisini taramalı elektron mikroskobu ile analiz etme yöntemini. Bu standart protokol, fenestrasyon çapı, sıklığı ve gözenekliliğinin doğru ölçümünü sağlar.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarların teşekkür hakkı yok.

NOT: Hayvanların kullanımını içeren tüm işlemler yerel mevzuata uygun olarak yürütülmektedir. Çalışmalarımız Sydney İl Sağlık İlçe Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır. izin prosedürleri, proje ruhsat belgelerinde açıklanan ve her zaman hayvan refahı sağlayacak yönergeleri izleyin edilir. Işin yapıldığı ülkenin hayvan deneyleri mevzuat uyumu sağlayın. 1. Protokol EM sabitleyici Hazırlama için <ol><li> Sabitleştirici 100 ml için, 65 ° C bir konik bir şişe içinde 25 ml distile su, ısıya paraformaldehit toz 2 g eklenerek manyetik bir karıştırıcı ile sürekli karıştırmak suretiyle paraformaldehid hazırlar. NOT: Glutaraldehyde, paraformaldehıt ve sodyum kakodilat tampon tüm tehlikeli maddeler ve her zaman fumehood ele alınmalıdır. </li><li> Daha sonra soğumaya bırakın 65 ºC min 2 ısı. Gerekirse, sodyum hidroksit çözeltisi ekleme dropwISE tamamen çözeltinin-berraklaştırılması için karıştırılırken. NOT: sodyum hidroksit tehlikeli, dikkatli olun. </li><li> EM notu stok glutaraldehit 10 ml, 50 ile 0.2 M sodyum kakodilat tamponu ml sükroz 2 g ekleyin ve bir manyetik karıştırıcı ile karıştırın. 1.0 M CaCl 2 2 ml ekleyin. </li><li> Damıtılmış su ile 100 ml&#39;ye solüsyonu yapmadan önce pH 7.4&#39;e ayarlayın. Nihai sabitleyici% 2.5 glutaraldehit,% 2 paraformaldehit, 2 mmol CaCl2, 0.1 M kakodilat tampon içinde% 2 sukroz içermektedir. Toplam Osmolalite 440 mOsmol / L olduğundan emin olun. Preparat 24 saat içinde kullanın. </li></ol> Karaciğer 2. perfüzyon Fixation <ol><li> 37 ºC - 35 Sıcak perfüzyon tampon ve fiksatif. kan kaybı tamponu ve fiksatif doğru sıcaklık doku bütünlüğünü sağlamak için yardımcı olur. </li><li> 50 mg / kg ketamin ve 5 mg / kg iksilazin tek bir intraperitoneal enjeksiyon ile hayvan anestezi uygulayın. </li><li> Hayvan altına alındıktan sonraarka bacak çekilmesi ve kuyruk tutam tarafından değerlendirilen derin anestezi, Y kesi karaciğer ve portal ven ortaya çıkarmak için hayvanın karın künt uçlu makas ile yapılır. NOT: Bu ekipman kolayca SEM görülecektir mikroorganizmalar ve genel enkaz ile örneklerin kirlenmesini önlemek için temiz olduğundan emin olun. </li><li> Diğer daha distalde karaciğer, karaciğer portal ven yaklaşık bir proksimal iki çok gevşek sütür kravat. </li><li> Kanül sabitlemek için .Tighten dikişler (fareler için sıçanlar için 18 G, 22 G) uygun boyutta IV kanül ile portal ven cannulate. </li><li> Fosfat tamponlu tuzlu su ile perfüzyon başlar 37 ° C ısıtıldı ve H 2 0 10 cm arasında bir basınçta. PBS içinde 5 ila 20 mi, genellikle karaciğer asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​için gereklidir. NOT: hava kabarcıkları da embolizasyon ve basınca sekonder eserler neden olarak kanül bağlı tüpler aracılığıyla karaciğer girmesine izin vermeyin; Hepatositlerde hasar, siPerfüzyon basıncı fazla yüksek ise, nusoids ve LSEC fenestrasyonlar oluşur. </li><li> Abdominal ve torakal vena kava tampon karaciğer serbestçe çıkmak için izin Sever. Bu LSECs yüksek geri basınç hasarını önler. </li><li> Karaciğer kan ücretsizdir sonra, EM fiksatif ile PBS değiştirin ve karaciğer sertleştirilmiş ve çok solgun kadar, yaklaşık 5 dakika boyunca serpmek. </li><li> Perfüzyon durdurun ve 1 sabitlenir karaciğer kesti - keskin neşter kullanılarak 2 mm 3 blok. </li><li> 4 ºC&#39;de 72 saat - 24 EM sabitleştirici sonrası düzeltme doku. Not: Genellikle, underfixation overfixation daha eserler neden olur. </li><li> 4 ºC&#39;de depolama için 0.1 M sodyum kakodilat tampon sonrası düzeltme dönemi izleyen sabitleyici değiştirin. NOT: Bu şekilde saklanan örnekler bir (12 aya kadar) önemli zaman döneminde, ancak zamanında ikincil sabitleme için korunacaktır ve sınav En iyi sonuçlar için tavsiye edilir. </li></ol> 3. İğne Perfusion NOT: İğne sabitleme doğrudan biyopsi karaciğer dokusu içine fiksatif enjekte edilmesini içeren perfüzyon fiksasyon bir çeşididir. sabitleştirici onları asıl bulbus olfaktoryusları alındı ​​ve sabitleştirici doku bloğun tüm teşhir amacıyla kan damarları aracılığıyla temizlenmesi için amaçtır. Bakım basınç yaralanması 18,19 önlemek için düşük enjekte etme basıncını tutmak için alınmalıdır. <ol><li> Hayvan veya konunun karaciğer küçük bir parça çıkarıp kan ve enkaz kaldırmak için tuzlu suda durulayın. </li><li> Ince uçlu bir iğne (tipik olarak bir insülin şırıngası) ile donatılmış bir şırınga halinde normal tuzlu su çizin. </li><li> Kan dokusu dışarı kızarmış kadar karaciğere çok yavaş tuzlu su enjekte edilir. Çoklu enjeksiyonlar gerekebilir. </li><li> Ince delikli bir iğnesi (tipik bir insülin şırınga) ile donatılmış bir başka şırınga içine EM fiksatif çizin. </li><li> Zor ve renk tan hale gelinceye kadar karaciğere çok yavaş fiksatif enjekte edilir. Çoklu püskürtmes gerekebilir. </li><li> Keskin bir neşter kullanılarak 2 mm 3 blok - 1 içine sabit karaciğer kesin. 72 saat 4 ° C - 24 EM sabitleştirici kuluçkaya yatmaktadır. İkincil fiksasyon başlamadan önce 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 kere yıkayın. </li></ol> Taramalı Elektron Mikroskobu için 4. Hazırlık <ol><li> Yıkama örnek 0.1 M sodyum kakodilat tamponunda 3 kez. Lipidler düzeltmek için, sonrası 2 saat süreyle 0.1 M sodyum kakodilat tamponu içinde% 2 osmiyum tetroksit numuneyi düzeltin. NOT: glutaraldehit ve osmiyum tetroksit çapraz reaksiyona ve SEM eserler üretmek olarak komple yıkama çok önemlidir. </li><li> Dehidrasyonu başlatma etanol artan konsantrasyonlarda örnekleri durulayın. 5 dakika boyunca% 50 etanol içinde ilk durulama; % 70 etanol ile 5 dakika boyunca, sonra 3 kez; % 90 etanol ile 5 dakika boyunca 3 kez yıkayın; % 100 etanol içinde 5 dakika için 2 defa yıkayın; ve son olarak% 100 etanol (moleküler elek) içinde 10 dakika boyunca 2 kez yıkayın. </li><li> Örneklerinden her etanolü çıkarmak<html> ve fumehood içinde ve heksametildisilazan (HMDS) ile değiştirin ve 10 dakika süre ile bırakın. Doku örneklerinden HMDS &#39;yi çıkarın ve buharlaşmasına izin verin. NOT: Bu nedenle son dehidrasyon aşaması için kullanmadan önce RT ulaşmak için izin yaparken soğuk HMDS oldukça higroskopik olduğunu. </li><li> İsteğe bağlı olarak, hemen örnekleri monte veya SEM mount hazır olana kadar bir kurutucu içine yerleştirin. </li></ol> 5. Montaj NOT: Doğru örnek montaj SEM altında analiz için kullanılabilir açıkça belirlenen sinüzoidler sayısını en üst düzeye çıkaracaktır. <ol><li> Metal SEM taslakları tabanını Etiket ve taslakları üstüne çift taraflı iletken karbon bandı uygulayın. </li><li> Sonraki SEM için en iyi sinüzoidlerin ile yüzeyi tanımlamak için diseksiyon mikroskop kullanılarak örnekleri gözünüzde canlandırın. Saplama karbon bant yüzeyine yukarı o yüzeyi yerleştirin. </li><li> Çubuk örnekleri sıkıca saplama, numuneler artık serpme kaplama için hazırız. </li></ol>ove_title &quot;&gt; 6.. Kaplama NOT: Bir püskürtme kaplayıcı gerekçesiyle numune iletken metal (altın veya platin) ince bir film ile kaplanması örnek ve elektron ışını hasardan korur. Kaplama ise ilgi çok kalın yapıları gölgede olabilir. <ol><li> Otomatik ince püskürtme kaplayıcıda vakum odasına yerleştirin taslakları, 45 saniye boyunca rotasyona modu ve otomatik püskürtme kaplama ayarlayın. Ancak altın da uygundur, ince ayrıntılarıyla için platin kaplama kullanın. </li><li> Monte karaciğer örneklerinin dış yüzeylerine karbon boya ince bir tabaka sürün kat değil sinüs yüzeyleri özen. </li><li> Örnekler platin ile kaplanır ve karbon boya kuruduktan sonra da SEM ile ilgili gözlem için hazırdır. Örnekler bir kurutucu içinde saklanabilir. </li></ol> 7. Tarama Elektron Mikroskobu Kullanımı <ol><li> Yer taramalı elektron mikroskobu içine numune ve vakum mikroskop dönün. &lt;/ Li&gt; <li> Düşük büyütmede başlanarak numunelerin görünüm için standart mikroskop çalışma prosedürleri kullanarak, giderek artan büyütme. </li><li> Mikroskop mesafe, nokta boyutunu ve astigmatizma çalışmak için uygun ayarlanır emin olun. </li><li> Tespit bütünlüğü için kontrol edin. LSEC boşluklar çoğunlukla ücretsiz ve 30 ölçüm fenestrasyonlar içeriyorsa - 250 nm çapında bu genellikle o numune hazırlama başarılı olmuştur işaret eder. </li><li> Sinüzoidlerinde boşlukların tamamen veya fenestrasyonlar yoksun iseniz numune hazırlama başarılı olmamıştır veya önemli bir patoloji yoktur. Bu durumda, çok ince bir jilet ile örnek dilim ve kesme yüzeyleri kaplanabilir ve başarılı bir şekilde sabit sinüzoidler için analiz edilmiştir. </li><li> Yaklaşık 15.000-20.000 × büyütme iyi fiksasyon ve fenestrasyonlar açıkça (görünür nerede genellikle en az 10 fenestrasyonlar içeren enkaz ücretsiz düz LSEC yüzeyleri seçin). </li><li> Karaciğer başına en az iki blok kullanılarak, blok farklı alanlarından, karaciğer başına en az 10 sinüzoidler görüntülerini kaydedin. 15.000 10 mikrografları Örnekleme - fenestrasyonlar ölçümü tüm karaciğer temsilcisi olmak için hayvan başına 20.000 × büyütme genellikle yeterlidir. </li></ol> 8. Analiz NOT: NIH ücretsiz indirebilirsiniz ImageJ yazılım fenestrasyonu çap ve frekans (ölçmek için kullanılmaktadır <a href="http://imagej.nih.gov/ij">www.imagej.nih.gov/ij</a> ). <ol><li> Açık Resim J ve resim (Ekran shot 1) gömülü ölçek çubuğunu kullanarak ölçeği ayarlayın. </li><li> Fenestre ve defenestrated alanlar dahil LSEC tüm düz alanı etrafında çokgen ImageJ aracını iz kullanma. Bu yanlış gözenekliliği şişirmek gibi sadece elek plakaları iz yok. Obscuri olabilir hücre yüzeyi üzerinde artıkların herhangi bir büyük parçalar hariçng fenestrasyonlar. </li><li> , Fenestrasyonu çapını ölçmek satırı aracını seçerek her fenestrasyon en uzun çapı boyunca bir çizgi takip ve çizgi ölçmek için &quot;m&quot; basın ve &quot;D&quot; kalıcı resmin üzerine çizgi çizmek (berabere). Bu çizgi fenestrasyonu çapı olarak tanımlanır. hat uzunluğu artık ImageJ sonuçları kutunun (Ekran shot 2) satışa sunulacak. </li><li> Daha büyük 250 nm üzerindeki LSEC sitoplazmada delikler, hem de fenestrasyonlar tüm boşlukları ölçün. Boşluklar genellikle boşluklar da hastalık ve toksisite sonucu oluşabilir, ancak kötü perfüzyon veya fiksasyon, yansıtan eserler bulunmaktadır. boşluklar verileri daha sonra analiz fenestrasyon parametrelerinin hesaplanması dışında tutulacaktır. </li><li> Dairesel olmayan boşluklar alan boşlukları etrafında izleme ve ImageJ kendi alanını hesaplayarak hesaplanmalıdır. </li><li> Furthe için bir EXCEL elektronik tabloya ImageJ sonuçları kutusundan verileri yapıştırınr analizi. </li></ol> 9. Hesaplamalar <ol><li> (Boşluklar ≥ 250 nm boşluklar, dahil değil) Tüm fenestrasyonu çapları ortalama fenestrasyon çapı = ortalama. </li><li> R, yarıçap, tek tek fenestrasyon çapı (r = D / 2), aşağıdakileri içeren olmayan boşluklar hesaplanır fenestrasyon alan = πr 2. </li><li> Gözeneklilik (%) = (Σ (πr 2) / analiz edilen toplam alan - boşlukların Σ (alan =)) (2 um)) x 100. </li><li> Fenestrasyonu frekansı = fenestrasyonlar toplam sayısı / (toplam alan (boşlukların alan) (mikron 2)-Σ analiz. </li></ol> Fenestrasyonlu Verilerin 10. Sunumu NOT: fenestrasyonu verilerinin ölçümü de dahil olmak üzere Mümkün yayınlar aşağıdaki bilgileri içermelidir <ol><li> Kullanılan sınır çapları genellikle (fenestrasyonlar tanımlamak ne doğrulayan bir açıklama ile fenestrasyon çapı,fenestrasyonu frekans (sayı / um 2) ve porozite (%),) nm 50-250 arası. </li><li> Boşluklar analizi, fenestrasyon çapı ve ciğer, bloklar, görüntü ve fenestrasyonlar sayısının frekans dağılımı grafiği analize dahil edilmelidir dahil edilip onaylayan bir açıklama. </li></ol>

<ol><li>Cogger, V. C., Le Couteur, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCogger%2C+VC+%22The+Liver%3A+Biology+and+Pathobiology%22">The Liver: Biology and Pathobiology</a>. Arias, I. M., et al. , John Wiley & Sons, Ltd. 387-404 (2009).</li>
<li>Fraser, R., Dobbs, B. R., Rogers, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+and+the+liver+sieve%3A+the+role+of+fenestrated+sinusoidal+endothelium+in+lipoprotein+metabolism%2C+atherosclerosis%2C+and+cirrhosis%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins and the liver sieve: the role of fenestrated sinusoidal endothelium in lipoprotein metabolism, atherosclerosis, and cirrhosis.</a> Hepatology. 21, 863-874 (1995).</li>
<li>Wisse, W., De Zanger, R. B., Charels, K., Van Der Smissen, P., McCuskey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+liver+sieve%3A+considerations+concerning+the+structure+and+function+of+endothelial+fenestrae%2C+the+sinusoidal+wall+and+the+space+of+Disse%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">The liver sieve: considerations concerning the structure and function of endothelial fenestrae, the sinusoidal wall and the space of Disse.</a> Hepatology. 5 (4), 683-692 (1985).</li>
<li>Reilly, J. N., Cogger, V. C., Fraser, R., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+feeding+and+fasting+on+fenestrations+in+the+liver+sinusoidal+endothelial+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Pathology%22%5BJournal%5D)">The effect of feeding and fasting on fenestrations in the liver sinusoidal endothelial cell.</a> Pathology. 42 (3), 255-258 (2010).</li>
<li>Tian, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+serotonin+receptor-2B+rescues+small-for-size+liver+graft+failure+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Activation of serotonin receptor-2B rescues small-for-size liver graft failure in mice.</a> Hepatology. 53 (1), 253-262 (2011).</li>
<li>Cogger, V. C., Mitchell, S. J., Warren, A., de Cabo, R., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-Related+Loss+of+Responsiveness+to+2%2C5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine+in+Liver+Sinusoidal+Endothelial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gerontol+A+Biol+Sci+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Age-Related Loss of Responsiveness to 2,5-Dimethoxy-4-Iodoamphetamine in Liver Sinusoidal Endothelial Cells.</a> J Gerontol A Biol Sci Med Sci. 69 (5), 514-518 (2013).</li>
<li>Reilly, J. N., Cogger, V. C., Le Couteur, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Old+age+is+associated+with+ultrastructural+changes+in+isolated+rat+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">Old age is associated with ultrastructural changes in isolated rat liver sinusoidal endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 59 (1), 65-69 (2010).</li>
<li>Le Couteur, D. G., et al. Calorie Restriction, Aging and Longevity. Rattan, A. E., Le Couteur, D. G., de Cabo, R., et al. , 191-216 (2010).</li>
<li>McLean, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+pseudocapillarization+of+the+human+liver%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Age-related pseudocapillarization of the human liver.</a> J Pathol. 200 (1), 112-117 (2003).</li>
<li>Le Couteur, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudocapillarization+and+associated+energy+limitation+in+the+aged+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Pseudocapillarization and associated energy limitation in the aged rat liver.</a> Hepatology. 33 (3), 537-543 (2001).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+acute+oxidative+stress+on+the+ultrastructure+of+the+perfused+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">The effect of acute oxidative stress on the ultrastructure of the perfused rat liver.</a> Pharmacol Toxicol. 89 (6), 306-311 (2001).</li>
<li>Horn, T., Christoffersen, P., Henriksen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alcoholic+liver+injury%3A+defenestration+in+noncirrhotic+livers-a+scanning+electron+microscopic+study%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Alcoholic liver injury: defenestration in noncirrhotic livers-a scanning electron microscopic study.</a> Hepatology. 7 (1), 77-82 (1987).</li>
<li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alterations+in+liver+sinusoidal+endothelium+in+a+baboon+model+of+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Alterations in liver sinusoidal endothelium in a baboon model of type 1 diabetes.</a> Diabetologia. 50 (9), 1969-1976 (2007).</li>
<li>Fraser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+perfusion+pressure+damages+the+sieving+ability+of+sinusoidal+endothelium+in+rat+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">High perfusion pressure damages the sieving ability of sinusoidal endothelium in rat livers.</a> Br J Exp Pathol. 61 (2), 222-228 (1980).</li>
<li>Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electron+microscopic+study+of+the+fenestrated+endothelial+lining+of+rat+liver+sinusoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastruct+Res%22%5BJournal%5D)">An electron microscopic study of the fenestrated endothelial lining of rat liver sinusoids.</a> J Ultrastruct Res. 31 (1), 125-150 (1970).</li>
<li>Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ultrastructural+characterization+of+the+endothelial+cell+in+the+rat+liver+sinusoid+under+normal+and+various+experimental+conditions%2C+as+a+contribution+to+the+distinction+between+endothelial+and+Kupffer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Ultrastruct+Res%22%5BJournal%5D)">An ultrastructural characterization of the endothelial cell in the rat liver sinusoid under normal and various experimental conditions, as a contribution to the distinction between endothelial and Kupffer cells.</a> J Ultrastruct Res. 38 (5), 528-562 (1972).</li>
<li>Fahimi, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perfusion+and+immersion+fixation+of+rat+liver+with+glutaraldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Perfusion and immersion fixation of rat liver with glutaraldehyde.</a> Lab Invest. 16 (5), 736-750 (1967).</li>
<li>Wisse, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fixation+methods+for+electron+microscopy+of+human+and+other+liver%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Fixation methods for electron microscopy of human and other liver.</a> World J Gastroenterol. 16 (23), 2851-2866 (2010).</li>
<li>Vreuls, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Jet-fixation%3A+a+novel+method+to+improve+microscopy+of+human+liver+needle+biopsies%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Jet-fixation: a novel method to improve microscopy of human liver needle biopsies.</a> Hepatology. 59 (2), 737-739 (2014).</li>
<li>Furrer, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+reverts+age-related+capillarization+and+failure+of+regeneration+in+the+liver+through+a+VEGF-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Serotonin reverts age-related capillarization and failure of regeneration in the liver through a VEGF-dependent pathway.</a> Proc Natl Acad Sci U. S. A. 108 (7), 2945-2950 (2011).</li>
<li>Zhang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((OxLDL+induced+injury+and+defenestration+of+HLSECs+via+LOX-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">OxLDL induced injury and defenestration of HLSECs via LOX-1.</a> J Mol Endocrinol. , (2014).</li>
<li>May, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+model+for+conditional+induction+and+rescue+of+portal+hypertension+reveals+a+role+of+VEGF-mediated+regulation+of+sinusoidal+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A transgenic model for conditional induction and rescue of portal hypertension reveals a role of VEGF-mediated regulation of sinusoidal fenestrations.</a> PLoS One. 6 (7), e21478(2011).</li>
<li>Funyu, J., Mochida, S., Inao, M., Matsui, A., Fujiwara, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VEGF+can+act+as+vascular+permeability+factor+in+the+hepatic+sinusoids+through+upregulation+of+porosity+of+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">VEGF can act as vascular permeability factor in the hepatic sinusoids through upregulation of porosity of endothelial cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 280 (2), 481-485 (2001).</li>
<li>Venkatraman, L., Tucker-Kellogg, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CD47-binding+peptide+of+thrombospondin-1+induces+defenestration+of+liver+sinusoidal+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Liver+Int%22%5BJournal%5D)">The CD47-binding peptide of thrombospondin-1 induces defenestration of liver sinusoidal endothelial cells.</a> Liver Int. 33 (9), 1386-1397 (2013).</li>
<li>Wack, K. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sinusoidal+ultrastructure+evaluated+during+the+revascularization+of+regenerating+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sinusoidal ultrastructure evaluated during the revascularization of regenerating rat liver.</a> Hepatology. 33 (9), 363-378 (2001).</li>
<li>Morsiani, E., Mazzoni, M., Aleotti, A., Gorini, P., Ricci, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+sinusoidal+wall+permeability+and+liver+fatty+change+after+two-thirds+hepatectomy%3A+An+ultrastructural+study+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Increased sinusoidal wall permeability and liver fatty change after two-thirds hepatectomy: An ultrastructural study in the rat.</a> Hepatology. 21 (2), 539-544 (1995).</li>
<li>Straub, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arsenic-stimulated+liver+sinusoidal+capillarization+in+mice+requires+NADPH+oxidase%E2%80%93generated+superoxide%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Arsenic-stimulated liver sinusoidal capillarization in mice requires NADPH oxidase–generated superoxide.</a> J Clin Invest. 118 (12), 3980-3989 (2008).</li>
<li>Barberá-Guillem, E., Arrue, J. M., Ballesteros, J., Vidal-Vanaclocha, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+in+endothelial+cells+of+developing+rat+liver+in+the+transition+from+fetal+to+postnatal+life%5BTitle%5D)+AND+%22JJ+Ultrastruct+Mol+Struct+Res%22%5BJournal%5D)">Structural changes in endothelial cells of developing rat liver in the transition from fetal to postnatal life.</a> JJ Ultrastruct Mol Struct Res. 97 (1-3), 197-206 (1986).</li>
<li>Jamieson, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caloric+restriction+reduces+age-related+pseudocapillarization+of+the+hepatic+sinusoid%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Caloric restriction reduces age-related pseudocapillarization of the hepatic sinusoid.</a> Exp Gerontol. 42 (4), 374-378 (2007).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyperlipidemia+and+surfactants%3A+the+liver+sieve+is+a+link%5BTitle%5D)+AND+%22Atherosclerosis%22%5BJournal%5D)">Hyperlipidemia and surfactants: the liver sieve is a link.</a> Atherosclerosis. 189 (2), 273-281 (2006).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effects+of+oxidative+stress+on+the+liver+sieve%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">The effects of oxidative stress on the liver sieve.</a> J Hepatol. 41 (3), 370-376 (2004).</li>
<li>Cogger, V. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+structured+illumination+microscopy+of+liver+sinusoidal+endothelial+cell+fenestrations%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional structured illumination microscopy of liver sinusoidal endothelial cell fenestrations.</a> J Struct Biol. 171 (3), 382-388 (2010).</li>
<li>Braet, F., de Zanger, R., Seynaeve, C., Baekeland, M., Wisse, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparative+atomic+force+microscopy+study+on+living+skin+fibroblasts+and+liver+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Electron+Microsc%22%5BJournal%5D)">A comparative atomic force microscopy study on living skin fibroblasts and liver endothelial cells.</a> J Electron Microsc. 50 (4), 283-290 (2001).</li>
<li>Monkemoller, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+fenestrations+in+liver+sinusoidal+endothelial+cells+by+optical+localization+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Phys+Chem+Chem+Phys%22%5BJournal%5D)">Imaging fenestrations in liver sinusoidal endothelial cells by optical localization microscopy.</a> Phys Chem Chem Phys. 16 (24), 12576-12581 (2014).</li>
</ol>

Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yoktur.

doğru ve tekrarlanabilir karaciğer sinüzoidal endotel durumunu ölçmek için yeteneği, bu son derece özel hücrelerin biyolojisinin anlaşılmasında önemli bir adımdır. Böyle yapılandırılmış aydınlatma mikroskobu 32, atomik kuvvet mikroskobu 33 d-STORM (doğrudan Stokastik Optik Reconstrucion Mikroskopi) 34 gibi daha yeni teknikler in vitro bu hücrelerin morfolojisi hakkında önemli bilgiler vermek, ancak SEM görselleştirmek ve onların yapısını ölçmek için birincil metodoloji ...

Karaciğer sinusoidal endotelyal hücreleri (LSECs) yüksek hepatik sinusoid duvarını kaplayan endotel farklılaşmış hücrelerdir. LSECs olmayan diyaframlı olan fenestrasyonlar ile delinir, transselüler çapı 50-250 nm gözenekleri. LSECs yüzeyinin% 20 kadar elek plakalar 1-3 (Şekil 1) olarak adlandırılan yüzlerce onlarca gruplar halinde genellikle fenestrasyon, ile kaplıdır. Fenestrasyonlar bir yüksek verimli ultrafiltrasyon sistemi oluşturmak, plazma ve kan ve hepatositler arasında nanosubstrates aktarımını sağlar. Fenestrasyonlar dinamik yapıları vardır - kendi büyüklüğü ve / veya numara hem çeşitli fizyolojik devletler, uyuşturucu ve hastalığa tepki olarak değiştirilebilir. Örneğin, fenestrasyonlar tok halde 4 daha aç bırakılmış daha büyük olan; Hücre yaşlanması ve bir çok hastalık durumunda 7-13 oluşur başına 5,6 ve büyüklüğü bir azalmaya ve fenestrasyonlar sayısı; 2-di-iodoamphetamine fenestrasyon sayısını artırır </sup&gt;. Fenestrasyonlar büyüklüğü ve sayısı doğru ölçümü LSEC morfolojisi, çeşitli hastalık, toksik ve fizyolojik devletler tarafından nasıl etkilendiğini anlamak için önemlidir; Karaciğer fonksiyon üzerindeki etkileri; ve geliştirmek için terapötik girişimlerin 1 fenestrasyonuna modüle. fenestrasyonlar çalışma zordur. sağlam karaciğer dokusu veya kültür LSECs hem daha önce sadece gözlem kullanılarak elektron mikroskobu mümkün olmuştur bu yüzden fenestrasyonlar çapı, geleneksel ışık mikroskobu çözünürlüğü altında yatıyor. taramalı elektron mikroskobu (SEM), en sık SEM binlerce endotel yüzeyi ve ölçüm geniş alanların gözlem için sağlar, çünkü fenestrasyon boyutu, frekans ve gözeneklilik (fenestrasyon delinmiştir LSEC membran yüzdesi) incelemek için kullanılmıştır değil onlarca fenestrasyonlar binlerce eğer. Kendi programını rağmen, rapor sonuçlara yönelik çalışmalar SEM-tabanlıBu tür fenestrasyon boyut, sayı, frekans ve gözeneklilik LSEC parametreleri literatürde (Tablo 1) geniş çapta değişebilir. Fenestrasyonlar ve elek plakaları sözleşme, kırmak dilate veya numune hazırlanması sırasında birleşme kırılgan yapılardır, bu nedenle dikkatli işleme kendi bütünlüğünü korumak için gereklidir. Artmış perfüzyon basıncı 14; Fiksatif ve tampon 15 yanlış ozmolarite; yetersiz fiksasyon veya fiksasyon süresi; ve post-fiksasyon dehidrasyon ve kurutma hızı ultrastrüktürü korunması müdahale eserler (Şekil 2) üretebilir SEM için işleme her alanlardır. Fenestrasyonlar kaybı (&quot;Defenestration &#39;) ve fenestrasyon çekme indirgenmiş fenestrasyon çapı ve hücre gözeneklilik ile sonuçlanır, kötü tespitin sonucu olarak meydana gelebilir. SEM analizi için numunelerin korunmasını geliştirmek için yöntemler daha önce 15-17 tarif edilmiştir ve tartışılacaktırBurada örnek korunmasını artırmak için nasıl ek ipuçları. Numune korunması temel amaçları LSEC yüzeyi görsel böylece sinüzoidler kan kaldırmak ve yüksek basınç ya da geciktirilmiş tespit birinden LSEC zarar görmesini önlemek için vardır. Portal ven yoluyla fiksatif Whole karaciğer perfüzyon karaciğer fiksasyon için tercih edilen bir yöntemdir. Detaylı olarak tarif edildiği gibi başka bir yerde 16,18 perfüzyon düşük bir basınçta yapılmalıdır (örneğin, H 2 0 10 cm) LSEC basınçla ilgili perfüzyon eserler ve zarar gelmesini önlemek için, tipik olarak, hücre membranında içinde olduğu gibi büyük boşluklar göstermiştir. Başka bir yerde 19 detaylı bir şekilde tarif edildiği gibi Bununla birlikte, makul bir sabitleme genellikle, insan ve hayvanlarda karaciğer biyopsi iğnesi perfüzyon kullanılarak elde edilebilir. Kan örneği üzerinden temizlendi kadar bu teknik, doğrudan dokuya sabitleştirici enjekte içerir ve doku sağlam ve sabitlenir. Elektron mikroskobu için örneklerin Fixation perf olması gerekirkaraciğerleri derece hızlı otolitik süreçleri sonucunda ortaya çıkan ultrastrüktürel değişiklikleri önlemek için kan akımının kesilmesini takiben mümkün olduğunca çabuk ormed. Biz de eserler dahil en aza indirir ve fenestrasyonlar ölçümünü standartlaştıran görüntü analizi bir yöntem mevcut. Gözeneklilik ve fenestrasyon frekansı için mikrograflar için sinüzoidler seçiminde değişimi, eserlerin görüntü analizi ve hücre alanının ölçümü geçme sonuçlarını büyük farklılıklara yol açmıştır. Değerlendirilmesi ve fenestrasyonları ve veri sunumu için minimum gereksinimleri ölçümü için bir standart yaklaşım açıkça daha önce 4,10,20-31 literatürde ele alınmamıştır.

<table><tbody><tr><td>% 25 EM sınıfı Gluteraldehit</td><td>ProSciTech</td><td>C001</td><td>Stoğu ihtiyaç duyulana kadar -20 ° C'de saklayın, yeniden dondurmaktan kaçının</td></tr><tr><td>Paraformaldehit tozu</td><td>Sigma Aldrich</td><td>158127</td><td>Her zaman Paraformaldehit taze</td></tr><tr><td>Sodyum Kakodilat tozu</td><td>hazırlayın Sigma Aldrich</td><td>C0250</td><td>Tozu dH2O içinde çözerek 0.2 M stok hazırlayın, pH 7.4 hazırlayın, çoğunlukla 1: 2 seyreltme hazırlayarak 0.1 M'de kullanılır</td></tr><tr><td>Kalsiyum Klorür</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C1016</td><td>Tozu dH2O Osmiyum tretroksit içinde çözerek 1 M CaCl2 hazırlayın</td></tr><tr><td></td><td>ProSciTech</td><td>C011</td><td>Kontaminasyonu önlemek için kullanmadan önce ampulleri zayıf asitte yıkayın. Cam şişede %2 stok hazırlayın</td></tr><tr><td>Etanol- Mutlak</td><td>Sigma Aldrich</td><td>459836&nbsp;</td><td>% 100 Etanol yüksek dereceli olmalı ve Moleküler Elek ile saklanmalıdır.</td></tr><tr>Etanol <td>Labtech</td><td>EL5'in</td> <td>diğer sınıfları</td><td>dH2O</td></tr><tr><td>Heksametildisilazane</td><td>Sigma Aldrich</td><td>52619&nbsp</td> ile derecelendirilmiş Etanoller hazırlayın;<td>Kullanmadan önce oda sıcaklığına ulaşmasını bekleyin</td></tr><tr><td>Kanüller</td><td>Terumo</td><td>TSROX1832C, TSROX2225C, TSROX2419C</td><td>çoğu sıçan için 18 G uygundur, çoğu fare için 22 G uygundur, ancak çok küçük fareler söz konusu olduğunda elinizde birkaç 24 G olması iyidir</td></tr><tr><td>İletken Karbon bant</td><td>ProSciTech</td><td>IA0201</td><td></td></tr><tr><td>Karbon Boya</td><td>ProSciTech</td><td>I003</td><td></td></tr><tr><td>Ketamin</td><td></td><td></td><td>Xylazine</td></tr> <tr><td></td><td>lisansı altında edinilmelidir</td><td></td><td>Lisans altında edinilmelidir</td></tr><tr><td>Moleküler Elek</td><td>Sigma Aldrich</td><td>208647</td><td>%100 Etanolden suyu uzaklaştırır</td></tr></tbody></table>

taramalı elektron mikroskobu karaciğer sinüs endotel hücreleri analizi ve bunların fenestrasyonlar için standart yöntemi

A Standardized Method for the Analysis of Liver Sinusoidal Endothelial Cells and Their Fenestrations by Scanning Electron Microscopy

Karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri karaciğere açılan kapıdır, transselüler fenestrasyonları, küçük ve çözünmüş maddelerin kandan metabolizma ve işleme için karaciğer parankimine engelsiz transferine izin verir. Fenestrasyonlar dinamik yapılardır - hem büyüklükleri hem de / veya sayıları çeşitli fizyolojik durumlara, ilaçlara ve hastalıklara yanıt olarak değiştirilebilir ve bu da onları modülasyon için önemli bir hedef haline getirir. LSEC morfolojisinin çeşitli hastalık, toksik ve fizyolojik durumlardan nasıl etkilendiğinin ve bu değişikliklerin karaciğer fonksiyonunu nasıl etkilediğinin anlaşılması, fenestratasyonların boyutunun ve sayısının doğru bir şekilde ölçülmesini gerektirir. Bu yazıda, tekrarlanabilir numune hazırlama ve doğru yorumlamayı sağlamak için laboratuvarımızda kullanılan taramalı elektron mikroskobu fiksasyonu ve işleme tekniklerini açıklıyoruz. Yöntemler arasında perfüzyon fiksasyonu, sekonder fiksasyon ve dehidrasyon, taramalı elektron mikroskobu için hazırlık ve analiz yer alır. Son olarak, alandaki tüm araştırmacılara fayda sağlayacak standartlaştırılmış görüntü analizi için adım adım bir yöntem sunuyoruz.

Taramalı elektron mikroskopisi işlemiyle düşük büyütme ilk görselleştirme çok büyük karaciğer damarları ve sinüzoidlerde (Şekil 1A) gözlemlemek için yeterince büyük bir açık alan ile, karaciğer numunesinin düz bir yüzey ortaya koyar. Montaj saplama doğru karaciğer blok yerleştirme sağlanması Bu nedenle (Şekil 1B) kaçınılmalıdır sinüzoidlerin ve karaciğer Glisson kapsülü net görüntüler elde etmek için gereklidir. Büyütme artan karaciğer yoğun damar yakın denetlenmesine izin verir ve dama...

Fenestre karaciğer sinüzoidal endotel hücresi, çeşitli hastalıklardan, toksinlerden ve fizyolojik durumlardan oldukça etkilenen biyolojik olarak önemli bir filtre sistemidir. Bu değişiklikler karaciğer fonksiyonunu önemli ölçüde etkiler. Bu hücrelerdeki pencere boyutlarının ve sayısının ölçümünün standardizasyonu için yöntemler açıklanmaktadır.

Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Liver sinusoidal endothelial cells are the gateway to the liver, their transcellular fenestrations allow the unimpeded transfer of small and dissolved ...

Bu prosedürün genel amacı, karaciğer sinüzoidal endotelini analiz etmektir. Bu işlem, öncelikle bir karaciğerin izole edilmesi ve fiksatif ile perfüze edilmesiyle gerçekleştirilir. Ardından karaciğer, elektron mikroskobisine hazırlık amacıyla bloklar halinde kesilir ve dehidre edilir.Ardından, karaciğer örnekleri püskürtme kaplama işlemine tabi tutulur ve elektron mikroskobu altında incelenir. Son olarak, elektron mikrografları analiz edilerek fenestrasyon çapı, frekansı ve gözeneklilik yüzdesi hesaplanır. Nihayetinde, çeşitli koşullar altında karaciğer sinüzoidal endotelindeki değişiklikleri göstermek için elektron mikroskopisi kullanılır.Bu yöntem, karaciğer kan damarlarının endotelindeki ultrastrüktür ve morfoloji hakkında bize bilgi sağlar. Aynı şekilde böbrek ve beynin incelenmesi için de kullanılabilir. Hayvan kullanımını içeren tüm prosedürler yerel mevzuata uygun olarak gerçekleştirilmektedir. Bu çalışma, Sydney Yerel Sağlık Bölgesi Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır.İzin verilen prosedürler proje lisans belgelerinde açıklanmıştır ve hayvan refahının her an sağlanmasını garanti eden kılavuzlara uygundur. Bu, hayatta kalma amaçlı olmayan (non survival) bir cerrahidir. Metin protokolüne göre fiksatifi hazırladıktan sonra, perfüzyon tamponunu ve fiksatifi 35 ila 37 °C'ye ısıtın.Hayvan, tek bir intraperitoneal ketamin ve xylazine enjeksiyonu ile anestezi edildikten sonra, sedasyon seviyesi arka ekstremite çekme refleksi ve kuyruk sıkıştırma ile değerlendirilir. Ardından, küt uçlu makas kullanılarak, karaciğere ve portal vene ulaşmak için hayvanın abdomeninde Y şeklinde bir insizyon yapılır. Daha sonra portal venin etrafına, biri karaciğere proksimalde, diğeri ise karaciğere daha distalde olmak üzere iki adet çok gevşek sütür bağlanır.Portal veni uygun büyüklükte bir IV kanül ile kanüle edin. Ardından kanülü sabitlemek için sütürleri sıkın. Şimdi 37 °C'ye ısıtılmış 5 ila 20 mL PBS kullanarak, 10 cm H2O basınçta perfüzyona başlayın.Artefaktlara ve karaciğere zarar verecek kadar yüksek hava basıncına neden olabileceği için karaciğere hava kabarcığı girmesinden kaçının; tamponun karaciğerden serbestçe çıkışına izin vermek için abdominal ve torasik vena cava'yı kesin. Bu işlem; yüksek geri basıncı, karaciğerin, sinüzoidal ve endotelyal hücrelerin veya LCC'lerin hasar görmesini önler. Karaciğer kandan arındığında, PBS'yi elektron mikroskopisi veya em fiksatörü ile değiştirin ve karaciğer sertleşip oldukça soluklaşana kadar perfüzyona devam edin.Yaklaşık beş dakika. Ardından skalpelle karaciğeri bir ila iki kübik milimetrelik bloklar halinde kesin. Sabitleme işlemi için em fiksatif kullanın.Dokuyu 4 °C'de 24 ila 72 saat boyunca fikse edin. Ardından dokuyu 0,1 molar sodyum sitrat tamponuna aktarın ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelemek üzere numuneleri hazırlayana kadar 4 °C'de 12 aya kadar saklayın. Numuneler metin protokolüne uygun olarak dehidrate edildikten sonra, metal SEM stuplarının tabanını etiketleyin ve bir diseksiyon mikroskobu altında stupların üst kısmına çift taraflı karbon bant uygulayın; SEM için en uygun sinüzoidlere sahip yüzeyi belirlemek amacıyla numuneleri görselleştirin.Seçilen yüzeyi karbon bantlı stub yüzeyine bakacak şekilde yerleştirin ve stub üzerine sıkıca yapıştırın. Metin protokolüne uygun olarak sputter kaplama ve SEM işlemlerini gerçekleştirdikten sonra, ImageJ'de bir görüntü açın ve resme gömülü ölçek çubuğunu kullanarak ölçeği ayarlayın; ImageJ'deki poligon aracını kullanarak, fenestreli ve fenestresiz alanlar dahil olmak üzere LSEC'in tüm düz alanının çevresini çizin, hücre yüzeyinde bulunan ve fenestrasyonları kapatabilecek büyük debris parçalarını hariç tutun. Fenestrasyon çapını ölçmek için çizgi aracını seçerek her bir fenestrasyonun en uzun çapı boyunca bir çizgi yerleştirin.Çizgiyi ölçmek için M'ye, çizgiyi resim üzerine kalıcı olarak çizmek için D'ye basın. Bu çizgi fenestrasyon çapı olarak tanımlanır ve artık Image J'nin sonuçlar kutusunda mevcut olacaktır. Fenestrasyonların yanı sıra LSEC sitoplazmasındaki 250 nanometer üzerindeki daha büyük delikler olan tüm boşlukları ölçün. Dairesel olmayan boşlukların çevresini çizerek ve Image J kullanarak alanlarını hesaplayın; ardından Image J sonuçlar kutusundaki verileri bir Excel hesap tablosuna aktarın.Daha ileri analizler için, fenestrasyon hesaplamalarını gerçekleştirmek üzere aşağıdaki formülleri kullanın. Ortalama fenestrasyon çapı, tüm fenestrasyon çaplarının ortalamasına eşittir. Fenestrasyon alanı, r'nin karesi ile pi'nin çarpımına eşittir; burada R, tekil fenestrasyon çaplarından hesaplanır.Gözeneklilik yüzdesi, sigma pi R kare değerinin analiz edilen toplam alan çarpı mikron değerine bölünmesi ve 100 ile çarpılmasıyla hesaplanır; boşlukların toplam alanı bu hesaplamadan hariç tutulmalıdır. Verileri yayınlarda sunarken, fenestrasyonları tanımlamak için sınır çaplarının kullanıldığını belirten bir ifadeyle birlikte fenestrasyon çapını, fenestrasyon frekansını ve gözenekliliği ekleyin; ayrıca boşlukların analize dahil edilip edilmediğini onaylayan bir ifade ile fenestrasyon çapının frekans dağılım grafiğini, karaciğer blok sayısını ve görüntüleri de ekleyin. SEM ile yapılan düşük büyütmeli inceleme, karaciğer örneğinin; portal traktus ve burada gösterilen merkezi ven dahil olmak üzere birçok büyük karaciğer damarını ve sinüzoidi gözlemlemek için yeterince geniş bir açık alana sahip düz bir yüzeyini ortaya koymaktadır.Karaciğer bloğunun montaj sapına doğru şekilde yerleştirilmesi, sinüzoidlerin net görüntülerinin elde edilmesi için esastır; karaciğer sinüzoidlerinin tüm detaylarını kapatan parlak kapsülden ise kaçınılmalıdır. Bu nedenle, burada gösterildiği gibi, daha yüksek büyütme LSEC fenestrasyonlarının gözlemlenmesine olanak tanır. Hepatosit plakaları kan damarlarına benzeyebilir, ancak BLI gibi özellikler oryantasyona yardımcı olur.Bu şekil, yüksek perfüzyon basıncının, SEM altında kolayca tanımlanabilen ve LSEC SIV plakalarının birleşmesinden kaynaklandığı düşünülen endotelyumdaki büyük boşluklar gibi artefaktlara neden olabileceğini göstermektedir; çekirdeklerin hemen üzerindeki hücre membranından kaçınmak, LSEC yüzeyinin altında bir şişkinlik şeklinde görülebilir ve fenestrasyon yoğunluğu ile gözeneklilik hesaplamalarının doğruluğuna yardımcı olur. Son olarak, LSEC fenestrasyon çapının, yoğunluğunun ve frekansının kantifikasyonu, fenestrasyonların ampirik bir ölçümünü sağlar ve yaşlanma, hastalık, toksinler veya tedavilerin neden olduğu değişikliklerin ölçülmesine olanak tanır. Perfüzyon prosedürünün ardından doku, hücresel ultrastrüktüre ve mitokondriyal yapıya bakmak için transmisyon elektron mikroskobisi gibi diğer teknikler için işlenebilir.Histoloji için de kullanılabilir.

a-standardized-method-for-analysis-liver-sinusoidal-endothelial-cells

Research

JoVE Journal

Biology

Biyoloji

Hayvan alınan hücre hatları var gibi birincil hücreleri ile karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri (sn) çalışma yapılmalıdır. Bu yöntem, karaciğer sindirim ve diferansiyel santrifüj sonraki kültür ve deney için SEC arıtma dayanmaktadır.

Karaciğer Hücreleri Karaciğer Perfüzyon Arıtma Takip in vivo Karaciğer endositoz

Karaciğer lökosit işe özgü karaciğer sinüzoidal endotel hücreleri ile kaplı olan hepatik sinüzoidler özel kanallar içinde gerçekleşir. Fizyolojik kesme stresi koşulları altında, insan karaciğer sinüzoidal endotelyumda lökosit işe faz kontrast mikroskopisi bu işlemi altında yatan moleküler mekanizmaların açıklanması kolaylaştırabilir.

Kayma Stres İnsan Karaciğer Sinüzoidal Endoteline altında Koşullarına Lökositer İşe Alım Eğitim için Bir Akış Adezyon Deneyi

Bu iletişim kuralının amacı yüksek canlılık ve yüksek verim tetkikine ve sinüsoidal endotel hücreleri karaciğer elde etmektir. Bu bir tür IV collagenase eriyik yolu ile portal ven, hepatositlerin ve sinüsoidal endotel hücreleri elde etmek için farklı aralıklarla tarafından takip ile karaciğer Ventriküler tarafından gerçekleştirilir.

Arıtma tetkikine ve fare karaciğer sinüsoidal endotel hücrelerinden perfüzyon

Bu iletişim kuralının amacı lenfatik endotel hücre popülasyonlarının içinde açıklanan işaretçileri kullanarak karaciğer belirlemektir. Biz collagenase IV ve DNaz ve yumuşak dokusu, lenfatik endotel hücreleri farklı nüfusu tanımlamak için akış sitometresi ile birlikte kıyma kullanmaktadır.

Lenfatik endotel hücreleri akış sitometrik çözümlenmesi için fare karaciğer sindirim

Burada, doğrudan fare aort endotel hücrelerini gözlemlemek için immünofloresan boyama için bir protokol sıyoruz. Bu teknik, endotel hücrelerinin farklı akış desenlerinde hücresel ve moleküler fenotiplerini incelerken ve ateroskleroz gelişiminde yararlıdır.

Vasküler Endotel Hücrelerini Doğrudan Gözlemlemek Için En Yüz İmmünofloresan Boyama

Bu protokol, güçlü bir 3D görüntüleme tekniği olan seri blok yüz taramalı elektron mikroskopisini (SBF-SEM) kullanmak için rutin bir yöntemi özetlemektedir. SBF-SEM'in başarılı bir şekilde uygulanması, uygun fiksasyon ve doku boyama tekniklerinin yanı sıra görüntüleme ayarlarının dikkatli bir şekilde değerlendirilmesi üzerine kuruludur. Bu protokol, bu işlemin tamamı için pratik hususlar içerir.

Biyolojik Doku Örneklerinin Seri Blok-Yüz Tarama Elektron Mikroskopisi (SBF-SEM)

Burada, kolesterol fazlasının karaciğer mikroçevresi ve bağışıklık hücresi manzarası üzerindeki etkisini incelemek için alkolsüz yağlı karaciğer hastalığı (NAFLD) ile ilişkili Hepatosellüler Karsinom (HCC) zebra balığı modelinin nasıl üretileceğini sunuyoruz.

Zebra Balığında Alkolsüz Yağlı Karaciğer Hastalığına Bağlı Hepatosellüler Karsinomun Erken İlerlemesi Sırasında Karaciğer Mikroçevresinin Analizi

Burada primer fare karaciğeri sinüzoidal endotel hücresi (LSEC) izolasyonu için bir protokol özetlenmekte ve gösterilmektedir. Protokol, karaciğer kollajenaz perfüzyonu, düşük hızlı santrifüjleme ile parankimal olmayan hücre saflaştırılması ve CD146 manyetik boncuk seçimine dayanmaktadır. Ayrıca bu izole LSEC'leri akış sitometrisi ve taramalı elektron mikroskobu kullanarak fenotipler ve karakterize ediyoruz.

Fare primer karaciğer sinüzoidal endotel hücrelerinin izolasyonu ve karakterizasyonu

Mevcut protokol, alkolsüz steatohepatit (NASH) sırasında hücre dışı matriks (ECM) yeniden şekillenmesinin dinamiklerini görselleştirmek için güvenilir bir platform oluşturmak üzere karaciğer in situ perfüzyon / desellülarizasyon ve iki foton mikroskopi yöntemlerini optimize etmektedir.

Alkolsüz Steatohepatitin Bir Fare Modelinde Karaciğer Hücre Dışı Matriksin 3D Görüntülenmesi

Karaciğerden hepatositlerdeki organeller veya diğer dokulardaki hücreler arasındaki membran temas bölgelerinin üç boyutlu ayrıntılarını elde etmek için basit ve kapsamlı bir protokoldür.

Hepatositlerde Organeller Arası Temas Bölgelerinin Seri Kesitli Elektron Mikroskobu Kullanılarak Üç Boyutlu Karakterizasyonu

Burada, karaciğer kanseri dokusundan elde edilen küçük hücre dışı veziküllerin optimize edilmiş bir diferansiyel ultrasantrifüjleme yöntemi ile zenginleştirilmesini açıklıyoruz.

Karaciğer Kanseri Dokusundan Elde Edilen Küçük Hücre Dışı Veziküller İçin Bir Zenginleştirme Yöntemi

Keşfedin karaciğer sinüs endotel hücrelerinin morfolojisini taramalı elektron mikroskobu ile analiz etme yöntemini. Bu standart protokol, fenestrasyon çapı, sıklığı ve gözenekliliğinin doğru ölçümünü sağlar.

Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Daha fazla video keşfet