Taramalı Elektron Mikroskobu Karaciğer Sinüs Endotel Hücreleri Analizi ve Bunların fenestrasyonlar için Standart Yöntemi

Bu prosedürün genel amacı karaciğer sinüzoidal endotelini analiz etmektir. Bu, önce bir karaciğeri izole ederek ve onu fiksatif ile perfüze ederek gerçekleştirilir. Daha sonra, karaciğer bloklar halinde kesilir ve elektron mikroskobu için hazırlık olarak kurutulur.

Daha sonra karaciğer örnekleri püskürtülerek kaplanır ve elektron mikroskobu altında incelenir. Son olarak, elektron mikrografları analiz edilir ve pencere çapı ve frekansı ve yüzde gözeneklilik hesaplanır. Sonuçta, elektron mikroskobu, çeşitli koşullar altında karaciğer sinüzoidal endotelyumundaki değişiklikleri göstermek için kullanılır.

Bu yöntem bize endotelyumlarındaki karaciğer kan damarlarının ultra yapısı ve morfolojisi hakkında fikir verir. Böbrek ve beyni aynı şekilde incelemek için de kullanılabilir: Hayvanların kullanımıyla ilgili tüm prosedürler yerel mevzuata göre gerçekleştirilir. Bu çalışma Sidney Yerel Sağlık Bölgesi Hayvan Refahı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

İzin verilen prosedürler proje lisans belgelerinde açıklanmıştır ve her zaman hayvanın refahını sağlayan yönergeleri takip eder. Bu hayatta kalmayan bir ameliyattır. Fiksatif hazırladıktan sonra, metin protokolüne göre, perfüzyon tamponunu ve fiksatifi 35 ila 37 santigrat derecede ısıtın.

Hayvan tek bir intraperitoneal ketamin ve ksilazin enjeksiyonu ile uyuşturulduktan sonra, arka bacak çekilmesi ve bir kuyruk tutamağı ile sedasyon seviyesini değerlendirin. Daha sonra, künt uçlu makasla, karaciğeri ve portal damarı ortaya çıkarmak için hayvanın karnında bir Y kesisi yapın. Daha sonra, biri karaciğere proksimal, diğeri daha distal olarak karaciğere portal ven etrafına iki çok gevşek dikiş bağlayın.

Portal veni uygun büyüklükte bir IV kanül ile kanül edin. Daha sonra kanülü sabitlemek için dikişleri sıkın. Şimdi 37 santigrat dereceye kadar ılık beş ila 20 mililitre PBS kullanarak, 10 santimetre H2O basıncında perfüzyona başlayın.

Karaciğere giren hava kabarcıklarından kaçının, bu da karaciğere zarar verecek, tamponun karaciğerden serbestçe çıkmasına izin vermek için abdominal ve torasik vena CVA'yı kesecek çok yüksek artefaktlar ve hava basıncı üretecektir. Bu, yüksek sırt basıncını, karaciğer hasarını, sinüzoidal ve endotel hücrelerini veya LCC'leri önler. Karaciğer kandan arındığında, PBS'yi elektron mikroskobu veya em, fiksatif ve perfüz ile karaciğer sertleşene ve çok soluk olana kadar değiştirin.

Yaklaşık beş dakika. Sonra neşter ile karaciğeri bir ila iki milimetre küp blok halinde kesin. Göndermek için em sabitleyici kullanın.

Dokuyu 24 ila 72 saat boyunca dört santigrat derecede sabitleyin. Daha sonra dokuyu 0.1 molar sodyum Cate tamponuna aktarın ve elektron mikroskobu veya SEM taraması için örnekleri monte etmek için 12 aya kadar dört santigrat derecede saklayın. Numuneleri metin protokolüne göre dehidre ettikten sonra, metal SEM saplamalarının tabanını etiketleyin ve bir diseksiyon mikroskobu altında saplamaların üstüne çift taraflı karbon bant uygulayın, SEM için en iyi sinüzoidlere sahip yüzeyi tanımlamak için numuneleri görselleştirin.

Dantel, saplamanın karbon bant yüzeyine yukarı bakacak şekilde seçilen bir yüzey ve saplama üzerine sıkıca yapıştırın. Metin protokolüne göre püskürtme kaplama ve SEM gerçekleştirdikten sonra, resim J'de bir görüntü açın ve resim J'deki çokgen aracını kullanarak ölçeği ayarlamak için resme gömülü bir ölçek çubuğu kullanın Fenestre ve fenestre alanlar da dahil olmak üzere LSEC'in tüm düz alanı boyunca izleyin, hücre yüzeyinde bulunan ve fenestratasyonları engelleyebilecek büyük kalıntı parçalarını hariç tutun. Pencere çapını ölçmek için, çizgi aracını seçerek her pencere aralığının en uzun çapı boyunca bir çizgi yerleştirin.

Çizgiyi ölçmek için M'ye ve çizgiyi resme kalıcı olarak çizmek için D'ye basın. Bu çizgi, fenestrasyon çapı olarak tanımlanır ve şimdi resim J.'nin sonuç kutusunda mevcut olacaktır. LSEC sitoplazmasında 250 nanometrenin üzerindeki daha büyük delikler olan tüm boşlukları ve fenestratasyonları ölçün. Dairesel olmayan boşlukların alanını, etraflarında izleyerek ve J görüntüsündeki sonuç kutusundaki verileri geçerek bir Excel elektronik tablosuna alanlarını hesaplamak için Görüntü J'yi kullanarak hesaplayın.

Daha fazla analiz için, pencere hesaplamalarını yapmak için aşağıdaki formülleri kullanın. Ortalama pencere çapı, tüm pencere çaplarının ortalamasına eşittir. Pencere alanı, R'nin bireysel pencere çaplarından hesaplandığı pi r kareye eşittir.

Gözeneklilik yüzdesi, analiz edilen toplam alan üzerinden sigma pi R'nin karesine eşittir ve mikron çarpı 100, boşlukların toplam alanını bu hesaplamadan çıkarır. Verileri yayınlarda sunmak için, fenestrasyon çapını ve fenestrasyon çaplarını tanımlamak için sınır çaplarının kullanıldığını doğrulayan bir ifade, fenestrasyon frekansı ve gözenekliliği, ayrıca boşlukların analize dahil edilip edilmediğini doğrulayan bir ifade ve fenestrasyon çapının ve karaciğer blok sayısının yanı sıra görüntülerin frekans dağılım grafiğini içerir. SEM ile düşük büyütme, burada gösterildiği gibi portal kanal ve merkezi ES dahil olmak üzere birçok büyük karaciğer damarını ve sinüzoidini gözlemlemek için yeterince geniş bir açıkta kalan alana sahip karaciğer örneğinin düz bir yüzeyini ortaya çıkarır.

Sinüzoidlerin net görüntülerinin elde edilmesi için montaj saplamasına doğru karaciğer bloğu yerleştirilmesini sağlamak çok önemlidir ve karaciğer sinüzoidlerinin tüm detaylarını kapsayan parıldayan kapsülden kaçınılmalıdır. Bu nedenle, burada gösterildiği gibi, daha yüksek büyütme, LSEC fenestratasyonlarının gözlemlenmesine izin verir. Hepatosit plakaları kan damarları gibi görünebilir, ancak BLI gibi özellikler oryantasyona yardımcı olur.

Bu şekil, yüksek füzyon basıncının, SEM altında kolayca tanımlanabilen LSEC SIV plakalarının birleşmesinden kaynaklandığı düşünülen endotelde büyük boşluklar gibi artefaktlara neden olabileceğini, doğrudan çekirdeğin üzerinde hücre zarından kaçınarak, LSEC yüzeyinin altında bir çıkıntı olarak görülebileceğini, fenestrasyon yoğunluğu ve gözeneklilik hesaplamalarının doğruluğuna yardımcı olacağını göstermektedir. Son olarak, LSEC fenestrasyon çapı yoğunluğunun ve frekansının ölçülmesi, fenestrasyonların ampirik bir ölçümünü sağlar ve yaşlanma hastalığı, toksinler veya tedavilerin neden olduğu değişikliklerin ölçümlerine izin verir. Perfüzyon prosedürünü takiben doku, hücresel ultra yapıya, mitokondriyal yapıya bakmak için transmisyon elektron mikroskobu gibi diğer teknikler için işlenebilir.

Histoloji için de kullanılabilir.