Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

Bu yeni nesil dizileme hedefli Amplikon Analizinin genel amacı; tanısal, prognostik ve hedefe yönelik tedaviye yanıt dahil olmak üzere terapötik kullanım için hasta tümörlerindeki patojenik mutasyonları tespit etmektir. Bu yöntem, bir hastanın hedefe yönelik veya alternatif bir tedaviden fayda sağlayabilecek bir gende mutasyona sahip olup olmadığı gibi temel soruları yanıtlar. Bu tekniğin temel avantajı, birçok gendeki hem yaygın hem de nadir etkili mutasyonların, tek bir analiz kullanılarak herhangi bir tümör dokusunda tespit edilebilmesidir.

Teknikler ve teknoloji oldukça karmaşık olduğu ve adımların öğrenilmesi çok zor olduğu için, bu yöntemi görsel olarak göstermek kritik önem taşımaktadır. Bu, Tıbbi Onkolojiyi ilerletmek adına belirleyici bir andır. Yeni nesil dizilemenin kliniğe uygulanmasıyla birlikte, hastalarımız için daha fazla ve daha iyi kanser tedavilerine sahip olacağız.

CPD Teknoloji Uzmanlarımız Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy ve Joe Grubb bu prosedürü uygulamalı olarak gösterecekler. Analizin daha karmaşık bölümlerini göstermek için ben de bu sürece destek vereceğim. Metin protokolüne ve üretici protokolüne uygun olarak genomik DNA ekstrasyonu gerçekleştirdikten sonra, örneğin çalışma konsantrasyonunu belirlemek için ekstre edilen DNA'nın 2 µL'sini bir florometrede analiz edin.

Bir Amplikon Kütüphanesi oluşturmak için, Hyb Plaka olarak adlandırılan yarı etekli 96 kuyucuklu bir plakaya gerekli hacimde düşük EDTA'lı TE ve panelin Oligo Tüpü'nden beş mikrolitre ekleyin, ardından her bir karşılık gelen kuyucuğa 100 ila 250 nanogram genomik DNA ekleyin. Buradaki herhangi bir karışıklığın ciddi sonuçları olacağından, bu en kritik adımdır. Sekanslama için Oligo Hibritleme Reaktifi 1'in eklenmesinin ve metin protokolüne uygun olarak santrifüj işleminin ardından, Hyb Plaka'yı önceden ısıtılmış hibritleme inkübatöründe 95 °C'de bir dakika boyunca inkübe edin.

İnkübatör yavaşça 40 °C'ye soğutulduktan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve her bir örneğin tüm hacmini Hyb Plakasından, önceden hazırlanmış ve yıkanmış ilgili filtre plaka ünitesinin (FPU) merkezine aktarın. FPU'nun kapağını kapatın ve 20 °C'de, 2.250 ×g kuvvetinde üç dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından 45 µL SW1 ekleyin ve tekrar santrifüjleyin.

SW1 ile ikinci bir yıkama ve UB1 ile bir yıkama yaptıktan sonra, her bir örnek kuyucuğuna 45 µL Uzatma Ligasyon Karışımı 3 ekleyin ve karıştırmak için pipetle üç kez aşağı yukarı çekin. Plakayı mühürlemek için yapışkan alüminyum folyo kullanın ve tüm FPU düzeneğini önceden ısıtılmış 37 °C'lik bir inkübatörde 45 dakika boyunca inkübe edin. PCR Amplifikasyonunu indekslemek için, primerleri İndeks Amplifikasyon Plakasına veya IAP Aparatına yerleştirin ve kullanılan indeksleri plaktaki karşılık gelen kuyucuklara paylaştırın, ardından 22 µL PCR Master Mix, 2E12 ekleyin ve pipetle üç kez aşağı yukarı çekin.

Metin protokolüne uygun olarak 45 dakikalık Uzatma Ligasyonu Reaksiyonu santrifüj edildikten sonra, FPU'nun her bir örnek kuyucuğuna 25 µL 50 mM sodyum hidroksit ekleyin ve pipet ucunun membrana temas ettiğinden emin olarak en az altı kez aşağı yukarı pipetleyin. Ardından, plakayı hafifçe eğerek ve 20 µL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, FPU plakasındaki sodyum hidroksiti en az altı kez aşağı yukarı pipetleyin. Elüsyonu FPU'dan IAP'nin karşılık gelen kolonuna aktarın.

Metin protokolünde belirtilen PCR programını çalıştırmadan önce, DNA'yı PCR Master Mix ile tamamen birleştirmek için pipetle nazikçe aşağı yukarı karıştırın. Kütüphane verimini doğruladıktan ve örnekleri metin protokolüne uygun olarak Manyetik Saflaştırma Boncukları ile inkübe ettikten sonra, yıkanmış boncukların bulunduğu her kuyuya 30 µL EBT ekleyin. Boncukların tüpün kenarlarından ayrıldığından emin olmak için birkaç kez aşağı yukarı pipetleme yapın.

Plaka hem çalkalamalı hem de çalkalamasız olarak inkübe edildikten sonra, plakayı manyetik standa yerleştirin ve süpernatantın 20 µL'sini Kütüphane Normalizasyon Plakası (LNP) adı verilen tamamen yeni bir plakaya aktarın. Normalizasyon karışımının hazırlanmasını, çözeltinin aralıklı olarak tersyüz edilmesini ve vorteksle karıştırılmasını takiben, LNP'deki her bir örneğe 45 µL ekleyin. Ardından, plakayı sızdırmaz şeffaf yapışkan film ile kapatın ve 30 dakika boyunca 1.800 RPM'de çalkalayın.

Boncuklar yıkandıktan sonra, LNP'yi manyetik standdan çıkarın ve örneği elüye etmek için her bir kuyucuğa 30 µL taze 0,1 normal sodyum hidroksit ekleyin. Ardından, LNP'yi 1.800 RPM'de beş dakika boyunca sallayın. LNP'yi tekrar manyetik standa yerleştirin ve süpernatan berraklaştıktan sonra, elüsyondan 30 µL'yi Saklama Plakasındaki önceden hazırlanmış Kütüphane Normalizasyon Saklama Tamponu 1'e aktarın.

Plakayı eğin, ardından sekanslanacak her bir örnekten beş µL'yi etiketlenmiş bir Havuzlanmış Amplikon Kütüphanesi (Pooled Amplicon Library veya PAL) 1,5 mL tüpüne ekleyin. Kullanılan sekanslama kimyasına bağlı olarak, PAL'den 4 ila 10 µL'yi 590 ila 596 µL Buffer HT1 içerisine ekleyin. Akış Hücresini (Flow Cell) temizleyin ve yükleyin.

Reaktifleri yükleyin. Ardından, sekanslama işlemini başlatmak için ekrandaki istemleri takip edin. Sekanslama işlemi tamamlandıktan sonra, Biyoenformatik İş Akışını çalıştırın.

Sıralanan kütüphanenin laboratuvar tarafından belirlenen kalite kontrol metriklerinile karşılaştığını doğrulamak için çalışma istatistiklerini analiz edin. Son olarak, bir Genomik Veri Görüntüleyici'de, BAM dosyalarını inceleyerek her bir varyantı manuel olarak gözden geçirin. Bu, bir kütüphane hazırlama örneğinin QC'den geçip geçmediğini belirlemek için kullanılan, ortalama kapsama alanı hariç, en önemli çalışma istatistiklerinin bir özetidir. Birinci Vaka için burada görüldüğü üzere, Biyoinformatik analizi raporlanabilir dört AML ilişkili mutasyon tespit etmiştir.

FLT3'te bir missense mutasyonu, IDH2'de bir missense mutasyonu ve NPM1'de bir frameshift mutasyonu. AML'li yetişkin hastaların yaklaşık %25'inde FLT3 mutasyonları gözlemlenir. Bu AML hastasında görüldüğü gibi, FLT3 Kinaz Alanı Nokta Mutasyonlarının prognostik önemi, prognoz üzerinde belirsiz bir etkiye sahiptir.

İzositrat Dehidrogenaz 2 veya IDH2, AML'de yaygın olarak mutasyona uğrayan epigenetik bir modifikasyonu kodlar. Nukleofosmin veya NPM1 genindeki mutasyonlar, AML'de en sık görülen kazanılmış mutasyonlardan biridir. Bu tablo, İkinci Vaka için tüm ekzonik varyantları listelemektedir.

Hastalıkla ilişkili iki mutasyon tespit edildi. ERBB2'nin Ekzon 20'sinde çerçeve içi (in-frame) bir insersiyon ve TP53'te bir missense mutasyonu saptandı. HER2/neu veya ERBB2, bir Tirozin Kinaz Reseptörü kodlamaktadır.

Aktif HER2/neu Ekzon 20 insersiyonları, akciğer adenokarsinomlarının %2 ila 4'ünde görülür ve akciğer kanserinde gözlemlenen HER2/neu mutasyonlarının çoğunluğunu oluşturur. TP53 değişiklikleri de kanserde yaygındır. Ekstre edilen DNA'nın kalitesine ve miktarına çok dikkat edilmesi gereklidir.

Bu durum özellikle FFPE örnekleri için önemlidir. Bu örneklerde genellikle değişken DNA verimi ile yüksek derecede degradasyonla karşılaşılır. Klinik analizinin validasyon sürecinde, DNA kütüphane hazırlığına geçmeden önce her örnek için DNA kalitesi ve miktarına yönelik metrikler belirlenmelidir.

Kütüphane hazırlığının yanı sıra; sekanslama çalışması için kesim değerlerinin, kalite kontrol istatistiklerinin, kütüphane hazırlama istatistiklerinin, bir Amplikonun kapsama derinliğinin ve minimum raporlanabilir alel frekansının belirlenmesiyle bir Biyoinformatik İzleme Planının doğrulanması kritiktir. Uzmanlaşıldığında, kütüphane hazırlığı bir çalışma gününde tamamlanabilir. Ancak, genel analiz iş akışı DNA ekstraksiyonu, sekanslama, veri işleme ve varyant incelemesi için daha fazla zaman gerektirir.

Bu prosedür, yalnızca belirli temel sıcak noktalardaki genomik DNA mutasyonlarını incelemek üzere tasarlanmıştır. Genlerin diferansiyel ekspresyonu, riskli tümörlerle ilişkilendirme ve yapısal yeniden düzenlemeler gibi ek soruları yanıtlamak için RNA kullanan diğer kütle analizleri gerçekleştirilebilir. Önemli gelişmeler ufuktadır.

Otomasyonun benimsenmesi ve benzersiz moleküler barkodlama kullanımı, laboratuvarların işlem süresini kısaltmasına, daha az örnek girdisi kullanmasına ve çok düşük alel frekansındaki varyantları tespit etmesine olanak tanıyacaktır. Kanser örneklerinde hastalıkla ilişkili mutasyonların tespiti, on yıllardır standart bakım prosedürü olmuştur. NGS, birçok kanserle ilişkili çok sayıda genin paralel olarak sekanslanmasında daha az yanlı bir yaklaşımdır; bu da birden fazla mutasyonun tanımlanmasını ve hastalar için daha iyi tedavilerin geliştirilmesini sağlar.

İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.