Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi
September 20th, 2016
Bu el yazması, iki yeni nesil dizileme paneli için klinik protokolleri açıklamaktadır. Bir panel hematolojik maligniteleri sorgularken, diğer panel solid tümörlerde sıklıkla mutasyona uğrayan genleri hedef alır. İnsan malignitelerindeki sürücü mutasyonlarının moleküler sınıflandırması, değerli prognostik ve öngörücü bilgiler sunar.
Bu yeni nesil dizileme hedefli Amplikon Testinin genel amacı, teşhis, prognostik ve hedefe yönelik tedaviye yanıt dahil olmak üzere terapötik kullanım için hasta tümörlerindeki patojenik mutasyonları tespit etmektir. Bu yöntem, bir hastanın hedefe yönelik veya alternatif bir tedaviden fayda sağlayabilecek bir gende mutasyona sahip olup olmadığı gibi önemli soruları yanıtlar. Bu tekniğin ana avantajı, birçok gende hem yaygın hem de nadir görülen eyleme geçirilebilir mutasyonların, tek bir tahlil kullanılarak herhangi bir tümör dokusunda tespit edilebilmesidir.
Teknikler ve teknoloji çok karmaşık olduğundan ve adımların öğrenilmesi çok zor olduğundan, bu yöntemi görsel olarak göstermek çok önemlidir. Bu, Tıbbi Onkolojinin ilerlemesinde belirleyici bir andır. Yeni nesil dizilemenin kliniğe uyarlanmasıyla, hastalarımız için daha fazla ve daha iyi kanser tedavilerine sahip olacağız.
CPD Teknoloji Uzmanlarımız Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy ve Joe Grubb bu prosedürü gösterecektir. Tahlilin daha karmaşık kısımlarını göstermek için bu sürece de yardımcı olacağım. Metin protokolüne göre genomik DNA'yı çıkardıktan sonra, üreticinin protokolünü izleyerek, numunenin çalışma konsantrasyonunu elde etmek için ekstrakte edilen DNA'nın iki mikrolitresini bir florometre üzerinde çalıştırın.
Bir Amplikon Kütüphanesi oluşturmak için, Hyb Plakası adı verilen yarı etekli 96 oyuklu bir plakada, gerekli hacimde düşük EDTA'lı TE, panelin Oligo Tüpünün beş mirkolitresini ekleyin, her karşılık gelen oyuğa 100 ila 250 nanogram genomik DNA ekleyin. Bu, en hayati adımdır, çünkü buradaki herhangi bir karışıklığın ciddi sonuçları olacaktır. Sıralama Reaktifi 1 için Oligo Hibridizasyonunun eklenmesini ve metin protokolüne göre döndürülmesini takiben, Hyb Plakasını önceden ısıtılmış hibridizasyon inkübatöründe 95 santigrat derecede bir dakika inkübe edin.
İnkübatörü yavaşça 40 santigrat dereceye kadar soğuttuktan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve her bir numunenin tüm hacmini Hyb Plakasından önceden hazırlanmış karşılık gelen, önceden yıkanmış filtre plakası ünitesinin veya FPU'nun merkezine aktarın. FPU'yu örtün ve 2, 250 kez G ve 20 santigrat derece üç dakikada santrifüjleyin. Ardından 45 mikrolitre SW1 ekleyin ve tekrar santrifüjleyin.
SW1 ile ikinci bir yıkamadan ve UB1 ile bir yıkamadan sonra, her bir numune kuyucuğuna 45 mikrolitre Uzatma Ligasyon Karışımı 3 ekleyin ve karıştırmak için üç kez yukarı ve aşağı sıkın. Plakayı kapatmak için yapışkan alüminyum folyo kullanın ve tüm FPU düzeneğini önceden ısıtılmış 37 santigrat derece inkübatörde 45 dakika inkübe edin. PCR Amplifikasyonunu indekslemek için, primerleri İndeks Amplifikasyon Plakasına veya IAP Fikstürüne yerleştirin ve kullanılan indeksleri plakadaki ilgili kuyucuklara ayırın, ardından 22 mikrolitre PCR Master Mix, 2E12 ekleyin ve üç kez yukarı ve aşağı sıkın.
Daha sonra, metin protokolüne göre 45 dakikalık Uzatma Ligasyon Reaksiyonunu döndürdükten sonra, FPU'nun her bir numune kuyucuğuna 25 mikrolitre 50 milimolar sodyum hidroksit ekleyin ve pipet ucunun membranla temas ettiğinden emin olarak en az altı kez yukarı ve aşağı sıkın. Ardından, plaka hafifçe eğilmiş ve çok kanallı bir pipet 20 mikrolitreye ayarlanmış durumdayken, FPU plakasındaki sodyum hidroksiti en az altı kez yukarı ve aşağı pipetleyin. Elüsyonu FPU'dan IAP'nin ilgili sütununa aktarın.
Metin protokolünde belirtilen PCR programını çalıştırmadan önce DNA'yı PCR Master Mix ile iyice birleştirmek için hafifçe yukarı ve aşağı pipetleyin. Kütüphane verimini doğruladıktan ve numuneleri metin protokolüne göre Manyetik Saflaştırma Boncukları ile inkübe ettikten sonra, yıkanmış boncukların her bir oyuğuna 30 mikrolitre EBT ekleyin. Boncukların tüpün yanından çıktığından emin olmak için birkaç kez yukarı ve aşağı pipetleyin.
Plaka ile inkübe edildikten ve daha sonra çalkalanmadan sonra, plakayı manyetik standa yerleştirin ve süpernatantın 20 mikrolitresini Kütüphane Normalizasyon Plakası veya LNP adı verilen tamamen yeni bir plakaya aktarın. Normalizasyon karışımının hazırlanmasının ardından, aralıklı ters çevirme ve çözeltinin girdaplanması ile, LNP'nin her bir örneğine 45 mikrolitre ekleyin. Ardından, plakayı kapatmak için şeffaf yapışkan film kullanın ve 30 dakika boyunca 1.800 RPM'de çalkalayın.
Boncukları yıkadıktan sonra, LNP'yi manyetik standdan çıkarın ve numuneyi çıkarmak için her bir oyuğa 30 mikrolitre taze 0.1 normal sodyum hidroksit ekleyin. Ardından, LNP'yi 1.800 RMP'de beş dakika çalkalayın. LNP'yi manyetik standa geri yerleştirin ve süpernatan temizlendikten sonra, 30 mikrolitre elüsyonu Saklama Plakasında önceden hazırlanmış Kütüphane Normalizasyon Depolama Tamponu 1'e aktarın.
Plakayı aşağı doğru bükün, ardından etiketli bir Havuzlanmış Amplikon Kitaplığına veya PAL, 1.5 mililitrelik tüpe sıralanacak her numuneden beş mikrolitre ekleyin. Hangi sıralama kimyasının kullanıldığına bağlı olarak, 590 ila 596 mikrolitre Tampon HT1'e dört ila 10 mikrolitre PAL ekleyin. Akış Hücresini temizleyin ve yükleyin.
Reaktifleri yükleyin. Ayrıca, sıralama çalıştırmasını başlatmak için ekrandaki talimatları izleyin. Sıralama çalıştırması tamamlandıktan sonra Bioinfomatics Pipeline'ı yürütün.
Sıralanan kitaplığın laboratuvar tarafından belirlenen kalite kontrol ölçümlerini geçtiğinden emin olmak için çalıştırma istatistiklerini analiz edin. Son olarak, bir Genomik Veri Görüntüleyicisi'nde, BAM dosyalarını görüntüleyerek her bir varyantı manuel olarak gözden geçirin. Bu, bir kütüphane hazırlık örneğinin geçip geçmediğini belirlemek için kullanılan, ortalama kapsamı içermeyen en önemli çalışma istatistiklerinin bir özetidir QC.As burada görüldüğü gibi, Birinci Durum, Biyoinformatik, raporlanabilir dört AML ile ilişkili mutasyon tespit etti.
FLT3'te bir yanlış anlamlı mutasyon, IDH2'de bir yanlış anlamlı mutasyon ve NPM1'de bir çerçeve kayması mutasyonu. FLT3'teki mutasyonlar, AML'li yetişkin hastaların yaklaşık% 25'inde gözlenir. Bu AML hastasında görüldüğü gibi FLT3 Kinaz Domain Point Mutasyonlarının prognostik önemi, prognoz üzerinde belirsiz bir etkiye sahiptir.
İzositrat Dehidrojenaz 2 veya IDH2, AML'de yaygın olarak mutasyona uğrayan bir epigenetik değiştiriciyi kodlar. Nükleofosmin veya NPM1 genindeki mutasyonlar, AML'de en sık edinilen mutasyonlardan biridir. Bu tablo, Durum İki için tüm ekzonik varyantları listeler.
Hastalıkla ilişkili iki mutasyon tespit edildi. ERBB2'nin Ekzon 20'sinde bir çerçeve içi yerleştirme ve TP53'te bir yanlış anlamlı mutasyon. HER2/neu veya ERBB2, bir Tirozin Kinaz Reseptörünü kodlar.
Akciğer Adenokarsinomlarının %2 ila %4'ünde aktive edici HER2/neu ekzon 20 eklemeleri görülür ve akciğer kanserinde gözlenen HER2/neu mutasyonlarının çoğunu oluşturur. TP53 değişiklikleri kanserde de sık görülür. Ekstrakte edilen DNA'nın kalitesine ve miktarına çok dikkat etmek gerekir.
Bu özellikle FFPE numuneleri için önemlidir. Genellikle DNA verimi olan bir değişkenle yüksek derecede bozulmuş deniyoruz. Klinik tahlilin doğrulama süreci sırasında, DNA'yı kütüphane hazırlığına ilerletmeden önce her bir numune için DNA kalitesi ve miktarı için metrikler oluşturulmalıdır.
Kütüphane hazırlığına ek olarak, sıralama çalışması için kesme değerlerini, kalite kontrol istatistiklerini, kütüphane hazırlama istatistiklerini, bir Amplicon'un cesaret derinliğini ve minimum raporlanabilir alel frekansını belirleyerek bir Biyoinfomatik Casus Planını doğrulamak çok önemlidir. Ustalaştıktan sonra, kütüphane hazırlığı bir iş günü içinde gerçekleştirilebilir. Ancak, genel tahlil iş akışı, DNA ekstraksiyonu, dizileme, veri işleme ve varyant incelemesi için daha fazla zaman gerektirir.
Bu prosedür, yalnızca belirli önemli sıcak noktalardaki genomik DNA mutasyonlarına bakmak için tasarlanmıştır. RNA kullanan diğer kitleler, genlerin diferansiyel ifadesi, risk tümörlerini ilişkilendirmek ve yapısal yeniden düzenlemeler gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir. Ufukta büyük gelişmeler var.
Otomasyonun benimsenmesi ve benzersiz bir moleküler barkodlamanın dahil edilmesi, laboratuvarların geri dönüş süresini kısaltmasına, daha az numune girdisi kullanmasına ve varyantları çok düşük bir alel frekansında tespit etmesine olanak tanıyacaktır. Kanser örneklerinde hastalıkla ilişkili mutasyonların tespiti, onlarca yıldır standart bakım olmuştur. NGS, birçok kanserle ilişkili birden fazla geni paralel olarak sıralamak için daha az önyargılı bir yaklaşımdır ve bu da çoklu mutasyonların tanımlanmasına ve hastalar için daha iyi tedavilere yol açar.
İzlediğiniz için teşekkür ederiz ve deneylerinizde iyi şanslar.
Genel Bakış
Bu el yazması, hematolojik maligniteler ve solid tümörleri hedefleyen yeni nesil dizileme panelleri için klinik protokolleri açıklamaktadır. Sürücü mutasyonların moleküler sınıflandırması, kanser tedavisi için değerli prognostik ve öngörüsel bilgiler sağlar.
Çalışmanın Temel Bileşenleri
Bilim Alanı
- Onkoloji
- Genomika
- Hastalığına Özgü Tıp
Arka Plan
- Yeni nesil dizileme, tümörlerde patojenik mutasyonların tespit edilmesini sağlar.
- Mutasyonları anlamak, tedavi kararlarını yönlendirebilir.
- Karmaşık teknikler, etkili öğrenme için görsel gösterimlerine ihtiyaç duyar.
- Dizileme teknolojisindeki gelişmeler, kanser tedavilerinde iyileştirme için kritik öneme sahiptir.
Çalışmanın Amacı
- Kanser hastalarında aksiyonel mutasyonları tespit etmek için protokoller geliştirmek.
- Onkolojide teşhis ve prognoz yeteneklerini artırmak.
- Genetik bilgilere dayalı hedefe yönelik tedavilerin kullanımını kolaylaştırmak.
Kullanılan Yöntemler
- Tümör örneklerinden genomik DNA'nın ekstraksiyonu.
- Spesifik reaktifler kullanılarak Amplikon Kütüphanelerinin hazırlanması.
- PCR amplifikasyonu ve dizileme protokollerinin uygulanması.
- Dizileme sonuçlarını ve varyant tespiti değerlendirmek için biyoinformatik analiz.
Ana Sonuçlar
- Akut miyeloid lösemi (AML) ile ilişkili raporlanabilir mutasyonların tespiti.
- FLT3, IDH2 ve NPM1 genlerinde mutasyonların tanımlanması.
- Bu mutasyonların prognostik önemine dair içgörüler.
- Yöntemin klinik ortamlarda etkinliğinin gösterimi.
Sonuçlar
- Yeni nesil dizileme, kanser mutasyon analizi için güçlü bir araçtır.
- Aksiyonel mutasyonlar, tedavi stratejilerini önemli ölçüde etkileyebilir.
- Görsel gösterimler, karmaşık metodolojileri anlamayı kolaylaştırır.
Sıkça Sorulan Sorular
Executive Industry Relevance
Next-generation sequencing (NGS) panels for solid and liquid tumors enable comprehensive detection of actionable mutations, directly informing therapeutic strategies and prognostic assessment in oncology pipelines. Integrating robust NGS workflows with stringent quality control and bioinformatics review enhances predictive confidence and supports risk-adjusted portfolio decisions. These capabilities are critical for advancing precision medicine and optimizing translational continuity from discovery through clinical implementation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic identification of driver mutations for functional target validation in cancer models.
- Supports biological de-risking by clarifying mutational landscapes relevant to disease progression.
- Facilitates prioritization of therapeutic hypotheses based on mutation prevalence and pathogenicity.
Screening & Assay Development
- Provides validated mutation panels for standardized screening across diverse tumor types.
- Ensures reproducibility and quantitative output through rigorous DNA quality and integrity controls.
- Enables scalable, multiplexed detection of rare and common variants in a single workflow.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant biomarkers for translational research continuity.
- Supports preclinical model selection and mechanistic de-risking based on actionable mutation status.
- Informs risk-adjusted advancement decisions by integrating genomic data with clinical endpoints.
Pipeline & Workflow Integration
NGS-based mutation detection bridges early discovery, lead identification, and translational research by providing high-confidence genomic data for decision-making.
- Discovery Biology: Enables hypothesis testing and pathway clarification through comprehensive mutation profiling.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative variant detection for assay readiness and downstream evaluation.
- Analytics: Provides robust variant calling, allele frequency quantification, and QC metrics for comparative analysis.
- Translational Research: Connects molecular findings to disease models and biomarker strategies when supported by mutation data.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, scalable NGS workflow adaptable to evolving oncology portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target selection.
- Operational Value: Standardizes mutation detection with reproducible, scalable protocols and bioinformatics pipelines.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of oncology assets.
Implementation Considerations
- Requires specialized expertise in molecular biology, sequencing, and bioinformatics analysis.
- Demands high-quality instrumentation for DNA extraction, library preparation, and sequencing.
- Necessitates rigorous cross-team standardization of QC metrics and variant interpretation thresholds.
- Must adapt protocols for variable sample types, especially FFPE and low-yield specimens.
- Relies on validated bioinformatics pipelines and established cutoff values for reliable reporting.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:19
Genomic DNA Quality Control and Amplicon Library Preparation
3:23
Indexing and PCR Amplification
4:37
PCR Purification and Bead-based Normalization
6:33
Sequencing and Data Analysis
7:19
Results: Mutations Detected in Solid and Liquid Tumors Using Next Generation Sequencing
9:06
Conclusion
