Name: Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-09-20T08:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 15 s
Description: Keşfedin, yeni nesil dizileme ile katı ve sıvı tümörlerdeki harekete geçirici mutasyonları tespit etme yöntemlerini. Bu teknik, kanser tedavisinde kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Yazarlar üretimde el yazması ve yardım okumak için Daniel Wild yardım kabul etmek istiyorum.

<ol><li>Gerlinger, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intratumor+heterogeneity+and+branched+evolution+revealed+by+multiregion+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Intratumor heterogeneity and branched evolution revealed by multiregion sequencing.</a> N Engl J Med. 366 (10), 883-892 (2012).</li>
<li>Campbell, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+patterns+and+dynamics+of+genomic+instability+in+metastatic+pancreatic+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The patterns and dynamics of genomic instability in metastatic pancreatic cancer.</a> Nature. 467 (7319), 1109-1113 (2010).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+in+relapsed+acute+myeloid+leukaemia+revealed+by+whole-genome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution in relapsed acute myeloid leukaemia revealed by whole-genome sequencing.</a> Nature. 481 (7382), 506-509 (2012).</li>
<li>Frampton, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+clinical+cancer+genomic+profiling+test+based+on+massively+parallel+DNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a clinical cancer genomic profiling test based on massively parallel DNA sequencing.</a> Nature Biotechnol. 31 (11), 1023-1031 (2013).</li>
<li>Patel, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+relevance+of+integrated+genetic+profiling+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Prognostic relevance of integrated genetic profiling in acute myeloid leukemia.</a> N Engl J Med. 366 (12), 1079-1089 (2012).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC+%28the+Catalogue+of+Somatic+Mutations+in+Cancer+%29%3A+a+resource+to+investigate+acquired+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC (the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer ): a resource to investigate acquired mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 38 (Database Issue), 652-657 (2010).</li>
<li>Shih, A. H., Abdel-wahab, O., Patel, J. P., Levine, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+mutations+in+epigenetic+regulators+in+myeloid+malignancies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of mutations in epigenetic regulators in myeloid malignancies.</a> Nat Rev Cancer. 12 (9), 599-612 (2012).</li>
<li>Liersch, R., Müller-Tidow, C., Berdel, W. E., Krug, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+factors+for+acute+myeloid+leukaemia+in+adults+-+biological+significance+and+clinical+use%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Haematol%22%5BJournal%5D)">Prognostic factors for acute myeloid leukaemia in adults - biological significance and clinical use.</a> Br J Haematol. 165 (1), 17-38 (2014).</li>
<li>Bacher, U., Schnittger, S., Haferlach, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+genetics+in+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Molecular genetics in acute myeloid leukemia.</a> Curr Opin Oncol. 22 (6), 646-655 (2010).</li>
<li>Subramanian, J., Govindan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+in+%26%2334%3BNever-smokers%26%2334%3B%3A+a+unique+entity%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+%28Williston+Park%29%22%5BJournal%5D)">Lung cancer in &#34;Never-smokers&#34;: a unique entity.</a> Oncology (Williston Park). 24 (1), 29-35 (2010).</li>
<li>Sakashita, S., Sakashita, M., Tsao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genes+and+pathology+of+non-small+cell+lung+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Genes and pathology of non-small cell lung carcinoma.</a> Semin Oncol. 41 (1), 28-39 (2014).</li>
<li>Arcila, M. E., Chaft, J. E., Nafa, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+clinicopathologic+associations%2C+and+molecular+spectrum+of+ERBB2+%28HER2%29+tyrosine+kinase+mutations+in+lung+adenocarcinomas%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Prevalence clinicopathologic associations, and molecular spectrum of ERBB2 (HER2) tyrosine kinase mutations in lung adenocarcinomas.</a> Clin Cancer Res. 18 (18), (2012).</li>
<li>Gandhi, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+I+study+of+neratinib+in+combination+with+temsirolimus+in+patients+with+human+epidermal+growth+factor+receptor+2-dependent+and+other+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Phase I study of neratinib in combination with temsirolimus in patients with human epidermal growth factor receptor 2-dependent and other solid tumors.</a> J Clin Oncol. 32 (2), 68-75 (2014).</li>
<li>Sheikhha, M. H., Awan, A., Tobal, K., Liu Yin, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+significance+of+FLT3+ITD+and+D835+mutations+in+AML+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Hematol+J%22%5BJournal%5D)">Prognostic significance of FLT3 ITD and D835 mutations in AML patients.</a> Hematol J. 4 (1), 41-46 (2003).</li>
<li>Mazières, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+that+harbors+an+HER2+mutation+epidemiologic+characteristics+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer that harbors an HER2 mutation epidemiologic characteristics and therapeutic perspectives.</a> J Clin Oncol. 31 (16), 1-8 (2014).</li>
<li>Robinson, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+Genomics+Viewer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Integrative Genomics Viewer.</a> Nat Biotechnol. 29 (1), 495-500 (2011).</li>
<li>Forbes, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((COSMIC%3A+exploring+the+world%27s+knowledge+of+somatic+mutations+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">COSMIC: exploring the world's knowledge of somatic mutations in human cancer.</a> Nucleic Acids Res. 43 (Database issue), D805-D811 (2014).</li>
<li>Daber, R., Sukhadia, S., Morrissette, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+limitations+of+next+generation+sequencing+informatics%2C+an+approach+to+clinical+pipeline+validation+using+artificial+data+sets%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Genetics%22%5BJournal%5D)">Understanding the limitations of next generation sequencing informatics, an approach to clinical pipeline validation using artificial data sets.</a> Cancer Genetics. 206 (12), 441-448 (2013).</li>
<li>Haraksingh, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-Wide+Mapping+of+Copy+Number+Variation+in+Humans%3A+Comparative+Analysis+of+High+Resolution+Array+Platforms%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Genome-Wide Mapping of Copy Number Variation in Humans: Comparative Analysis of High Resolution Array Platforms.</a> PLoS ONE. 6 (11), e27859(2011).</li>
<li>de Leeuw, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SNP+Array+Analysis+in+Constitutional+and+Cancer+Genome+Diagnostics+-+Copy+Number+Variants%2C+Genotyping+and+Quality+Control%5BTitle%5D)+AND+%22Cytogenet+Genome+Res%22%5BJournal%5D)">SNP Array Analysis in Constitutional and Cancer Genome Diagnostics - Copy Number Variants, Genotyping and Quality Control.</a> Cytogenet Genome Res. 135 (3-4), 212-221 (2011).</li>
</ol>

Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.

<html> Bu yazıda anlatılan iki NGS testler klinik sunulmaktadır gibi, en önemli pratik göz kalite kontrolüdür. Özellikle, yakın dikkate kalitesi ve çıkarılan DNA miktarına dikkat edilmelidir. Bu genellikle değişken DNA verimi ile son derece bozulmuş FFPE örnekleri için özellikle önemlidir. Bir izopropanol çökeltme metodu kolon dayalı yöntemler bazen sınırlı elüsyon hacimleri ile, DNA makaslama yol bulunmuştur olarak FFPE örneklerinden DNA verimini en üst düzeye çıkarmak amacıyla geliştirilmiştir. Bu nedenle, bir örnek çok düşük konsantrasyon elde edilir ve analiz için çok bozulmuş çoğu zaman, bunun nedeni, doku boyut, tür ya da tespit olup çıkarma işlemi büyük olasılıkla. Bir ekstraksiyon hatası varsa kan / kemik iliği örnekleri için, bunun nedeni bir örnek olma hemodilute genellikle (yani, beyaz kan veya tümör o çekilişte hücrelerin yeterli sayıda olmaması) ablasyon veya kemoterapi. . Doğrulama sırasında nt &quot;&gt; DNA nitelik ve nicelik kabul edilebilirliği için cutoffs kurulmalıdır 100 önerilen girdi - 250 ng genellikle tahlilde kullanılan DNA kalitesi iyi, ancak, daha sonra düşük girdi miktarları başarılı olabilir. (amplifiye DNA miktarı tavsiye edilen girdi ulaşacak beri) daha yüksek girdi miktarları sıralama sonuçlarının kalitesini artırabilir - DNA kalitesi düşükse ek olarak, (ng 250, yani büyütülebilir DNA miktarı az 100 olduğunu) . DNA kalite ve miktar için Metrik kütüphane hazırlık içine DNA ilerlemeden önce her bir örnek için uygulanmalıdır. Bu örnekleri bir &quot;gri bölge&quot; (Şekil 2) laboratuar müdürü veya designee takdirinde çalıştırılması gerekir. Şu anda en iyi DNA dizilimi sırasında iyi bir performans eğer tahmin yolu girişi DNA miktar ve kalite değerlendirmesi için izin veren bir qPCR tabanlı tahlil yapmaktır. Bu yaklaşım bioavailab adresleriFarklı büyüklükte parçalar (örneğin, 100 bp, 150 bp, 200 bp ve 300 bp) ve karşılaştırma verim amplifikasyonu yoluyla numune farklı büyüklükteki parçalardan, ility. Şu anda, kütüphane hazırlık birkaç kavşak noktası birinde bir yanlış adım kütüphane başarısız ya da kalitesiz olmasına neden olabilir manuel adımlar çok sayıda içerir. mikroakışkan jel analizi sıralama önce bir kütüphane hazırlık sorunu kontrol etmek için tek QC adımıdır. Buna göre, ekstra farkındalık başarılı bir reaksiyon olasılığını artırabilir birkaç kritik adımlar vardır. Doğru örnek ve oligonükleotid havuzu, her numune için kullanılan garanti zorunludur. Sağlanması ve uygun her bir numune çift endeksli PCR primer çiftlerinden birini 96 benzersiz kombinasyonu içeren kayıt örnek karıştırmak için şansını azaltır. Ayrıca, filtre plakası (FPU) doğru akar sağlamak için önemlidir; o uygun drenaj yoksa bu tamponlar neden olabilirKütüphane hazırlık nsion-ligasyonu adım vasatın altında performans ve kalitesiz sıralama verilerine yol. Kütüphane QC sonra LNB1 taneler tamamen yeniden süspansiyon haline sağlamak için önemlidir ve LNB1 / LNA1 bu çözelti konsantrasyonu kütüphanesinin molarite belirlemek için kullanılır olarak numunelerin eklemeden önce de karışık olduğu. boncuk elüsyon adım boncuk kapalı akıtılarak kütüphanenin bir optimal miktarda yol açarsa Nihayet, kümeleme yoğunluğu azalacak ve muhtemelen kütüphane yeterli ortalama kapsama almak değil neden olur. Tersine, kütüphanenin aşırı yoksul kaliteli okur yol açacaktır. Bu nedenle, sequencer kütüphanelerin uygun birleştirme ve kümelenmeyi sağlamak için boncuk esaslı normalizasyon adımında tutarlı olması önemlidir. Kütüphane hazırlanmasına ek olarak, ham de-birden fazla mesaj göndermiş fastq dosyaları hassas mutasyon çağrı üretecek biyoenformatik boru hattı doğrulamak için kritik öneme sahiptir. seçimi birbir aracılığıyla elemek zorunda kalacak pek çok açık kaynak ve ticari olarak mevcut hizalama, varyant arayanlar ve NGS yazılım paketleri olduğu gibi özel çözüm zaman alıcı olabilir. Özel algoritmaları, temel performans istatistiklerini çıkarmak en açık kaynak araçları atlatmış benzersiz yinelenen mutasyonları tespit ve loci her aşkın kopya sayısı durumunu belirlemek için tasarlanmış olması gerekir. Bir biyoinformatik boru hattının doğrulama işlemi sırasında, karşılayan veya kalite filtreleme sonra kapsama minimum derinliği (örn en az 250 okur) ve asgari alel frekansı hem aşan varyantları için raporlanabilir kesilecek belirlemek önemlidir (örneğin, 4 %). Bu bir çoklanmış amplikon tabanlı tahlil yana, asgari kapsama derinliğini ortalama belirlenmesi önemlidir (örneğin, 1,000x) kütüphane okur asgari derinliği düşük performans Amplikon&#39;u elde edebilmek için ulaşmak için ihtiyaç duyduğu. Buna ek olarak, deneyin birden fazla mesaj yapısı c yaparause kapalı hedef etkileri ve bu &#39;eserler&#39; keşfetti ve tamamen lansmandan önce incelenmesi gerekir. tarif edilen deney bir diğer önemli bir sınırlama doğrulanmış az alel frekansı elde etmek için daha fazla,% 10 tümör içeren örnekler için bir ihtiyaç vardır. Düşük frekans,% 1, FLT3 eklemeleri tespiti manuel yorum hala bu süreçte arzu edilir olduğunu kanıtıdır. Hatta% 5&#39;lik bir allel sıklığı kesme ile, bazı önemli mutasyonlar belki cevapsız ve böylece el ile inceleme bu varyantları tespit etmek için gerekli olacaktır. FLT3-ITD için ekson 14 görsel muayene farkedilmeden gitmez düşük düzeyde ya da büyük ekleme / tekrarını sağlamak için tüm AML hastaları için yapılır. Buna ek olarak, yaygın primer dizisinin yanında olan HER2 ekson 20 eklemeler, manuel müdahale gerekiyor. sağlam bir biyoinformatik boru hattı olmasına rağmen, bazı varyantlar sert kesim olan sadece doğası olan gözden gitmek olabilirEn istatistikler yukarıda belirtilen kapalı. Iyi biyoinformatik, bu sorunu hafifletmek için gerekli olacak gibi olacak daha iyi bir kütüphane hazırlama ve / veya sıralama metodolojileri, bu daha az eser ve yanlış pozitif ihtiva daha düşük eşik iyi kalitede veri olması daha avantajlıdır çünkü. Algılama ve alel frekansları yorumlanması tümörün yüzdesi belirlenmesi ve genom bazı bölgelerin amplifikasyonu yanlılığı zorluk zor olabilir. Bu heterozigozite (LOH) olay kaybı olarak yorumlanır halinde 2&#39;de görüldüğü gibi, ek olarak,% 50&#39;den fazla alel frekansları mutantının belirgin bir artışa yol açan, her iki yüzünden, normal alel kaybı tespit edilebilir, okuyan mutant alellin (örneğin, 2 mutantı ve bir normal kopyalama) ya da diğer mekanizmalar kazancı. Bu mekanizmalar dizisi karşılaştırmalı genomik hibridizasyon (aCGH 19) ve / veya bir SNP genotipleme dizisi kullanılarak açıklanacaktır edilebilir. 20. Geçerli hedef zenginleştirme metodolojileri daha dizileme tek bir örnek kapsama ve hedef sıralama okur kapalı daha ihtiyacı neden verimsiz hibrid yakalama veya birden fazla mesaj göndermiş PCR teknikleri ya tam gün prosedürleri güveniyor. Yakın gelecekte beklenen NGS moleküler onkoloji için ek uygulamalar tam automatable olması ve giriş DNA çok düşük miktarlarda örnekleri işlemek mümkün olabilir kolay kütüphane hazırlama yöntemlerini içerecektir (yani, 1 ng az) yanı sıra örnekleri çok bozulmuş olan DNA. Bu zorlukları ele almak için, çoğu yöntemleri muhtemelen, PCR bazlı olacak ya çok aşamalı PCR yaklaşım ya da bir kitlesel paralel singleplex PCR yaklaşımında olmak. Buna ek olarak, tek tek amplikonların molekül barkod önemli ölçüde arka dizileme gürültüsünü azaltmak için gösterilmiştir ve alt alel frekansları elde etmek ve dolaştırma yakalama doğru hareket tümör hücrelerinin daha düşük oranlarda örneklerin test sağlayacaktırTümör hücreleri ing. Kanser örneklerinde hastalıkla ilişkili mutasyonların saptanması yıllardır bakım standart olmuştur. Tarihsel olarak, genler, genellikle test dizisinin sonuna gelen bir mutasyonun belirlenmesi ile her seferinde sekans, tek bir gen / ekson test edildi. NGS gelişi neoplazi ile ilişkili birden fazla mutasyonun tanımlanması yol açan paralel birçok kanser ile ilişkili birden fazla gen sıralanması için daha az önyargılı bir yaklaşım için izin verdi. Kanser somatik mutasyonların saptanması için NGS klinik kullanımı giderek daha belirgindir. Gerçekten de, tümör örneklerinin NGS tabanlı analiz, geleneksel tek gen testi meydan okuyan yeni bir paradigma temsil eder, ama klinik yarar çok açıktır. Klinik laboratuvarlar bugün bu güçlü teknolojinin uygulanması ile dikkatli bir yöntem doğrulama ve test yorumunu evlenmek heyecan verici bir fırsat var.

Klinik onkoloji örneklerin nesil dizileme (NGS) hedeflenebilir genetik değişiklikler ve tahmini / prognostik moleküler belirteçlerin tanımlanması önemine bilimsel literatür noktaları büyüyen olarak daha yaygın olarak kullanılabilir, son birkaç yıl içinde olmuştur. Çok gen paneli analizleri ve hastalık ilerledikçe ve nüksler hem epitel 1,2 ve hematolojik 3 malignitelerde tüm exome sıralama çalışmaları tümör heterojenite kavramını ve klonal evrim katılaşmış olması. Ek olarak, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) ya da Sanger sekanslama gibi rakip yöntemin aksine NGS tek bir tahlil 4 Tüm klinik olarak anlamlı kanser genlerinin en genomik değişiklik tespit edebilir. Başlangıçta iki klinik NGS paneller, özel bir Hematolojik Paneli (Heme-NGS Paneli) ve bir off-the-raf FFPE numuneler için Kanser Paneli (Solid-NGS Panel) ile başlatılan Kişiselleştirilmiş Diagnostics Merkezi (bkz <strong&gt; Şekil 1). Bu paneller, seçilen genlerin klinik açıdan anlamlı ya da yüksek faiz bölgeleri kapsamaktadır; tüm genler veya ekzon tamamen kaplıdır değil. Amplikonlar uzama ve ligasyon, ardından prob hibridizasyonu ile oluşturulur. Hedeflenen bölgeler daha sıralaması için toplanmış olan 96 numuneye kadar izin evrensel çift endeksli primerleri ile PCR kullanılarak güçlendirilir. <img alt="Şekil 1" src="/files/ftp_upload/52758/52758fig1.jpg" /> Şekil 1:. Panellerde Kapalı Genlerin Listesi Kütüphane hazırlık kullanılarak yapılır ya özel Hematolojik Paneli 33 genlerin ya da off-the-raf Amplikon Kanser Paneli 47 genin (Katı-NGS) içinde (Heme-NGS Panel). Genler ya da ekzon hepsi bir amplikonlar sadece belirli noktaları kapsayacak olabilir. Tam kaplıdır değil <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/52758fig1large.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. &lt;</a>/ A&gt; Heme-NGS Panel içerik çoklu kaynaklardan elde edilen, ancak daha önce klinik yarar 5 yüksek seviyede gösteren olarak tarif akut myeloid lösemi (AML) mutasyona uğramış genlerin 16 civarında merkezleri oldu. Katı-NGS Paneli ticari (KOZMİK) veritabanı 6 Kanser Somatik Mutasyonlar Kataloğu belirtildiği gibi kanser yaygın mutasyona uğramış genlerin dayalı hedeflenmiş bölgeler ile üretilmektedir. Birkaç önemli adımlar klinik NGS genel iş akışını karakterize eder. Klinisyen testi emir sonra, bir patolog tümör yüzdesi ve örnek hacmi için analiz aşağıdaki numunenin yeterliliğini belirler. Kurumumuzda, biz teknoloji arka plan sekans hata oranı ( &quot;gürültü&quot;) ve hedeflenen yaklaşımının verimliliği nedeniyle en az% 10 tümör gerektirir. Doku testleri için yeterli ise, genomik DNA elde edildi. Bu DNA daha sonra (çoklu kalite kontrolüne tabi tutulurQC) adımlar. DNA, QC geçerse, bir amplikon kütüphanesi oluşturulur ve dizilenmiştir. Elde edilen veriler, in-house biyoinformatik boru hattı ile analiz edilir. biyoinformatik analizi takiben, varyantlar elle incelenir ve bir klinik raporu dahil edilmeden önce patojenik yorumlanır. biz tarif Aşağıda sonuçta bu titiz iş akışı ile gitti ve iki olgu klinik yönetiminde değişikliklere yol açmıştır. Durum 1 - Akut Myeloid Lösemi Hasta A kemik iliği biyopsisi olgunlaşması olmadan, AML için teşhis oldu. Sitogenetik çalışmalar kemik iliği örneğinin gönderilen ve normal kadın karyotip saptandı. Orada mevcut% 95 dolaşan patlamalar vardı, bu yüzden bir periferik kan numunesi Heme-NGS Panelinde kişiselleştirilmiş tanı testleri için gönderildi. Akut miyeloid lösemi (AML), beyaz kan hücrelerinin myeloid hematolojik kanseridir. bulmaTekrarlayan gen mutasyonları patogenezi ve prognozu 7 önemli olarak kabul ile AML gen mutasyonlarının, prognoz ve tedavi için giderek daha önemli hale gelmiştir. FLT3&#39;te iç tandem duplikasyonları (ITD) daha az olumlu sonuç 8 ile ilişkilendirilmiştir ise NPM1 ve CEBPA mutasyonlar, bir prognostik risk ile ilişkili bulunmuştur. Artan miktarda kanıt vücut AML 9, bu ve diğer mutasyonlar için bir patojenik rolünü desteklemektedir. Durum 2 - Akciğer Adenokarsinom Hasta B sol supraklaviküler kitle biyopsi akciğer adenokarsinomu gösterdi. % 50&#39;den fazla tümör rulo / kıvrımları, bir mutasyon hedeflenen terapötik müdahale için hazır olup olmadığını belirlemek için formalin ile fikse parafine gömülü (FFPE) lenf nodu kütlesinden Biyopsi materyali genomik test (Katı-NGS Paneli) için gönderildi. akciğer Cancer ABD&#39;de kansere bağlı ölümlerin başta gelen nedenidir ve iki ana tipi, küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (KHDAK) ve küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHAK) ayrılmıştır. NSCLC daha lezyonun histolojik göre, adenokarsinoma ya da skuamoz hücre karsinoması olarak tanımlanabilir. Akciğer adenokarsinomu sigara içen ve içmeyen hem görülen akciğer kanserinin en sık görülen alt tipi vardır ve sigara içmeyenler için 10 akciğer kanserinin en sık görülen şeklidir. Akciğer adenokarsinomlarında moleküler çalışmalar birden onkogenler 11 mutasyon belirledik. Sigara içenlerde tanımlanan en yaygın sürücü mutasyonlar KRAS ve BRAF mutasyonlar. Sigara içmeyen en yaygın mutasyonlar EGFR mutasyonları ve genleri ALK, RET ve ros1 içeren düzenlenmeleri vardır. Akciğer tümör geni ErbB2&#39;nin bir çerçeve ekson 20 ekleme (HER2 / neu) ile tarif edilmiştir. HE en yaygın anormallikR2 / neu hedeflenen tedavi (: HER2 / neu karşı insan monoklonal antikoru trastuzumab) mevcut olduğu göğüs kanseri, bu lokus kuvvetlendirilmesi olan. 2 gözlenir HER2 / neu ekson 20 ekleme - akciğer% 4 12 (sırasıyla, neratinib ve temsirolimusun) 13 HER2 / neu ve mTOR inhibitörleri ile kombinasyon tedavisine kısmi yanıt göstermiştir adenocarcimomas.

<table><tbody><tr><td>Genomik DNA ScreenTape</td><td>Agilent Teknolojisi</td><td>5067-5365</td><td></td></tr><tr><td>Genomik DNA Reaktifleri</td><td>Agilent Teknolojisi</td><td>5067-5366</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000 ScreenTape</td><td>Agilent Teknolojisi</td><td>5067-5584</td><td></td></tr><tr><td>Yüksek Hassasiyetli D1000 Reaktifleri</td><td>Agilent Teknolojisi</td><td>5067-5585</td><td></td></tr><tr><td>TapeStation 2200</td><td>Agilent Teknolojisi</td><td>G2965A TapeStation</td><td></td></tr><tr><td>Analiz Yazılımı</td><td>Agilent Technology</td><td>A.01.04 veya üstü</td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Tüp Depolama Rafları</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15/50 ml Tüp Rafı</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>96 kuyulu Plaka Rafı</td><td>Herhangi bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipet, tek kanallı, 0.5&ndash; 2.5 ve mu; l</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeti, tek kanallı, 1 &ndash; 10 & mu; l</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeti, tek kanallı, 2 &ndash; 20 &mu; l</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeti, tek kanallı, 10 &ndash; 100 ve mu; l</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeti, tek kanallı, 20 < 200 &mu; l</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeti, tek kanallı, 100 < 1.000 &mu; l</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serolojik Pipetleyici</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortekser</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buz kovası</td><td>Herhangi bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikrosantrifüj (tüpler ve şerit tüpler için)</td> <td>Herhangi bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dondurucu, -20 > C</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 & derece; C Buzdolabı</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Su veya Boncuk Banyosu</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>İnkübatörü (37 > c)</td> <td>Herhangi bir satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>serolojik pipetleri, 1&nbsp; ml</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serolojik Pipetler, 5&nbsp; ml</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serolojik Pipetler, 10&nbsp; ml</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Serolojik Pipetler, 25&nbsp; ml</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eldiveni</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tıraş Bıçağı/Scaples</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KimWipes</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 ml Konik Tüp</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml Konik Tüp</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kağıt Havlu</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>200 kanıt Etanol</td><td>Yanıcı Dolapta</td>Herhangi <td>Bir Satıcı</td><td></td> Mağazası</tr><tr><td>2-Propanol (İzopropanol)</td><td>Yanıcı Dolapta</td>Herhangi <td>Bir Satıcı</td><td></td> Mağazası</tr><tr><td>25 ml Rezervuarlar</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 N NaOH</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeti, 8 kanallı, 1 &ndash; 10 &mu; l</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeti, 8 kanallı, 10 &ndash; 100 &mu; l</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipeti, 8 kanallı, 20 &ndash; 300 &mu; l</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buz Kovası</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Su Fışkırtma Şişesi</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkol Fışkırtma Şişesi</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lens Temizleme Kağıdı</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plakası, 96 kuyulu PCR, Yarı Etekli</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tüp şeritleri, 8 kuyulu, 0.2 & nbsp; ml</td><td>Herhangi Bir Satıcı</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP Boncuk</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63881</td><td></td></tr><tr><td>BioShake IQ veya 3000-T karaağaç</td><td>Bulldog Bio / Q.Instruments</td><td>1808-0506 / 1808-0517</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 S - LabChipDS</td><td>Kumpas</td><td>128876</td><td></td></tr><tr><td>DropPlate96 D - LabChipDS</td><td>Kumpas</td><td>132848</td><td></td></tr><tr><td>DropSense96</td><td>Kumpas (Trinean)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DropQuant Yazılım</td><td>Kaliper (Trinean)</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plaka Sızdırmazlık Filmi</td><td>Denville</td><td>B1212-5S</td><td></td></tr><tr><td>Alüminyum Conta Folyosu</td><td>Denville</td><td>B1212-6S</td><td></td></tr><tr><td>Nükleaz İçermeyen, Saf Su Sistemi</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5424 santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>22621408</td><td></td></tr><tr><td>5804R santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>22623508</td><td>Hem 15 ml'lik tüp hem de plaka döndürücüler, tercihen 2.500 x g'a kadar çıkabilen bir santrifüj.</td></tr><tr><td>Güvenli Kilitli Tüp 1.5 ml, Doğal</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>5 ml Tüp, DNA LoBind Tüp</td><td>Eppendorf</td><td>30108310</td><td></td></tr><tr><td>5430R Santrifüj</td><td>Eppendorf</td><td>022620645</td><td>Herhangi bir plaka döndürücü santrifüj çalışacaktır</td></tr><tr><td>Hybex Microsample İnkübatör</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-30-0</td><td></td></tr><tr><td>Hybex 0.2 ml Tüp Blok</td><td>Fisher Scientific</td><td>1057-31-0</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Amplicon &ndash; Kanser Paneli</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1008</td><td>96 reaksiyon</td></tr><tr><td>TruSeq Özel Amplikon</td><td>Illumina</td><td>PE-940-1011</td><td>96 reaksiyon</td></tr><tr><td>TruSeq Özel Amplikon İndeks Kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1003</td><td>96 İndeks, 384 Numune</td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v3, 500 Döngü</td><td>Illumina</td><td>MS-102-3003</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v2, 300 Döngü</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reaktif Kiti v2, 500 Döngü</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2003</td><td></td></tr><tr><td>Deney Yöneticisi</td><td>Illumina</td><td>1.3 veya üstü</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq Reporter</td><td>Illumina</td><td>2.0 veya üstü</td><td></td></tr><tr><td>Sıralama Analizi Viewer</td><td>Illumina</td><td>1.8 veya üstü</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq İndeks Plakası Fikstürü ve Yaka Kiti</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1007</td><td></td></tr><tr><td>MiSeq v2</td><td>Illumina</td><td>SY-410-1003</td><td></td></tr><tr><td>TruSeq Özel Amplikon Filtre Plakası</td><td>Illumina</td><td>FC-130-1006</td><td></td></tr><tr><td>İndeks Adaptörü Yedek Kapaklar</td><td>Illumina</td><td>11294657</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 2.0</td><td>Invitrogen</td><td>Q32866</td><td></td></tr><tr><td>Qubit 0.5 ml Tüpler</td><td>Invitrogen</td><td>Q32856</td><td></td></tr><tr><td>Qubit dsDNA Geniş Aralıklı Test Kiti</td><td>Invitrogen</td><td>Q32853</td><td></td></tr><tr><td>DynaMa6-96 Manyetik Stand, Yan Etekli</td><td>Invitrogen</td><td>120.27</td><td></td></tr><tr><td>GeneAmp PCR System 9700 (altın/gümüş blok)</td><td>Life Technologies</td><td>N8050200</td><td></td></tr><tr><td>Gentra Puregene Kan Kiti</td><td>Qiagen</td><td>158489</td><td></td></tr><tr><td>Deparafinizasyon Solüsyonu (16 ml)</td><td>Qiagen</td><td>19093</td><td></td></tr><tr><td>Tampon ATL (4 x 50ml)</td><td>Qiagen</td><td>939011</td><td></td></tr><tr><td>Protein Çökeltme Çözeltisi (50 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158910</td><td></td></tr><tr><td>DNA Hidrasyon Çözeltisi (100 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158914</td><td></td></tr><tr><td>Glikojen Çözeltisi (500&nbsp; &mu; l)</td><td>Qiagen</td><td>158930</td><td></td></tr><tr><td>Qiagen Proteinaz K</td><td>Qiagen</td><td>19133</td><td></td></tr><tr><td>Rnase (5 ml)</td><td>Qiagen</td><td>158924</td><td></td></tr><tr><td>Nukalaz İçermeyen Su (10 x 50 ml)&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>129114</td><td></td></tr><tr><td>Havaneli</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1415-5390</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 10 & # 181; l Sterilize edilmiş raflarda uzun filtre pipet uçları, 96 uçlu 10 raf (960 uç).</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1180-3810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 100 & # 181; l sterilize edilmiş raflarda doğal, eğimli filtre pipet uçları, 96 uçlu 10 raf (960 uç)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1840</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 200 &mu; l Raflarda doğal, eğimli filtre pipet uçları, sterilize edilmiş raflar, 96 uçlu 10 raf (960 uç)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-8810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 20 &mu; l Raflarda doğal, eğimli filtre pipet uçları, sterilize edilmiş raflar, 96 uçlu 10 raf (960 uç)</td><td>USA Scientific</td><td>1180-1810</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT 1.000 &mu; l</td><td>ABD Bilimsel</td><td>1182-1830'da</td><td></td> doğal, dereceli XL filtre pipet uçları</tr></tbody></table>

katı ve sıvı tümörlerinde harekete geçirici mutasyonlar tespiti için yeni nesil dizi

Next Generation Sequencing for the Detection of Actionable Mutations in Solid and Liquid Tumors

Kanserlerin başlaması ve ilerlemesi için gerekli olan sürücü mutasyonlara ilişkin anlayışımız geliştikçe, bir tümörün spesifik moleküler profillerinin terapötik ajanlara yanıtı nasıl öngörebileceği veya prognoz hakkında bilgi sağlayabileceği konusunda kritik bilgiler ediniyoruz. Kurumumuzda, rutin klinik bakımın bir parçası olarak, hem hematolojik hem de katı tümörleri iki yeni nesil dizileme (NGS) paneli kullanarak geniş bir mutasyon spektrumu için tarayan bir tümör genotipleme programı oluşturulmuştur: periferik kan ve kemik iliği ile kullanım için özel, 33 gen hematolojik malignite paneli ve kanserde yaygın olarak mutasyona uğramış 47 geni hedef alan formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku ile kullanım için ticari olarak üretilmiş katı bir tümör paneli. İş akışımız, test için yeterli miktarda tümör olduğundan emin olmak için biyopsinin bir patolog incelemesini ve ardından numune üzerinde özelleştirilmiş DNA ekstraksiyonunun gerçekleştirilmesini içerir. Numunenin kalite kontrolü, miktar, kalite ve bütünlük için adımları içerir ve ancak ekstrakte edilen DNA bu metrikleri geçtikten sonra bir amplikon kütüphanesi oluşturulur ve dizilenir. Elde edilen veriler, şirket içi bir biyoinformatik boru hattı aracılığıyla analiz edilir ve varyantlar patojenite açısından gözden geçirilir ve yorumlanır. Burada, iyi tasarlanmış bir NGS iş akışının klinik sonuçların optimize edilmesine nasıl katkıda bulunabileceğine dair fikir vermek için iki klinik vaka kullanarak her bir panelin faydasının bir anlık görüntüsünü sunuyoruz.

Olgu 1 - Heme-NGS Paneli Lösemi periferik kandan elde edilen DNA Heme-NGS Paneli için yeterli nitelik ve nicelik (176 ng / ul) oldu. kapsama genel ortalama derinliği (1,000x kapsamının asgari ortalama derinliği üzerinde) 4,933x oldu. Ek çalışma istatistikleri Tablo 3&#39;te bulunmaktadır. 250x kapsama altına 8 bölgelerde ki, 3 nedeniyle primerlerin yanlış süsleme (yani, primer sekans düzgün nedeniyle sıralama hataları kaldırılmadı), 1 testin bilinen bir eser oldu vardı ve diğer 4 hayır raporlanabilir varyantları ile farklı genlerin ekson kısmi bölgeleri vardı. Klinik protokolü sadece en az 250 okur kapsadığı varyantları raporlama içerir rağmen, en az 100 ile tüm veri inceleme için veritabanına alınır okur. Veri işleme from biyoinformatik boru hattı üç raporlanabilir, hastalıkla ilişkili mutasyonlar tespit; FLT3 bir missens mutasyonu IDH2 bir missens mutasyonu ve NPM1 bir çerçeve kayması mutasyon. Bunların alel frekansları ile egzonik varyantlar Tablo 4&#39;te açıklanmıştır. FLT3&#39;te ortak bir mutasyon otomatik olarak boru hattı denilen ve ekson 14 ekson 14. Görsel denetim gözle kontrol gerektirir değil FLT3 -İç tandem duplikasyon (ITD) &#39;dir FLT3 sunulan örnekte hiçbir ekleme ya da çoğaltılması gösterdi. FLT3 I836del% 1 allel frekansı oldu ve% 5 valide asgari alel frekansının altına düştü çünkü nihai raporda yer almamıştır. Bu mutasyon FLT3 D835Y değişikliği ile aynı DNA molekülü üzerinde değil (yani, aynı amplikon bölgede gözlenen, ancak &quot;cıs&quot; sıralama herhangi okur in) ve sadece .bam fi manuel inceleme ile izlendiles p.D835Y değişikliği doğrularken. İki FLT3 mutasyonlarının alt alel frekansları bu mutasyonların heterojenliği ve / veya klonal evrim temsil edebilir göstermektedir; Ancak, fark amplikon veya yakınındaki bir tek nükleotid polimorfizmi (SNP) ya da bu alel amplifikasyonu etkilenen primer dizisi örtüşen tahlil performansı nedeniyle olabilir. FLT3, IDH2 ve NPM1 AML tespit mutasyonlar ile Olgu 1 Heme-NGS Panel sonuçları, FLT3&#39;te AML. Mutasyonlarının üç yaygın Değişime uğramış genler AML (KOZMİK veritabanı 17) olan yetişkin hastaların ~% 25&#39;inde görülen ve ya vardır edilir tirozin kinaz alanında iç tandem duplikasyonları (ITD) ya da yanlış anlamlı mutasyon. FLT3-ITD daha yaygın mutasyon ve standart kemoterapiye zayıf tepki ile ilişkili iken FLT3 kinaz d prognostik önemiOMain nokta mutasyonları, bu AML hastada görülen, prognozu 14 belirsiz bir etkisi vardır. Izositrat dehidrojenez 2 (NADP +), mitokondriyal (IDH2), yaygın olarak AML mutasyona uğramış bir epigenetik değiştirici kodlayan bir gendir. Epigenetik nitelemeler mutasyonlar gen disregülasyona neden genlerin bu sınıftaki diğer mutasyonları temsil IDH1 ve DNMT3A mutasyonlarla, AML nispeten yaygındır. Nucleophosmin (NPM1) genindeki mutasyonlar, AML en yaygın edinilmiş mutasyonların bir ve genellikle (a FLT3 yokluğunda - ITD) iyi bir prognostik faktör olarak kabul edilmektedir. NPM1 ve IDH2 Eş mutasyonlar% 89 3 yıllık genel sağkalım, bir prognostik gösterge 5 literatürde tarif edilmiştir. genel 3-yıllık sağkalım ile karşılaştırıldığında bu önemli bir sağkalım avantajı temsilYabani tip NPM1 ve% 31 IDH2. Örneğin, standart-bakım uygulamaları UÖM 1 mutasyon analizi ve FLT3-ITD mutasyonu içerir. İkincil mutasyonlar olumlu olabilir gibi bu senaryoda, yalnızca bir NPM1 mutasyon tespiti, riski için uygun tabakalandırmak hasta başarısız olur (örneğin, IDH2) (örneğin, TET2) ya da olumsuz, bir kemik iliği nakli hafifletmek için güven azaltır. Olgu 2 - Katı NGS Paneli FFPE dokudan ekstre DNA, bir 252 ng / ul konsantrasyon ve 1000 baz çifti (bp) DNA bölgesinin sadece% 4&#39;ü ile, katı-NGS Panel için yeterli kalite ve miktar. Veri analizinden sonra kapsama ortalama derinliği 9167 250 okuma derinliğinin altında hiçbir bölge ile (iyi 1000 minimum derinlik kesim okur üzeri) okur oldu. Ek QC metrikler sho vardırTablo 3&#39;te wn. ERBB2 (Her2 / neu) ekson 20 bir çerçeve ekleme ve TP53 bir yanlış anlamlı mutasyon: biyoinformatik boru hattı yoluyla işlenen veriler iki hastalıkla ilişkili mutasyonlar tespit etti. Bunların alel frekansları ile tüm egzonik türevleri Tablo 5&#39;te temsil edilmektedir. Isimlendirme yansıtılan ErbB2 ekleme aslında, çoğaltılmış bir tandem (Her2 / neu) dizi temsil eder. Kimlik ve sıralama çerçeve ekleme gerekli manuel incelemenin onay IGV yoluyla okur. TP53 ve Her2 hem görüldüğü gibi% 50&#39;den fazla mutasyon frekanslarının tespiti, / neu mutasyonları heterozigotluk (LOH) olay (tartışma) kaybı işaret ediyor. akciğer adenokarsinomu tespit mutasyonlar ile Olgu 2 Katı NGS Panel sonuçları in ERBB2 (HER2 / neu) ve TP53, iki genin yaygın. HER2 / neu akciğer kanseri, EGFR başka yaygın mutasyona uğramış gene benzer bir tirozin kinaz reseptörünü kodlayan akciğer kanseri hastaları için geçerli standart-bakım parçası olarak test değil . 20 eklemeler 2 gözlenir HER2 / neu ekson etkinleştirilmesi - Akciğer adenokarsinomların% 4, akciğer kanseri gözlenen HER2 / neu mutasyonlarının çoğunluğunu oluşturmaktadır ve tipik olarak EGFR ve ALK 12 gibi diğer sürücü genlerindeki mutasyonlar olmadan tümörlerde görülür . HER2 / neu ve mTOR inhibitörleri 13 ve kemoterapi 15 ile birlikte monoklonal antikor Trastuzumab ile önemli hastalık kontrolü ile kombinasyon tedavisine kısmi yanıt da dahil olmak üzere, HER2 / neu eklemeleri, aktive olan hastalar için çeşitli tedavi seçenekleri için kanıt gösteren potansiyel birkaç satır vardır. Bir TP53 değişikliği keşfetme unco değilKanserde MMON, ancak şu anda hiçbir eyleme tedaviler vardır. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Dava 1 </td><td> Olgu 2 </td></tr><tr><td> Toplam Çalıştırma okur </td><td> 2.215.926 </td><td> 2.129.110 </td></tr><tr><td> Yüzde Mapping okur </td><td> 98,42% </td><td> 98,29% </td></tr><tr><td> Yüzde Hedef üzerinde okur </td><td> 99.01% </td><td> 97,29% </td></tr><tr><td> Yüzde Filtre sonra Target üzerinde okur </td><td> 97,60% </td><td> 95,45% </td></tr><tr><td> Kullanılabilir yüzdesi okur </td><td> 94,87% </td><td> 91,79% </td></tr><tr><td> 250x Kapsama yukarıdaki Üs yüzdesi </td><td> 98.40% </td><td> 100% </td></tr><tr><td> Üs a yüzdesiBove 1000x Kapsama </td><td> 95,90% </td><td> 99,70% </td></tr><tr><td> 250X altında Kapsam - Amplikon Numarası </td><td> 8 </td><td> 0 </td></tr></tbody></table> Tablo 3:. Sıralama Run QC Metrik Bu kütüphane hazırlık örnek QC geçti olmadığını belirlemek için veri inceleme için kullanılan ortalama kapsama dahil olmak üzere en önemli çalışma istatistiklerinin özetini değildir. tüm yüzdeler% 90&#39;ın üzerinde ise tüm süreç başarılı olur, ancak FPU yıkama adımı ya da primer çapraz konuşma SW1 taşınmasını veya UB1, 80 aralığında &#39;Hedef üzerinde Yüzde&#39; düşük olması ile mümkündür - % 90. &#39;Yüzde eşlenen &quot;çok düşük ise, tüm numuneler, insan hizalamak gerektiği gibi, bu, bakteriler ya da diğer DNA kontaminasyonu işaret eder. Bu özelliklerde herhangi% 80 altında olduğunda, numune nasıl p belirlemeye yardımcı olmak için daha fazla inceleme için işaretlenirroceed ve sürecini iyileştirmek. <img alt="Tablo 4" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl4.jpg" /> Tablo 4:.. Durum 1 Sonuçları Tespit edilen patojen, ilişkili hastalık, bilinmeyen önemi varyantı (VUS) ve listelenen% 5 alel frekansının raporlama kriterlerine üzerinde büyük olasılıkla iyi huylu egzonik varyantlar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_4.xlsx" target="_blank">bu tabloyu indirmek için tıklayınız.</a> <img alt="Tablo 5" src="/files/ftp_upload/52758/52758tbl5.jpg" /> Tablo 5:.. Durum 2 Sonuçları Algılanan ilgili patojenik, hastalık, bilinmeyen önemi varyantı (VUS) ve listelenen% 5 alel frekansının raporlama kriterlerine üzerinde büyük olasılıkla iyi huylu egzonik varyantlar <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/JoVE_Table_5.xlsx" target="_blank">bu tabloyu indirmek için tıklayınız</a>. Yan Şekil 1: amplikon tabanlı SampleSheet.csv bir örnek. Bu levha ne iş akışı (örneğin, GenerateFastq) ne Uygulama ve Tahlili (örneğin, FastqOnly), kaç dizisine bazlar (ya da okur) (bu durumda 186 bp (bu durumda Amplikon olarak) çalıştırmak için hangi kimya sequencer için nakleden x 186 bp) ve örnekleri) bu durumda ikili indeksleme (bazı endeksler ile ilişkili son neler. Sarı vurgulanır parça deneyci istediğini değiştirildi, ancak laboratuvar bu parametreleri kullanan bu durumda. Edilebilmektedir <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52758/SupplementaryFigure1.pdf" target="_blank">bu rakamı indirmek için tıklayınız.</a>

Bu el yazması, iki yeni nesil dizileme paneli için klinik protokolleri açıklamaktadır. Bir panel hematolojik maligniteleri sorgularken, diğer panel solid tümörlerde sıklıkla mutasyona uğrayan genleri hedef alır. İnsan malignitelerindeki sürücü mutasyonlarının moleküler sınıflandırması, değerli prognostik ve öngörücü bilgiler sunar.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

As our understanding of the driver mutations necessary for initiation and progression of cancers improves, we gain critical information on how specific ...

Bu yeni nesil dizileme hedefli Amplikon Analizinin genel amacı; tanısal, prognostik ve hedefe yönelik tedaviye yanıt dahil olmak üzere terapötik kullanım için hasta tümörlerindeki patojenik mutasyonları tespit etmektir. Bu yöntem, bir hastanın hedefe yönelik veya alternatif bir tedaviden fayda sağlayabilecek bir gende mutasyona sahip olup olmadığı gibi temel soruları yanıtlar. Bu tekniğin temel avantajı, birçok gendeki hem yaygın hem de nadir etkili mutasyonların, tek bir analiz kullanılarak herhangi bir tümör dokusunda tespit edilebilmesidir.Teknikler ve teknoloji oldukça karmaşık olduğu ve adımların öğrenilmesi çok zor olduğu için, bu yöntemi görsel olarak göstermek kritik önem taşımaktadır. Bu, Tıbbi Onkolojiyi ilerletmek adına belirleyici bir andır. Yeni nesil dizilemenin kliniğe uygulanmasıyla birlikte, hastalarımız için daha fazla ve daha iyi kanser tedavilerine sahip olacağız.CPD Teknoloji Uzmanlarımız Barentt Li, Patrick Candrea, Karthik Ganapathy ve Joe Grubb bu prosedürü uygulamalı olarak gösterecekler. Analizin daha karmaşık bölümlerini göstermek için ben de bu sürece destek vereceğim. Metin protokolüne ve üretici protokolüne uygun olarak genomik DNA ekstrasyonu gerçekleştirdikten sonra, örneğin çalışma konsantrasyonunu belirlemek için ekstre edilen DNA'nın 2 µL'sini bir florometrede analiz edin.Bir Amplikon Kütüphanesi oluşturmak için, Hyb Plaka olarak adlandırılan yarı etekli 96 kuyucuklu bir plakaya gerekli hacimde düşük EDTA'lı TE ve panelin Oligo Tüpü'nden beş mikrolitre ekleyin, ardından her bir karşılık gelen kuyucuğa 100 ila 250 nanogram genomik DNA ekleyin. Buradaki herhangi bir karışıklığın ciddi sonuçları olacağından, bu en kritik adımdır. Sekanslama için Oligo Hibritleme Reaktifi 1'in eklenmesinin ve metin protokolüne uygun olarak santrifüj işleminin ardından, Hyb Plaka'yı önceden ısıtılmış hibritleme inkübatöründe 95 °C'de bir dakika boyunca inkübe edin.İnkübatör yavaşça 40 °C'ye soğutulduktan sonra, plakayı inkübatörden çıkarın ve her bir örneğin tüm hacmini Hyb Plakasından, önceden hazırlanmış ve yıkanmış ilgili filtre plaka ünitesinin (FPU) merkezine aktarın. FPU'nun kapağını kapatın ve 20 °C'de, 2.250 ×g kuvvetinde üç dakika boyunca santrifüjleyin. Ardından 45 µL SW1 ekleyin ve tekrar santrifüjleyin.SW1 ile ikinci bir yıkama ve UB1 ile bir yıkama yaptıktan sonra, her bir örnek kuyucuğuna 45 µL Uzatma Ligasyon Karışımı 3 ekleyin ve karıştırmak için pipetle üç kez aşağı yukarı çekin. Plakayı mühürlemek için yapışkan alüminyum folyo kullanın ve tüm FPU düzeneğini önceden ısıtılmış 37 °C'lik bir inkübatörde 45 dakika boyunca inkübe edin. PCR Amplifikasyonunu indekslemek için, primerleri İndeks Amplifikasyon Plakasına veya IAP Aparatına yerleştirin ve kullanılan indeksleri plaktaki karşılık gelen kuyucuklara paylaştırın, ardından 22 µL PCR Master Mix, 2E12 ekleyin ve pipetle üç kez aşağı yukarı çekin.Metin protokolüne uygun olarak 45 dakikalık Uzatma Ligasyonu Reaksiyonu santrifüj edildikten sonra, FPU'nun her bir örnek kuyucuğuna 25 µL 50 mM sodyum hidroksit ekleyin ve pipet ucunun membrana temas ettiğinden emin olarak en az altı kez aşağı yukarı pipetleyin. Ardından, plakayı hafifçe eğerek ve 20 µL'ye ayarlanmış çok kanallı bir pipet kullanarak, FPU plakasındaki sodyum hidroksiti en az altı kez aşağı yukarı pipetleyin. Elüsyonu FPU'dan IAP'nin karşılık gelen kolonuna aktarın.Metin protokolünde belirtilen PCR programını çalıştırmadan önce, DNA'yı PCR Master Mix ile tamamen birleştirmek için pipetle nazikçe aşağı yukarı karıştırın. Kütüphane verimini doğruladıktan ve örnekleri metin protokolüne uygun olarak Manyetik Saflaştırma Boncukları ile inkübe ettikten sonra, yıkanmış boncukların bulunduğu her kuyuya 30 µL EBT ekleyin. Boncukların tüpün kenarlarından ayrıldığından emin olmak için birkaç kez aşağı yukarı pipetleme yapın.Plaka hem çalkalamalı hem de çalkalamasız olarak inkübe edildikten sonra, plakayı manyetik standa yerleştirin ve süpernatantın 20 µL'sini Kütüphane Normalizasyon Plakası (LNP) adı verilen tamamen yeni bir plakaya aktarın. Normalizasyon karışımının hazırlanmasını, çözeltinin aralıklı olarak tersyüz edilmesini ve vorteksle karıştırılmasını takiben, LNP'deki her bir örneğe 45 µL ekleyin. Ardından, plakayı sızdırmaz şeffaf yapışkan film ile kapatın ve 30 dakika boyunca 1.800 RPM'de çalkalayın.Boncuklar yıkandıktan sonra, LNP'yi manyetik standdan çıkarın ve örneği elüye etmek için her bir kuyucuğa 30 µL taze 0,1 normal sodyum hidroksit ekleyin. Ardından, LNP'yi 1.800 RPM'de beş dakika boyunca sallayın. LNP'yi tekrar manyetik standa yerleştirin ve süpernatan berraklaştıktan sonra, elüsyondan 30 µL'yi Saklama Plakasındaki önceden hazırlanmış Kütüphane Normalizasyon Saklama Tamponu 1'e aktarın.Plakayı eğin, ardından sekanslanacak her bir örnekten beş µL'yi etiketlenmiş bir Havuzlanmış Amplikon Kütüphanesi (Pooled Amplicon Library veya PAL) 1,5 mL tüpüne ekleyin. Kullanılan sekanslama kimyasına bağlı olarak, PAL'den 4 ila 10 µL'yi 590 ila 596 µL Buffer HT1 içerisine ekleyin. Akış Hücresini (Flow Cell) temizleyin ve yükleyin.Reaktifleri yükleyin. Ardından, sekanslama işlemini başlatmak için ekrandaki istemleri takip edin. Sekanslama işlemi tamamlandıktan sonra, Biyoenformatik İş Akışını çalıştırın.Sıralanan kütüphanenin laboratuvar tarafından belirlenen kalite kontrol metriklerinile karşılaştığını doğrulamak için çalışma istatistiklerini analiz edin. Son olarak, bir Genomik Veri Görüntüleyici'de, BAM dosyalarını inceleyerek her bir varyantı manuel olarak gözden geçirin. Bu, bir kütüphane hazırlama örneğinin QC'den geçip geçmediğini belirlemek için kullanılan, ortalama kapsama alanı hariç, en önemli çalışma istatistiklerinin bir özetidir. Birinci Vaka için burada görüldüğü üzere, Biyoinformatik analizi raporlanabilir dört AML ilişkili mutasyon tespit etmiştir.FLT3'te bir missense mutasyonu, IDH2'de bir missense mutasyonu ve NPM1'de bir frameshift mutasyonu. AML'li yetişkin hastaların yaklaşık %25'inde FLT3 mutasyonları gözlemlenir. Bu AML hastasında görüldüğü gibi, FLT3 Kinaz Alanı Nokta Mutasyonlarının prognostik önemi, prognoz üzerinde belirsiz bir etkiye sahiptir.İzositrat Dehidrogenaz 2 veya IDH2, AML'de yaygın olarak mutasyona uğrayan epigenetik bir modifikasyonu kodlar. Nukleofosmin veya NPM1 genindeki mutasyonlar, AML'de en sık görülen kazanılmış mutasyonlardan biridir. Bu tablo, İkinci Vaka için tüm ekzonik varyantları listelemektedir.Hastalıkla ilişkili iki mutasyon tespit edildi. ERBB2'nin Ekzon 20'sinde çerçeve içi (in-frame) bir insersiyon ve TP53'te bir missense mutasyonu saptandı. HER2/neu veya ERBB2, bir Tirozin Kinaz Reseptörü kodlamaktadır.Aktif HER2/neu Ekzon 20 insersiyonları, akciğer adenokarsinomlarının %2 ila 4'ünde görülür ve akciğer kanserinde gözlemlenen HER2/neu mutasyonlarının çoğunluğunu oluşturur. TP53 değişiklikleri de kanserde yaygındır. Ekstre edilen DNA'nın kalitesine ve miktarına çok dikkat edilmesi gereklidir.Bu durum özellikle FFPE örnekleri için önemlidir. Bu örneklerde genellikle değişken DNA verimi ile yüksek derecede degradasyonla karşılaşılır. Klinik analizinin validasyon sürecinde, DNA kütüphane hazırlığına geçmeden önce her örnek için DNA kalitesi ve miktarına yönelik metrikler belirlenmelidir.Kütüphane hazırlığının yanı sıra; sekanslama çalışması için kesim değerlerinin, kalite kontrol istatistiklerinin, kütüphane hazırlama istatistiklerinin, bir Amplikonun kapsama derinliğinin ve minimum raporlanabilir alel frekansının belirlenmesiyle bir Biyoinformatik İzleme Planının doğrulanması kritiktir. Uzmanlaşıldığında, kütüphane hazırlığı bir çalışma gününde tamamlanabilir. Ancak, genel analiz iş akışı DNA ekstraksiyonu, sekanslama, veri işleme ve varyant incelemesi için daha fazla zaman gerektirir.Bu prosedür, yalnızca belirli temel sıcak noktalardaki genomik DNA mutasyonlarını incelemek üzere tasarlanmıştır. Genlerin diferansiyel ekspresyonu, riskli tümörlerle ilişkilendirme ve yapısal yeniden düzenlemeler gibi ek soruları yanıtlamak için RNA kullanan diğer kütle analizleri gerçekleştirilebilir. Önemli gelişmeler ufuktadır.Otomasyonun benimsenmesi ve benzersiz moleküler barkodlama kullanımı, laboratuvarların işlem süresini kısaltmasına, daha az örnek girdisi kullanmasına ve çok düşük alel frekansındaki varyantları tespit etmesine olanak tanıyacaktır. Kanser örneklerinde hastalıkla ilişkili mutasyonların tespiti, on yıllardır standart bakım prosedürü olmuştur. NGS, birçok kanserle ilişkili çok sayıda genin paralel olarak sekanslanmasında daha az yanlı bir yaklaşımdır; bu da birden fazla mutasyonun tanımlanmasını ve hastalar için daha iyi tedavilerin geliştirilmesini sağlar.İzlediğiniz için teşekkür eder, deneylerinizde başarılar dileriz.

next-generation-sequencing-for-detection-actionable-mutations-solid

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Kanser Araştırmaları

Biz Barkodlanan DNA kütüphaneleri ve büyük ölçüde paralel "yeni nesil" dizisi ile klinik tümör numunelerinde önemli kanserle ilişkili mutasyonların saptanması için olan hibridizasyon-bazlı sonraki ekson yakalama hazırlanmasını tarif etmektedir. Hedefli ekson dizileme nedenle düşük frekanslı mutasyonları tespit etmek için yüksek duyarlılık verimli, yüksek verimlilik, düşük maliyet ve derin dizisi kapsama avantajlar sunmaktadır.

Ekson yakalama ve Devasa Paralel Dizilimine tarafından Tümör Örneklerinin somatik genetik değişiklikler tespit

Onkoloji örneklerinin hedeflenen yeni nesil dizilimi için entegre bir sistem tanımlanmıştır. Bu çapraz platform sistemi, düşük kaliteli ve düşük miktarlı tümör biyopsileri için optimize edilmiştir, düşük DNA girdilerini barındırır, iyi karakterize edilmiş çok varyantlı kontroller içerir ve kantitatif pre-analitik kalite kontrol önlemleriyle bilgilendirilen yeni bir varyant arayan içerir.

Düşük kaliteli ve düşük miktar Tümör Biyopsilerinde ve Islak ve kuru Bench Süreçleri Entegrasyonu Hedefli optimize eder nesil Sıralama

Bu el yazması mutasyonlar düşük frekans ctDNA, ER-Seq. algılamak için bir teknik anlatılmaktadır Bu yöntem iki yönlü hata düzeltmesi, özel arka plan filtre ve verimli moleküler acquirement eşsiz kullanımı tarafından ayrıştırılan.

Sonraki nesil sıralama kullanarak CtDNA nadir mutasyonların tespiti

Yüksek kaliteli genomik DNA tümör dokulardan alma genetik değişiklikler sonraki nesil sıralama kullanarak analiz etmek için önemli bir ilk adım olduğunu. Bu makalede, biz tümör hücreleri zenginleştirmek ve bozulmamış DNA touch Künye Sitoloji numune almak için basit ve hızlı bir yöntem mevcut.

Yüksek kaliteli tümör DNA klinik-patolojik numunelerin Touch Künye Sitoloji kullanarak elde etmek için basit ve hızlı yöntemi

Algılama ribonükleik asit (cRNA) kan dolaşan bir karşılanmamış ihtiyaç Klinik teşhis olduğunu. Burada küçük hücreli dışı akciğer kanserli hastalarda hassas ve belirli dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak üzerinden cRNA karakterize yöntemleri açıklanmaktadır. Testleri 72 saat içinde füzyon türevlerini algılamak için tasarım gereksinimlerini karşılamak.

Kan tabanlı Test ROS1 tespiti için ve füzyon transkriptleri ribonükleik asit veya dijital Polimeraz zincir reaksiyonu kullanarak dolaşan gelen RET

Burada, hastanın biyolojik sıvılarında (biyoluidler) bulunan DNA 'Yı dolaşarak tümör somatik mutasyonları tespit etmek için bir protokol sunuyoruz. Damlacık dijital polimeraz zincir reaksiyonu (dPCR) tabanlı yöntem, tümör mutasyonu allelik frekansının (MAF) ölçülmesini sağlar ve tümör yanıtının tanı ve temporal izlenmesi için minimal invaziv bir tamamlayıcı kolaylaştırır.

Hasta Biofluidinde tümör Ilişkili sirkülasyon DNA 'Sı tespiti ve Izlenmesi

Bu makalede, belirli bir hastadan farklı örnekler arasında klonal ve subklonal değişiklikleri tanımlamak için bir yöntem açıklanmaktadır. Burada açıklanan deneyler belirli bir tümör tipine odaklansa da, yaklaşım diğer solid tümörler için genel olarak uygulanabilir.

Hedefe Yönelik Sıralama Yaklaşımı ile Karşılaştırmalı Lezyonlar Analizi

Bu makalede, klinik katı tümör örneklerinde Onkojenik gen Fusions değerlendirmek için yeni nesil sıralamanın ardından bir bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyon tabanlı kitaplık hazırlama kiti kullanımını ayrıntılarıyla. Hem ıslak tezgah hem de veri analizi adımları açıklanmıştır.

Yeni nesil sıralamanın ardından bağlantılı Multiplex polimeraz zincir reaksiyonu kullanılarak Onkojenik gen füzyon tespiti

Bu yazıda kan toplama, plazma ve buffy kat ayırma, cfDNA ve germline DNA ekstraksiyonu, cfDNA veya germline DNA'nın nicelleştirilmesi ve cfDNA parça zenginleştirme analizi dahil olmak üzere invaziv olmayan sıvı biyopsi tekniği için ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.

Kanser Hastalarının Kan Plazma Örneklerinde Hücresiz DNA Tespiti

Skuamöz olmayan küçük hücreli dışı akciğer kanseri (NS-NSCLC) bakım yönetimi için test edilecek moleküler biyobelirteçlerin artması, hızlı ve güvenilir moleküler tespit yöntemlerinin geliştirilmesine yol açmıştır. NS-KHDAK hastaları için genomik değişiklik değerlendirmesi için ultra hızlı yeni nesil dizileme (NGS) yaklaşımı kullanan bir iş akışı tanımlıyoruz.

Skuamöz Olmayan Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Ultra Hızlı Amplikon Tabanlı Yeni Nesil Dizileme

Bu protokol, küçük hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) formalinle sabitlenmiş parafine gömülü dokularda hedeflenebilir genomik değişiklikleri tespit etmek için otomatik, ISO15189 onaylı yeni nesil dizileme iş akışını açıklar.

Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanserinde Hedeflenebilir Değişikliklerin Yeni Nesil Dizileme Kullanılarak Saptanması

Keşfedin, yeni nesil dizileme ile katı ve sıvı tümörlerdeki harekete geçirici mutasyonları tespit etme yöntemlerini. Bu teknik, kanser tedavisinde kişiselleştirilmiş tedavi stratejileri geliştirmeye yardımcı olur.

Katı ve Sıvı Tümörlerinde harekete geçirici Mutasyonlar Tespiti için Yeni Nesil Dizi

Daha fazla video keşfet